Chẩn đoán virus viêm não nhật bản (japanese encephalitis virus) bằng kỹ thuật rt lamp (loop mediated isolathermal amplification)

Hình 6: Bước 1 của kỹ thuật LAMP Bước 2: DNA polymerase thực hiện phản ứng tổng hợp sợi DNA bổ sung với sợi DNA đích, bắt đầu từ đầu 3’ của vùng F2 của FIP hình 7.. Hình 7: Bước 2 của kỹ

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



Chủ đề:

CHẨN ĐOÁN VIRUS VIÊM NÃO NHẬT

BẢN (JAPANESE ENCEPHALITIS VIRUS)

BẰNG KỸ THUẬT RT-LAMP

(LOOP-MEDIATED ISOLATHERMAL

AMPLIFICATION)

Nhóm thực hiện: Giáo viên hướng dẫn:

Tp Hồ Chí Minh, tháng 10/2009

MỤC LỤC

I Đặt vấn đề

II Tổng quan tài liệu

1 Định nghĩa bệnh VNNB

2 Virus VNNB

3 Phân bố virus VNNB

4 Chu trình lây nhiễm của virus VNNB

5 Đặc điểm bệnh VNNB

6 Giới thiệu kỹ thuật LAMP

a Khái niệm kỹ thuật LAMP

b Thiết kế mồi cho LAMP

c Nguyên lý của kỹ thuật LAMP

d RT-LAMP

e LAMP phát hiện SNP

f Đọc kết quả III Vật liệu và Phương pháp

1 Định tính virus VNNB

a Vật liệu

b Phương pháp

c Đọc kết quả

2 Định lượng virus VNNB

d Vật liệu

e Phương pháp và tính toán

IV Kết luận

V Tài liệu tham khảo

I Đặt vấn đề

Theo thông báo của viện vệ sinh dịch tễ trung ương, mỗi năm có khoảng 3.000 trẻ em mắc bệnh viêm não, trong đó có từ 30-40% bị viêm não Nhật Bản Bệnh viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis) do muỗi truyền

và phát triển mạnh vào mùa nắng nóng, phù hợp với điều kiện hoạt động của muỗi truyền bệnh nên thường gọi là bệnh viêm não mùa hè hay viêm não B Viêm não Nhật Bản là bệnh do muỗi truyền virut gây bệnh, giống các bệnh nhiễm virus khác do muỗi truyền như sốt xuất huyết (Dengue fever), sốt vàng (Yellow fever) Hiện nay bệnh viêm não Nhật Bản chưa có thuốc đặc trị do vậy thường có tỷ lệ tử vong cao hoặc để lại di chứng nặng nề

Trong thập kỷ 1960 có nhiều trận dịch viêm não siêu vi được gọi là hội chứng viêm não cấp tính gọi tắt là hội chứng não cấp (HCNC), xảy ra tại hầu hết các địa phương ở miền Bắc, nhất là ở miền trung du và vùng đồng bằng châu thổ sông Hồng, có nơi tỷ lệ mắc bệnh hằng năm lên tới 6 -10/100.000 dân với tỷ lệ tử vong từ 5,7% - 28,5% và siêu vi VNNB là tác nhân gây ra 50% - 70% HCNC Tại miền Nam viêm não siêu vi xảy ra rải rác quanh năm, số mắc cao nhất vào năm 1980 với tỷ lệ 4,95/100.000 dân và

tỷ lệ tử vong 27,46%, thưòng tập trung nhiều ở đồng bằng sông Cửu Long vựa lúa của miền Nam, nơi có thói quen nuôi heo gần nhà Chưa tiến hành nghiên cứu có hệ thống tại đây, nhưng qua kết quả báo cáo sơ bộ của bệnh viện lớn tại TP HCM, từ 64% - 69% hội chứng não cấp nhập viện có tác nhân gây bệnh là virút VNNB, với tỷ lệ tử vong vào khoảng 16% (BS Võ Công Khanh, 2007)

