Phân lập, định danh và xác định đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase

Các chuỗi cellulose gần nhau được liên kết với nhau tạo thành các tấm cellulose qua liên kết hydrogen và liên kết Vander Waal tạo thành cấu trúc tinh thể, phân tử dạng sợi, bền vững [43]

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HOÀNG NGUYÊN

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC

ĐIỂM SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN

KỊ KHÍ, ƯA NHIỆT, SINH CELLULASE

CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH

MÃ NGÀNH: 60 42 30 HDKH: TS HOÀNG QUỐC KHÁNH

Anh Ngô Đức Duy, anh Nguyễn Duy Long, chị Đào Thị Thu Hiền cùng toàn bộ các anh chị phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn trực tiếp hoàn thành khóa luận

Thầy cô và các anh chị ở Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Thầy cô bộ môn sinh hóa, cùng toàn thể các thầy cô khoa Sinh học Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh cũng như các thầy cô trước đây đã tận tâm dạy dỗ và truyền đạt nhiều kiến thức quí báu trong suốt nhiều năm học qua

Các bạn lớp cao học khóa 18 đã quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ niềm vui nỗi buồn trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng con xin cảm ơn ba mẹ đã nuôi nấng, chăm sóc, luôn dạy con điều hay lẽ phải và cho con ăn học thành người có ích cho xã hội Em cũng xin cảm ơn các anh chị đã luôn quan tâm, chăm sóc, khích lệ em trong những lúc khó khăn nhất để em có thể vững bước trên đường đời

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

LỜI MỞ ĐẦU

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Cấu trúc và thành phần của sinh khối cellulose 1

1.1.1 Cấu trúc của cellulose 1

1.1.2 Thành phần của sinh khối thực vật 2

1.2 Các chủng sinh vật sinh cellulase 3

1.2.1 Nấm mốc 3

1.2.2 Vi khuẩn sản xuất cellulase 5

1.3 Đặc điểm vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt sinh cellulase .7

1.3.1 Đặc điểm chung .7

1.3.1.1 Cơ chất ưu tiên 7

1.3.1.2 Sự hình thành phức hợp cellulose-enzyme-microbe 7

1.3.1.3 Sự hấp thu và biến dưỡng sản phẩm thủy phân cellulose 8

1.3.1.4 Sự biến dưỡng lên men và sản phẩm sau cùng 10

1.3.2 Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình 10

1.4 Hệ thống enzym cellulase .12

1.4.1 Thành phần của cellulase 12

1.4.2 Cơ chế thủy giải cellulose 13

1.4.3 Ứng dụng enzyme cellulase 14

1.4.4 Hệ thống cellulase không phức hợp 15

1.4.5 Cellulosome - Hệ thống cellulase phức hợp 16

1.4.5.1 Đặc điểm chung 16

1.4.5.3 Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào 20

1.4.5.4 Sự sắp xếp của cellulosome 22

1.4.5.5 Sự điều hòa nguồn carbon 24

1.5 Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase 25

1.6 Phương pháp định danh sinh học phân tử 26

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29

2.1 Vật liệu 29

2.1.1 Nguồn phân lập 29

2.1.2 Thiết bị dụng cụ 29

2.1.2.1 Thiết bị thông dụng 29

2.1.2.2 Thiết bị phân lập vi khuẩn kị khí 29

2.1.2.3 Môi trường 30

2.1.2.4 Hóa chất 31

2.1.2.5 Chủng vi khuẩn đối chứng 35

2.2 Phương pháp thực hiện 35

2.1.1 Phương pháp tạo môi trường kị khí 35

2.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí sinh cellulase 36

2.2.2 Đặc tính sinh lí hình thái vi khuẩn 37

2.2.2.1 Đặc điểm khuẩn lạc 37

2.2.2.2 Phương pháp nhuộm Gram 37

2.2.2.3 Phương pháp nhuộm bào tử 38

2.2.3 Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS 39

2.2.3.1 Khả năng sử dụng giấy lọc 41

2.2.3.2 Khả năng sử dụng rơm rạ 41

2.2.3.3 Xác định hàm lượng protein ngoại bào 42

2.2.3.4 Định lượng hoạt tính cellulase tổng số 43

2.2.3.5 Bán định lượng hoạt tính endoglucanase 44

2.2.3.6 Hoạt tính endoglucanase xác định In-situ trên gel polyacrylamide 45

2.2.3.6.2 Sự khác biệt giữa dung dịch protein A và protein B 47

2.2.3.6.3 Khả năng thủy phân CMC của các chủng 47

2.2.3.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase 48

2.2.3.8 Tối ưu hóa hoạt tính cellulase 48

2.2.3.8.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 48

2.2.3.8.2 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase 48

2.2.4 Định danh vi khuẩn 49

2.2.4.1 Định danh nhanh bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng cho vi khuẩn Clostridium 50

2.2.4.2 Phản ứng PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân loại loài 51

3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 52

3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase 52

3.2 Đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase 54 3.2.1 Đặc điểm khuẩn lạc 54

3.2.2 Nhuộm Gram 55

3.2.3 Nhuộm bào tử 56

3.3 Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS 57

3.3.1 Khả năng sử dụng giấy lọc 57

3.3.2 Khả năng sử dụng rơm rạ 58

3.3.3 Xác định hàm lượng protein ngoại bào 59

3.3.4 Xác định hoạt tính cellulase tổng số 60

3.3.5 Bán định lượng hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch CMC 62

3.3.6 Hoạt tính endoglucanase xác định In-situ trên gel polyacrylamide 64

3.3.6.1 Nồng độ protein tối ưu cho khả năng thủy phân CMC 64

3.3.6.2 Sự khác biệt giữa dung dịch protein B và protein A 65

3.3.6.3 Khả năng thủy phân CMC của 6 chủng khảo sát 68

3.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 73

3.5.2 Ảnh hưởnng pH lên hoạt tính cellulase 74

3.6 Định danh vi khuẩn 75

3.6.1 Định danh nhanh bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng cho vi khuẩn Clostridium 76

3.6.2 PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân loại 77

4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81

4.1 Kết luận 81

4.2 Kiến nghị 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

PHỤ LỤC 3

PHỤ LỤC 4

PHỤ LỤC 5

PHỤ LỤC 6

Biểu đồ 3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc 57

Biểu đồ 3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ 58

Biểu đồ 3.3. Nồng độ protein ngoại bào của các chủng 59

Biểu đồ 3.4. Hoạt tính cellulase tổng số của các chủng 61

Biểu đồ 3.5. Sự tương quan giữa lg(trọng lượng phân tử) protein thang chuẩn với Rf 67

Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase 72

Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính celluase 73

Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính celluase 85

Hình 1.1. Cấu trúc cellulose trong vách tế bào thực vật 3

Hình 1.2. Sự hấp thu carbohydrate và phosphoryl hóa bởi C.thermocellum 9

Hình 1.3.Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình 11

Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của hệ enzym cellulase của Trichoderma reesei 13

Hình 1.5. Cấu trúc cellulosome của C thermocellum 18

Hình 1.6. Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào 21

Hình 1.7. Cấu trúc của phức hợp Coh-XDoc loại II của loài C thermocellum 23

Hình 2.1. Quy trình thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi universal 52

Hình 3.1. Vòng phân giải cellulose của mẫu DR5 và DM7 53

Hình 3.2. Khuẩn lạc chủng DR5-1 54

Hình 3.3. Kết quả nhuộm Gram chủng TQ1-2 55

Hình 3.4. Kết quả nhuộm bào tử chủng DR5-1 56

Hình 3.5. Vòng phân CMC của dung dịch protein B và protein A của TQ1-2 62

Hình 3.6. Vạch phân giải CMC trên gel với lượng protein khác nhau của dung dịch Protein B chủng TQ1-2 64

Hình 3.7a. Kết quả điện di SDS-PAGE các chủng DM5-1, DM7-1, DR5-1 66

Hình 3.7b. Kết quả điện di SDS-PAGE các chủng DM8-1, DT2-1, TQ1-2 66

Hình 3.8a. Vạch phân giải CMC của dung dịch Protein B và protein A chủng DM5-1, DM7-1, DR5-1 69

Hình 3.8b. Vạch phân giải CMC của dung dịch ProteinB và protein A chủng DM8-1, DT2-1, TQ1-2 69

Hình 3.9.Sản phẩm PCR cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G-Clos-1205-A-21 76

Hình 3.10. Sản phẩm PCR cặp mồi universal 77

Hình 3.11. Cây phân loại loài của các chủng khảo sát 80

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh lý của một số vi khuẩn thủy giải cellulose 5

Bảng 1.2 Vi khuẩn sản xuất hệ thống cellulosome 17

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 54

Bảng 3.2 Nhuộm Gram và khảo sát các đặc điểm hình thái tế bào 55

Bảng 3.3 Hoạt tính cellulase tổng số của các chủng 61

Bảng 3.4 Hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch CMC 62

Bảng 3.5 Trọng lượng phân tử của các vạch protein trên SDS-PAGE 68

Bảng 3.6 Trọng lượng phân tử của các vạch protein phân giải CMC trên gel 70

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cấu trúc và thành phần của sinh khối cellulose

1.1.1 Cấu trúc của cellulose

Cellulose là polimer được cấu thành từ các đơn phân glucose được liên kết bởi β-1,4 glycoside, là vật liệu chủ yếu của vách tế bào thực vật và là nguồn carbohydrate phong phú nhất trong tự nhiên Mức độ polimer hóa thường từ 100 đến 20.000 Các chuỗi cellulose gần nhau được liên kết với nhau tạo thành các tấm cellulose qua liên kết hydrogen và liên kết Vander Waal tạo thành cấu trúc tinh thể, phân tử dạng sợi, bền vững [43]

Khoảng 30 phân tử cellulose riêng lẻ được sắp xếp thành đơn vị lớn hơn gọi

là sợi cơ bản, sau đó được bó thành sợi lớn hơn gọi là vi sợi và được cấu trúc thành những sợi cellulose Sợi cellulose bền vững bởi các liên kết nội phân tử cũng như liên kết hydrogen nội phân tử Sự xắp xếp các chuỗi riêng lẻ bên trong những sợi

cơ bản đã được tìm hiểu từ sự phân tích tán xạ tia X [23]

Cấu trúc cellulose tinh thể bao gồm những cấu trúc cố định trong những vị trí riêng biệt có quan hệ chặt chẽ với những vị trí khác Chúng có khả năng ngăn ngừa sự xâm nhập không chỉ enzym mà thậm chí những phân tử nhỏ như nước Bên cạnh cellulose cấu trúc tinh thể, những sai sót trong cấu trúc tinh thể đã dẫn đến hình thành một nhóm sợi cellulose có cấu trúc vô định hình Sợi cellulose còn

có những cấu trúc bất quy tắc khác như: những chỗ xoắn trong vi sợi, những lỗ trống trên bề mặt, những lỗ, hốc nhỏ và một số mạch nhỏ Tổng diện tích tiếp xúc của sợi cellulose lớn hơn bề mặt tinh thể trong cấu trúc cùng kích thước Sự không đồng nhất trong cấu trúc làm cho sợi bị hydrate bởi nước khi nhúng vào môi trường lỏng và cho phép sự xâm nhập bởi các phân tử lớn bao gồm các enzym thủy phân cellulose [23]

Phân tử cellulose rất bền vững, với thời gian bán rã là 5-8 triệu năm cho sự phân cắt liên kết β-1,4 glycoside tại 25oC Trong khi, quá trình phân hủy sinh học thường nhanh hơn và cung cấp dòng carbon cho khí quyển [43]

1.1.2 Thành phần của sinh khối thực vật

Sinh khối thực vật chiếm giữ khoảng một nửa nguồn carbon trong sinh quyển Người ta ước tính rằng lượng carbon được thực vật đồng hóa hàng năm khoảng 200 tỷ tấn [29] Khoảng 70% sinh khối thực vật được cấu thành từ các đơn

vị đường chứa 5, 6 carbon [27] Phân tử cellulose kết hợp thành những sợi có cấu trúc tinh thể hình thành nên bộ khung cho vách tế bào thực vật Sợi cellulose được liên kết chéo với các polysaccharide khác gọi là hemicellulose để làm tăng độ bền cho vách tế bào Hemicellulose bao gồm xylan (đơn phân -D-xylose với liên kết -1,4-), glucomannan (đơn phân -D-mannose và -D-glucose với liên kết -1,4-), xyloglucan (đơn phân -D- glucose với liên kết 1,4-, và -D-xylose và -D-glucose với liên kết -1,6-), 1,3-1,4-glucan (đơn phân -D-glucose với liên kết -1,3- và -1,4-),

và số lượng nhỏ polysaccharide khác bao gồm -D-glucose, -D-xylose, -D-mannose

và đơn vị đường khác với các liên kết khác nhau Bộ khung cellulose và hemicellulose còn được liên kết với pectin (đơn phân -D-galacturonic acid với liên kết chủ yếu -1,4-), với chức năng là chất gắn trong vách tế bào [23]

