Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn nái mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản(PRRS), ứng dụng kĩ thuật RT PCR để chuẩn đoán

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI --- LÊ THỊ TOAN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN NÁI MẮC HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN PRRS, ỨNG DỤNG KỸ THUẬ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

LÊ THỊ TOAN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN NÁI MẮC HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN (PRRS), ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT –

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

LÊ THỊ TOAN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN NÁI MẮC HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN (PRRS), ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT –

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan công trình nghiên cứu này là của riêng cá nhân tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này mà tôi sử dụng chưa từng ñược công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Hà Nội, tháng 9 năm 2013

Tác giả luận văn

Lê Thị Toan

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện ñề tài, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự giúp ñỡ, hướng dẫn tận tình của các thầy giáo, cô giáo, các tập thể, cá nhân, bạn bè ñồng nghiệp trong và ngoài trường

Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất ñến cô giáo PGS TS Nguyễn Thị Lan, người ñã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi ñiều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học Tôi xin trân trọng cảm ơn:

- Các thầy cô giáo khoa thú y ñặc biệt các thầy cô Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y, ñã giúp tôi hoàn thành khóa học và nâng cao chất lượng luận văn

- Các cán bộ phòng thí nghiệm Trọng ñiểm công nghệ sinh học Thú y khoa Thú y , Phòng thí nghiệm bộ môn bệnh lý Thú y

- Lãnh ñạo và cán bộ Huyện uỷ Phúc Thọ nơi tôi công tác ñã tạo ñiều kiện ñể tôi yên tâm học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ñến những người thân, gia ñình ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng 9 năm 2013

Tác giả luận văn

Lê Thị Toan

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

PHẦN I MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục ñích ñề tài 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 2

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới và Việt Nam 3

2.1.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới 3

2.1.2 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam 5

2.2 Virus PRRS 6

2.2.1 Hình thái cấu trúc của virus PRRS 6

2.2.2 Phân loại virus PRRS 8

2.2.3 Sức ñề kháng của virus PRRS 9

2.3 Dịch tễ học của bệnh 9

2.3.1 ðộng vật cảm nhiễm 9

2.3.2 Phương thức truyền lây 9

2.3.3 Cơ chế sinh bệnh 10

2.4 Triệu chứng của lợn mắc PRRS 13

2.4.1 Lợn nái 13

2.4.2 Lợn ñực giống 13

2.4.3 Lợn con theo mẹ 14

2.4.4 Lợn con cai sữa và lợn choai 14

2.5 Bệnh tích của lợn mắc PRRS 14

2.5.1 Lợn nái mang thai 14

2.5.2 Lợn nái nuơi con, lợn choai và lợn vỗ béo 14

2.5.3 Lợn con theo mẹ 15

2.6 Các phương pháp chẩn đốn PRRS 15

2.6.1 Chẩn đốn lâm sàng 15

2.6.2 Chẩn đốn bằng phương pháp giải phẫu bệnh 15

2.6.3 Chẩn đốn bằng phương pháp huyết thanh học 15

2.6.4 Kỹ thuật RT- PCR 16

PHẦN III ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 ðối tượng, phạm vi địa điểm nghiên cứu 18

3.2 Nội dung nghiên cứu 18

3.3 Nguyên liệu 18

3.3.1 Mẫu bệnh phẩm 18

3.3.2 Hố chất 19

3.3.3 Dụng cụ 19

3.4 Phương pháp nghiên cứu 19

3.4.1 Phương pháp quan sát, thống kê sinh học 19

3.4.2 Phương pháp mổ khám 19

3.4.3 Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý kiểm tra bệnh tích vi thể 20

3.4.4 Phương pháp RT - PCR 22

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Khái quát về điều kiện tự nhiên kinh tế xã hội của huyện Phúc Thọ 26

4.2 Tình hình chăn nuơi lợn tại huyện Phúc Thọ 26

4.3 Tình hình dịch bệnh và sử dụng vacxin trên ñàn lợn tại huyện

Phúc Thọ 28

4.4 Tình hình dịch bệnh PRRS trên ñàn lợn nuôi tại huyện Phúc Thọ 29

4.4.1 Nguyên nhân dịch bệnh xẩy ra 29

4.4.2 Tổng hợp diễn biến của dịch bệnh PRRS của ñàn lợn 30

4.5 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn nghi mắc PRRS 31

4.6 Biến ñổi bệnh lý của lợn nghi mắc PRRS 35

4.6.1 Bệnh tích ñại thể của lợn nghi mắc PRRS 35

4.6.2 Bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn mắc PRRS 39

4.7 Kết quả phản ứng RT – PCR 45

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 ðề nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 4.1 Tình hình đàn lợn tính đến cuối tháng 4/2012 tại huyện Phúc Thọ

(Trước khi xảy ra hội chứng rối loạn hơ hấp và sinh sản) 27 Bảng 4.2 Kết quả tiêm phịng cho đàn lợn nuơi tại huyện Phúc Thọ năm 2012

(Trước khi xẩy ra dịch rối loạn hơ hấp và sinh sản ở lợn tháng 5/2012) 28 Bảng 4.3 Tổng hợp dịch PRRS trên đàn lợn nuơi tại huyện Phúc Thọ năm

2012 31 Bảng 4.4 Kết quả thu thập mẫu tại huyện Phúc Thọ 31 Bảng 4.5 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn nái nghi mắc PRRS 32 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu một số bệnh tích đại thể ở lợn nghi mắc