Vì hiện nay vẫn chưa có thuốc đặc trị bệnh VNNB và người bị bệnh VNNB có nguy có tử vong cao, nếu có điều trị khỏi bệnh thì cũng để lại những di chứng hết sức nặng nề về thần kinh Do đó, để hạn chế những hậu quả do bệnh VNNB đem lại cần sử dụng kỹ thuật gene để chẩn đoán phát hiện sớm virus VNNB sớm ngay khi virus mới xâm nhâp vào cơ thể hay trong thời gian ủ bệnh

II Tổng quan tài liệu

1 Định nghĩa bệnh VNNB

Viêm não Nhật Bản (VNNB) là một bệnh nhiễm trùng cấp tính gây ra bởi một loại siêu vi trùng thuộc nhóm Arbovirus có ái tính với tế bào thần kinh, có tên là virút viêm não Nhật Bản Virút lây truyền qua người nhờ trung gian của loại côn trùng tiết túc là muỗi Bệnh có thể xảy ra rải rác hay thành dịch

Tùy theo mức độ và vị trí bị tổn thương tại hệ thần kinh trung ương (HTKTW), lâm sàng sẽ có biểu hiện triệu chứng của nơi bị xâm phạm như: viêm não, viêm màng não, viêm sừng trước tủy sống hoặc bệnh cảnh phối

hợp: viêm não màng não, viêm não màng não tủy sống (BS.Võ Công Khanh, 2007)

2 Virus VNNB

Virus VNNB được xếp vào giống Flavivirus, họ Flavivudae, được tách từ họ Togavirudae Hình cầu, nhân chứa ribonucleic acid (RNA), kích thước 45 - 50nm, bao quanh bởi cấu trúc hình khối gọi là capsid, phần vỏ giàu chất lipid (hình 1)

Hình 1: virus VNNB Cấu trúc kháng nguyên của virus VNNB B có liên quan mật thiết với kháng nguyên của virus viêm não Murray Valley, virus viêm não West Nile, virus viêm não Saint Louis Do vậy, ba virus viêm não này được xếp vào nhóm virus VNNB B (Phạm Sỹ Lăng – Nguyễn Thiện, 2004)

Hình 2:các chủng virus VNNB

3 phân bố của virus VNNB

Các virus trong nhóm virus VNNB phân bố và gây bệnh khắp nơi trên thế giới, riêng virus VNNB lưu hành rộng rãi ở các nước trong vùng Đông á, Nam Á, và Đông Nam Á trong đó có Việt Nam (hình 3)

Hình 3: phân bố của virus VNNB và các virus trong nhóm VNNB

4 Chu trình lây nhiễm virus VNNB

Virus VNNB được bảo tồn trong thiên nhiên do truyền sinh học từ

động vật có xương sống này sang động vật có xương sống khác qua trung gian của côn trùng tiết túc hút máu là muỗi Chim là vật chủ cơ bản của chu trình Chim - Muỗi trong việc duy trì virus VNNB trong tự nhiên, nhưng chưa có nghiên cứu rõ về vai trò quan trọng của chim trong việc truyền virus VNNB qua muỗi đến người

Hình 4: Đường lây truyền bệnh viêm não Nhật Bản Heo là vật chủ quan trọng nhất có khả năng làm lan rộng virus VNNB, và chu trình Heo - Muỗi tồn tại quanh năm Người sống gần chu trình sinh thái tự nhiên này, có thể mắc bệnh khi bị muỗi đốt Người được coi là vật chủ cuối cùng đối với virus VNNB vì virus trong máu người tồn tại trong thời gian ngắn với nồng độ thấp, nên không thể lây bệnh từ người này sang người khác qua muỗi đốt