Thành phần và cấu trúc của vách tế bào có sự khác biệt lớn giữa các loài thực vật, hàm lượng cellulose thông thường chiếm từ 35 đến 50% trọng lượng khô thực vật Trong một số trường hợp, sợi cellulose được gắn vào mạng lưới các sợi sinh học khác, chủ yếu là hemicellulose chiếm khoảng 20 đến 35% và lignin chiếm khoảng đến30% trọng lượng khô thực vật [23]

Lignin, hiện diện cùng với cellulose trong nhiều loài thực vật giúp làm cứng vách tế bào thực vật Các loại thực vật khác nhau thì có thành phần lignin khác nhau Tuy nhiên, sự hiện diện của lignin ngăn cản sự chuyển đổi các polysaccharide thành các đơn phân dưới tác động của enzym [6]

Hình 1.1 Cấu trúc cellulose trong vách tế bào thực vật [46]

Sự sử dụng sinh khối cellulose phức tạp hơn so với cellulose thuần khiết không chỉ bởi thành phần phức tạp của chúng mà còn bởi vì cấu trúc đa dạng của

tế bào thực vật Tế bào thực vật rất khác nhau về kích thước và tổ chức Một số loại tế bào thực vật có vách mỏng, ít bị lignin hóa thì dễ dàng bị thủy phân bởi các enzym thủy giải polysaccharide[23]

Sinh khối thực vật khó khăn trong việc thủy giải bởi vì: chúng liên kết với hemicellulose, được bao bọc bởi lignin và có cấu trúc tinh thể có khả năng hình thành sáu liên kết hydrogen: bốn liên kết nội phân tử và hai liên kết liên phân tử

Do đó, trước khi thủy giải với enzym, việc tiền xử lý là cần thiết để gia tăng diện tích bề mặt của cellulose bằng cách loại bỏ lớp lignin, hòa tan hemicellulose, phá

vỡ cấu trúc tinh thể và gia tăng cấu trúc lỗ trong tinh thể [11]

số lượng lớn cellulase ngoại bào trong dịch nuôi cấy, mặc dù thỉnh thoảng cũng có

sự hiện diện trên bề mặt tế bào Hầu hết các loài nấm đều có khả năng sử dụng cellulose như là nguồn cơ chất cho sự phát triển Nhiều loài nấm nguyên thủy, như

lớp nấm Chytridomycete kị khí, có khả năng thủy giải cellulose trong vùng ruột

của động vật nhai lại Khảnăng thủy giải cellulose cũng được tìm thấy ở nhiều loài nấm kị khí khác [23]

Với xấp xỉ 700 loài nấm Zygomycete, nhưng chỉ một vài loài thuộc giống

Mucor cho thấy có hoạt tính thủy giải cellulose Trái lại,ngành nấm Ascomycete, Basidiomycetevà Deuteromycete, mỗi ngành có hơn 15,000 loài, thủy giải mạnh cellulose Nhiều giống nấm thu hút nhiều sự nghiên cứu cho hoạt tính thủy giải

cellulose và gỗ như: Chaetomium và Helotium (Ascomycete); Coriolus, Phanerochaete, Poria, Schizophyllum và Serpula (Basidiomycete); và Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium

và Trichoderma (Deuteromycete) [23]

Nấm mốc thuộc giống Trichoderma và Aspergillus là hai loài sản xuất được

số lượng lớn cellulase và đã có nhiều sản phẩm thương mại dùng trong công

nghiệp Trichoderma sản xuất ra lượng lớn endo-ß-glucanase và exo-ß-glucanase nhưng với mức độ thấp ß-glucosidase, trong khi đó giống Aspergillus sản xuất số lượng lớn endo-ß-glucanase và ß-glucosidase nhưng với số lượng thấp exo-ß-

glucanase [27]

Phức hợp cellulase của Trichoderma reesei có thể chuyển đổi hoàn toàn

cellulose tự nhiên cũng như các dẫn xuất của cellulose thành glucose Sự phát triển của các loại nấm cũng như sự sản xuất của các loại enzyme cellulase phụ thuộc nhiều vào thành phần môi trường, nước, pH, nhiệt độ và ánh sáng, và không khí môi trường xung quanh [34]

Chủng Aspergillus fumigatus cho thấy khả năng sử dụng cellulose tinh thể

như là nguồn carbon duy nhất Chúng tạo ra nhiều loại cellulase ngoại bào, trong

đó có 6 vạch có hoạt tính endoglucanase khi điện di trên gel polyacrylamide Hoạt tính CMCase tối ưu tại 65°C và pH 2, cho thấy đây là loài vi sinh vật sản xuất endoglucanase ưa nhiệt và acid [13]

1.2.2 Vi khuẩn sản xuất cellulase

Trong số các loài vi khuẩn, khả năng thủy giải cellulose được tìm thấy ở hai

bộ: Actinomycetales hiếu khí và Clostridiales kị khí Dựa vào các đặc điểm sinh lí,

vi khuẩn thủy giải cellulose có thể thấy bao gồm những nhóm sinh lí sau [23]:

o Vi khuẩn kị khí, gram dương (Clostridium, Ruminococcus, và Caldicellulosiruptor)

o Vi khuẩn gram dương hiếu khí (Cellulomonas và Thermobifida)

o Vi khuẩn nhầy hiếu (Cytophaga, và Sporocytophaga)

Thông thường, chỉ một vài loài trong những giống trên có hoạt tính thủy giải cellulose Các vi khuẩn này khác nhau trong việc sử dụng oxy, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ muối và cellulose trong môi trường tự nhiên Việc phân loại các vi khuẩn

kị khí sử dụng cellulose là hết sức phức tạp bởi vì gần đây nhiều chủng vi khuẩn không có khả năng thủy giải cellulose nhưng lại có hệ thống gen cellulosome

không được biểu hiện do sự sai hỏng của trình tự promoter như loài Clostridium acetobutylicum [33]

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh lý của một số vi khuẩn thủy giải cellulose [23]