PRRS 35 Bảng 4.7 Bệnh tích vi thể chủ yếu ở phổi, hạch phổi của lợn nghi mắc PRRS 41 Bảng 4.8 Bệnh tích vi thể ở gan, lách, thận của lợn nghi mắc PRRS 42 Bảng 4.9 Bệnh tích vi thể ở ruột, hạch ruột, tử cung của lợn nghi mắc PRRS 43 Bảng 4.10 Kết quả chẩn đốn virus PRRS bằng kỹ thuật RT – PCR 45 Bảng 4.11 Kết quả chẩn đốn virus PRRS bằng kỹ thuật RT-PCR so

sánh với phương pháp IHC……….47

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Bản ñồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới 4

Hình 2.2 Hình thái Virus PRRS 7

Hình 2.3 Hình ảnh cấu trúc hệ gen của virus PRRS 7

Hình 2.4 ðại thực bào bình thường 13

Hình 2.5 ðại thực bào bệnh lý 13

Hình 2.6 Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR 17

Hình 4.1 Một số hình ảnh triệu chứng lâm sàng 34

Hình 4.2 Một số hình ảnh bệnh tích ñại thể 38

Hình 4.3 Một số hình ảnh bệnh tích vi thể của lợn mắc PRRS 44

Hình 4.4 Kết quả phản ứng RT – PCR 46

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CPE Cytopathogenic Effect (Bệnh tích tế bào)

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

FBS Fetal Bovine Serum

IPMA Immuno - Peroxidase Monolayer Assay

OIE Office Internationable des Epizooties (Tổ chức bảo vệ sức khỏe

ñộng vật thế giới) PBS Phosphate Buffer Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PRRS Porcine Reproductive and Repiratory Syndrome

PRRSV Porcine Reproductive and Repiratory Syndrome Virus

RNA Ribonucleic Acid

RT - PCR Reverse Transcriptase - Polymerace Chain Reaction

VNT Virus Neutralization Test: phản ứng trung hòa virus

PHẦN I

MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề

Trong thời gian vừa qua, ở nước ta chăn nuôi là một trong những ngành có những bước phát triển mạnh mẽ, nhằm phục vụ cho nhu cầu của nhân dân trong nước cũng như xuất khẩu, góp một phần rất lớn vào việc cải thiện ñời sống nhân dân Ngoài ra nó còn là một ngành ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế, xoá ñói giảm nghèo và làm giàu cho người dân

Tuy nhiên trên bước ñường phát triển ñó ngành chăn nuôi ñã gặp phải không ít khó khăn, trong thời gian gần ñây bệnh “Tai xanh” hay hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) ñã trở thành nỗi kinh hoàng ñối với người chăn nuôi Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, nguy hiểm ñối với lợn Bệnh có tốc ñộ lây lan nhanh, ñặc biệt là gây bệnh cho lợn ở mọi lứa tuổi Virus PRRS không chỉ gây bệnh mà nó còn làm suy giảm miễn dịch , từ ñó tạo ñiều kiện cho các mầm bệnh khác có cơ hội xâm nhập vào cơ thể và gây bệnh

Ở Việt Nam, sự bùng phát thành dịch và gây tổn thất to lớn cho ngành chăn nuôi lợn Dịch bệnh xảy ra ñầu tiên vào tháng 3/2007 tại Hải Dương (Cục Thú y, 2007), từ ñó ñến nay bệnh xảy ra liên tiếp trên cả ba miền Bắc, Trung, Nam với diễn biến rất phức tạp, gây thiệt hai nặng nề về kinh tế cho các hộ chăn nuôi, ngoài ra dịch bệnh còn tạo tâm lý hoang mang cho các hộ chăn nuôi cũng như người tiêu dùng trong nước

Năm 2012 hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn ñã xảy ra trên ñịa bàn huyện Phúc Thọ, thành phố Hà Nội, do người chăn nuôi chưa hiểu hết

về tính chất nguy hiểm của dịch nên còn chủ quan trong công tác phòng

chống, khơng khai báo kịp thời khi lợn bị bệnh, cán bộ làm cơng tác thú y ở

cơ sở khơng chẩn đốn ra bệnh Dịch bệnh xảy ra gây ảnh hưởng lớn tới đời sống và tâm lý cho các hộ chăn nuơi nĩi riêng và địa phương nĩi chung Bên cạnh đĩ, virus cịn tồn tại trong những đàn, những cá thể đã cảm nhiễm bệnh nhưng khơng cĩ biểu hiện triệu chứng của bệnh gây khĩ khăn cho cơng tác thanh tốn bệnh trên thực tế ở địa phương

Vì vậy việc xác định rõ triệu chứng lâm sàng , biến đổi bệnh lý đại thể , vi thể, chẩn đốn chính xác sự cĩ mặt của virus PRRS ở lợn đặc biệt là lợn nái cĩ một ý nghĩa rất quan trọng trong việc hạn chế và tiến tới thanh tốn hết bệnh PRRS Cĩ rất nhiều phương pháp chẩn đốn PRRS đã được các nhà khoa học tìm ra: Phương pháp ELISA, RT – PCR, phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp – IFA, Phương pháp chẩn đốn bằng phản ứng RT –PCR là một phương pháp mới đang được áp dụng hứa hẹn sẽ mang lại hiệu quả tích cực trong chẩn đốn PRRS

Xuất phát từ thực tế trên chúng tơi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn nái mắc hội chứng rối loạn hơ hấp và sinh sản (PRRS), ứng dụng kỹ thuật RT – PCR để chẩn đốn”

1.2 Mục đích đề tài

- Xác định các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn nái mắc PRRS

- Xác định một số biến đổi bệnh lý đại thể, vi thể chủ yếu của lợn nái mắc PRRS

- Xác định chính xác sự cĩ mặt của virus PRRS ở các lợn nái mắc bệnh

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Cung cấp các thơng tin nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc chẩn đốn, phịng và chống dịch bệnh để giúp các nhà quản lý, hộ chăn nuơi đưa ra biện pháp phịng chống dịch bệnh kịp thời, hiệu quả

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới và Việt Nam

2.1.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn ñược ghi nhận lần ñầu tiên trong các báo cáo về các thiệt hại của ngành công nghiệp chăn nuôi tại Mỹ Tại các ổ dịch biểu hiện các triệu chứng lâm sàng của PRRS ñã ñược báo cáo

ở Mỹ vào cuối những năm 80 của thế kỷ trước (1987) người ta thấy số lượng lợn chết trong ñiều kiện bình thường tăng lên và lợn chậm lớn Các triệu chứng lâm sàng bao gồm rối loạn sinh sản nghiêm trọng, viêm phổi ở lợn con sau cai sữa, chậm lớn, giảm năng suất và tỷ lệ tử vong tăng (Neumann và cs, 2005) Khi ñó ñã có nhiều giả thuyết ñược ñặt ra, người ta cũng bắt ñầu kiểm tra

sự bất thường ở ñường sinh sản của lợn giống nhưng vào thời ñiểm ñó vẫn chưa thể biết ñược mối liên hệ của nguyên nhân gây ra tình trạng nêu trên., bệnh vẫn còn là một bí ẩn Hàng năm ước tính tiêu phí ngành công nghiệp chăn nuôi lợn ở

Mỹ là 560 triệu USD cho bệnh tai xanh theo Neumann và cs (2005)

Rất nhanh chóng, năm 1988 bệnh tai xanh ñã lan sang nước láng giềng Canada và tiếp tục hoành hành trong khi ñó bí ẩn về căn bệnh vẫn chưa ñược giải mã

Hai năm sau các ổ dịch có các triệu chứng lâm sàng tương tự ñã ñược báo cáo ở CHLB ðức (1990) Một năm sau (1991) kể từ khi có báo cáo ñầu tiên về bệnh, virus ñã ñược tìm thấy tại Hà Lan Các tác giả người Hà Lan ñã xác ñịnh ñược ñặc tính của virus sau khi thực nghiệm thành công các chỉ tiêu của ñịnh ñề Koch và virus ñược ñặt tên là virus Lelystad, là tên Viện Thú y ñã phát hiện ra virus (Terpstra và cs, 1991) Sau ñó không lâu, virus PRRS ñược Mỹ ñặt tên là ATCC VR – 2332) (Collin và cs, 1992) ðứng trước những thiệt hại cũng như

diễn biến phức tạp của bệnh, năm 1992, tại hội nghị quốc tế về bệnh tổ chức ở St.Paul, Minnesota, tổ chức Thú y thế giới (OIE) ñã chính thức ñặt tên cho bệnh này là Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) (Nodelijk, 1996); (Weiland, 1999)

Tính từ năm 2005 trở lại ñây, 25 nước vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục (trừ châu Úc và New Zealand) trên Thế giới ñã báo cáo phát hiện có PRRS lưu hành Con số thực tế sẽ còn khác rất nhiều Trong số các nước nêu trên có cả các nước có ngành chăn nuôi phát triển mạnh như Mỹ, Hà Lan, ðan Mạch, Anh, Pháp, ðức…

Hình 2.1 Bản ñồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới

Tại Trung Quốc, dịch bệnh PRRS ñã xuất hiện trong những năm gần ñây và hiện ñang còn tồn tại Theo Tian và cs (2007) virus PRRS gây ra ñại dịch lây lan ở hơn 10 tỉnh thành của Trung Quốc làm chết 2.000 000 con lợn, trong

ñó có hơn 400.000 sảy thai, ñẻ non Tính từ ñầu năm ñến tháng 7/2007, dịch bệnh ñã xảy ra ở trên 25 tỉnh, với trên 180.000 lợn mắc bệnh và 45.000 con chết Qua một số nghiên cứu với qui mô lớn, người ta ñã xác ñịnh virus gây bệnh PRRS tại Trung Quốc thuộc chủng Bắc Mỹ thể cường ñộc gây ra

Tại Thái Lan, một nghiên cứu quy mô rộng lớn từ năm 2000 – 2003 cho thấy các virus PRRS ñược phân lập từ nhiều ñịa phương gồm cả chủng Châu Âu và chủng Bắc Mỹ, trong ñó virus thuộc chủng Bắc Mỹ chiếm 33,58% Dịch bệnh PRRS lần ñầu tiên xuất hiện ở nước này vào năm 1989 và

tỷ lệ lưu hành huyết thanh của bệnh cũng thay ñổi khác nhau, từ 8,7% vào năm 1991 và trên 76% vào năm 2002 Nguồn gốc PRRS tại Thái Lan là do việc sử dụng tinh lợn nhập nội ñã bị nhiễm virus PRRS hoặc là do các ñàn nhập nội mang trùng

2.1.2 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam

Lần ñầu tiên trong lịch sử xuất hiện PRRS ở Việt Nam vào năm 1997, PRRS ñược phát hiện trên ñàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam Kết quả kiểm tra thấy 10/51 lợn giống nhập khẩu có huyết thanh dương tính với PRRS theo Cục Thú y (2007) Toàn bộ số lợn này ñã ñược xử lý vào thời gian ñó Tuy nhiên, trong những năm tiếp theo, các nghiên cứu về bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29% theo Bộ NN và PTNT(2007)

Như vậy có thể thấy virus PRRS ñã xuất hiện và lưu hành tại nước ta trong một thời gian dài Tuy nhiên, kể từ khi xác ñịnh ñược lợn có kháng thể kháng virus PRRS ở ñàn lợn giống nhập từ Mỹ, tại Việt nam chưa từng có vụ dịch PRRS nào xảy ra

Dấu ấn quan trọng của dịch PRRS tại Việt Nam ñược bắt ñầu từ ngày 12/3/2007 khi hàng loạt ñàn lợn tại Hải Dương có những biểu hiện ốm khác thường sau ñó lây lan ra các tỉnh ñồng bằng Bắc Bộ , tiếp ñó dịch xuất hiện ở các tỉnh miền Trung và Nam Bộ gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi lợn (Tô Long Thành và cs, 2008)

ðầu năm 2008 dịch tái xuất hiện ở nhiều xã thuộc tỉnh Hà Tĩnh và chỉ

1 tháng sau (tháng 4/2008) dịch ñã bùng phát ở 775 xã, phường thuộc 57

huyện thị của 10 tỉnh: Hà Tĩnh, Thanh Hoá, Quảng Nam, Nghệ An, Lâm ðồng, Thừa Thiên Huế, Thái Bình, Thái Nguyên, Ninh Bình và Nam ðịnh với tổng số lợn mắc bệnh khoảng 255.250 con, số chết và phải tiêu huỷ là 254.242 con ðây là ñợt dịch lớn nhất từ trước ñến nay

Cho ñến tháng 7 năm 2008 tổng số lợn mắc bệnh là 16.677 con, số chết

và buộc phải tiêu huỷ là 14.799 con Tình hình cho thấy virus gây bệnh ñã phân tán rộng và có khả năng bùng phát thành dịch lớn trên cả nước nếu không có biện pháp can thiệp kịp thời Ngày 18/2/2009 dịch PRRS trên lợn ñã xuất hiện lại tại tỉnh Quảng Ninh, dịch bùng phát tại huyện Yên Hưng , Quảng Ninh với tổng số 76 con ốm, trong ñó có 23 lợn nái và 53 lợn thịt Ngày 28/2/2009 ñã xuất hiện tại Duy Xuyên, Quảng Nam, cho ñến nay tình hình diễn biến của bệnh vẫn ñang vô cùng phức tạp chưa thể thống kê ñầy ñủ các thiệt hại do bệnh gây ra

Sau một thời gian dài khống chế thành công, ñến tháng 3/ 2010 dịch bệnh PRRS tái xuất hiện ở Hải Dương sau một thời gian lắng xuống rồi rất nhanh chóng phát tán cả 3 miền Bắc, Trung, Nam Theo Cục thú y tính ñến 05/10/2010 cả nước trên 621.000 lợn mắc dịch, chết và tiêu hủy trên 336.000con Tình hình dịch PRRS vẫn ñang diễn biến phức tạp và không có chiều hướng giảm xuống (nguồn phòng dịch tễ Cục thú y)

2.2 Virus PRRS

2.2.1 Hình thái cấu trúc của virus PRRS

Virus PRRS là một virus ARN chuỗi ñơn dương, virus ñược xếp vào giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales

Quan sát virus PRRS dưới kính hiển vi ñiện tử thấy virus có dạng hình cầu, có vỏ bọc, trên bề mặt có nhiều gai nhô ra, kích thước 45 – 80 nm và chứa nhân nucleocapxit kích thước 25 – 35 nm

Hình 2.2 Hình thái Virus PRRS

Sự nhân lên của virus không bị ảnh hưởng khi dùng hợp chất ức chế tổng hợp ADN là 5 – bromo – 2 – deoxyuridin, 5 – iodo-2- deoxyuridin và mitomicin C chứng tỏ acid nucleic ñó là ARN Sợi ARN này có khối lượng khoảng 15.1 kb

Hình 2.3 Hình ảnh cấu trúc hệ gen của virus PRRS

Virus PRRS có các loại Protein cấu trúc bao gồm:

- Nucleocapsid protein (N, ORF7) (ORF: open reading frame) khoảng 14 – 15 kDa, ñây là protein vỏ bọc nhân

- Membrane protein (M, ORF6) khoảng 18 – 19 kDa là protein liên kết

2.2.2 Phân loại virus PRRS

Về tính ña dạng di truyền, virus PRRS có hai chủng chính: chủng virus

có nguồn gốc ở Châu Âu (virus Lelystad – LV) và chủng virus có nguồn gốc

ở Bắc Mỹ (VR- 2332) Ngoài sự khác biệt giữa các lần phân lập người ta ñã chứng minh ñược có sự biến dị di truyền mạnh trong cả hai typ phân lập Theo Murtaugh và cs (1995), Nelsen và cs (1999), Meng và cs (1995) các chủng virus này gây bệnh trên ñộng vật cảm thụ với bệnh cảnh giống nhau nhưng chúng lại ñại diện cho 2 genotyp khác biệt

Những nghiên cứu gần ñây cho thấy có sự khác biệt về tính di truyền trong các virus ñược phân lập từ các vùng ñịa lý khác nhau Bản thân các virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay ñổi về chuỗi nucelotid khá cao ñến 20% Chủng Bắc Mỹ có 3 subtyp: VR- 2332, Taiwan và 807/94 phân lập

ở Canada Chủng Châu Âu có 2 subtyp: I 10 phân lập tại Hà Lan và Olot tại Tây Ban Nha Chính sự khác biệt và sự ña dạng về tính kháng nguyên, khả năng biến ñổi cấu trúc kháng nguyên của virus ñã làm tăng khó khăn cho việc sản xuất vacxin chống lại chúng

Người ta ñã phát hiện thấy chủng virus châu Âu tại một số vùng của Bắc Mỹ Ở châu Á, PRRSV ñã trở lên khá phổ biến với sự có mặt của cả 2

chủng châu Âu và Bắc Mỹ, sự phân bố virus theo các vùng ñịa lý chỉ là tương ñối Các virus PRRS phân lập ñược ở châu Âu có cùng loại kháng nguyên nhưng khác biệt với các chủng của Bắc Mỹ

2.3.2 Phương thức truyền lây

Virus có trong dịch mũi, nước bọt, phân, nước tiểu của lợn ốm, hoặc mang trùng và phát tán ra môi trường Tinh dịch của lợn ñực giống cũng ñược xác ñịnh là nguồn phát tán mầm bệnh, virus ở tinh dịch cũng có thể lây nhiễm sang bào thai Ở lợn mẹ mang trùng, virus có thể lây nhiễm qua bào thai từ

giai ñoạn giữa thai kỳ trở ñi và virus cũng ñược bài thải qua nước bọt và sữa Lợn trưởng thành có thể bài thải virus trong 14 ngày trong khi ñó lợn con và lợn choai bài thải virus tới 1 – 2 tháng

Virus có khả năng phân tán thông qua các hình thức: vận chuyển lợn mang trùng, phân tán theo gió (có thể ñi xa tới 3 km), qua bụi, bọt nước, dụng

cụ chăn nuôi và dụng cụ bảo hộ lao ñộng nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo và có thể do một số chim hoang dã

Sự truyền lây qua không khí là quan trọng trong việc phát tán virus PRRS

Sự lây lan bệnh từ ñàn lợn này sang ñàn lợn khác thường theo tinh dịch khi phối giống Ngoài ra còn các ñường như kim tiêm, nước uống, không khí, côn trùng, vật liệu nhiễm khuẩn, kí chủ không phải là lợn Ở Pháp 56% ñàn mắc bệnh do tiếp xúc với lợn bệnh, 20% do tinh dịch, 21% do vật dụng và 3%

từ những nguồn chưa xác ñịnh ñược

Ở các cơ sở có lưu hành bệnh, môi trường bị ô nhiễm, bệnh lây lan quanh năm nhưng tập trung vào thời kỳ có nhiều lợn nái phối giống và bệnh phát sinh thành dịch, với tỷ lệ cao, lợn nái có hội chứng rối loạn sinh sản trong khi lợn con bị viêm ñường hô hấp phổ biến

Sự vận chuyển lợn bệnh, sự lây lan cục bộ qua không khí ñược coi như

là phương tiện truyền lây phổ biến nhất

2.3.3 Cơ chế sinh bệnh

Virus có ñặc ñiểm rất thích hợp với ñại thực bào, ñặc biệt là ñại thực bào phế nang ðây là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus, vì thế virus hấp phụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này

và phá huỷ nó Virus nhân lên ngay bên trong ñại thực bào, sau ñó phá huỷ và giết chết ñại thực bào (tới 40%) ðại thực bào bị giết chết nên sức ñề kháng của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng Do vậy lợn bệnh thường dễ dàng

bị nhiễm khuẩn kế phát

Cĩ nhiều báo cáo về nhiễm trùng kế phát ở đàn lợn trong ổ dịch PRRS, đặc biệt ở chuồng nuơi lợn sơ sinh Tác nhân chủ yếu liên quan đến nhiễm trùng kế phát là: Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, Salmonella cholerasuis, Pasteurella multocida và Actinobacillus pneuropneumoniae, SIV, EMCV, virus giả dại (Aujeszky), Porcine cytomegalovirus, Porcine respiratory coronavirus và Porcine paramyxovirus

Các nhà nghiên cứu đã phân lập virus từ phổi, gan, lách và huyết thanh hoặc dịch cơ thể lợn con sinh ra cả sống và chết nhưng khơng phân lập được

từ thai chết khơ, họ cũng phát hiện kháng thể chống virus PRRS đặc hiệu trong dịch xoang ngực hoặc sữa đầu Dấu hiệu này chỉ ra rằng truyền bệnh qua nhau thai là phổ biến trong giai đoạn cuối kỳ chửa, nhưng cơ chế của giảm sinh sản cịn chưa được hiểu biết

Lợn nái cĩ virus trong huyết thanh sớm lúc 1 ngày sau khi tiêm truyền,

cĩ thể đốn là sau đĩ virus nhân lên ở đại thực bào phế nang Virus huyết kéo dài (lên tới 14 ngày) là điển hình ở lợn nái; vì vậy chúng cĩ đủ thời gian để tuần hồn máu, đưa virus tới nhau thai Virus vượt qua nhau thai và nhiễm vào thai như thế nào? Terpstra và cs (1991) gợi ý rằng đại thực bào cĩ thể đi qua nhau thai, nhưng câu hỏi cần thiết đưa ra liệu virus cĩ liên quan đến đại thực bào cao trong máu hay khơng cịn chưa biết rõ Chistianson và cs, (1992)

đã tiêm virus vào trong tử cung cĩ thai 45 - 49 ngày tuổi đã chứng minh rằng

ở giai đoạn giữa thời kỳ mang thai giúp virus nhân lên nhưng chúng ít khi vượt qua nhau thai ở giai đoạn này

Người ta đã phân lập virus từ đại thực bào phế nang, phổi, tim, thận, não, lách, hạch lâm ba, tuyến ức, amidan, tuỷ xương, bạch cầu mạch máu ngoại vi và huyết thanh Virus huyết cĩ thể phát hiện ngay 1 ngày sau khi tiêm truyền, tuy nhiên 28 ngày phổ biến hơn Cịn chưa biết rõ rằng liệu các

cơ quan trên cĩ phải là nơi nhân lên của virus hay khơng hay chỉ đơn thuần do kết quả dịng máu đưa vào các mơ

Những vi khuẩn hay gây gây bệnh kế phát ở phổi và nguyên nhân có triệu chứng tai xanh:

Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Thị Lan (2007) trong nghiên cứu về PRRS cho rằng, phổi chắc ñặc chính là nguyên nhân gây khó thở dẫn ñến thiếu oxy tại máu và các mô bào Chính nguyên nhân suy giảm sự trao ñổi khí tại phổi làm máu của gia súc bệnh có màu sẫm, màu này có thể nhìn ñược từ bên ngoài tại các vùng da mỏng, các vùng da có nhiều mạch quản như vùng tai, bẹn, bụng, Vì vậy mà có triệu chứng tai xanh Chúng ta thường gọi nôm na bệnh do PRRSV gây ra là bệnh “tai xanh” cũng là vì có triệu chứng này

Chính do cơ chế tác ñộng là tấn công vào hệ miễn dịch, gây suy giảm miễm dịch ñã mở cửa cho các loại vi sinh vật gây bệnh khác xâm nhập và gây bệnh Cơ chế gây bệnh này ta ñã gặp ở bệnh AIDS ở người và Gumboro gà Việc sử dụng vắc xin PRRS phòng bệnh ngay từ ñầu ít có tác dụng bởi virus PRRS gồm 2 chủng là chủng Châu Âu (virus Lelystad) và chủng Bắc Mỹ (virus VR2332) Hai chủng này có ñộ lệch kháng nguyên lên tới 40%, ngoài

ra ngay trong cùng một chủng, cũng có sự sai khác về kháng nguyên lên tới 20% (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007)) Chính vì ñiều ñó làm cho việc sử dụng vắc xin có mức ñộ bảo hộ thấp, dù ñã tiêm vắc xin nhưng gia súc vẫn có khả năng mắc bệnh Khi gia súc bị PRRS, hệ thống miễn dịch

bị suy giảm rõ rệt và dễ dàng bị nhiễm các loại vi sinh vật gây bệnh có sẵn trong cơ thể hoặc từ ngoài môi trường

Hình 2.4 ðại thực bào bình thường Hình 2.5 ðại thực bào bệnh lý 2.4 Triệu chứng của lợn mắc PRRS

Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của hội chứng PRRS, các nhà khoa

học ñã cho rằng: Triệu chứng lâm sàng của lợn rất thay ñổi và phụ thuộc vào

các chủng virus, trạng thái miễn dịch của ñàn cũng như ñiều kiện quản lý

chăm sóc

2.4.1 Lợn nái

Trong tháng ñầu tiên khi bị nhiễm bệnh lợn biếng ăn, sốt 400C – 410C,

một số con tai chuyển màu xanh trong thời gian ngắn, tím ñuôi, tím âm hộ,

sảy thai ở giai ñoạn ñầu Lợn nái trong giai ñoạn nuôi con thường biếng ăn,

lười uống nước, viêm vú, mất sữa, ñộng dục lẫn lộn 5 – 10 ngày sau khi sinh,

nái chậm lên giống Nếu bệnh kéo dài sẽ kế phát nhiều bệnh ghép và dẫn ñến

tử vong ðỉnh cao của bệnh là hiện tượng sảy thai, ñẻ non, thai chết lưu, thai

gỗ hàng loạt Lợn con ñẻ ra yếu ớt, tỷ lệ tử vong cao có thể lên tới 70%

2.4.2 Lợn ñực giống

Khi bị nhiễm bệnh, lợn thường bỏ ăn, sốt cao, ñờ dẫn hoặc hôn mê, một

số con có hiện tượng tai chuyển màu xanh ðặc biệt xuất hiện hiện tượng

viêm dịch hoàn, giảm hưng phấn hoặc mất tính ñực, lượng tinh dịch ít, chất

lượng tinh kém Lợn ñực giống rất lâu mới hồi phục ñược khả năng sinh sản

2.4.3 Lợn con theo mẹ

Thể trạng gầy yếu, lợn nhanh chóng rơi vào tình trạng tụt ñường huyết

do không bú ñược, mắt có dử màu nâu, sưng mí mắt và các màng quanh mắt, trên da xuất hiện những ñám phồng rộp, tiêu chảy, chân choãi ra, ñi run rẩy, lợn con rất dễ mắc các bệnh kế phát và tỉ lệ tử vong cao

2.4.4 Lợn con cai sữa và lợn choai

Lợn chán ăn, lông xơ xác, có biểu hiện ho nhẹ… Trong những trường hợp ghép với bệnh khác có thể thấy viêm phổi cấp tính, hình thành nhiều ổ áp

xe, thể trạng gầy yếu, da xanh, tiêu chảy, hắt hơi, thở nhanh, chảy nước mắt, tỉ

lệ chết khoảng 15%

2.5 Bệnh tích của lợn mắc PRRS

2.5.1 Lợn nái mang thai

Trường hợp ñẻ non thì thấy có nhiều thai ñã chết, trên cơ thể chúng có nhiều ñám thối rữa (thai chết lưu) Trường hợp ñẻ muộn thì số thai chết lưu ít hơn so với ñẻ non song số lợn con sinh ra rất yếu, nhiều con chết trong lúc ñẻ

do thời gian ñẻ kéo dài

Mổ khám thấy bệnh tích tập trung ở phổi, phổi bị phù nề, viêm hoại tử

và tích nước, cắt miếng phổi bỏ vào bát nước thấy phổi chìm

2.5.2 Lợn nái nuôi con, lợn choai và lợn vỗ béo

Bệnh tích tập trung ở phổi Các ổ viêm thường gặp ở thuỳ ñỉnh, song cũng thấy ở các thuỳ khác nhưng hầu như không xuất hiện ñối xứng Các ổ viêm, áp xe thường có màu xám ñỏ, rắn chắc Mô phổi lồi ra và có màu ñỏ xám loang lổ như tuyến ức hay như ñá grannito Cắt miếng phổi nhỏ bỏ vào nước thấy miếng phổi chìm, chứng tỏ phổi ñã bị phù nề tích nước nặng

Tim, gan, lách của lợn mắc PRRS có bệnh tích không ñặc trưng tuỳ thuộc vào sự kế phát các bệnh khác

Những lợn bị táo bón thì ruột chứa nhiều phân cục rắn chắc, niêm mạc ruột bị viêm nhưng ở những lợn tiêu chảy thì thành ruột mỏng trên bề mặt có phủ một lớp nhầy màu nâu

2.5.3 Lợn con theo mẹ

Thể xác gầy, ướt, các biến đổi ở phổi giống như các loại lợn khác Ruột chứa nhiều nước, thành ruột mỏng và đơi khi thấy cĩ một số cục sữa vĩn khơng tiêu

Thể trạng gầy yếu, lợn nhanh chĩng rơi vào tình trạng tụt đường huyết

do khơng bú được, mắt cĩ dử màu nâu, sưng mí mắt và các màng quanh mắt, tiêu chảy, chân chỗi ra run rẩy, lợn con rất dễ mắc các bệnh kế phát và tỷ lệ

2.6.2 Chẩn đốn bằng phương pháp giải phẫu bệnh

ðối với lợn con, lợn vỗ béo, lợn chuẩn bị xuất chuồng: Khi mổ khám thấy phổi rắn, chắc và cĩ vùng xám và hồng

Trên tiêu bản vi thể cho thấy viêm phổi kẽ tăng sinh đa điểm hoặc lan tràn làm vách phế nang dầy lên, giảm số lượng tế bào lympho trong các tổ chức lympho…

2.6.3 Chẩn đốn bằng phương pháp huyết thanh học

ðể phát hiện sự cĩ mặt của virus PRRS người ta cĩ thể sử dụng phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA); phương pháp miễn dịch enzym trên thảm tế bào một lớp và phản ứng trung hịa virus trên mơi trường

tế bào một lớp (VNT); phương pháp miễn dịch bệnh lý khi sử dụng kháng thể chuẩn để phát hiện virus cĩ trong mẫu bệnh phẩm lợn bệnh PRRS (Buwtner

và cs, 2000) ; (Anette, 1997)

Phương pháp ELISA cĩ thể chẩn đốn một số lượng mẫu huyết thanh lớn và kết quả nhanh Khi dùng phương pháp này cĩ thể phát hiện dược cả chủng virus cĩ nguồn gốc Bắc Mỹ và chủng cĩ nguồn gốc từ Châu Âu

Phản ứng trung hịa virus trên mơi trường tế bào một lớp (Virus neutralization test) là chỉ thị tốt nhất để đánh giá tình trạng bệnh trong quá khứ vì kháng thể trung hịa cĩ thể tồn tại ít nhất một năm (Anette, 1997) Tuy nhiên phản ứng trung hịa virus kém nhạy hơn các phản ứng huyết thanh khác

vì kháng thể trung hịa xuất hiện chậm hơn

Cĩ một thực tế là khi đánh giá kết quả của một phản ứng huyết thanh phải cân nhắc đến trạng thái miễn dịch của đàn sau khi được tiêm phịng vacxin vì hiện tại chưa cĩ phản ứng huyết thanh học nào phân biệt được kháng thể do lợn mắc bệnh tự nhiên hay do tiêm phịng vacxin (Anette, 1997)

2.6.4 Kỹ thuật RT- PCR

Dùng phản ứng RT- PCR phân tích mẫu máu (được lấy trong giai đoạn đầu của pha cấp tính) để xác định sự cĩ mặt của virus, đây là phản ứng tương đối nhạy và chính xác

Kỹ thuật RT – PCR hay cịn là phản ứng PCR ngược là một phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khuơn RNA, theo nguyên lý của phản ứng PCR bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất là chuyển đổi một sợi RNA là khuơn thành cDNA, sau đĩ qua giai đoạn thứ hai dùng DNA hai sợi này làm khuơn để tiếp tục thực hiện phản ứng PCR

Hình 2.6 Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR

RNA là một sợi bao gồm 4 nucleotit liên kết với nhau, trong ñó có Adenine, Guanine, Cytsein, Uracil Chuỗi nucleotit này phải ñược chuyển ñổi thành DNA hai sợi mà thành phần Uracil ñược thay thế bằng Thyamine Phản ứng tạo cDNA từ RNA hệ gen phải nhờ ñến vai trò của enzyme phiên mã ngược Do vậy giai ñoạn này ñược gọi là giai ñoạn chuyển ngược Khi ñã có DNA phản ứng tiếp theo sẽ là PCR Toàn bộ phản ứng nhân một ñoạn DNA

từ khuôn RNA qua hai giai ñoạn nói trên ñược gọi là phản RT –PCR hay phản ứng PCR ngược Thay ñổi nhiệt ñộ ñể phù hợp cho mỗi chu kỳ (Lê Thanh Hoà, 2006)

Có thể phân lập virus PRRS từ huyết thanh, phổi, hạch amidan,…tuy nhiên virus PRRS có ñặc ñiểm khó phân lập và khó quan sát bệnh tích tế bào Virus thích hợp nhất trên tế bào ñại thực bào ở phổi lợn, tuy nhiên mỗi lần phân lập ñều phải sản xuất lại tế bào, giữa các lô tế bào ñược sản xuất ra có sự biến ñổi khác nhau và

ñộ mẫn cảm với virus PRRS cũng khác nhau Trong phòng thí nghiệm PRRS thích ứng trên các loại tế bào như: CL2621, PAM, Marc-145…trong ñó tế bào thận khỉ châu Phi Marc-145 thường ñược sử dụng nhiều nhất (Anette, 1997)

PHẦN III ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng, phạm vi địa điểm nghiên cứu

- ðối tượng nghiên cứu:

Nghiên cứu được tiến hành với đối tượng là lợn nái nghi mắc PRRS ở huyện Phúc Thọ, thành phố Hà Nội bao gồm:

+ Lợn nái mang thai

+ Lợn nái nuơi con

- ðịa điểm thực hiện đề tài:

ðề tài được thực hiện tại phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học khoa Thú y, phịng thí nghiệm bộ mơn bệnh lý khoa Thú y trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn nái mắc PRRS

- Nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể chủ yếu của một số cơ quan của lợn nái mắc PRRS

- Nghiên cứu bệnh tích vi thể chủ yếu của một số cơ quan của lợn nái mắc PRRS

- Ứng dụng phương pháp RT – PCR để chẩn đốn chính xác lợn nái mắc PRRS

3.3 Nguyên liệu

3.3.1 Mẫu bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong nghiên cứu là: Phổi, hạch phổi, tim, gan, lá lách, thận, tử cung… của các lợn nghi mắc PRRS

3.3.2 Hoá chất

- Hoá chất sử dụng làm tiêu bản vi thể, trong nuôi cấy tế bào, nhuộm hóa miễn dịch: Formol 10%, cồn, xylen, parafin, thuốc nhuộm haematoxylin, thuốc nhuộm eosin,

- Hoá chất sử dụng cho phản ứng RT – PCR: Kít chiết tách ARN (QIAamp), Nuclease free Water, dNTP, enzym, primers, TBE, agarose

3.3.3 Dụng cụ

- Tủ lạnh, tủ ấm 370C, tủ sấy, buồng cấy vô trùng

- Máy ñúc tự ñộng, máy cắt Microton, máy ly tâm lạnh, máy votex, máy PCR, máy chạy ñiện di, máy chụp ảnh gel

- Các dụng cụ khác gồm: Lam kính, kính hiển vi, bình nuôi cấy tế bào, ống eppendoft, pipet, găng tay…

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp quan sát, thống kê sinh học

ðể xác ñịnh ñược triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PRRS, chúng tôi tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện lâm sàng của lợn từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý ñầu tiên ðồng thời dựa vào các ñặc ñiểm dịch tễ học, những can thiệp trong quá trình bệnh xảy ra cũng như thu thập các thông tin liên quan Tiến hành phân tích, thống kê ñể ñưa ra những kết quả chính xác Xác ñịnh chính xác những triệu chứng lâm sàng chủ

yếu có ý nghĩa vô cùng quan trọng cho các bước thí nghiệm tiếp theo

3.4.2 Phương pháp mổ khám

ðể xác ñịnh ñược các biến ñổi ñại thể của các cơ quan, tổ chức của lợn mắc PRRS cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng Lợn bệnh ñược cố ñịnh cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể quan sát và chụp ảnh Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: Phổi, hạch phổi, tim, gan, lá lách… ngâm trong formol 10% làm tiêu bản vi thể

3.4.3 Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý kiểm tra bệnh tích vi thể

Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến ñổi ñại thể cần tiến hành làm tiêu bản ñể xác ñịnh bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ñúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE) theo phương pháp của Bộ môn Bệnh lý Thú y, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:

- Cố ñịnh bệnh phẩm:

Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%

- Vùi bệnh phẩm:

Tiến hành lần lượt các bước sau:

+ Rửa focmol: Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h

+ ðưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ñúc mẫu tự ñộng

Hệ thống máy chuyển ñúc mẫu tự ñộng bao gồm 12 bình

Cồn 1000 : 2 lần (mỗi lần 1 phút) Cồn 950 : 1 lần

Cồn 700 : 1 lần Cồn 500 : 1 lần + Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 15 phút

+ Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân tế bào)

Nhỏ Haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước

Sau ñó cho tiêu bản qua hệ thống cồn:

Cồn 500 : 1 lần Cồn 700 : 1 lần Cồn 950 : 1 lần Cồn 1000 : 2 lần Rửa tiêu bản