5 Đặc điểm của bệnh VNNB

a Phân bố theo mùa

Khí hậu với những yếu tố nhiệt độ và mưa cũng có ảnh hưởng đến tình hình bệnh Vào mùa mưa, ruộng lúa đầy nước tạo điều kiện tốt cho muỗi sinh sản và phát triển mạnh trong thiên nhiên, trùng hợp với thời điểm bệnh xảy ra nhiều

Vào mùa hè thời tiết nóng, ở nhiệt độ từ 270C – 300C, virus thường phát triển tốt trong cơ thể muỗi Nếu dưới 200C thì sự phát triển của virus dừng lại Đó là lý do tại sao mô hình dịch tễ học lại khác nhau giữa hai miền Nam, Bắc Việt Nam Tại Miền Bắc bệnh giảm nhiều vào những tháng lạnh, tăng vào những tháng hè và đỉnh cao vào tháng 5 - 6 - 7 Tại miền Nam, thời tiết nóng bệnh rải rác quanh năm (BS Võ Công Khanh, 2007)

b Phân bố theo tuổi và giới tính

Tất cả mọi lứa tuổi chưa có miễn dịch đều có thể mắc bệnh Ở những vùng có bệnh VNNB lưu hành, trẻ em sớm tiếp xúc với tác nhân gây bệnh nên tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ cao thường từ 2 - 10 tuổi, phần đông ở thể không triệu chứng lâm sàng, số lượng trẻ có kháng thể đặc hiệu tăng theo tuổi nên

tỷ lệ mắc bệnh giảm ở trẻ lớn và người lớn Người nước ngoài không phân biệt tuổi tác nếu chưa có miễn dịch đặc biệu đều có thể mắc bệnh khi đến vùng có VNNB lưu hành Bệnh không liên quan tới giới tính tuy nhiên trong thực tế số bệnh nam thường nhiều hơn nữ

Tuy chu trình sinh thái của virus VNNB trong thiên nhiên không thay đổi, nhưng tình hình dịch tễ có biến đổi trước tác động của con người, như

thay đổi lề lối canh tác và chăn nuôi, đô thị hóa, điều kiện kinh tế xã hội được nâng cao, sử dụng thuốc diệt trừ côn trùng trong canh nông, và cuối cùng là thuốc chủng ngừa VNNB đã được sử dụng (BS Võ Công Khanh)

6 Giới thiệu kỹ thuật LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification)

a Khái niệm kỹ thuật LAMP

LAMP là kỹ thuật nhân bản acid nucleic đơn giản, nhanh, đặc hiệu và cho hiệu quả cao LAMP được phát triển bởi công ty hóa chất Eiken, Nhật Bản nó sử dụng bốn đoạn mồi được thiết kế đặc biệt để nhận diện 6 vùng trình tự trên acid nucleic đích và quá trình phản ứng thực hiện ở nhiệt độ không đổi từ 600C – 650C (thường 630C), với thời gian phản ứng từ 30-60 phút nhanh hơn rất nhiều so với phản ứng PCR thành phần phản ứng gồm: mẫu, 4 đoạn primer, DNA polymerase, dung dịch đệm, dNTP, tất cả các thành phần phản ứng cho vào một test tube và thực hiện phản ứng trong tủ

ổn nhiệt trong kỹ thuật này cả hai quá trình nhân bản và kiểm tra kết quả phản ứng chỉ trong một bước (Eikenchemical.com)

Đặc điểm của kỹ thuật LAMP (Eikenchemical.com):

 Không cần bước biến tính DNA sợi đôi thành sợi đơn

 Phản ứng khuếch đại thực hiện dưới một nhiệt độ không đổi

 Hiệu quả khuếch đại cực kỳ cao

 Sử dụng bốn đoạn mồi để nhận diện sáu vùng trình tự trên trình

tự đích

 Giảm giá thành do không yêu cầu hóa chất đắt tiền và thiết tinh vi

 Trong sản phẩm khuếch đại có các vòng

 Có thể khuếch đại trình tự đích là RNA giống như DNA nhờ enzyme reverse transcriptase

b Thiết kế mồi cho LAMP

sở dĩ kỹ thuật LAMP có nhiều ưu điểm so với kỹ thuật PCR là do các mồi dùng trong kỹ thuật LAMP được thiết kế đặc biệt giúp cho sự biến tính, bắt cặp và nhân đôi DNA nhanh chóng