Streptomyces S reticuli + Que

sợi

Trung bình

Nội bào tử

Mặc dù, các vi khuẩn kị khí tùy ý phân bố rộng rãi, giống Cellulomonas là

giống vi khuẩn kị khí tùy ý duy nhất có hoạt tính phân hủy cellulase Các vi khuẩn

thủy giải cellulose hiếu khí trong đất thường được tìm thấy: Bacillus, Micromonospora và Thermobifida [23]

Gần đây, chủng Bacillus subtilis DR được phân lập từ suối nước nóng tạo ra

một vài loại cellulase bền nhiệt Nhiệt độ môi trường cao cho phép sản xuất ra loại endocellulase CelDR bền nhiệt với nhiệt độ tối ưu lên đến 50°C và hoạt tính này vẫn còn đến 70% tại 75°C sau khi ủ 30 phút Chủng vi khuẩn này cho thấy có

nhiều tiềm năng dùng trong công nghiệp lọc dầu bởi vì khả năng chịu được nhiệt

độ cao [27]

Chủng vi khuẩn ưa nhiệt thủy giải cellulose Brevibacillus sp JXL có khả

năng sử dụng nhiều loại cơ chất như cellulose tinh thể, CMC, xylan, cellobiose,

glucose và xylose Enzym của Brevibacillus sp JXL có khả năng bền nhiệt rất cao,

vẫn giữ được 50% sau khi xử lý tại 100°C trong một giờ

1.3 Đặc điểm vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt sinh cellulase

1.3.1 Đặc điểm chung

1.3.1.1 Cơ chất ưu tiên

Những loài vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose (Fibrobacter, Ruminococcus

và Clostridium) thường giới hạn trong phạm vi sử dụng carbohydrate, phát triển

trên cellulose và những sản phẩm thủy phân của chúng nhưng không phát triển trên đường đơn, đường đôi, đường đa được cấu thành bởi các đơn phân khác

glucose C thermocellum phát triển chậm trên môi trường glucose và cả C thermocellum và R albus dùng cellobiose ưu tiên hơn so với glucose Một vài loài

vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose có thể sử dụng xylan [23]

Một vài báo cáo gần đây cho thấy các vi khuẩn kị khí phân giải cellulose

(Anaerocellum thermophilum, C saccharolyticus và Halocella cellulolytica) có

phạm vi rộng trong việc sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau với các hợp chất tinh bột, đường đơn, đường đa Các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của những loài thủy giải cellulose bao gồm: nitrogen, phospho, lưu huỳnh, các khoáng

đa lượng, vi lượng và một số loại vitamin Một vài vi khuẩn thủy giải cellulose cần các yếu tố cho sự phát triển mạnh như pepton hay dịch chiết nấm men [23]

1.3.1.2 Sự hình thành phức hợp cellulose-enzyme-microbe (CEM)

Sự biến dưỡng cellulose bắt đầu từ sự thủy phân cellulose thành các loại đường đơn hoặc đôi và sau đó sử dụng các sản phẩm thủy giải này Có 2 cách thủy giải cellulose [23]:

o Vi khuẩn hiếu khí và nấm: enzyme cellulase thường không gắn hay gắn yếu vào cellulose, sản xuất cellulase ngoại bào và oxy hóa sản phẩm thủy phân thành CO2 và nước

o Vi khuẩn và nấm kị khí cho thấy khuynh hướng gắn enzyme cellulase vào cellulose, sản xuất ra phức hợp cellulase được tổ chức thành các cellulosome và tạo ra nhiều sản phẩm lên men khác nhau

Yêu cầu đầu tiên cho sự thủy giải cellulose là sự liên kết enzym vào

cellulose hình thành phức hợp enzyme-cơ chất hoặc hình thành phức hợp CEM

[23] Chủng đột biến C thermocellum và F succinogenes không có sự kết dính

này giảm khả năng thủy phân cellulose Do đó, sự gắn kết phức hợp CEM là một yêu cầu quan trọng cho sự sử dụng cellulose giữa các vi khuẩn kị khí, là tác nhân quan trọng cho thủy giải cellulose [23]

Phức hợp CEM có nhiều thuận lợi hơn trong hoạt tính thủy giải cellulose trong môi trường nuôi cấy: tập trung enzym trên bề mặt cellulose, cho phép vi sinh vật thủy giải cellulose tiếp xúc với các sản phẩm thủy phân, bảo vệ vi khuẩn dưới tác động của bacteriophage và các enzym thủy giải protease trong môi trường Nhìn chung, việc tạo các yếu tố liên kết cellulose có nhiều lợi ích trong việc tiết kiệm phí tổn năng lượng cho vi khuẩn [23]

1.3.1.3 Sự hấp thu và biến dưỡng sản phẩm thủy phân cellulose

Sự hấp thu glucose và cellodextrin được tìm thấy ở nhiều loài thủy giải

cellulose C thermocellum cho thấy sự hấp thu [14C]cellobiose và cellodextrin bởi

hệ thống phụ thuộc ATP trong khi đó glucose cũng được hấp thụ theo cơ chế riêng biệt và phụ thuộc ATP Sự sụt giảm vận chuyển cellobiose và cellodextrin nhanh chóng khi giảm nồng độ ATP nội bào

Hình 1.2 Sự hấp thu carbohydrate và phosphoryl hóa bởi C.thermocellum [35]

Chú thích: G-1-P, glucose-1-phosphate; G-6-P, glucose-6-phosphate; Pi, phosphate vô cơ; CBPase, cellobiose phosphorylase; CDPase, cellodextrin phosphorylase; HK, hexokinase; PGM, phosphoglucomutase

Chủng vi khuẩn thủy giải cellulose Streptomyces reticuli sản xuất protein ABC (ATP-binding cassette protein) có khả năng hỗ trợ vận chuyển cellobiose,

cellotriose và cellodextrin Trái lại, F succinogenes dùng nồng độ điện hóa cho sự hấp thu glucose và cellobiose Sự yêu cầu Na+ cho sựphát triển trên cellulose cho thấy rằng Na+ cũng là động lực cho sự hấp thụ cellodextrin [26]

Nồng độ cellodextrin và các cơ chất khác như cellulose hoặc cellobiose quyết định con đường biến dưỡng cellodextrin cũng như sự phân cắt thủy giải phosphoryl hóa hay sự thủy giải không phosphoryl hóa.Sự điều hòa dòng cơ chất thông qua hai con đường biến dưỡng có lẽ cung cấp một phương cách để điều chỉnh cung cấp ATP đáp ứng với các yếu tố môi trường Sinh khối tế bào gia tăng cùng với sự gia tăng chiều dài chuỗi cellodextrin, sản lượng tế bào trên cellulose cao hơn trên cellobiose [26]

