KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM, GANODERMA COLOSSUM; NẤM VÂN CHI TRAMETES VERSICOLOR VÀ NẤM THƯỢNG HOÀNG PHELLINUS LINTEUS NUÔI TRỒNG Ở VIỆT NAM TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ

Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết thô cao chiết cồn và cao chiết nước từ các mẫu nấm Linh chi, Vân chi, Thượng hoàng trên ba dòng tế bào ung thư HeLa, NCI-H460 và MCF-7

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM, GANODERMA COLOSSUM; NẤM VÂN CHI TRAMETES VERSICOLOR VÀ NẤM THƯỢNG HOÀNG PHELLINUS LINTEUS NUÔI TRỒNG Ở VIỆT NAM TRÊN MỘT SỐ DÒNG

TẾ BÀO UNG THƯ

Chuyên ngành: DI TRUYỀN

Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cám ơn đến PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương Cô đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài Và tôi cũng rất biết ơn Trung tâm Sâm và Dược liệu T.P.Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện chotôi được thực hiện đề tài tại Trung tâm

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương

đã tạo cho tôi cơ hội được thực hiện khóa luận tại phòng thí nghiệm SHPT của trường và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình học tập

Tôi cũng trân trọng cảm ơn GS.TS Nguyễn Kim Phi Phụng cùng các Thầy Cô,các anh chị em trong khoa Hóa đã cho tôi rất nhiều tình thương cũng như nhiệt tình tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Đặc biệt, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới em Nguyễn Thái Hoàng Tâm và em LêMinh Triết đã nhiệt tình giúp đỡ tôi rất nhiều về mặt chuyên môn

Tôi chân thành biết ơn cha mẹ và những người bạn thân đã động viên và giúp

đỡ tôi hoàn thành xong luận văn này

Nguyễn Thị Thúy Hằng

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát về ung thư 3

1.1.1 Sơ lược về nguyên nhân gây ung thư 3

1.1.2 Đặc tính của tế bào ung thư 4

1.2 Apoptosis và ung thư 4

1.2.1 Phân biệt apoptosis với necrosis 5

1.2.2 Caspase- enzyme đóng vai trò trung tâm trong apoptosis 7

1.2.3 Các con đường hoạt hoá caspase trong tiến trình apoptosis 11

1.2.4 Apoptosis - mục tiêu trị liệu ung thư 17

1.3 Tóm tắt những nghiên cứu về nấm dược liệu 19

1.3.1 Khái quát chung về nấm dược liệu 19

1.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 24

1.3.3 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý 27

1.3.4 Nghiên cứu và ứng dụng nấm dược liệu theo hướng điều trị ung thư 31

1.4 NCI và việc sàng lọc dược liệu kháng ung thư 32

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu 34

2.1.1 Ba dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela, ung thư vú MCF-7 và ung thư phổi NCI-H460 sử dụng trong đề tài 34

2.1.2 Thuốc đối chiếu Camptothecin 35

2.1.3 Nấm dược liệu 35

2.1.4 Hóa chất 37

2.1.5 Thiết bị 40

2.2 Phương pháp 40

2.2.1 Phương pháp thu nhận cao chiết từ nấm dược liệu 40

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật 43

2.2.3 Phương pháp đếm tế bào với Tryphan blue 44

2.2.4 Thử nghiệm SRB 46

2.2.5 Phương pháp kính hiển vi huỳnh quang với thuốc nhuộm kép AO/EB 50

2.2.6 Phương pháp tách chiết và điện di DNA phân tử lượng nhỏ (phương pháp DNA phân mảnh) 51

2.2.7 Phương pháp xác định hoạt tính caspase-3 53

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1 Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết thô (cao chiết cồn và cao chiết nước) từ các mẫu nấm Linh chi, Vân chi, Thượng hoàng trên ba dòng tế bào ung thư HeLa, NCI-H460 và MCF-7 57

3.1.1 Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào HeLa 57

3.1.2 Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào MCF-7 61

3.1.3 Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết cồn

và cao chiết nước trên dòng tế bào NCI-H460 63

3.2 Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô chiết từ nấm Linh chi vàng trên ba dòng tế bào HeLa, NCI-H460 và MCF-7 66

3.2.1 Tế bào HeLa 67

3.2.2 Tế bào ung thư vú MCF-7 69

3.2.3 Tế bào ung thư phổi NCI-H460 70

3.2.4 Kết quả xác định cao chiết tiềm năng 72

3.3 Xác định giá trị IC 50 của cao chiết cồn nấm Linh chi vàng (Ganoderma colossum) trên dòng tế bào HeLa 73

3.4 Kết quả xác định khả năng gây apoptosis của cao chiết cồn nấm Linh chi vàng (Ganoderma colossum) trên dòng tế bào ung thư HeLa 75

3.4.1 Kết quả nhuộm huỳnh quang với thuốc nhuộm kép AO/EB 75

3.4.2 Kết quả phân tích DNA phân mảnh 78

3.4.3 Kết quả xác định hoạt tính caspase-3 80

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN Kết luận 84

TÀI LIỆU THAM KHẢO 85

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Sự khác nhau giữa apoptosis và necrosis 5

Bảng 1.2 Các nhóm caspase và vai trò của nó trong tế bào 8

Bảng 1.3 Thành phần hóa học của nấm Linh chi Ganoderma lucidum 24

Bảng 2.1 Các loại nấm dược liệu sử dụng trong đề tài 35

Bảng 2.2 Độ ẩm của nguyên liệu và cao chiết 36

Bảng 3.1 Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 58

Bảng 3.2 Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 61

Bảng 3.3 Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 63

Bảng 3.4 Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn, các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô chiết xuất từ nấm Linh chi vàng trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 68

Bảng 3.5 Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn, các cao chiết

phân đoạn có chứa triterpen và polysaccharid thô chiết xuất từ nấm Linh chivàng trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 69

Bảng 3.6 Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn, các cao chiết phân

đoạn có chứa triterpen và polysaccharide thô chiết xuất từ nấm Linh chi vàngtrên dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 71

Bảng 3.7 Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn nấm Linh chi vàng

trên dòng tế bào HeLa ở các nồng độ thử nghiệm sau 48 giờ cảm ứng 74

Bảng 3.8 Kết quả hoạt tính caspase-3 của quần thể tế bào Hela ở những

thời điểm khác nhau 82

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AIF : apoptosis inducing factor

Apaf-1 : protease-activating factor 1

AO/ EB : acridine orange/ ethidium bromide

BuOH : buthanol

CAD : caspase activated DNase

CARD : caspase recruitment domain

CPT : camptothecin

: Asp-Glu-Val-Asp DED : death effector domain

DISC : death inducing signalling complex

DNA : deoxyribose nucleic acid

DMSO : dimethyl sulphoxide

E’MEM : eagle minimal essential medium

EDTA : ethylenediaminetera-acetic acid

FasL : Fas-ligand

FasR : Fas- receptor

FADD : Fas-associated death domain

FBS : fetal bovine serum

HEPES : n-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethane sulfonic acid

IC50 : inhibitor concentration of 50%

ICAD : inhibitor of caspase activated DNase

MTT : 3-(4,5 Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromideNCI : national cancer institute

NST : nhiễm sắc thể

PARP : enzyme nuclear polymerase PARP

PSK : polysaccharopeptide Krestin

PSP : polysaccharopeptide

PBS : phosphate buffer saline

RAIDD : RIP associated Ich-1/CED3 homologous protein with death domainR110 : rhodamine 110

SRB : sulforhodamine B

STD : standard deviation

TCA : trichloroacetic acid

TNF : tumor necrosis factor

TRAIL : TNF- related apoptosis induced- ligand

TRADD : TNF receptor – associated death domain

WHO : world health organization

XTT : sodium 3,3,-[(phenylamino)carbonyl]-3,4-tetrazolium-bis(4-

methoxy-6-nitro)benzenesulfonic acid hydrate

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Sự hình thành tế bào ung thư 4

Hình 1.2 Sự khác biệt hình thái giữa tế bào apoptosis và necrosis 7

Hình 1.3 Cơ chế tự hoạt hóa của caspase 9

Hình 1.4 “Thác” caspase 10

Hình 1.5 Hai con đường khởi phát quá trình apoptosis 11

Hình 1.6 Cơ chế hoạt hóa caspase thông qua thụ thể gây chết TNF 13

Hình 1.7 Sự truyền tín hiệu apoptosis thông qua ty thể 15

Hình 1.8 Con đường khởi phát apoptosis thông qua granzyme A, B 17

Hình 1.9 Hình thái quả thể nấm Linh chi 20

Hình 1.10 Hình thái quả thể nấm Vân chi 21

Hình 1.11 Hình thái quả thể nấm Thượng hoàng mọc trên mạt cưa 23

Hình 2.1 Ba dòng tế bào ung thư sử dụng trong đề tài 34

Hình 2.2 Quy trình thu nhận cao chiết phân đoạn có chứa triterpen 42

Hình 2.3 Tế bào nhuộm với Tryphan blue quan sát trong buồng đếm hồng cầu 44

Hình 2.4 Buồng đếm hồng cầu 45 Hình 2.5 Sự phân cắt DNA trong apoptosis 51 Hình 2.6 Sự điện di DNA bị phân cắt trong quá trình apoptosis

và necrosis trên gel agarose 52

Hình 3.1 Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của các cao chiết

cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100 µg/ml

sau 48 giờ cảm ứng 59

Hình 3.2 Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của các cao chiết

cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml

sau 48 giờ cảm ứng 62

Hình 3.3 Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của các cao chiết cồn

và cao chiết nước trên dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml

sau 48 giờ cảm ứng 64

Hình 3.4 Biểu đồ so sánh tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao cồn trên

3 dòng tế bào Hela, MCF-7 và NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml

sau 48 giờ cảm ứng 65

Hình 3.5 Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của cao chiết cồn,

các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi vàngtrên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 68

Hình 3.6 Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của cao chiết cồn,

các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi vàngtrên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 70

Hình 3.7 Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của cao chiết cồn,

các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi vàngtrên dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 71

Hình 3.8 Biểu đồ so sánh tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn,

các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi vàngtrên 3 dòng tế bào HeLa, MCF-7 và NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml

sau 48 giờ cảm ứng 72

Hình 3.9 Đồ thị thể hiện tỷ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ của cao

chiết cồn nấm Linh chi vàng trên dòng tế bào HeLa sau 48 giờ cảm ứng 74

Hình 3.10 Hình thái tế bào HeLa quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang 77 Hình 3.11 Kết quả điện di DNA bộ gen của quần thể tế bào HeLa sau khi được

cảm ứng với cao chiết cồn Linh chi vàng ở nồng độ 92,6 µg/ml 79

So với các loại ung thư khác, ung thư phổi chiếm tỷ lệ và gây tử vong cao nhất

ở nam giới, kể cả ở các nước phát triển và đang phát triển Theo thống kê của Tổchức Y tế Thế giới, ung thư vú và ung thư cổ tử cung là hai loại ung thư thường gặp

và có tỷ lệ tử vong cao nhất trong các loại ung thư phụ khoa ở nữ giới, đặc biệt làphụ nữ ở các nước đang phát triển Tại Việt Nam, hai loại ung thư này đứng đầutrong các loại ung thư thường gặp ở nữ giới

Cho đến nay, việc điều trị ung thư vẫn đang là một thách thức rất lớn đối vớicác nhà khoa học Hiện nay để điều trị ung thư, người ta vẫn dùng ba liệu pháp phổbiến nhất là phẫu thuật, xạ trị và hóa trị Tuy nhiên, các liệu pháp này ít nhiều cũnggây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người do các tác dụng phụ Chẳng hạn phươngpháp hóa trị liệu vẫn còn bị hạn chế bởi việc liều cao của thuốc chữa ung thư có thểgây độc, làm giảm chất lượng cuộc sống của bệnh nhân [68]

Con người từ xa xưa đã biết sử dụng nhiều loại dược liệu quý trong tự nhiên

để chữa bệnh Chính vì thế, việc tìm kiếm và sàng lọc các hợp chất tự nhiên có hoạttính kháng ung thư hiện nay đang là đề tài thu hút sự quan tâm của các nhà khoahọc trên thế giới Các tổ chức y tế lớn trên thế giới như WHO và NCI (NationalCancer Institute) đang có những dự án nghiên cứu mở rộng ra khắp các châu lụctrong việc tìm kiếm các loại thuốc mới có tiềm năng điều trị được ung thư Mộttrong những mục tiêu của việc tìm các hợp chất tự nhiên dùng trong điều trị ung thưhiện nay là tìm kiếm các hợp chất có khả năng cảm ứng tế bào ung thư chết theochương trình (apoptosis)

Qua các nghiên cứu thực nghiệm và nghiên cứu lâm sàng ở người cho thấy,các nấm dược liệu như nấm Linh chi, Vân chi và Thượng hoàng có tác dụng kíchthích chức năng của hệ miễn dịch và ức chế sự phát triển của khối u bằng cách làmngừng chu trình phân bào và cảm ứng quá trình apoptosis [33],[36],[39],[44],[51],[71]; đồng thời ngăn ngừa sự di căn của các tế bào ung thư [31],[61],[63].

Ở Việt Nam, gần đây việc nuôi trồng thành công nhiều loại nấm dược liệu quý

đã tạo điều kiện cho các nhà khoa học trong nước dần dần quan tâm hơn về việcnghiên cứu các loại nấm này [1],[4] Tuy nhiên ở nước ta, việc tiếp cận theo hướng

nghiên cứu thử nghiệm và sàng lọc in vitro các hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng

ung thư từ các loại nấm này vẫn còn là bước đầu và chỉ mới có một vài nghiên cứuđược công bố [3],[6] Nhằm làm rõ hơn về tác dụng kháng ung thư của các loại nấmLinh Chi, Vân Chi và Thượng Hoàng nuôi trồng tại Việt Nam trên ba loại ung thưđược xem là phổ biến nhất hiện nay ở nước ta, trong khuôn khổ luận văn, chúng tôitiến hành thực hiện:

Đánh giá khả năng gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết nướccủa 7 mẫu nấm (Linh Chi, Vân Chi và Thượng Hoàng) trên ba dòng tế bào là ungthư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung Hela và ung thư phổi NCI-H460 bằng thửnghiệm Sulforhodamine B (SRB) Từ đó, chọn ra một loại nấm có tiềm năng nhất

Bước đầu khảo sát khả năng gây độc trên ba dòng tế bào Hela, NCI-H460

và MCF-7 của các dịch chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharid thôtrong loại nấm dược liệu tiềm năng đã được xác định ở trên bằng thử nghiệmSulforhodamine B (SRB)

Chọn ra một cao chiết tiềm năng có khả năng gây độc tế bào cao nhất.Xác định khả năng cảm ứng apoptosis của cao chiết tiềm năng bằng baphương pháp sau:

Phương pháp kính hiển vi huỳnh quang

Thử nghiệm DNA phân mảnh

Thử nghiệm caspase

Chương 1 Tổng quan tài liệu

1.1 Khái quát về ung thư

Ung thư là thuật ngữ dùng để chỉ bệnh liên quan đến những tế bào bất thường phân chia vô hạn (tăng trưởng không kiểm soát) Các tế bào ung thư có thể xâm lấnsang những mô lân cận và chúng có thể di căn sang những cơ quan khác trong cơ thể bằng cách di chuyển theo các mạch máu và hệ thống bạch huyết Hầu hết ung thư tạo thành khối u, ngoại trừ một vài dạng, như ung thư bạch cầu

1.1.1 Sơ lược về nguyên nhân gây ung thư

Trong cơ thể, các tế bào tăng sinh một cách có kiểm soát tạo ra các tế bào mớithay thế cho những tế bào chết đi Sự cân bằng giữa quá trình tăng sinh và chết của

tế bào được điều hòa chặt chẽ

Trong quá trình nguyên phân, tế bào có thể xảy ra những sai hỏng trong DNA.Những sai hỏng đó nếu thoát được cơ chế sửa sai của tế bào sẽ dẫn đến sự hìnhthành một số đột biến Những đột biến này có thể liên quan đến sự tăng sinh, khảnăng đi vào mạch máu và khả năng di chuyển của tế bào

Thông thường, những tế bào mang những sai hỏng trong DNA như thế sẽ trảiqua apoptosis để “tự sát” Nhưng trong trường hợp tế bào ung thư, những đột biến

sẽ ngăn cản không cho tế bào đi vào quá trình apoptosis Những đột biến của tế bàoung thư làm cho tế bào không nhận diện được những tín hiệu điều hòa tăng trưởng

và chúng trở nên tăng sinh nhanh hơn tế bào bình thường Vì không thể kiểm soátđược sự tăng sinh của tế bào ung thư, nên thường sẽ dẫn đến sự hình thành khối u.Nói chung, nguồn gốc căn bản của ung thư là do sự tích lũy nhiều đột biến trong cácgen dẫn đến sự hoạt động bất thường của tế bào (xem hình 1.1), làm cho các tế bàovượt khỏi chu trình kiểm soát thông thường cũng như có khả năng xâm lấn và dicăn

Hình 1.1 Sự hình thành tế bào ung thư [73].

1.1.2 Đặc tính của tế bào ung thư

Nhìn chung, các tế bào ung thư bao gồm các đặc điểm sau: [29]

¾ Không bị kiểm soát bởi các tín hiệu ngoại bào hay nội bào của quá trình điềuhòa chu trình tế bào

¾ Không bị cảm ứng apoptosis

¾ Tăng sinh vô hạn và không có khả năng biệt hóa

¾ Có hoạt động bất thường của emzyme telomerase

¾ Có khả năng di căn đến các vị trí khác trong cơ thể

¾ Có khả năng tồn tại và tăng trưởng tại vị trí mới

1.2 Apoptosis và ung thư

Apoptosis được gọi là “sự chết của tế bào theo chương trình” Apoptosisthường xảy ra trong suốt quá trình phát triển bình thường của sinh vật đa bào và tiếp

diễn trong suốt cả cuộc đời Đồng thời, nó cũng là một cơ chế nội cân bằng giúpduy trì sự cân bằng của quần thể tế bào trong mô.

Sự điều hòa quá trình apoptosis nếu xảy ra vấn đề sẽ dẫn đến một số căn bệnh.Ung thư là một căn bệnh mà đặc điểm là biểu hiện quá ít apoptosis

1.2.1 Phân biệt apoptosis với necrosis

Tế bào có thể chết theo 2 cơ chế chính: apoptosis và necrosis (hoại tử) Sựkhác nhau giữa quá trình apoptosis và necrosis được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Sự khác nhau giữa apoptosis và necrosis [11],[17],[20],[67]

Tế bào chết theo “chương trình” Tế bào chết “bất ngờ”

Là quá trình sinh lý, nhằm loại bỏ

những tế bào hư hại hoặc không có ích

trong cơ thể Tế bào cũng có thể bị cảm

ứng apoptosis khi bị sự tác động của

các tác nhân kích thích như các hợp

chất gây độc tế bào, sự thiếu oxi trong

mô, hoặc nhiễm virút

Là quá trình bệnh lý, xảy ra khi tế bào

bị những tổn thương cơ học nghiêmtrọng

Xảy ra sau vài giờ đến vài ngày bị kích

Tế bào apoptosis trải qua 3 giai đoạn:

ƒ Ở giai đoạn sớm: Chất nhiễm sắc

cô đặc lại, có hiện tượng tạo bóng màng

(blebbing), DNA bị phân cắt thành

những phân mảnh có kích thước

50-300kb

ƒ Ở giai đoạn giữa, DNA tiếp tục bị

phân cắt thành những phân mảnh có

kích thước là bội số của 180bp, tạo

thành “thang DNA” khi xuất hiện trên

gel agarose

ƒ Ở giai đoạn muộn, có hiện tượng

nẩy chồi Các chồi tách ra hình thành

thể apoptotic Thể apoptotic với màng

còn nguyên vẹn chứa tế bào chất, các

bào quan còn toàn vẹn bị nén chặt, có

hoặc không có mảnh vụn nhân Trong

in vivo, các thể apoptotic này sẽ bị thực

bào nên không gây ra phản ứng viêm

Còn trong in vitro, các thể apoptotic sẽ

phồng lên và cuối cùng là bị ly giải,

giai đoạn cuối cùng này của apoptosis

được gọi là “secondary necrosis”

“smear”

ƒ Màng tế bào bị phá vỡ, giải phóngbào tương ra các mô xung quanh, gây raphản ứng viêm (hình 1.2)

Hình 1.2 Sự khác biệt hình thái giữa tế bào apoptosis và necrosis [11]

1.2.2 Caspase- enzyme đóng vai trò trung tâm trong apoptosis

Sự “chết theo chương trình” là hiện tượng “tự tử” của tế bào, sự hoạt động củacác tín hiệu phân tử bên trong bản thân tế bào sẽ dẫn đến cái chết của chính nó Quátrình apoptosis được điều hòa chặt chẽ ở mức độ gen Sự cảm ứng và biểu hiệnapoptosis đòi hỏi sự cộng tác giữa các phân tử tín hiệu, các thụ thể, các enzyme vàcác protein điều hòa Trong đó, hệ thống tín hiệu các caspase đóng vai trò quantrọng trong việc biến đổi hình thái đặc trưng của apoptosis

Các enzyme này thuộc họ cysteine protease, phân cắt protein ở vị trí sau gốcaspartic acid, vì thế chúng được đặt tên là caspase Trong tế bào, một chuỗi cáccaspase tương tác hoạt hóa dây chuyền tạo nên hiện tượng được gọi là “tháccaspase” (caspase-cascade) (xem hình 1.4) Khi chưa được hoạt hóa, các caspasetồn tại ở dạng bất hoạt (procaspase) Dựa trên sự tương đồng trong trình tự aminoacid, 14 caspase được chia làm 3 nhóm nhỏ: ( xem bảng 1.2)

Bảng 1.2 Các nhóm caspase và vai trò của nó trong tế bào

(caspase khởi sự)

Caspase-2Caspase-8Caspase-9Caspase-10

II Tiến hành apoptosis

(caspase hành sự)

Caspase-3Caspase-6Caspase-7

III Nhân tố trung gian

phản ứng viêm

Caspase-1Caspase-4Caspase-5Caspase-11Caspase-12Caspase-13Caspase-14

Các procaspase khởi sự (procaspase-2, 8, 9 và 10) sẽ tự hoạt hóa hình thànhcác caspase khởi sự có hoạt tính Sau đó, các caspase khởi sự sẽ phân cắt cácprocaspase hành sự (procaspase-3, 6 và 7) thành các caspase hành sự Sự tự hoạthóa của procaspase theo cơ chế: hai hoặc nhiều procaspase tập hợp lại gần nhau, doprocaspase không hoàn toàn mất đi hoạt tính phân cắt protein nên khi chúng tập hợplại gần nhau, phân tử procaspase sẽ bị cắt tại vị trí gốc aspartic acid tạo ra một tiểuphần lớn (khoảng 20 kDa) và một tiểu phần nhỏ (khoảng 10 kDa) đồng thời phóngthích prodomain Sau đó, xảy ra quá trình nhị trùng hợp (dimer hóa), hình thành liênkết ái lực giữa đầu C của tiểu phần lớn với đầu N của tiểu phần nhỏ trình hình thành

cấu trúc tetramer α2β2 gồm 2 tiểu phần lớn và 2 tiểu phần nhỏ [10],[24] ( hình 1.3).

Hình 1.3 Cơ chế tự hoạt hóa của caspase Phân tử procaspase gồm có 3 phần:

Pro (prodomain) - L (tiểu phần lớn) -S (tiểu phần nhỏ) [10]

™ Các caspase khởi sự: gồm có caspase-2, 8, 9 và 10 (xem hình 1.4)

Caspase-8, 9 và 10: có nhiệm vụ hoạt hóa các procaspase hành sự 3, 6 và 7.

Caspase-8 còn có thêm một chức năng gián tiếp tham gia vào con đường hoạt hóaapoptosis thông qua ty thể, đó là phân cắt proapoptotic protein Bid dạng bất hoạtthành tBid có hoạt tính, kích thích sự giải phóng cytochrome C

Caspase-2: Hiện nay, người ta vẫn chưa biết rõ lắm về cơ chế hoạt động của

caspase-2 Có nghiên cứu cho rằng caspase-2 tham gia vào con đường nội bào hoạthóa apoptosis thông qua ty thể Nghiên cứu này cho rằng caspase-2 kích hoạt trựctiếp con đường hoạt hóa apoptosis thông qua ty thể mà không cần sử dụng đến chứcnăng phân cắt protein của nó [58]

Hình 1.4 “Thác” caspase – Các caspase có thể phân cắt lẫn nhau hoặc phân cắt

các protein khác [74]

™ Các caspase hành sự: gồm có caspase-3, 6 và 7 ( xem hình 1.4)

Ngoài việc được các caspase khởi sự hoạt hóa, các caspase hành sự cũng cókhả năng hoạt hóa lẫn nhau

Caspase-3 là một yếu tố chủ chốt thi hành apoptosis Nó được hoạt hóa bởi

caspase-8, caspase-9, caspase-10, granzyme B và các yếu tố khác Caspase-3 chịutrách nhiệm phân cắt nhiều cơ chất mà một vài cơ chất trong số đó là procaspase-6,procaspase-9, PARP, ICAD (inhibitor of caspase- activated deoxyribonuclease) Tất

cả các cơ chất của caspase-3 thông thường đều có chứa trình tự DEVD Val-Asp)

(Asp-Glu-Ngoài các caspase khởi sự, procaspase-6 có thể được hoạt hóa bởi caspase-3,

nhưng không bị hoạt hóa bởi granzyme B Caspase-6 cũng có thể hoạt hóa lại

procaspase-3 bằng con đường “positive feedback”

Trong khi đó, procaspase-7 lại có thể được hoạt hóa bởi granzyme B

Caspase-7 cũng có thể hoạt hóa procaspase-6 [24].

1.2.3 Các con đường hoạt hoá caspase trong tiến trình apoptosis

Sự hoạt hóa caspase được điều hòa một cách chặt chẽ, thông qua 2 con đườngchính: con đường tín hiệu ngoại bào (extrinsic pathway) - thông qua thụ thể gâychết và con đường nội bào (intrinsic pathway) - thông qua ty thể [67] Tuy nhiên,hai con đường này không độc lập hoàn toàn mà có sự liên kết với nhau, tín hiệuphân tử của con đường này có thể ảnh hưởng lên con đường kia [20] (xem hình1.5)

Hình 1.5 Hai con đường khởi phát quá trình apoptosis [75]

Con đường tín hiệu ngoại bào (hoạt hóa procaspase khởi sự thông qua thụ thể gây chết)

Thụ thể gây chết (death receptor) trên bề mặt tế bào khi kết hợp với các ligandđặc hiệu như TNFα, FasL và TRAIL (TNF- related apoptosis induced- ligand) sẽtruyền đi tín hiệu apoptosis

Những thụ thể gây chết là thành viên của hệ thống thụ thể TNF (tumornecrosis factor) Những thành viên của hệ thống thụ thể này thường liên kết vớinhững ligand có cấu trúc tương tự TNF FasL và TRAIL chính là những ligand cócấu trúc như thế [10] TNFR1 và Fas (CD95) là hai trong số những thụ thể có khảnăng hoạt hóa apoptosis Sự kết hợp giữa các ligand với receptor đặc hiệu như sau:FasL/FasR, TNFα/TNFR1 [20] Trên domain nội bào của các receptor TNF nàychứa một vùng đặc biệt gọi là “death domain” (DD)

Để hoạt hóa yếu tố khởi sự apoptosis, cần phải có các phân tử protein nội bàolàm cầu nối trung gian, các phân tử protein này được gọi là các adaptor TRADD(TNF receptor – associated death domain) và FADD (Fas-associated death domain)

là các adaptor tham gia vào quá trình truyền tín hiệu hoạt hóa apoptosis Trên cả haiphân tử TRADD và FADD đều có chứa “death domain” có thể liên kết trực tiếp với

“death domain” của thụ thể Trên FADD, còn có một domain khác gọi là DED(death effector domain) Trên phân tử procaspase-8 và procaspase-10 cũng có 2DED, nhờ đó mà có thể liên kết trực tiếp với adaptor FADD [10] Sự hoạt hóaprocaspase-10 cũng tương tự như procaspase-8

Tùy theo thụ thể mà sẽ có sự phối hợp các adaptor khác nhau Đối với thụ thểTNFR1, cần phải có cả TRADD và FADD TRADD là phân tử trung gian liên kếtFADD và thụ thể TNFR1 thông qua các “death domain” Sau đó, FADD sẽ kết hợpvới procaspase-8 thông qua DED [10] Đối với thụ thể Fas, các ligand (FasL vàCD95L) cũng hoạt hóa apoptosis theo cách giống với thụ thể TNFR1 Tuy nhiên,adaptor FADD có thể kết hợp trực tiếp với thụ thể Fas mà không cần thông quatrung gian TRADD [76] (xem hình 1.6)

Hình 1.6 Cơ chế hoạt hóa caspase thông qua thụ thể gây chết TNF [72]

Một phức hợp protein (phần “death domain" của thụ thể/adaptor/procaspase-8)được gọi là DISC (death inducing signalling complex) Các caspase được tuyểnchọn đến phức hợp DISC chủ yếu là procaspase-8, một vài trường hợp làprocaspase-10 Trong phức hợp DISC, 2 phân tử procaspase-8 kết hợp với nhau dẫnđến sự tự hoạt hóa procaspase-8 thành caspase-8 hoạt động Sau đó, con đường hoạthóa tiếp theo của caspase-8 thay đổi tuỳ loại tế bào Ở một số dòng tế bào lympho,caspase-8 hoạt động mạnh mẽ và có thể hoạt hóa trực tiếp procaspase-3 thànhcaspase-3 dạng hoạt động Ở một số tế bào khác, caspase-8 không hoạt hóa trực tiếpprocaspase-3 mà hoạt hóa thông qua con đường trung gian ty thể Khi đó, caspase-8cắt protein Bid thuộc họ proapoptotic protein trong tế bào chất thành dạng hoạtđộng của nó là tBid, sau đó tBid sẽ khởi động con đường hoạt hóa apoptosis thôngqua ty thể [24] (xem hình 1.5)

Đối với procaspase-2 (procaspase khởi sự), sự hoạt hóa của nó cũng thông quathụ thể gây chết Để hoạt hóa procaspase-2 cần 2 adaptor là TRADD và RAIDD(RIP associated Ich-1/CED3 homologous protein with death domain) TRADD vẫn

là phân tử trung gian gắn kết RAIDD với receptor, còn RAIDD sẽ liên kết vớiprocaspase-2 Lúc này, procaspase-2 sẽ được hoạt hóa thành caspase-2 [10]

Con đường nội bào thông qua ty thể

Ty thể có vai trò quan trọng trong sự điều hòa quá trình chết của tế bào Nóchứa nhiều proapoptotic protein như là AIF (apoptosis inducing factor), cytochromeC

Trong tế bào chất có một họ protein liên quan tới sự đáp ứng apoptosis, đó là

họ protein Bcl-2 Họ protein này chia làm 2 nhóm: nhóm pro-apoptotic protein(gồm Bax, Bad và Bid) và nhóm anti-apoptotic protein (Bcl-2 và Bcl-xL) Nhómpro-apoptotic protein nằm trong cytosol, trong khi các anti-apoptotic protein định vịtrên màng ty thể Sự nhạy cảm của tế bào đối với tín hiệu kích thích hoạt hóaapoptosis phụ thuộc vào sự cân bằng giữa 2 nhóm protein này Khi có những tínhiệu kích thích hoạt hóa apoptosis (như sự mất yếu tố tăng trưởng, stress tế bào, sựgây hại của gốc tự do), nhóm pro-apoptotic protein sẽ bị kích hoạt và tăng sự biểuhiện Sau đó, chúng đến tương tác với các anti-apoptotic protein làm thay đổi cấuhình của nhóm protein này, dẫn đến sự hình thành các kênh (PT pore) trên màng,giải phóng cytochrome C ra ngoài tế bào chất [76] (xem hình 1.7)

Hình 1.7 Sự truyền tín hiệu apoptosis thông qua ty thể [76]

Khi ra đến tế bào chất, cytochrome C tương tác với protein Apaf-1( activating factor 1) Trên Apaf-1 có một domain gọi là CARD (caspase recruitmentdomain), một domain khác là “nucleotide-binding domain” và nhiều “WD repeatdomain” Bình thường Apaf-1 trong cytosol bất hoạt ở dạng đơn phân Khicytochrome C tương tác với Apaf-1 thông qua “nucleotide-binding domain” và

protease-“WD repeat domain” làm thay đổi cấu hình Apaf-1, dẫn đến hình thành dạng hoạtđộng của Apaf-1 dưới dạng các đơn phân kết hợp lại Sau khi được hoạt hóa,Apaf-1 liên kết với procaspase-9 thông qua domain CARD của chúng Sự kết hợpnày hình thành một phức hợp gọi là apoptosome gồm có “cytochrome C/Apaf-1/procaspase-9” Sự tạo thành apoptosome giúp hoạt hóa procaspase-9 thành

caspase-9 dạng hoạt động Caspase-9 nếu được phóng thích ra khỏi Apaf-1 ở dạng

tự do thì hoạt tính protease của nó sẽ yếu đi so với khi vẫn còn liên kết với Apaf-1

Vì vậy, để duy trì hoạt tính protease ở mức tối ưu, caspase-9 ở dạng hoạt động vẫn

sẽ kết hợp với Apaf-1 tạo thành phức hợp “Apaf-1/caspase-9” gọi là holoenzyme.Chính phức hợp holoenzyme phân cắt các procaspase-3, 6 và 7 thành dạng caspasehoạt động [10]

Con đường hoạt hóa apoptosis bởi các granzyme A và B do tế bào T độc tiết ra

Ngoài 2 con đường hoạt hóa apoptosis: ngoại bào (qua thụ thể) và nội bào (qua

ty thể) được trình bày ở trên, còn có con đường khác có thể hoạt hóa được quá trìnhapoptosis Đó là con đường hoạt hóa apoptosis bởi các granzyme A, B do các tế bào

T độc tiết ra

Tế bào T gây độc có thể hoạt hóa apoptosis thông qua con đường tiết ragranzyme A và granzyme B Tế bào T có thụ thể CD8 nhận tín hiệu từ tế bào trìnhdiện kháng nguyên và giải phóng các serine protease là granzyme A và B qua kênhperforin xuyên màng vào trong tế bào mục tiêu và hoạt hóa apoptosis (xem hình1.8)

Granzyme B có cơ chế phân cắt protein ở gốc aspartate, vì thế sẽ hoạt hóaprocaspase-10 và phân cắt những nhân tố giống như ICAD (inhibitor of caspaseactivated DNase) Có những nghiên cứu chứng minh rằng granzyme B có thể sửdụng con đường ty thể để khuếch đại tín hiệu apoptosis bằng cách phân cắt đặc hiệuproapoptotic protein Bid và cảm ứng sự phóng thích cytochrome C Tuy nhiên,granzyme B cũng có thể trực tiếp hoạt hóa caspase-3 [20]

Granzyme A là một nhân tố quan trọng trong con đường hoạt hóa apoptosiskhông phụ thuộc vào caspase Granzyme A hoạt hóa sự phân cắt DNA thông quaDNase NM23- H1, một enzyme ức chế khối u Enzyme DNase này có vai trò quantrọng trong việc giám sát miễn dịch ngăn chặn ung thư thông qua việc cảm ứngapoptosis ở tế bào khối u Bình thường, một phức hợp protein gọi là SET sẽ ức chế

gen NM23- H1 Trong tế bào, phức hợp SET này có nhiệm vụ bảo vệ chất nhiễm sắc

và cấu trúc DNA Protease granzyme A sẽ phân cắt phức hợp protein SET, giảiphóng gen NM23- H1 khỏi sự ức chế, dẫn đến sự phân cắt DNA [20]

Hình 1.8 Con đường khởi phát apoptosis thông qua granzyme A và B [78]

1.2.4 Apoptosis - mục tiêu trị liệu ung thư

Trong nhiều trường hợp, điều trị ung thư bằng tia phóng xạ hoặc hóa chất cũngkhó tiêu diệt các khối u, vì những đột biến trong chuỗi phản ứng dẫn đến quá trình

apoptosis thường tạo ra những tế bào có khả năng kháng lại với các loại tác nhânđiều trị trên Trong khi đó, các tế bào bình thường vẫn còn nguyên vẹn cơ chế chếttheo chương trình, vì thế các liệu pháp điều trị ung thư bằng tia phóng xạ hoặc hóachất cũng sẽ ảnh hưởng tới những tế bào bình thường làm cho các tế bào khỏe mạnhnày cũng bị apoptosis, dẫn tới những tác dụng phụ như ảnh hưởng đến hệ tiêu hóa,tủy xương và da Mục tiêu của liệu pháp điều trị ung thư hiện nay là làm cho tế bàoung thư chết đi mà không gây ra quá nhiều tác hại đến tế bào bình thường Mọi ýkiến đều thống nhất rằng, để cho các tế bào ung thư trải qua quá trình apoptosis làmột ý tưởng hay [26].

Tuy nhiên, một liệu pháp điều trị ung thư chỉ có khả năng cảm ứng apoptosis

mà bản thân không có khả năng gây độc tế bào có vẻ như là gây chết tế bào bìnhthường nhiều hơn là tế bào ung thư Hiện nay, các thuốc điều trị ung thư tác độngtheo 2 hướng: cảm ứng apoptosis và gây độc trực tiếp tế bào ung thư Các thuốcđiều trị ung thư có tác dụng tốt về mặt lâm sàng ức chế sự tăng sinh của của tế bàoung thư bằng cách ngăn cản sự hình thành DNA, mRNA hoặc protein; trực tiếp pháhủy DNA hay ức chế những thành phần cần thiết cho quá trình sao chép DNA; hoặcphân cắt nhiễm sắc thể Tế bào ung thư được điều trị theo cách này có quá trìnhnguyên phân bị ngăn chặn, mất đi khả năng duy trì hoạt động của màng tế bào hoặctrở nên già yếu đi Đồng thời, các loại thuốc này sẽ gây apoptosis ở tế bào ung thưtheo cách khôi phục lại nguyên vẹn quá trình apoptosis, dẫn đến sự tự tử của tế bào[26]

Thật ra, apoptosis là một phản ứng bình thường của tế bào khi bị tác động bởicác yếu tố kích thích [26] Trong một vài trường hợp, loại kích thích và mức độ kíchthích quyết định tế bào chết bởi apoptosis hay necrosis Ở nồng độ thấp, các tácnhân kích thích như là nhiệt độ, tia phóng xạ và thuốc gây độc tế bào kháng ung thư

có thể cảm ứng apoptosis nhưng cũng với loại tác nhân đó nếu ở liều cao có thể gây

ra necrosis [20] Vì thế thường các tế bào ung thư điều trị với thuốc gây độc mộtcách hợp lý sẽ không bị chết do độc tính của thuốc mà sẽ hoạt hoá cơ chế tự tử của

nó để chết [26]

1.3 Tóm tắt những nghiên cứu về nấm dược liệu

1.3.1 Khái quát chung về nấm dược liệu

Nấm dược liệu là một trong những vị thuốc được sử dụng rộng rãi và lâu đời ởphương Đông Đối với nền y học cổ truyền, nó được coi là loại dược liệu quý dùng

để tăng cường sức khỏe và kéo dài tuổi thọ Ngày nay, nền khoa học hiện đại đãchứng minh được trong nấm dược liệu thật sự có những thành phần hoạt chất chủyếu như nhóm polysaccharide có tác dụng điều hòa hoạt hóa hệ thống miễn dịch,nhóm triterpene có tác dụng chống khối u, ngoài ra còn có các nhóm chất khác cũng

có tác dụng giúp cơ thể chống lại bệnh tật Những hoạt chất này có tác động trựctiếp hoặc gián tiếp kháng lại những căn bệnh hiểm nghèo, đặc biệt là ung thư

Nấm Linh chi

Từ hàng ngàn năm nay, Linh chi đã được biết như một vị thuốc quý trong cổthư Trung Quốc Trong “Thần Nông bản thảo kinh” – bộ sách nổi tiếng về thảodược ra đời cách đây hơn 2000 năm, Linh chi được xếp đứng đầu các vị thuốcthượng phẩm, trên cả nhân sâm, là một loại dược thảo được xem là kỳ diệu, có rấtnhiều hiệu năng, dùng lâu không hại, có thể giúp người ta diên niên trường thọ Nhưthế, Linh chi từ lâu đã có tên chính thức trong dược điển của Trung Quốc, NhậtBản, Hàn Quốc như một phương thuốc đặc trị

Năm 1971, hai nhà bác học người Nhật tên là Yukio Naoi và Zenzaburo Kasai,thuộc đại học Kyoto đã thành công trong việc gây giống và người ta mới sản xuấtđược loại nấm này một cách qui mô Từ đó, những tác dụng kỳ diệu của loài nấmnày mới được làm sáng tỏ bằng các nghiên cứu, thử nghiệm hiện đại với sự thamgia của rất nhiều nhà khoa học phương Đông và cả phương Tây Đến nay có ít nhấthơn 2.000 báo cáo khoa học về Linh chi đã được công bố trên thế giới [7]

™ Phân loại – danh pháp

Có rất nhiều loài Linh chi khác nhau Các loài Linh chi được xếp vào một họ

riêng là họ nấm Linh chi Ganodermataceae, trong đó chi Ganoderma có gần đến 80 loài Khi nói đến Linh chi tức là đề cập đến loài Linh chi đỏ, đây là loại Linh chi tốt

B A

nhất trong các loài thuộc họ Linh chi (xem hình 1.9.A) Ngày nay, các nhà khoa học

đã xác định Linh chi đỏ là loài nấm có tên khoa học là Ganoderma lucidum (Leyss

ex Fr.) Karst Ngoài ra, ở Việt Nam nó còn có tên thông dụng là Linh chi, ở TrungQuốc gọi Lingzhi, Hàn Quốc gọi là Youngzhi và Nhật gọi là Reishi

Linh chi đỏ được gọi là “Linh chi chuẩn” để phân biệt với những loài khác cùng chi Ganoderma Hiện nay, nấm Linh chi đỏ có khoảng 45 thứ (variete), có

màu sắc khác nhau thay đổi từ vàng, vàng cam đến cam, đỏ cam, đỏ, đỏ sậm, đỏtía Ngoài ra, các nhà khoa học Nhật Bản cho rằng, nếu trồng Linh chi trong môitrường và điều kiện khác nhau, sẽ có màu sắc khác nhau

Linh chi vàng được nuôi trồng thành công ở Việt Nam có tên khoa học là

Ganoderma colossum, chưa thấy xuất hiện ở Trung Quốc và các nước Đông Nam Á

khác Cho đến nay, nấm Linh chi vàng Ganoderma colossum vẫn chưa được nghiên

cứu nhiều ở Việt Nam cũng như trên thế giới) [7] (xem hình 1.9.B)

Hình 1.9 Hình thái quả thể nấm Linh chi Hình A - Linh chi đỏ (Ganoderma

lucidum) Hình B – Linh chi vàng (Ganoderma colossum)

™ Hình thái học - Môi trường sống

Nấm Linh chi có chung một đặc điểm là tai nấm hóa gỗ; mũ xòe tròn, bầu dụchoặc hình thận; có cuống ngắn hoặc dài hay không cuống Mặt trên mũ có vân đồngtâm và được phủ bởi lớp sắc tố bóng láng như verni Mặt dưới phẳng, màu trắnghoặc vàng, có nhiều lỗ li ti, là nơi hình thành và phóng thích bào tử nấm

Chi Ganoderma rất phong phú và phân bố khá rộng, nhất là ở vùng nhiệt đới

ẩm Gặp hầu hết ở các nước Châu Á Ở Việt Nam, gặp rải rác từ Bắc đến Nam.Trong thiên nhiên, nấm này thường chỉ có nơi rừng rậm, ít ánh sáng và độ ẩmcao Tuy nhiên trong hàng vạn cây già, chỉ có độ hai ba cây có Linh chi Vì thế nấmnày rất hiếm trong dạng thiên nhiên

Nấm Vân chi

Do có nhiều tác dụng dược lý nên cách đây hơn 2000 năm, nấm Vân chi đãđược sử dụng tại Trung Quốc Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu vềnấm Vân chi Hiện nay, các dược phẩm chế xuất từ nấm Vân chi được phát triển đadạng, được sử dụng rộng rãi trong y học hiện đại, kết hợp với với các liệu pháp vật

lý, hóa học, sinh học khác trong việc điều trị bệnh, đặc biệt là chống ung thư

Hình 1.10 Hình thái quả thể nấm Vân chi Hình A - Vân chi vàng Hình B - Vân

chi nâu

™ Phân loại - Danh pháp

Vân chi có tên khoa học là Trametes versicolor (C von Linnaeus) A Pilát hay

Coriolus versicolor (C von Linnaeus) L Quélet Về hệ thống phân loại, nấm này

thuộc họ Polyporaceae, bộ Aphyllophorales, lớp Hymenomycetes, ngànhBasidiomycota Ở Nhật, nấm này còn được gọi là Kawaratake và ở Trung Quốcnấm còn có tên là Yun-Zhi Hiện nay, có hơn 120 chủng nấm Vân chi đã đượcbiết [19]

™ Hình thái học - Môi trường sống

Vân chi là nấm hàng năm, chất da-hóa gỗ Mặt trên tán phủ lông dày, mịn, rấtbiến đổi về màu sắc Thường quả thể chồng chất xen kẽ nhau như ngói lợp Mặt tánnấm có nhiều vòng đồng tâm màu sắc từ vàng xám, xanh xám, xám nâu, xám đen,xanh đen, nâu đen Kích thước thay đổi với đường kính tán trung bình cỡ 2-7 cm,dày cỡ 2,5-4 mm Thịt nấm mỏng, màu kem hơi vàng, dày 0,6-2,5 mm [8]

Nấm Vân chi phân bố hầu khắp thế giới, được tìm thấy nhiều ở các vùng rừng

ôn đới ở Bắc Mỹ, ở Châu Á và Châu Âu Trong tự nhiên và nuôi trồng, nấm Vânchi phát triển thành quả thể Tuy nhiên, nấm có thể phát triển trong sự lên men chìmdưới dạng sinh khối hệ sợi

Nấm Thượng hoàng

Bên cạnh các loại nấm dược liệu quý khác, Thượng hoàng cũng là một loạinấm dược liệu đã được sử dụng suốt hàng thế kỷ ở các nước phương Đông Hiệnnay, có 3 nước đang nghiên cứu nhiều về nấm Thượng hoàng là Nhật Bản, TrungQuốc và Hàn Quốc Trong đó, Hàn Quốc là nước đang cố gắng đẩy mạnh việc trồngnấm Thượng hoàng Vì đây là nấm đa niên có thời gian trồng kéo dài, nên ngoàidạng quả thể, hiện nay đang có xu hướng lên men sinh khối hệ sợi nấm để có mộtsản lượng sinh khối nhanh và nhiều hơn

™ Phân loại - Danh pháp

Nấm Thượng hoàng thuộc ngành Basidiomycota, lớp Basidiomycetes, bộ

Hymenochaetales, họ Hymenochaetaceae, chi Phellinus, có tên khoa học là

Phellinus linteus Nấm Thượng hoàng còn gọi là nấm Hoàng sơn Ở Trung Quốc,

nấm Thượng hoàng được gọi là Song-gen, ở Hàn Quốc là Sang-hwang và ở Nhật làMeshimakobu

Hình 1.11 Hình thái quả thể nấm Thượng hoàng mọc trên mạt cưa

™ Môi trường sống

Đây là các loài nấm mọc nhiều năm, lớp thụ tầng năm sau chồng lên lớp thụtầng năm trước Nấm thường mọc ở những vùng rừng sâu, trên núi cao hiểm trởhoặc trong các khu rừng nguyên sinh Tuổi của nấm có khi lên đến vài chục năm.Đến nay, Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu đã trồng thành

công loài nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus) với công thức do Trung tâm phối

chế trong bịch mạt cưa Đây là công trình trồng nấm Thượng hoàng đầu tiên ở ViệtNam từ nguồn giống phong phú trong nước ( xem hình 1.11)

1.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

Thành phần hóa học của nấm Linh chi

™ Nấm Linh chi Ganoderma lucidum

Cho đến nay, các nhà khoa học đã hiểu biết khá rõ về thành phần hóa học của

Ganoderma lucidum Trong nấm có chứa các nhóm chất triterpene, terpenoid và

sterol, polysaccharide, protein, peptide, acid amin, glycoprotein, alkaloid, acid béo,acid hữu cơ, vitamin, các khoáng đa lượng, vi lượng Thành phần hóa học của

Ganoderma lucidum được tóm tắt ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Thành phần hóa học của nấm Linh chi Ganoderma lucidum

Ergosta-7,22-dien-3β-yl palmitate Ergosta-7,22-dien-3β-yl linoleate Ergosta-7,22-dien-3β-yl pentadecanoate Ergosta-7-dien-3β-yl linoleate

Triterpenoid

ester

Ganoderic acid A, B, H Ganoderic acid methyl esterGanoderic acid V1 (24E)-3β,20ξ−dihydroxy-7,11,15-trioxo-5α-lanosta-8,24-dien-26-oic acid

Triterpenoid

Ganoderma acid T, S, R, P,Q,0Ganoderemic D

Ganoderiol A, B, F

Polyoxygenate

lanostanoid

triterpen

Lanosta-7,9(11),24-trien-3β,15α−dihydroxy-26-oic acidLanosta-7,9(11),24-trien-3β,22α−diacetoxy−15α−dihydroxy-26-oic acid

Lanosta-7,9(11),24-trien-15α 26-oic acid

,22α−diacetoxy−3β−dihydroxy-Peptidoglycan Ganoderan B, C

Protein Lingzhi - 8

Acid béo Oleic acid

™ Nấm Linh chi vàng Ganoderma colossum

Trên thế giới, Ganoderma colossum là một loài Linh chi hiếm trong họ

Ganodermatacease, chỉ thấy xuất hiện ở Việt Nam Vì thế các nghiên cứu về tácdụng sinh học của nó chưa nhiều, các hợp chất mang hoạt tính sinh học của nó vẫnchưa được biết rõ Gần đây, một vài nghiên cứu hiếm hoi được thực hiện với mục

đích xác định thành phần hoạt chất của Ganoderma colossum Các nhà nghiên cứu

đã phát hiện trong Ganoderma colossum có các chất chuyển hóa triterpene mới Đó

là các colossolactone I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, A, B, C, D, E, F, G; và mộtfarnesyl hydroquinone mới là ganomycin I Trong nấm cũng tìm thấy sự hiện diệncủa ergosterol, schisanlactone A, ganomycin B, lucidenic acid [21],[22],[23], [42],[66]

Thành phần hóa học của nấm Vân chi [19]

Trong các nấm dùng làm dược liệu thì các polysaccharopeptide thu nhận từnấm Vân chi được thương mại hóa nhiều nhất Những polysaccharopeptide củanấm Vân chi có giá trị thương mại được biết nhiều nhất là polysaccharopeptideKrestin (PSK) và polysaccharopeptide (PSP).