LAMP được thực hiện với bốn đoạn mồi được thiết kế đặc biệt để nhận ra sáu vùng trình tự khác nhau trên DNA đích bao gồm: Vùng F3c, F2c, F1c ở đầu 3’ và B1, B2, B3 ở đầu 5’

Hình 5: các mồi và vị trí gắn trên DNA đích

Mồi được thiết kế tốt sẽ quyết định kết quả của phản ứng khuếch đại Mồi được sử dụng trong LAMP đều được thiết kế và kiểm tra bằng phần mềm PrimerExplore là phần mềm đặc biệt được viết dành riêng để thiết kế mồi cho LAMP (Eikenchemical.com)

c Nguyên lý của kỹ thuật LAMP

sau khi DNA mẫu và các chất phản ứng được cho vào trong test tube

sẽ được đưa vào trong tủ ổn nhiệt và giữ nhiệt độ không đổi từ 600C - 650C Quá trình phản ứng bắt đầu qua các bước sau:

bước 1: DNA sợi đôi bị mất trạng thái cân bằng khi nhiệt độ đột ngột

lên 650C nên sẽ bị tách ra thành hai sợi đơn DNA, một mồi gắn vào trình tự

bổ sung trên DNA đích bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung nhờ enzyme DNA polymerase Đối với kỹ thuật LAMP không cần bước biến tính DNA bằng nhiệt như PCR mà dựa vào việc tạo sợi đơn dựa vào mồi (hình 6)

Hình 6: Bước 1 của kỹ thuật LAMP

Bước 2: DNA polymerase thực hiện phản ứng tổng hợp sợi DNA bổ

sung với sợi DNA đích, bắt đầu từ đầu 3’ của vùng F2 của FIP (hình 7)

Hình 7: Bước 2 của kỹ thuật LAMP

Bước 3: Primer F3 gắn vào vùng F3c và tổng hợp sợi bổ sung thay thế

vị trí và giải phóng sợi bổ sung chứa FIP (hình 8)

Hình 8: Bước 3 của kỹ thuật LAMP

Bước 4: Một sợi đôi DNA được tổng hợp từ primer F3 và sợi DNA

mẫu (hình 9)

Hình 9: Bước 4 của kỹ thuật LAMP

Bước 5: Sợi bổ sung gắn với primer FIP được giải phóng trở thành sợi

đơn nhờ phản ứng thế chỗ của primer F3 khi tổng hợp sợi bổ sung Khi ở dạng sợi đơn thì sợi này sẽ tạo thành cấu trúc vòng ở đầu 5’ do sự bổ sung của vùng F1 và F1c (hình 10)

Hình 10: Bước 5 của kỹ thuật LAMP

Bước 6: DNA sợi đơn ở bước 5 sẽ là sợi khuôn để cho primer BIP

tổng hợp sợi bổ sung và sau đó primer B3 sẽ tổng hợp sợi bổ sung khác thế chỗ cho sợi có chứa primer BIP Primer BIP gắn với đầu 3’ và khi tổng hợp

sẽ làm cho cấu trúc vòng chuyển thành cấu trúc thẳng Primer B3 cũng bắt đầu từ đầu 3’ nhưng gắn ở phía ngoài của primer BIP, DNA tổng hợp từ B3

sẽ thế chỗ và giải phóng sợi đơn có chứa primer BIP (hình 11)

Hình 11: Bước 6 của kỹ thuật LAMP

Bước 7: DNA sợi đôi được tạo ra từ bước 6 nhờ primer B3 (hình 12).