1.3.1.4 Sự biến dưỡng lên men và sản phẩm sau cùng

Đối với Clostridium và R albus,ethanol và H2 là sản phẩm biến dưỡng cuối cùngvà acetyl coenzyme A (acetyl-CoA) có vai trò quan trọng tạo ra ethanol và

acetate [14] Sự sản xuất ethanol trong nuôi cấy mẻ của C thermocellum được gia

tăng khi cho thêm acetate và lactate và sụt giảm khi cho thêm ethanol [23] Chủng

Anaerocellum thermophilum là chủng duy nhất trong số vi khuẩn kị khí thủy giải

cellulose, tạo ra lactate là sản phẩm chính của sự lên men cellulose [38]

Sản phẩm cuối cùng được điều hòa ở vài mức độ: nồng độ các chất trung gian, sản phẩm lên men, chất mang electron, hoạt tính và sự tổng hợp enzym Chủng F succinogenes S85, R albus 7, và R flavefaciens FD-1 ít thay đổi sản

phẩm lên men khi thay đổi tỷ lệ phát triển, pH, nguồn carbohydrate trong tự nhiên

C cellulolyticum và C thermocellum có sự gia tăng tỉ lệ chuyển đổi ethanol thành

acetate và thay đổi tỷ lệ sản phẩm sau cùng khi có sự hiện diện của dịch chiết nấm men trong môi trường [23]

Hầu hết các vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose phát triển tối ưu khi tiếp xúc trực tiếp với cơ chất, một vài loài sự tiếp xúc này là bắt buộc Giống như các vi khuẩn kị khí khác, vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose thường có sinh khối thấp, phần lớn cơ chất được chuyển thành các sản phẩm lên men khác nhau: ethanol, acid hữu cơ, CO2 và H2 [23]

1.3.2 Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình

Clostridium thermocellum: là vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, thủy giải

cellulose và có khả năng sinh ethanol, chuyển đổi trực tiếp cơ chất cellulose thành ethanol Chúng phân hủy vật liệu cellulose thông qua một phức hợp cellulase lớn gọi là cellulosome Đây là một phức hợp protein rất phức tạp bao gồm khoảng 20 loại enzym có hoạt tính xúc tác khác nhau có trọng lượng từ 40-180 KDa

Cellulosome của C thermocellum được nghiên cứu nhiều và được dùng như là

kiểu mẫu trong nghiên cứu cellulosome ở các loài khác Enzym thủy giải cellulose

trong môi trường nuôi cấy C thermocellumđược phân bố trong cả dịch lỏng và trên bề mặt tế bào [23]

C thermocellum Anaerocellum thermophilum C saccharolyticus

Hình 1.3 Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình

C thermocellum thủy phân cellulose tạo thành sản phẩm trung gian

cellobiose và cellodextrin, sau đó tiếp tục được biến dưỡng và tạo thành sản phẩm cuối cùng là ethanol, acetic acid, lactic acid, hydrogen và carbon dioxide [23]

C thermocellum được quan tâm nghiên cứu nhiều bởi vì: chúng có thể sử

dụng chất thải thực vật và tạo ra ethanol, gián tiếp thủy giải vật liệu chứa lignin như các loại gỗ cứng thay thế cách tiền xử lý bởi acid, giảm chi phí cung cấp oxy, giảm tạp nhiễm và chi phí làm mát trong quá trình lên men, dễ dàng hơn trong quá trình thu nhận ethanol, vi sinh vật ưa nhiệt có sức sống mạnh và hệ enzym bền vững, sinh khối tế bào thấp nên cơ chất chuyển thành ethanol sẽ nhiều hơn [11]

Anaerocellum thermophilum: là vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, phát triển tối

ưu tại 75°C, không tạo bào tử, Gram dương được phân lập ở suối nước nóng Kamchatka, Russia Chúng phát triển nhanh chóng tại 75°C

Anaerocellum thermophilum dùng nhiều loại polysaccharide, bao gồm

cellulose tinh thể, hemicellulose, pectin, tinh bột và sinh khối thực vật chưa được tiền xử lý.Chúng tạo sản phẩm cuối cùng chủ yếu như lactate, acetate, CO2 và H2

Anaerocellum thermophilum có trình tự bộ gen dài 2.97 Mb, bao gồm một

chromosome và hai plasmid (8.3và 3.6 Kb) Bộ gen mã hóa nhiều loại enzym thủy giải cellulose, vận chuyển, biến dưỡng đường đơn và có cấu trúc giống như loài ưa

nhiệt kị khí khác Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 [21]

Caldicellulosiruptor saccharolyticus: là vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, Gram

dương lên men sinh khối thực vật chứa cellulose, hemicellulose và pectin tạo thành acetate, CO2 và hydrogen Chúng sử dụng nhiều loại cơ chất, khả năng tạo

hydrogen cao và xử dụng được cả đường glucose và xylose Bộ gen của C saccharolyticus có kích thước 2,970,275 bp mã hóa cho khoảng 2,679 protein

Phân tích trình tự gen của C saccharolyticus cho thấy chúng có nhiều gen

mã hóa cho enzym thủy giải polysaccharide, cellulose, hemicellulose, pectin, và tinh bột, nhiều protein vận chuyển ABC cho hấp thụ đường đơn, đôi và các cellodextrin Chúng có khả năng biến dưỡng nhiều loại đường rhamnose, fucose, arabinose, glucuronate, fructose và galactose Khả năng sử dụng nhiều loại sinh khối thực vật lên men đồng thời nhiều loại carbohydrate là những đặc điểm tiềm năng cho sử dụng sinh khối thực vật cho sản xuất nhiên liệu sinh học [41]

1.4 Hệ thống enzym cellulase

1.4.1 Thành phần của cellulase

Phân tích sinh hóa của hệ thống cellulase từ vi khuẩn kị khí, hiếu khí và từ nấm đã cho những kiến thức tổng quan về hệ thống enzym này Hệ thống cellulase được phân loại dựa trên phương thức thủy phân và đặc điểm cấu trúc của chúng

Ba loại hoạt tính enzym cellulase cơ bản [19], [23], [22]:

o Endoglucanase hoặc 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4), phân cắt tại vị trí vô định hình bên trong phân tử cellulose tạo ra các chuỗi oligosaccharide

o Exoglucanase, bao gồm 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (cellodextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91) Exoglucanase phân cắt từ đầu khử hoặc không khử của chuỗi cellulose tạo ra sản phẩm chính glucose hay cellobiose Exoglucanase hoạt động chủ yếu trên vùng cellulose tinh thể

o β-glucosidase hoặc β-glucoside glucohydrolase (EC3.2.1.21) Thủy phân cellodextrin hòa tan và cellobiose thành glucose