PSK được tách chiết lần đầu tiên ở Nhật Bản vào cuối thập kỷ 60, trong khi đóPSP được phân lập tại Trung Quốc vào năm 1983 Vào năm 1985, PSK xếp hạng 19trong danh sách của những thuốc thành công về mặt thương mại nhất trên thế giới.PSP xuất hiện trên thị trường khoảng 10 năm sau PSK

Về tính chất vật lý, PSK và PSP thông thường tồn tại ở dạng bột màu nâu sẫmhoặc nâu sáng, không mùi vị, tan và bền trong nước nóng nhưng không tan trongcác dung môi như methanol, benzen, pyridine, chloroform và hexan Cácpolysaccharopeptide này có khả năng chống chịu với tác động của enzyme thuỷphân protein

PSK và PSP có cấu trúc hoá học cũng như các tính chất sinh lý học khá tươngđồng Chúng đều là những hỗn hợp của các chuỗi đường liên kết với một số protein

Cả hai đều có trọng lượng phân tử khoảng 100 kDa Thành phần polypeptid củachúng có chứa một lượng lớn acid aspartic và acid glutamic Thành phầnpolysaccharide của cả PSK và PSP đều được kết cấu bởi các mạch đường đơnmonosaccharide được liên kết với nhau bởi các cầu nối α-(1-4) và β-(1-3) glucosid.PSK và PSP khác nhau chủ yếu ở chổ PSK có chứa đường fucose và PSP thì chứađường rhamnose và arabinose Ngoài ra cả hai còn chứa galactose, mannose vàxylose

Thành phần hóa học của nấm Thượng hoàng

Những hợp chất chính của nấm Thượng hoàng là polysaccharide, amino acid,acid γ-aminobutyric, nhiều vitamin và đường [49] Các nhà nghiên cứu đã chứngminh trong nấm Thượng hoàng có meshimakobnol A, meshimakobnol B,phellifuropyranone A, và hợp chất phelligridin G [43]

1.3.3 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý

Tác dụng dược lý và một số nghiên cứu về tác dụng sinh học của nấm Linh chi

™ Nấm Linh chi Ganoderma lucidum

Trong các nhóm hợp chất của Ganoderma lucidum, hai nhóm chất có nhiều

hoạt tính sinh học được quan tâm nhiều nhất là triterpene và polysaccharide Nhómtriterpene có khả năng kháng lại các khối u, chúng trực tiếp gây độc tế bào ung thưhơn là thông qua hệ miễn dịch Người ta cho rằng nhóm polysaccharide kháng ungthư gián tiếp bằng cách kích thích hệ miễn dịch hơn là trực tiếp gây độc lên tế bàokhối u Tuy nhiên, trong nhóm polysaccharide có một số chất không chỉ điều hòamiễn dịch mà còn có thể trực tiếp gây độc tế bào, một trong số đó là cácpolysaccharide liên kết protein (glycoprotein) [54]

Ganoderma lucidum có tính năng kích thích và điều biến hệ miễn dịch.

Polysaccharide của Ganoderma lucidum với chức năng kích thích miễn dịch có thể

cảm ứng sự biệt hóa monocytic leukemic cell thành dendritic cell [16] Mặt khác,

polysaccharide của Ganoderma lucidum còn làm tăng khả năng gây độc tế bào của

cytotoxic T-lymphocyte đặc hiệu được cảm ứng bởi dendritic cell [15]

Ganoderma lucidum có khả năng chống khối u và không gây hại cho tế bào bình thường Ganoderic acid thu nhận từ Ganoderma lucidum làm ngừng chu

trình tế bào, ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thư gan BEL7402 ở người,nhưng lại không gây ảnh hưởng tương tự trên dòng tế bào gan bình thường L02

[69] Dịch nước nóng hòa tan bào tử và quả thể của Ganoderma lucidum (ở dạng bột) ức chế sự di căn của ung thư vú và tuyến tiền liệt [61] Mặt khác,

Ganoderma lucidum cũng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư vú bằng cách điều

hòa giảm bớt sự biểu hiện của estrogen receptor và tín hiệu NF-κBB [38].

Ganoderma lucidum có tác dụng như 1 chất chống oxi hóa Dịch chiết nước

nóng của Ganoderma lucidum có tác dụng chống oxi hóa trên gan chuột [59] Dịch chiết ethyl acetate, methanol và nước của Ganoderma lucidum có tác dụng tiêu diệt

các gốc superoxide và hydroxyl [9]

Ganoderma lucidum có một số công dụng khác như hạ huyết áp, hạ mỡ trong

máu Trong Ganoderma lucidum có chứa các phân tử 26-oxygenosterol có hoạt tính

chống lại sự tổng hợp cholesterol [7],[28] Bên cạnh đó Linh chi còn có thêm một

số công dụng như: hiệu quả giảm đường huyết, trị bệnh suy nhược thần kinh, làmgiảm sự mỏi mệt, làm thuyên giảm bệnh viêm gan và phục hồi hoạt động của tế bàogan, và đặc biệt Linh chi có khả năng chống HIV [7]

™ Nấm Linh chi vàng Ganoderma colossum

Trong nghiên cứu của Peter Kleinwätchter (2000), 7 hợp chất colossolactone

A-G của Linh chi vàng Ganoderma colossum có tác dụng kháng viêm và có khả

năng gây độc các dòng tế bào ung thư HeLa, K-562, L-929 [42]

Theo nghiên cứu của Riham Salah El Dine và cộng sự, các colossolactone (V,

VI, VII, VIII, E, G), schisanlactone A, ganomycin B và ganomycin I có khả năng ứcchế protease HIV-1 (một enzyme có vai trò quan trọng trong sự sao chép của virusHIV-1) [21],[23]

Ngoài ra, dịch chiết cồn của Linh chi vàng còn có khả năng ngăn cản sự di căncủa tế bào ung thư gan HepG2 bị cảm ứng bởi PMA (phorbol-12-myristate-13-acetate) [66]

Tác dụng tăng cường miễn dịch và điều trị ung thư của nấm Vân chi

Trong y học cổ truyền của Trung Quốc và Nhật Bản, quả thể nấm Vân chiđược thu hái, phơi khô, tán thành bột và chế biến thành trà [19] Hoạt chất chiếtxuất từ nước nóng của nấm Vân chi được dùng để trừ thấp, tiêu nhọt, bổ phế và tănglực Trong cuốn y thư xuất bản dưới triều Minh có ghi: nấm Vân chi có tác dụngdưỡng thần, tăng sức, mạnh gân cốt Nếu dùng Vân chi trong thời gian dài sẽ làmtăng sức khỏe và tuổi thọ

Một số nghiên cứu về tác dụng sinh học của nấm Vân chi trên thế giới: Nấm Vân chi có khả năng điều hòa miễn dịch Polysaccharopeptide của

nấm Vân chi có khả năng điều hòa miễn dịch bằng cách cảm ứng sự sản xuất của interleukin-6, interferon, immunoglobulin-G, đại thực bào và tế bào lympho T Nó