Hình 12: Bước 7 của kỹ thuật LAMP

Bước 8: DNA sợi đơn ở bước 6 sẽ tạo thành cấu trúc dạng vòng ở hai

đầu nhờ trình tự bổ sung của vùng F1 với F1c của primer FIP và vùng B1c với B1 của primer BIP Đây là cấu trúc khởi đầu cho chu trình khuếch đại DNA đích của kỹ thuật LAMP (hình 13)

Hình 13: Bước 8 của kỹ thuật LAMP

Bước 9-11: Cấu trúc DNA ở bước 8 sẽ nhanh chóng bị thay đổi do

hoạt động tổng hợp của các mồi và DNA polymerase Primer FIP sẽ gắn vào một vòng của DNA đích và tổng hợp sợi bổ sung và tạo sợi đơn DNA có chứa một vòng do sự bổ sung của vùng B1 và B1c (bước 9) DNA sợi đơn được giải phóng nhanh chóng tạo câu trúc như bước 8, cấu trúc này tiếp tục tham gia làm khuôn để tiếp tục tổng hợp DNA (bước 11)

Hình 14: bước 9-11 của kỹ thuật LAMP

d RT-LAMP (reverse transcriptase LAMP)

Kỹ thuật RT-LAMP cần phải tổng hợp c.DNA từ khuôn RNA và sử dụng kỹ thuật LAMP để khuếch đại và kiểm tra kết quả Với khuôn là RNA nên thành phần các chất phản ứng ngoài các thành phần phản ứng của kỹ thuật LAMP (primer, DNA polymerase, dNTP, dung dịch đệm) còn có thêm enzyme reverse transcriptase trong thành phần phản ứng Sau đó thành phần phản ứng được hòa trộn và đưa vào tủ ổn nhiệt giữ ở nhiệt độ từ 60-650-C

Các bước của kỹ thuật RT-LAMP tương tự như kỹ thuật LAMP cho DNA, nhưng có thêm bước tạo cDNA từ RNA như hình 15

Hình 15: Tổng hợp cDNA từ RNA

e LAMP phát hiện SNP (single nucleotide polymorphis)

vì kỹ thuật LAMP có độ đặc hiệu cao nên chỉ có những trình tự DNA đích có độ tương đồng ở mức từng nucleotide mới được khuếch đại khi sử dụng kỹ thuật LAMP để phát hiện các dạng SNP Hơn nưa đặc điểm của phản ứng khuếch đại của LAMP có thể sự khác nhau một nucleotide trong chu trình khuếch đại cho cả sợi sene và anti-sene, và các dạng SNP có thể được phát hiện dễ dang, nhanh chóng bằng sự khuếch đại DNA có chứa SNP chỉ trong một phản ứng duy nhất Phản ứng cho kết quả nhanh chỉ trong khoảng 30 phút

Đặc điểm của LAMP cho SNP:

 Sử dụng 4 primer được thiết kế để xác đinh 6 vùng trình tự trên khuôn, chỉ có DNA đích bổ sung hoàn toàn mới được khuếch đại

 Phản ứng đặc hiệu có thể phân biệt sự khác nhau một nucleotide

 Các SNP có thể được phát hiện chỉ trong một bước nhờ sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại

Nguyên lý của LAMP cho SNP: Như hình 16, nguyên lý cơ bản khi

sử dụng primer cho dạng hoang dại (WT primer) Primer FIP và BIP được thiết kế chứa một nucleotide SNP (trường hợp này là allen cho kiểu hoang dại) ở đầu 5’ Sử dụng WT primer, khi mà DNA đích có allen WT, DNA được tổng hợp nhờ sự tạo thành cấu trúc vòng đôi ở hai đầu Nếu như DNA đích có sự đột biến allen WT (MUT) thì sẽ không tạo ra DNA có cấu trúc vòng kép ở hai đầu nên sự khuếch đại không xảy ra