Cellulase là một cấu trúc nhiều đơn vị bao gồm vị trí liên kết và thủy phân carbonhydrate (CBD) CBD là tiểu phần có trong cấu trúc của cellulases và được phân chia thành 54 họ khác nhau Chức năng chủ yếu của CBD gắn kết vùng xúc tác vào cellulose tinh thể Sự gắn kết đưa vùng xúc tác lại gần vùng cellulose tinh

thể cho sự thủy giải hiệu quả Sự gắn kết cellulase thông qua CBD bền vững, cũng cho thấy khả năng xúc tác cắt đứt các tương tác không cộng hóa trị giữa các chuỗi cellulose của vùng cellulose tinh thể [23] Một vài CBD khác ưu tiên gắn kết với vùng cellulose vô định hình [19] Mô hình thủy phân cellulose được đề nghị lần đầu bởi Reese và các cộng sự, các CBD có vai trò làm “tróc” những đoạn cellulose

từ bề mặt, gia tăng sự thủy giải cellulose [23]

Hệ thống cellulase hoạt động phối hợp để nâng cao hiệu quả thủy phân cellulose Vi sinh vật đã thích ứng theo nhiều cách khác nhau để gia tăng hiệu quả thủy phân cellulose cũng như hemicellulose và lignin trong tự nhiên [23]

Cellulase từ những nguồn khác nhau có những đặc điểm khác nhau về pH tối ưu, độ hòa tan và thành phần amino acid Khả năng chịu nhiệt cũng như cơ chất tối ưu cũng thay đổi theo nguồn thu nhận pH tối ưu thường khoảng 4 - 5 và nhiệt

độ là 40-50°C [30]

1.4.2 Cơ chế thủy giải cellulose

Cơ chế thủy giải cellulose được chấp nhận hiện nay do hoạt động phối hợp của endoglucanase, exoglucanase (cellobiohydrolase) và β-glucosidase Endoglucanase thủy giải liên kết β-1,4-glucosidic bên trong phân tử, exoglucanase tiếp tục phân cắt chuỗi cellulose tại hai đầu cuối tạo ra cellobiose hoặc glucose và β-glucosidase thủy giải cellobiose thành glucose [43]

Trong quá trình thủy giải cellulose, cơ chất có sự thay đổi: sự thay đổi số lượng đầu khử tạo ra bởi endoglucanase và các chuỗi này được exoglucanase sử dụng, sự thay đổi trong khả năng xâm nhập vào phân tử cellulose của enzym từ

sự thủy phân cơ chất [43] Hoạt động phối hợp của endoglucanase và exoglucanase làm thay đổi bề mặt cellulose qua thời gian làm cho thay đổi tỷ lệ thủy phân [23]

Endoglucanase hoạt động trên vùng cellulose vô định hình và hoạt tính của chúng có thể được thử nghiệm bằng cơ chất cellulose hòa tan như carboxymethylcellulose Tuy nhiên, một vài cellulases cho thấy cả hai hoạt tính endo- và exo- Chúng có sự phối hợp rất cao giữa hai hoạt tính endo- và exo- cần thiết cho sự thủy phân cellulose hiệu quả [23]

1.4.3 Ứng dụng enzyme cellulase

Công nghiệp dệt nhuộm: cellulase là một trong ba nhóm enzym được

ứng dụng nhiều nhất trong công nghiệp dệt Chúng giúp cho vải bông mềm và sáng màu hơn thay thế cho đá bột được dùng truyền thống, giúp vết cắt hoàn hảo hơn, giúp điều chỉnh độ đậm nhạt cho vải sợi [3], [4]

Công nghiệp tẩy rửa: cellulase, đặc biệt là EGIII và CBHI, thông

thường được dùng làm sạch vải sợi Những cellulase thu nhận từ những chủng nấm

mốc: T.reesei, T viride, T.Harzianum, H.Insolens… hoạt động trong môi trường

kiềm nhẹ thường được ứng dụng trong công nghiệp tẩy rửa Chúng thường được dùng kết hợp với bột giặt và chất tẩy [3], [4]

Công nghiệp thực phẩm và thức ăn gia súc: trong công nghiệp thực

phẩm cellulase được dùng trong dịch chiết làm trong nước ép trái cây, dùng trong dịch chiết dầu oliu Glucanase được thêm vào để cải thiện dịch mạch nha trong sản xuất bia rượu Cellulase cũng được dùng trong dịch chiết carotenoid cho sản xuất chất màu thực phẩm Sự điều chế phối hợp hoạt động cellulase, hemicellulase và pectinase cải thiện chất lượng dinh dưỡng thức ăn cỏ cho vật nuôi [3], [4]

Công nghiệp sản xuất giấy: cellulase và hemicellulase đã được sử dụng

chuyển đổi bột gỗ thô thành bột gỗ mịn, loại màu bột gỗ tái sử dụng và cải thiện hệ

thống thoát nước trong các nhà máy bột gỗ Chúng cũng được dùng sản xuất bột giấy mềm làm nguyên liệu cho sản xuất khăn giấy và giấy vệ sinh [3], [4]

Sản xuất nhiên liệu sinh học: có lẽ ứng dụng quan trọng nhất của

cellulase hiện nay được dùng để sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối thực vật Cellulase có thể chuyển đổi sinh khối thực vật thành đường glucose và các đường khác mà chúng có khả năng được vi sinh vật sử dụng như là nguồn cơ chất sản xuất ethanol và protein đơn bào Hiện nay, sản xuất ethanol từ sinh khối thực vật trải qua quá trính gồm nhiều bước: tiền xử lý loại bỏ lignin, thủy giải cellulose thành các loại đường có khả năng lên men bằng cellulase ở nhiệt độ 500C và cuối cùng dùng vi sinh vật để sản xuất ethanol Tuy nhiên, quá trình này lại chưa hiệu quả về mặt kinh tế [3], [4], [37], [22]

có bốn vòng trên bề mặt tạo ra một ống với chiều dài 50Å, CBHII có hai vòng trên

bề mặt tạo ra một ống với chiều dài 20Å Cấu trúc ống cần thiết cho quá trình phân cắt cellulose từ đầu khử và không khử Tuy nhiên, hoạt tính cả hai loại cellobiohydrolase giảm khi mức độ polymer hóa của cellulose giảm Cellobiose, sản phẩm chính của hoạt tính thủy giải CBHI và CHBII, sẽ kìm hãm hoạt tính cellobiohydrolase và endoglucanase [23]

Cấu trúc EGI bao gồm nhiều vòng ngắn tạo ra một đường rãnh Các rãnh cho phép cellulose đi vào và thủy giải EGIII có cấu trúc tương tự EGI, đây là

chiếm vai trò không lớn trong quá trình thủy giải cellulose, chúng chiếm không tới 20% tổng số cellulase [40]

T reesei tạo ra ít nhất hai loại ß-glucosidase tham gia thủy giải cellobiose

và các oligosaccharidethành glucose Cả hai loại BGLI và BGLII thu nhận được trong dịch nuôi cấy và cũng được gắn lên vách tế bào ß-glucosidasetrên vách tế

bào làm giảm khả năng mất glucose vào môi trường khi thủy phân cellobiose T reesei sản xuất ß-glucosidase thấp hơn những loại nấm khác như Aspergillus Sp Hơn nữa, ß-glucosidase của T reesei bị kìm hãm mạnh bởi glucose so với Aspergillus Trong công nghiệp hiện nay, cellulase của T reesei được bổ sung với ß-glucosidase của Aspergillus làm tăng khả năng đường hóa của chúng [31]

Loài nấm trắng Phanerochaete chrysosporium được dùng cho nghiên cứu

phân hủy lignocellulose Chúng tạo ra nhiều phức hợp enzym phân hủy cellulose, hemicellulose,và lignin là thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật Sự phân hủy cellulose và hemicellulosethường được xảy ra trước, trong khi sự biến dưỡng lignin xảy ra sau khi có sự giới hạn nguồn carbon, nitrogen, hoặc sulfur [23]

1.4.5 Cellulosome - Hệ thống cellulase phức hợp

1.4.5.1 Đặc điểm chung

Những vi khuẩn kị khí thiếu khả năng xâm nhập vào bên trong vật liệu cellulose và do đó chúng phải tìm ra một cơ chế hữu hiệu cho sự phân hủy cellulose khi có sự hiện diện cạnh tranh của nhiều vi sinh vật khác và bị giới hạn bởi ATP cho sự tổng hợp cellulase Điều này đã dẫn đến sự phát triển của “Hệ thống cellulase phức hợp”, gọi là cellulosome, thường được tìm thấy ở các loài

Clostridia và Ruminococcus [23]

Các cellulosome kết hợp với nhau tạo thành các polycellulosome và được gắn lên vách tế bào có đường kính 60-200 nm Mỗi polycellulosome chứa đựng vài trăm cellulosome [7] Cellulosome là phức hợp ngoại bào lớn và tương đối bền vững, trọng lượng phân tử từ 2-16 MDa đối với cellulosome và có thể đạt đến trọng lượng 100 MDa đối với polycellulosome [12], [33]

Cellulosome được phát hiện lần đầu bởi Bayer và Lamed khi quan sát

thấy những khối u trên bề mặt tế bào C thermocellum và phức hợp này chứa

protein không có hoạt tính xúc tác có chức năng gắn liên kết các tiểu đơn

vị enzym Cellulosome không chỉ phân hủy cellulose tinh thể, mà c òn p hâ n

hủ y hemicellulose, chitin, thậm chí cả pectin [12]

Cellulosome có khả năng phối hợp hoạt tính các enzym trong không gian gần với vách tế bào vi khuẩn và có khả năng phối hợp hoạt tính giữa các cellulase hiện diện bên trong cellulosome Cellulosome thường chứa 6 đến 13% carbohydrate, có vai trò bảo vệ khỏi hoạt tính của protease và cũng có thể có vai trò quan trọng trong sự nhận diện các cohensin [23] Các sản phẩm thủy giải cellulose cũng được tế bào hấp thu tốt hơn do có sự tiếp xúc với vách tế bào [34] Cellulosome gắn kết rất linh hoạt với cellulose tinh thể [12]

Cellulosome được tìm thấy ở nhiều loài vi khuẩn: C cellulovoran, C cellulolyticum, C josui, C acetobutylicum, Acetovibrio cellulolyticus, Bacteroides cellulosolvens, R albus, R flavefaciens, Vibrio sp và nhóm nấm kị khí Neocallimastix, Piromyces và Orpinomyces [11], [23]

Thành phần quan trọng của cellulosome là protein scaffoldin không có hoạt tính xúc tác, có chức năng tập hợp các tiểu đơn vị cellulase Các tiểu đơn vị xúc tác chứa những vùng dockerin khác nhau có trách nhiệm gắn vào scaffoldin Mối quan hệ này được thể hiện v ù n g cohesin trên scaffoldin, gắn kết với vùng, dockerin trên enzyme và CBD trên scaffoldin liên kết phức hợp với cellulose [11]

Có ít nhất tám gen scaffoldin từ vi khuẩn thủy giải cellulose đã được giải trình tự

Chúng bao gồm cipA của C thermocellum, cbpA của C cellulovoran, cipC của C cellulolyticum, cipA của C josui, cipA của C acetobutylicum , scaB của R flavefacien, cipBc của B cellulosolven và cipV của A cellulolyticus Phức hợp cellulosome của C thermocellum tương tự như những loài vi khuẩn ưa nhiệt trung bình C cellulovoran và C cellulolyticum [11]

Bảng 1.2 Vi khuẩn sản xuất hệ thống cellulosome [12]

Clostridium acetobutylicum M Soil

M, mesophilic; T, thermophilic (trên 50°C)

Mặc dù, C acetobutylicum không thủy phân cellulose, p h â n t í c h trình tự

genome cho thấy có sự hiện diện của nhóm gen mã hóa cho cellulosome Nhóm gen này bao gồm gen mã hóa protein scaffolding CipA, endocellulase Cel48A, vài endoglucanase nhóm 5 và 9, mannanase Man5G và protein kị nước, OrfXp

Tổ chức gen này tương đồng với của C cellulolyticum [11], [6]

1.4.5.2 Cấu trúc cellulosome

Scaffolding protein (scaffoldin)

Cellulosome bao gồm protein scaffolding, kết hợp với nhiều loại enzym trong cellulosome Protein scaffolding, cũng được gọi là “scaffoldin”, đây là protein không có hoạt tính xúc tác gồm nhiều cohesin và vùng CBD, vùng ưa nước, vùng dockerin II, vùng có hoạt tính enzym và nhiều vùng chức năng chưa được xác định trên scaffoldin [6], [12]

Cohesin và Dockerin

Các cohesin hiện diện trong scaffoldin và có vị trí liên kết với vùng dockerin của enzym trên cellulosome Tương tác cohesin-dockerin đóng vai trò quan trọng trong sự xắp xếp của cellulosome Số lượng cohesin có trong scaffoldin khác nhau giữa các loài Có sự tương đồng trong trình tự amino acid giữa cohesin từ những loài khác nhau Tuy nhiên, các cohesin có sự

chuyên biệt trong tương tác với các dockerin, cohesin của C thermocellum không tương tác với dockerin của C cellulolyticum và ngược lại [6], [12]

Có hai loại cohesin: cohesin loại I gắn chuyên biệt với dockerin loại I trên tiểu đơn vị xúc tác, và cohesin loại II trên protein bề mặt tế bào gắn kết dockerin loại II của scaffoldin vào vách tế bào Tất cả enzyme thuộc cellulosome chứa vùng dockerin Nếu enzyme không chứa dockerin, chúng không phải là thành phần của cellulosome[11]

Ở loài C thermocellum, trình tự genome cho thấy có ít nhất 72 protein

chứa dockerin nhưng chỉ có chín cohesin trên phân tử scaffoldin Cohesin có độ tương đồng cao và năm trong số đó có sự tương đồng hơn 90% Cohesin của một chủng nhận biết gần như tất cả các dockerin của chủng đó [9] CelD là endoglucanase hoạt động nhất, scaffoldin gia tăng hoạt tính của CelD ít nhất 10 lần trên avicel nhưng không có hoạt tính khi CelD thiếu dockerin [11]

Calcium là kim loại chính của cellulosome, tương tác giữa dockerin và cohesin yêu cầu Ca2+ ở nhiều loài như C thermocellum và C cellulolyticum Do

đó, cellulosome có thể bị phân rã bởi nồng độ EDTA trung bình EDTA kìm hãm hoạt tính của cellulosome do chúng có khả năng gắn kết với Ca2+ [15]

Endoglucanase D có ba vị trí gắn Ca2+ và một vị trí gắn kết kẽm Ca2+ cũng gia tăng tính bền nhiệt cho exoglucanase CelS, enzyme nhiều nhất của

cellulosome Sự gấp cuộn của protein tạo thành dockerin phụ thuộc Ca2+, giải thích tại sao Ca2+ cần thiết cho tương tác cohesin-dockerin và khả năng bền vững của cellulosome [25]

Các thành phần của cellulosome bị phân rã khi xử lý với DTT Cellulosome bị phân rã dưới điều kiện không biến tính khi ủ tại nhiệt độ 60°C có sự diện của EDTA và cellulose tinh thể Trong quá trình phân tách, scaffoldin vẫn gắn vào cellulose nhưng các tiểu đơn vị bị phóng thích [11]

SDS-EDTA-Cellulosome cũng có thể bị phân rã mà không mất hoạt tính thủy giải cellulose tinh thể khi dùng đ ệ m 50 mM Na acetate (pH 5.0) chứa 10 mM DTT,

10 mM EDTA và 0.2% SDS tại 30°C trong 25 phút [9]

Cellulose-Binding Domain

Vùng liên kết carbohydrate (CBD) của scaffoldin liên kết chặt chẽ cellulosome với cơ chất cellulose CBD liên kết cellulosome với cellulose tinh thể hiệu quả hơn đối với cellulose vô định hình [12]

Sự tương tác CelS, CelD và endoglucanase trên scaffoldin với cơ chất cellulose thông qua cấu trúc CBD Các CBD khác nhau gắn trên những vị trí khác

nhau trên cellulose tinh thể S o s á n h g i ữ a CBD của CipA ở loài C thermocellum với hai loại ở T.reesei và một ở Cellulomonas fimi, CBD của CipA

có nhiều vị trí kết hợp với phân tử cellulose hơn [11]

CBD của CipA ở loài C thermocellum đã được tạo dòng, biểu hiện trong

E coli, và cấu trúc của chúng đã được xác định CBD cũng gắn kết với Ca2+ mà

chức năng chưa được biết đến Cấu trúc CBD của CipC ở loài C cellulolyticum

cũng đã được xác định Chúng bao gồm vị trí gắn kết bề mặt gắn kết cellulose và một rãnh cạn với chức năng chưa được biết đến [11]

1.4.5.3 Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào

Vùng HLD hay S-layer homology (SLH) của C cellulovoran có vai trò

quan trọng trong sự liên kết cellulosome với bề mặt của tế bào[31] Cellulosome gắn vào tế bào trong suốt pha lag, được phóng thích vào môi trường trong pha tăng trưởng, và tồn tại tự do trong môi trường hoặc gắn vào cellulose trong pha ổn

trên bề mặt tế bào Sự gấp cuộn protein của dockerin phụ thuộc Ca2+, sự xắp xếp cấu trúc cellulosome dễ dàng khi có sự hiện diện Ca2+ bên ngoài tế bào [12].

Hình 1.6 Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào thông qua tương tác

cohesion-dockerin loại II với protein chứa vùng SLH, SdbA, Orf2p và OlpB [11]

Đầu cuối gen cipA của gen loài C thermocellum là ba khung đọc mở

(ORF) mã hóa cho protein trên bề mặt tế bào Vùng SLH hiện diện trong polypeptide liên kết với bề mặt tế bào vi khuẩn và hình thành liên kết không cộng

hóa trị với peptidoglycan của vách tế bào Ba gen mã hóa được gọi là olpA, olpB,

và orf2p Gen thứ tư, sdbA, mã hóa cho protein trên bề mặt tế bào khác, là phần

khác hiện diện trong genome [11]

Protein OlpA đã được định vị trên bề mặt tế bào của C thermocellum Do

đó, có giả thuyết cho rằng vùng này chịu trách nhiệm gắn cellulosome vào bề mặt

tế bào OlpA có vùng cohesin loại I gắn kết với enzym cellulosome thông qua

dockerin loại I Gene olpB mã hóa OlpB, cũng định vị trên bề mặt tế bào [11]

Protein SdbA của C thermocellum có một vùng cohesin loại II gắn chuyên

biệt vào dockerin loại II của CipA SdbA được gắn thông qua vùng SLH của chúng