Hình 16: nguyên lý của LAMP cho SNP

f Đọc kết quả

Kết quả sau khi khuếch đại bằng kỹ thuật LAMP có thể dùng để định tính hoặc định lượng Nếu chỉ cần định thì kết quả có thể đọc bằng mắt thường dựa vào màu của test tube sau khuếch đại, hoặc đọc dưới tia UV để hiện màu của chất phát huỳnh quang như SYBR green, hoặc cũng có thể đọc trên bảng gel điện di với nồng độ agarose 2% - 3% Khi cần định lượng thì cần xây dựng đường chuẩn với các với độ cản quang ( chỉ số OD), sau đó dựa vào đường chuẩn và giá trị OD của mẫu tính nồng độ DNA có tròn mẫu

Hình 17: Đọc kết quả nhờ UV (a) và bằng mắt thường (b)

Hình 18: Đọc kết quả trên bảng gel điện di

Hình 19: Đường chuẩn dùng định lượng

III Vật liệu và phương pháp

1 Định tính virus VNNB

Bởi vì virus VNNB có bộ máy di truyền là RNA nên sử dụng kỹ thuật RT-LAMP cho việc định tính virus

a Vật liệu

Thiết kế mồi đặc trưng cho virus VNNB: Bốn đoạn mồi cho RT-LAMP được thiết kế từ gene E của virus VNNB Trình tự của gene E được lấy từ GeneBank Bốn đoạn mồi này có khả năng xác khuếch đại trình tự đích khoảng 235bp tương ứng với vị trí từ 992 đến 1225 Tất cả các đoạn mồi được thiết kế và kiểm tra trên phần mềm PrimerExplore (M M Parida

và ctv, 2006) Trình tự bốn đoạn mồi dùng cho phản ứng RT-LAMP chẩn đoán virus VNNB như sau:

 Outer primer (19 base):

 Forward outer primer F3: GGAATGGGCAATCGTGACT

 Backward outer primer B3: CGTTGTGAGCTTCTCCAGT

 Inner primer:

 forward inner primer FIP (F1c+TTTT+F2) gồm 22bp:

GCGGACGTCCAATGTTGGTTTG

 Backward inner primer BIP (B1+TTTT+B2c) gồm 18bp: GCCACTTGGGTGGACTTG

Chuẩn bị mẫu: Mẫu được lấy từ bệnh nhân VNNB khi bệnh nhân có các biểu hiện triệu chứng bệnh từ ngày thứ một đến ngày thứ bảy Mẫu sau đó sẽ được trữ lạnh ở -800C nếu chưa tiến hành tách RNA ngay Ngoài mẫu bệnh phẩm thì còn cần phải chuẩn bị đối chứng âm, mẫu đối chứng âm này phải được kiểm tra kỹ để loại bỏ sự xâm nhiễm virus VNNB hoặc các loài thân thuộc từ bên ngoài Đối chứng dương là virus được nuôi trên tế bào C6/36

(dòng tế bào của ấu trùng muỗi Aedes albopictus).

Các thành phần khác cho kỹ thuật RT-LAMP: Bst DNA polymerase

and AMV reverse transcriptase, dNTP, Tris-HCl (ph 8.8), KCl, MgSO4, (NH4)2SO4, Tween 20, betaine

b phương pháp

Tách RNA: RNA của virus được tách từ 140l dịch nổi của bình nuôi virus VNNB (đối chứng dương), 140l đối chứng âm và 140l mẫu máu của bệnh nhân sử dụng QIAamp viral RNA mini kit (QIAGEN, Đức) với quy trình theo bộ kit RNA được tách ra khỏi cột QIAspin có thể tích cuối cùng 100l bao gồm cả dung dịch rửa và được trữ ở -700C cho đến khi sử dụng

Thực hiện phản ứng LAMP: Tất cả thành phần phản ứng của RT-LAMP có tổng thể tích phản ứng 25l sử dụng Loopamp RNA amplification kit (Eiken Chemical Co Ltd., Tokyo, Nhật Bản) với thành phần phản ứng bao gồm: