nghiên cứu một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng sinh học nhằm định hướng ứng dụng xử lý nước ô nhiễm dầu

Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng sinh học nhằm định hướng ứng dụng xử lý nước ô nhiễm dầu” Với mục tiêu nghiên cứu là:

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NƯỚC Ô NHIỄM DẦU”

Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS NGHIÊM NGỌC MINH

Sinh viên thực hiện : BÙI NHƯ QUỲNH

HÀ NỘI, 05/2012

LỜI CÁM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới

PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh, trưởng phòng Công nghệ Sinh học Môi

trường, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này.

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới toàn thể các anh chị Phòng Công

nghệ Sinh học Môi trường, đặc biệt là TS Lê Thị Nhi Công và ThS Cung Thị Ngọc Mai đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi tận tình trong quá trình

thực hiện khóa luận của mình.

Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội cùng với ban lãnh đạo Viện

Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu tại trường cũng như tại viện.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận này.

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2012 Sinh viên

Bùi Như Quỳnh

MỤC LỤC

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình ô nhiễm dầu hiện nay và ảnh hưởng của nó 3

1.1.1 Tình hình ô nhiễm dầu hiện nay

3

1.1.2 Ảnh hưởng của nước ô nhiễm dầu .5

1.2 Các phương pháp xử lý ô nhiễm dầu 6 1.2.1 Phương pháp cơ học .6

1.2.2 Phương pháp hóa học .6

1.2.3 Phương pháp phân hủy sinh học .7

1.3 Màng sinh học (Biofilm) 12 1.3.1 Khái niệm về biofilm .12

1.3.2 Thành phần và cấu trúc của biofilm .13

1.3.2.1 Thành phần mạng lưới các hợp chất ngoại bào 13

1.3.2.2 Thành phần tế bào 15

1.3.2.3 Cấu trúc biofilm 15

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành biofilm của vi sinh vật .16

1.4 Các phương pháp phân loại vi sinh vật 18 1.4.1 Phương pháp phân loại truyền thống .19

1.4.2 Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử

19CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng 21

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu

23

2.2.2 .Làm giàu tập đoàn vi sinh vật trên môi trường khoáng dịch chứa 1% dầu DO 23 2.2.3 Phân lập một số chủng có khả năng sử dụng dầu DO

27

2.2.9 Ảnh hưởng của các điều kiện hóa lý trong tạo biofilm của các chủng vi khuẩn 29

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo biofilm30

3.1.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy dầu DO

3.3 Phân loại phân tử dựa trên việc xác định trình tự đoạn gene mã hóa 16SrRNA của chủng vi khuẩn B8 38

3.3.1 Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn

38

3.3.2 Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng B8

393.4 Ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý trong tạo biofilm của chủng

PHỤ LỤC 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

bp Base pair (cặp bazơ)

DNA Deoxyribonucleic acid

ESP Extracellular Polymeric Substances (Hợp chất ngoại bào)

MPA Môi trường Malt Peptone Agar

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

ppm Past per million (Đơn vị 1 phần triệu (mg/l))

RNA Ribonucleic acid

rRNA Ribosomal Ribonucleic acid

Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vikhuẩn33

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc hiển vi của một biofilm………… 16 Hình 3.1: Mẫu làm giàu lần 1, lần 2, lần 3 trên môi trường khoáng có bổ sung1% dầu DO……… … 30 Hình 3.2: Tập đoàn vi sinh vật sử dụng dầu DO trên môi trường khoáng

Hình 3.3: Khả năng phân hủy dầu DO của các chủng vi khuẩn …… 32 Hình 3.4: Khả năng hoạt động của CHHBM của 5 chủng vi khuẩn… …… 34 Hình 3.5: Khả năng tạo biofilm của 5 chủng vi khuẩn……… …… 35 Hình 3.6: Kết quả phân hủy dầu DO của 5 chủng sau 5 ngày……… 36 Hình 3.7: (A) Điện di đồ DNA tổng số chủng B8; (B) Điện di đồ sản phẩmnhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA của chủng B8……… …… 38 Hình 3.8: Trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA của chủng vi khuẩn

Hình 3.9: Cây phát sinh chủng loại dựa trên so sánh trình tự gen 16S rRNAcủa chủng B8 và các chủng vi sinh vật đại diện……….…… 40 Hình 3.10: Biofilm của chủng B8 ở pH khác nhau (48h) ……… 42 Hình 3.11: Ảnh hưởng của pH tới khả năng tạo biofilm của chủng B8 …… 42 Hình 3.12: Biofilm của chủng B8 ở nồng độ NaCl khác nhau (48h)… …… 43 Hình 3.13: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới sự hình thành biofilm của chủng

Hình 3.14: Biofilm của chủng B8 ở nhiệt độ khác nhau (48h)……… …… 44 Hình 3.15: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng tạo biofilm của chủng

MỞ ĐẦU

Công nghiệp dầu khí là một trong những ngành công nghiệp quantrọng, đem lại lợi ích vô cùng lớn cho nền kinh tế quốc dân Nguồn nguyênliệu dầu khí tạo ra rất nhiều sản phẩm phục vụ cho hầu hết các lĩnh vực côngnghiệp, nông nghiệp, đời sống xã hội, an ninh quốc phòng… Bất kì một nướcnào sở hữu nguồn tài nguyên quý giá này đều có tiềm năng phát triển kinh tếvượt trội, vì vậy nó không ngừng được tìm kiếm, khai thác và với quy môngày càng tăng Đặc biệt với một nước đang phát triển như nước ta thì vai tròcủa nó lại càng quan trọng

Hiện Việt Nam là nước khai thác dầu đứng thứ 3 Đông Nam Á, tấn dầuđầu tiên được khai thác vào năm 1986 tại Vũng Tàu, tính đến năm 2004 đãkhai thác được tấn dầu thứ 140 triệu, hàng năm đem lại một phần ba nguồnngân sách quốc gia Hoạt động thăm dò khai thác dầu khí diễn ra hết sức sôinổi ở thềm lục địa phía Nam và đang có xu hướng chuyển sang miền Bắc như

Vấn đề đặt ra cho các nhà môi trường là phải xử lí chúng, phương ángiải quyết phải đảm bảo sao cho vừa hiệu quả, đơn giản mà lại kinh tế Do đó

mà phương pháp phân hủy sinh học đang được chú ý bởi các ưu điểm vượt

trội của nó so với các phương pháp hoá lí như: an toàn với môi trường, đơngiản, xử lí triệt để mà giá thành lại rẻ Một trong các phương pháp xử lí sinhhọc đem lại hiệu quả cao đó là sử dụng màng sinh học do các vi sinh vật tạo

ra Màng sinh học (biofilm) là một tập hợp các vi sinh vật gắn trên một bề mặtcủa vật thể cứng hoặc bề mặt chất lỏng, tạo thành lớp màng bao phủ bề mặt

đó Các vi sinh vật trong biofilm liên kết với nhau một cách chặt chẽ, tạothành một cấu trúc bền vững Do mật độ các chủng vi sinh vật trong biofilmcao, hỗ trợ và liên kết với nhau một cách chặt chẽ nên khả năng đồng hóa,trao đổi chất, phân hủy các hydrocarbon sẽ xảy ra nhanh hơn Vì vậy biofilmđược ứng dụng cao trong xử lý ô nhiễm môi trường Việc ứng dụng thànhcông biofilm trong công nghiệp dầu khí và xử lý ô nhiễm trên thế giới hứahẹn trở thành một công nghệ mới đem lại hiệu quả kinh tế cao và thân thiệnvới môi trường

Tuy nhiên ở Việt Nam hiện nay vẫn chưa có nhiều công trình nghiêncứu về màng sinh học từ vi sinh vật nhằm ứng dụng trong xử lý ô nhiễm dầu

Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng sinh học nhằm định hướng ứng dụng xử lý nước ô nhiễm dầu”

Với mục tiêu nghiên cứu là:

Tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn tạo biofilm có khả năng phânhủy và chuyển hóa các thành phần dầu mỏ nhằm định hướng ứng dụng xử lýnước thải ô nhiễm dầu

Những nội dung nghiên cứu gồm có:

- Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủydầu DO

- Đánh giá khả năng tạo biofilm của các chủng đã tuyển chọn

- Phân loại và định tên một số chủng đã chọn

- Đánh giá ảnh hưởng các điều kiện sinh trưởng của các chủng biofilm

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình ô nhiễm dầu hiện nay và ảnh hưởng của nó

1.1.1 Tình hình ô nhiễm dầu hiện nay

 Trên thế giới

Trong lịch sử của thế giới đã có vô vàn những vụ tràn dầu kinh hoànggây hậu quả nghiêm trọng Năm 1991 là một năm kinh hoàng khi thế giới liêntiếp chứng kiến những vụ tràn dầu lớn trên biển, gây hậu quả nghiêm trọngđến hệ sinh thái biển Trong cuộc chiến vùng vịnh năm 1991 khi quân độiIraq rút khỏi Kuwait, họ đã mở tất cả các van của giếng dầu và phá vỡ cácđường ống dẫn dầu nhằm ngăn cản bước tiến của quân đội Mỹ Kết quả làmột lượng dầu lớn nhất trong lịch sử đã phủ lên Vịnh Ba Tư Ước tính, số dầuloang tương đương 240 triệu gallon dầu thô Diện tích dầu loang có kíchthước tương đương đảo Hawaii Cũng trong thời gian này, hai con tàu chở dầu

là ABT Summer và M/T Heaven Tanker vì lý do kỹ thuật đã bị nổ trên biển,làm tràn hơn 80 triệu gallons dầu, số dầu tràn đã lan trên diện tích lên đến 120

km2 [22] Ngày 14/4/2001, tàu Zainab (Iraq) vận chuyển khoảng 1300 tấn dầuthô bị chìm trên đường tới Pakistan Xấp xỉ 300 tấn dầu đã tràn xuống biểntrước khi người ta kịp hàn lỗ thủng thân tàu Sự cố tràn dầu này là thảm họamôi trường lớn nhất ở các Tiểu vương quốc Ảrập thống nhất suốt 6 năm qua[6] Ngày 07/12/2007, một sà lan đâm vào một chiếc tàu chở dầu ở ngoài khơi

bờ biển phía Tây Hàn Quốc làm 10.280 tấn dầu đã tràn ra trên 40 km đường

bờ biển Ngày 24/9/2008, một đoạn dài 15 km trên sông Loire - con sông lớnnhất nước Pháp, đã bị ô nhiễm dầu máy do sự cố xảy ra trong khi thực hiệnquy trình bảo dưỡng kỹ thuật tại một nhà máy điện nguyên tử gần đó Gầnđây nhất, ngày 21/4/2011 giàn khoan dầu Deepwater Horizon của Mỹ, ngoàikhơi bang Louisiana bất ngờ phát nổ và chìm tại vịnh Mehico Sau khi sự cốnày xảy ra, mỗi ngày có tới 5000 thùng dầu tràn ra biển gây ra sự cố tràn dầunghiêm trọng nhất tại Mỹ trong khoảng nửa thập kỷ qua, đe dọa hệ sinh thái ở

khu vực vốn đã chịu nhiều tác động của tình trạng bão lũ và xói mòn tại vùng

bờ biển này

 Ở Việt Nam

Theo thống kê của Trung tâm nghiên cứu an toàn dầu khí, từ năm 1987đến năm 2001 tại Việt Nam đã xảy ra hơn 90 vụ tràn dầu tại các vùng sông vàbiển ven bờ [7] Riêng thành phố Hồ Chí Minh, tính từ năm 1993 đến nay đãxảy ra trên 8 vụ tràn dầu với lượng dầu ước tính là 2520 tấn, gây thiệt hại hơn

7 triệu USD Điển hình như cuối tháng 10/2007 tàu vận tải biển New Oriental

bị lâm nạn và chìm đắm ở vùng biển xã An Ninh Đông, huyện Tuy An, tỉnhPhú Yên Vết dầu loang ra cách vị trí tàu chìm về hướng Tây Nam khoảng

500 m với diện rộng ước tính khoảng 25 ha Đêm 23/12/2007, trên vùng biểncách mũi Ba Làng An – xã Bình Châu – huyện Bình Sơn – tỉnh Quảng Ngãikhoảng 3 hải lý, hai chiếc tàu chở hàng đã đâm nhau, làm hơn 170 m3 dầudiezel tràn ra biển Theo báo cáo hiện trạng ô nhiễm vùng ven biển Việt Namnăm 2010 thì Vịnh Hạ Long là nơi ô nhiễm dầu nặng nhất cả nước Vùngnước Cảng Cái Lân có thời điểm hàm lượng dầu trong nước biển đạt tới 1,75mg/l gấp 6 lần tiêu chuẩn Việt Nam (Tiêu chuẩn tạm thời: 0,3 mg/l) và gấphàng chục lần tiêu chuẩn ASEAN, có đến 1/3 diện tích mặt vịnh thườngxuyên có hàm lượng dầu từ 1 đến 1,73 mg/l [5] Hàm lượng dầu trong trầmtích ven bờ hai bên Cửa Lục đạt mức độ cao nhất 752,85 mg/kg Bằng mắtthường có thể thấy, tại cảng tàu du lịch Bãi Cháy, cầu cảng Tuần Châu, cáckhu neo đậu tàu du lịch ở các điểm tham quan du lịch trên Vịnh, khu neo đậutàu Vụng Đâng, Lán Bố, Bến Đoan, cảng xăng dầu B12, cảng Cái Lân, khucông nhiệp đóng tàu Giếng Đáy…, đều thường xuyên có váng dầu loang rộngtrên mặt biển

Từ những ví dụ trên, ta có thể thấy vấn đề ô nhiễm dầu ngày nay đangtrở thành nỗi bức xúc toàn cầu Đứng trước những hiểm họa ô nhiễm dầu mỏ

và các sản phẩm của nó, để có thể giải quyết một cách triệt để đòi hỏi phải có

sự nghiên cứu của nhiều nhà khoa học, công nghệ và các nhà quản lí môitrường cũng như sự hợp tác giữa các đơn vị vận chuyển, kinh doanh và sửdụng dầu mỏ.

1.1.2 Ảnh hưởng của nước ô nhiễm dầu

 Đối với môi trường

Dầu ô nhiễm làm thay đổi tính chất lí hóa của môi trường nước, tăng độnhớt, giảm nồng độ oxy hấp thụ vào nước…, dẫn đến thiệt hại nghiêm trọngđối với môi trường

Nước biển nhiễm dầu làm thay đổi hệ sinh thái vùng bờ biển, sóngđánh khoảng 10% lượng dầu vào đất liền làm hư hại vùng đất ven biển Cặndầu lắng xuống đáy làm ô nhiễm trầm tích biển Một tấn dầu mỏ tràn ra biển

có thể loang phủ 12 km2 mặt nước, tạo thành váng dầu ngăn cách nước vàkhông khí, làm thay đổi tính chất của môi trường biển, cản trở việc trao đổioxi và cacbonic với bầu khí quyển Làm ảnh hưởng đến khí hậu khu vực,giảm sự bốc hơi nước dẫn đến giảm lượng mưa

 Đối với sinh vật

Nước nhiễm dầu khi chưa được xử lý mà thải ra môi trường sẽ ảnhhưởng rất lớn đến các sinh vật đang sống

Đối với sinh vật thủy sinh sự ô nhiễm này sẽ gây suy giảm hàm lượngoxy hòa tan, phú dưỡng hóa, tồn lưu các chất độc hại…, làm thay đổi điềukiện sống, gây nhiễm độc và rối loạn trao đổi chất trong cơ thể sinh vật Hậuquả đem lại là mất cân bằng sinh học với sự diệt vong, suy giảm cá thể, sốlượng loài Động vật trên cạn sống gần khu vực ô nhiễm cũng chịu ảnh hưởng

có thể dẫn đến chậm phát triển, suy yếu, xuất hiện các biến dị di truyền, giảmkhả năng sinh sản, tử vong, nếu ăn phải dầu sẽ bị chứng mất nước và giảmkhả năng tiêu hóa

Dầu nổi trên mặt nước làm ánh sáng giảm khi xuyên vào trong nước,

nó hạn chế sự quang hợp của các thực vật trong nước và vi sinh vật phù du

Điều này làm giảm lượng cá thể của hệ động vật và ảnh hưởng đến chuỗi thức

ăn trong hệ sinh thái

 Đối với kinh tế, xã hội và con người

Tốn kém tiền bạc để làm sạch môi trường bị ô nhiễm

Ngoài những thiệt hại trực tiếp về tài sản ra nó còn có ảnh hưởng mangtính chất lâu dài như các cảnh quan, các vùng nuôi trồng, đánh bắt thủy hảisản…

Dầu có ảnh hưởng trực tiếp đến con người thông qua tiếp xúc trực tiếphoặc hít thở hơi dầu gây buồn nôn, nhức đầu, các vấn đề về da… Ngoài rachúng còn gây ra một số bệnh ung thư, bệnh phổi, gián đoạn hormon…

1.2 Các phương pháp xử lý ô nhiễm dầu

1.2.1 Phương pháp cơ học

Một số phương pháp cơ học dựng để xử lý ô nhiễm dầu như lắng, gạn

cơ học, hấp thụ… Phương pháp lắng, gạn cơ học dựa trên sự khác nhau về tỉtrọng giữa dầu và nước để phân tách và thu hồi dầu Phương pháp hấp thụ sửdụng các loại vật liệu có khả năng hấp thụ và giữ dầu

Ưu điểm của phương pháp cơ học là có thể dựng để ứng cứu các điểm

bị ô nhiễm với khối lượng dầu lớn như vụ tràn dầu biển Tuy nhiên phươngpháp này cũng có hạn chế là không xử lý được triệt để ô nhiễm dầu, khônghấp thụ hoặc vớt được dầu hòa tan trong nước

Sử dụng phân hủy sinh học trong xử lý ô nhiễm dầu đã được các nhàkhoa học trên thế giới nghiên cứu từ năm 1976 Công nghệ phân hủy sinh họcđảm bảo an toàn sinh học cho môi trường hơn tất cả các công nghệ khác, đặcbiệt trong điều kiện sinh thái đa hệ việc áp dụng công nghệ phân hủy sinh họclàm sạch dầu cũng như làm sạch các chất độc khác đạt hiệu quả cao nhất Xử

lí ô nhiễm hữu cơ bằng phân hủy sinh học là phương pháp an toàn, rẻ và cóthể áp dụng ở các qui mô rất lớn ngoài tự nhiên Sản phẩm cuối cùng củaphân hủy sinh học thường là các chất khí (CO2, N2, CH4, H2S), các chất vô cơ(NH4+, PO43-) và sinh khối vi sinh vật Các sản phẩm này không độc hại vàkhông gây ô nhiễm thứ cấp cho môi trường

a Vai trò của vi sinh vật trong phân hủy dầu

Dầu mỏ là một hỗn hợp các hợp chất hữu cơ có khả năng gây ô nhiễmmôi trường Trong dầu mỏ, chủ yếu là các hợp chất hydrocarbon nên dễ bị visinh vật phân hủy trong điều kiện hiếu khí và kị khí [2, 4] Nhiều nghiên cứucho thấy rằng, trong tự nhiên các vi sinh vật phân hủy dầu và các sản phẩm từdầu mỏ luôn tồn tại và phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái khác nhau nhưtrong đất, nước ngọt, nước biển, các mẫu trầm tích, vùng cực, mỏ dầu…, và

vô cùng đa dạng về chủng loài [9] Bao gồm các nhóm vi khuẩn như:

Achromobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Bacillus, Pseudomonas…, các nhóm xạ khuẩn như: Streptomyces sp, Actinomyces sp…, các loại nấm như: Allescheria, Aspergilius, Cephalosporium, Mucor, Hansenula…, và một số

loài tảo [2, 4, 19]

Vai trò của các nhóm vi sinh vật sử dụng dầu thể hiện rất khác nhautrong các môi trường khác nhau Mỗi loại vi sinh vật chỉ có thể phân hủymạnh một vài hydrocarbon khác nhau Không một vi sinh vật đơn lẻ nào cókhả năng phân hủy tất cả các loại hydrocarbon có trong thành phần dầu mỏ[29] Vì vậy ứng dụng màng sinh học – tập hợp các vi sinh vật sẽ giúp choquá trình phân hủy các loại hydrocarbon nhanh hơn và triệt để hơn

b Cơ chế phân hủy hydrocarbon nhờ vi sinh vật

Cơ chế phân huỷ các hydrocarbon của vi sinh vật đã được các nhà khoahọc trong và ngoài nước nghiên cứu Vi sinh vật sử dụng hydrocarbon làmnguồn dinh dưỡng và năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển Việc sửdụng các hydrocarbon của vi sinh vật có thể xảy ra theo hai hướng:

- Đối với một số các hydrocarbon tan trong nước, vi sinh vật có thể hấpthụ trực tiếp

- Đối với các hydrocarbon khó tan mà có thể tan dưới dạng nhũ tươngdầu - nước thì quá trình phân huỷ vi sinh theo trình tự các bước: đầutiên là hòa tan các hydrocarbon dưới dạng nhũ tương dầu nước, sau đó

vi sinh vật tiếp xúc với dầu, cuối cùng nó tiết ra các enzyme để chuyểnhoá các hydrocarbon thành các chất mà nó có thể sử dụng được

Nhìn chung các hydrocarbon khác nhau bị phân huỷ bởi nhiều loại vikhuẩn và bằng nhiều con đường khác nhau [9, 19, 21]

 Cơ chế phân huỷ các alkan

Khả năng phân huỷ của các alkan phụ thuộc vào cấu trúc phân tử củachúng Thông thường các hydrocarbon bậc 1 và bậc 2 dễ phân huỷ hơn cáchydrocarbon bậc 3 và 4

 Cơ chế phân huỷ các n-alkan:

Quá trình phân huỷ alkan được khơi mào nhờ enzyme mono-oxygenase

và di-oxygenase Quá trình này đòi hỏi có sự tham gia của một phân tử oxy vàchất cho điện tử NADPH2

Các giai đoạn oxi hoá alkan:

* Giai đoạn 1: Tạo thành rượu

Tạo thành hợp chất peoxit

R- CH2- CH3 + O2 —> R- CH2- CH2- OOH

Hợp chất peroxide không bền dưới tác dụng của NADPH2 tạo thành rượu

và nước [19] Có hai khả năng xảy ra:

Tạo thành rượu bậc 1: xảy ra khi nhóm OH gắn vào C bậc 1:

R- CH2-CH2- OOH + NADPH2 —> RCH2- CH2- OH + H2O + NADPTạo thành rượu bậc 2: khi nhóm OH gắn với C bậc 2:

* Giai đoạn 2: tạo thành aldehyde và xeton

Rượu bậc 1 tạo thành aldehyde:

RCH2- CH2- CH2- OH + 1/2 O2 —> RCH2- CH2- CHO + H2O

Rượu bậc 2 tạo thành xeton:

* Giai đoạn 3: tạo thành acid béo:

Các xeton bị oxy hoá tạo thành este, liên kết este bị phá vỡ tạo ra một acid

và rượu bậc một, rượu bậc 1 lại bị oxy hoá thành aldehyde rồi acid béo:

Các aldehyde bị oxy hoá thành acid béo:

RCH2- CH2- CHO +1/2 O2 —>R- CH2- COOH

Có trường hợp sự oxi hóa xảy ra ở cả hai đầu của alkan tạo thành các diol,các dicarbonxylic

* Giai đoạn 4: các acid béo bị oxi hóa.

Acid béo mạch dài dưới tác dụng của một loại enzyme chuyển sangdạng acetyl coenzyme A và được hoạt hóa bởi một chuỗi các enzyme Kếtquả là nhóm acetyl CoA bị cắt ra và phân tử acid béo bị cắt đi hai nguyên tửcacbon Quá trình này được lặp lại và cuối cùng phân tử CoA qua chu trìnhCreb được chuyển hóa tới CO2 và H2O [9, 19, 21]

 Cơ chế phân huỷ các alkan mạch nhánh:

Do cản trở về mặt không gian nên khả năng phân huỷ của chúng kémhơn n-alkan Các vi sinh vật phân huỷ ưu tiên C bậc 1 và bậc 2, còn C bậc 3

và 4 thì khó phân huỷ hơn

Alkan có nhóm metyl ở đầu mạch khó phân huỷ hơn ở giữa mạch.Alkan có mạch nhánh dài dễ bị phân huỷ hơn alkan có mạch nhánhngắn [39, 41]

 Cơ chế phân huỷ các hydrocarbon no mạch vòng:

Phân hủy sinh học hydrocarbon no mạch vòng thường có sự tham giađồng chuyển hóa (co-metabolism) hoặc tập đoàn vi sinh vật cùng thực hiệnquá trình đồng hóa [30] Cycloalkan là cấu tử chính của dầu thô Dưới tácdụng của enzyme monooxygenase và oxygenase các cycloalkan bị phân huỷthành các cycloalkanol

Theo các tác giả, khả năng phân huỷ của cyclohexan là mạnh nhấttrong dãy đồng đẳng cycloalkan Cùng vòng cycloalkan chất nào có mạchnhánh dài hơn thì sẽ dễ phân huỷ hơn

Khi phân huỷ cyclohexan, quá trình hydroxyl hóa được xúc tác bởienzyme oxydase chức năng tạo ra một rượu mạch vòng Rượu mạch vòng sẽ

bị dehydro hóa để tạo ra xeton, xeton bị oxi hóa tiếp thành lacton Lacton sẽ

bị thuỷ phân, nhóm hydroxyl bị oxi hóa thành một nhóm aldehyde và mộtnhóm cacboxyl Kết quả là acid dicacboxylic bị biến đổi tiếp nhờ chu trìnhoxi hóa

Các vi sinh vật có khả năng phát triển trên cyclohexan phải thực hiệntất cả các phản ứng trên Tuy nhiên ta thường gặp hơn các vi sinh vật có khảnăng chuyển cyclohexan thành rượu mạch vòng nhưng không có khả nănglacton hóa và mở mạch vòng Do vậy cơ chế cộng sinh và cùng trao đổi chất(co-metabolism) đúng một vai trò rất quan trọng trong phân huỷ sinh học cáchợp chất hydrocarbon mạch vòng

 Cơ chế phân huỷ hydrocarbon thơm

Các hợp chất hydrocarbon thơm bị oxi hóa qua một vài phản ứng để tạothành catechol Vòng thơm đã bị dihydroxyl hóa thành catechol sẽ được mở

nhờ cắt ở vị trí octo, tạo ra acid ciamuconic Chất này bị oxi hóa tiếp thànhacid ketoadipic Acid này bị oxi hóa thành các hợp chất cacbon trung gian:acid succinic và axetyl-CoA Cũng có khi vòng thơm bị mở ở vị trí meta tạo

ra 2 hydroxy-cis, cis-muconic semi-aldehyde Chất này được biến đổi tiếpthành acid focmic, pyruvic và acetaldehyde Các hợp chất đa nhân (nhiềuvòng thơm) cũng bị phân hủy nhờ quá trình dihydroxyl hóa và bị gãy mộttrong các vòng thơm Vòng thơm đã bị gãy bị phân hủy đến acid pyruvic vàCO2 Vòng thơm thứ hai sẽ bị phân hủy tương tự như vậy

c Các phương thức xử lí ô nhiễm dầu bằng biện pháp phân huỷ sinh học

Khái niệm phân huỷ sinh học đưa ra để mô tả quá trình sử dụng các visinh vật sống xử lí các vị trí bị ô nhiễm Trong các vi sinh vật thì vi khuẩnđược sử dụng nhiều nhất, tuy nhiên nấm và các thực vật bậc cao cũng gópphần xử lí ô nhiễm

Bản chất của quá trình phục hồi sinh học là cố gắng thúc đẩy sự phânhuỷ sinh học trong tự nhiên Khi trong môi trường bị ô nhiễm dầu, các vi sinhvật có khả năng sử dụng dầu làm thức ăn lập tức phát triển Tuy nhiên sựthành công của việc ứng dụng chúng để xử lí ô nhiễm dầu phụ thuộc vào khảnăng tối ưu hoá các điều kiện khác nhau về sinh học, hoá học, địa chất…,giúp cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển mạnh mẽ nhất có thể, với thờigian nhanh nhất

Có hai phương thức xử lí ô nhiễm dầu:

- Đưa vào một số vi sinh vật chọn lọc có khả năng phân huỷ cao, bổsung cùng với quần xã sinh vật bản địa trong môi trường bị ô nhiễm,đồng thời tối ưu hóa các điều kiện dinh dưỡng để tăng cường khả năngphân huỷ dầu

- Lấy quần xã sinh vật bản địa làm trung tâm, các đặc điểm sinh học,sinh thái của quần xã vi sinh vật được nghiên cứu kỹ qua đó đưa cácchất dinh dưỡng hữu cơ, vô cơ, cùng các chế phẩm sinh học với một tỉ

lệ thích hợp nhằm kích hoạt tập đoàn vi sinh vật có khả năng phân huỷdầu bản địa làm sạch môi trường.

Trên thế giới cả hai phương thức này cũng đã được đem ra áp dụngnhưng theo các tài liệu thì phương thức thứ nhất dường như ít hiệu quả hơnkhi xử lí dầu trong môi trường mở Trong các thử nghiệm thực tế, việc chothêm các vi sinh vật cho thấy không có gì hiệu quả hơn so với chỉ thêm cácchất dinh dưỡng Nguyên nhân có thể là do khi đưa một lượng vi sinh vật mớivào môi trường, chúng phải mất thời gian để thích nghi với môi trường sinhthái mới, và thường mất đi khả năng phân huỷ mạnh như vốn có do có các tácnhân kìm hãm nào đó trong môi trường ô nhiễm, nhiều khi chúng chuyểnsang sử dụng nguồn cơ chất mới không phải là dầu

Ngày nay người ta thấy rằng với hệ vi sinh vật trong biofilm có khảnăng chống chịu các điều kiện khắc nghiệt của môi trường tốt hơn, hỗ trợ traođổi chất tốt hơn và hạn chế sự cạnh tranh của các vi sinh vật khác [28] Bêncạnh đó, các chủng vi sinh vật này thường có khả năng phân huỷ các loạihydrocarbon khác nhau nên việc ứng dụng biofilm trong công nghiệp dầu khí

và xử lý ô nhiễm hứa hẹn trở thành một công nghệ mới đem lại hiệu quả kinh

tế cao và thân thiện với môi trường [31, 36]

1.3 Màng sinh học (Biofilm)

1.3.1 Khái niệm về biofilm

Màng sinh học (biofilm) là một tập hợp các vi sinh vật gắn trên một bềmặt của vật thể cứng hoặc bề mặt chất lỏng, tạo thành lớp màng bao phủ bềmặt đó

Phần lớn các vi sinh vật sinh trưởng trên môi trường bán lỏng đều cókhả năng tạo ra màng sinh học Khu hệ vi sinh vật trong biofilm có khả năngchống chịu các điều kiện khắc nghiệt của môi trường tốt hơn, hỗ trợ trao đổichất tốt hơn và hạn chế sự cạnh tranh của các vi sinh vật khác [28] Nhìnchung có thể thấy một biofilm trong tự nhiên là cấu trúc của các loài vi sinh

vật gồm 2 thành phần chính:

- Thành phần tế bào: gồm tập hợp các tế bào của một hay nhiều loài visinh vật khác nhau, bám dính trên bề mặt nhất định (có thể hữu sinhhoặc vô sinh)

- Mạng lưới các hợp chất ngoại bào (extracellular polymeric substances– EPS) bao quanh các tế bào, tạo nên cấu trúc đặc trưng cho biofilm[10]

Biofilm không phải là một dạng sống quá đặc biệt mà trên thực tế đây

là một hình thức tồn tại khá phổ biến của vi sinh vật trong môi trường tựnhiên

1.3.2 Thành phần và cấu trúc của biofilm

Về cơ bản biofilm được cấu tạo gồm rất nhiều tế bào của cùng một loàihay từ các loài vi sinh vật khác, khối lượng tế bào vi sinh vật chiếm 2 – 5%tổng khối lượng biofilm, 97% là nước, 3 – 6% còn lại là các hợp chất polymerngoại bào (EPS) và ion [8] Một tế bào riêng lẻ có thể tạo ra vài thành phầnngoại bào khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi trường, đặc tính của từngloài vi khuẩn cũng như cách thức khác nhau hình thành biofilm

1.3.2.1 Thành phần mạng lưới các hợp chất ngoại bào

Thành phần polymer ngoại bào rất đa dạng tùy loài vi sinh vật, dạngbiofilm và điều kiện hình thành Nhưng về cơ bản đều bao gồm cácpolysaccharide chiếm khoảng 40 – 95%, 1 – 60% là protein, 1 – 10% là acidnucleic, 1 – 40% lipid [15] Các hợp chất này thay đổi theo không gian vàthời gian tồn tại của biofilm Về cơ bản biofilm càng dày và thời gian tồn tạicàng lâu thì có hàm lượng EPS càng nhiều Mật độ tế bào tập trung cao nhất ởlớp đỉnh của biofilm và giảm dần theo độ sâu nhưng thành phần EPS lạiphong phú hơn ở vùng phía trong biofilm Thành phần EPS trong hầu hết cácbiofilm cũng khác biệt so với các vi khuẩn ở dạng sống tự do Những thành

phần chính được xem xét trong một biofilm bao gồm polysaccharide, protein

và DNA

Bảng 1.1: Vai trò của mạng lưới ngoại bào trong biofilm [17]

Hiệu quả của mạng

lưới ngoại bào Thành phần Vai trò trong biofilm

Amyloid

Cấu tạo nên cấu trúcbiofilm

Hoạt hóa Enzyme ngoại bào Phân hủy chất hữu cơ

Hoạt hóa bề mặt Amphiplic Tương tác giữa các bề mặt

Acid nucleic

Truyền thông tin giữa các

tế bào trong mạng lướiChất dinh dưỡng Nhiều loại polymer Nguồn cung cấp C, N, P

a Thành phần polysaccharide ngoại bào

Polysaccharide là thành phần quan trọng để tạo nên cấu trúc hoàn chỉnhbiofilm Các polysaccharide có thể rất đa dạng về đặc tính sinh lý, sinh hóathông qua dạng liên kết glycosidic giữa các phân tử (β-1,4, β-1,3 hay α-1,6)hay đơn vị monomer cấu tạo nên Polysaccharide có thể là các đồng phân tửcấu tạo bởi một đơn phân monosaccharide duy nhất như cellulose, dextran,curdlan hay dị phân tử cấu tạo bởi 2 đến 4 dạng đơn phân khác nhau nhưalginate, emulsan, gellen Các monosaccharide phổ biến trong biofilm là D-glucose, D-galactose, D-mannose, L-fucose Nhóm acid uronic như acid D-glucuronic, acid D-galacturonic Thành phần các đường đơn có ảnh hưởngđến đặc tính của polysaccharide và qua đó ảnh hưởng đến đặc tính của cảmạng lưới biofilm [11]

b Protein ngoại bào

Những phương pháp di truyền và chụp ảnh hiển vi cung cấp thông tin

về việc protein đóng vai trị như là một yếu tố kết nối tế bào – tế bào trong quátrình hình thành biofilm bởi các loài vi khuẩn Protein ngoại bào có khốilượng dao động từ 10 kDa đến 200 kDa với 40 – 60% thành phần là acid amin

kị nước Những thành phần protein chính trong mạng lưới ngoại bào được nốivới nhau bởi các ion hóa trị 2 là Ca2+ , Mg2+ và một lượng nhỏ carbohydrate

và acid nucleic

1.3.2.2 Thành phần tế bào

Biofilm có thể được hình thành bởi tập hợp các tế bào của một hoặcnhiều loài vi sinh vật khác như nấm, tảo, xạ khuẩn, vi khuẩn Trong biofilmcác tế bào tập hợp thành các đơn vị cấu trúc là các vi khuẩn lạc Thành phầnnày đóng vai trị qua trọng trong quá trình hình thành biofilm đặc biệt là giaiđoạn đầu bởi nó qui định đặc tính hình thành biofilm cho từng loài vi sinh vật,đảm nhiệm chức năng tiết các hợp chất ngoại bào cũng như có chứa các yếu

tố phụ trợ tế bào như lông roi, lông nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tếbào khác lên bề mặt giá thể

1.3.2.3 Cấu trúc biofilm

Cấu trúc biofilm bao gồm thành phần tế bào liên kết với nhau một cách

có trật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào Mạnglưới các hợp chất ngoại bào có vai trò qui định sự sắp xếp tế bào đồng thời tạonên những kênh dẫn truyền nước bên trong biofilm Nhờ đó một dòng nướcchảy có thể đi qua biofilm tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chấtdinh dưỡng đến khắp các tế bào trong biofilm cũng như mang đi những chấtthải không cần thiết [44].Cấu trúc của biofilm được minh họa trong hình 1.1:

(A) (B)

Hình 1.1: Cấu trúc hiển vi của một biofilm

(A) Cấu trúc không gian của một biofilm với mạng lưới ngoại bào bao quanh(B) Ảnh hiển vi quét cho thấy cấu trúc không đồng đều bên trong biofilm và cấu

trúc những kênh dẫn nước cho phép dòng nước chảy qua [17]

Về cơ bản, một mạng lưới ngoại bào (EPS) có độ dày từ 0,2 đến 1 µm

Ở một vài loài vi khuẩn độ dày của lớp EPS không vượt quá 10 đến 30 nm[15] Các biofilm được hình thành từ các loài khác nhau cũng không luônluôn giống như nhau, theo kiểu gồm nhiều lớp vi khuẩn hiếu khí bên trên vànhiều lớp vi khuẩn kị khí bên dưới mà đều có cấu trúc đặc trưng do các luồngnước chảy qua khuấy động nên các vi khuẩn kị khí và hiếu khí có thể songsong tồn tại khắp các hốc nhỏ ở trong biofilm

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành biofilm của vi sinh vật

Biofilm có thể được hình thành trên một loạt các bề mặt bao gồm: môsống, các dụng cụ y khoa, các hệ thống ống nước…, có cấu tạo từ những vậtliệu khác nhau Tuy nhiên trong điều kiện tự nhiên để chuyển từ dạng sống tự

do trong môi trường sang dạng cấu trúc trong biofilm đòi hỏi một loạt nhữngđiều kiện nhất định [27]

 Đặc tính bề mặt giá thể

Đây là yếu tố quyết định đến việc hấp thụ chất hữu cơ và bám dính của

tế bào bởi vậy mỗi loài vi khuẩn chỉ hình thành biofilm được trên một số bềmặt nhất định

Diện tích bề mặt là một trong những yếu tố chính ảnh hưởng đến sựphát triển biofilm Theo nguyên tắc diện tích bề mặt càng lớn càng làm tăngkhả năng tiếp xúc với tế bào, qua đó tạo điều kiện cho việc bám dính lên bềmặt giá thể Các hệ thống ống dẫn khác với hầu hết các môi trường tự nhiên(ao, hồ, sông, suối…) thường có một diện tích bề mặt khá lớn tạo điều kiệncho việc tiếp xúc giữa tế bào vi khuẩn và bề mặt

Sự phát triển của các tế bào vi khuẩn trong biofilm đã được chứngminh là có tăng lên khi tăng mức độ thô ráp của bề mặt Điều này được giảithích là do ở bề mặt thô ráp, lực tương tác giữa các tế bào với bề mặt bị giảm

đi và diện tích tiếp xúc tăng lên so với bề mặt nhẵn [12]

Các tính chất cấu tạo của bề mặt cũng ảnh hưởng mạnh đến tốc độ vàmức độ gắn kết tế bào lên bề mặt Hầu hết các nghiên cứu nhận thấy rằng các

vi sinh vật gắn kết với một bề mặt kị nước, không phân cực như Teflon vànhựa nhanh hơn là so với một vật liệu ưa nước như thủy tinh hay kim loại[10]

 Điều kiện môi trường

Các đặc trưng hóa lý của môi trường nước như pH, mức độ dinhdưỡng, nồng độ các ion, nhiệt độ có thể đóng vai trị quan trọng trong mức độgắn kết vi sinh vật lên bề mặt

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng bám dính của vi sinh vật và sựhình thành màng sinh vật cũng chịu ảnh hưởng của nhịp điệu mùa ở các lưuvực nước khác nhau [18] Hiệu ứng này có được là do ảnh hưởng của nhiệt độnước theo mùa lên các thông số tăng trưởng của vi sinh vật Năm 1988,Fletcher đã chứng minh sự gia tăng nồng độ của một số cation (Na+, Ca2+,

Fe3+, La+) ảnh hưởng đến khả năng bám dính của chủng Pseudomonas fluorescens lên bề mặt thủy tinh, bằng cách làm giảm lực tương tác giữa các

tế bào vi khuẩn với bề mặt kính [23] Nghiên cứu của Cowan và cộng sự(1991) cho thấy sự gia tăng nồng độ chất dinh dưỡng tỷ lệ thuận với số lượnggắn kết của các tế bào vi khuẩn lên bề mặt [14].

 Đặc tính tế bào

Mặc dù biofilm là hình thức tồn tại phổ biến của vi sinh vật trong môitrường tự nhiên nhưng không phải vi sinh vật nào cũng có khả năng hìnhthành biofilm Các đặc tính của tế bào bao quanh các cấu trúc phụ trợ nhưlông roi, lụng nhung, khả năng di động, khả năng tạo các chất ngoại bào(protein, polysaccharide) ảnh hưởng lớn đến việc hình thành biofilm [16].Những vi sinh vật có lông roi, lông nhung sẽ giúp cho việc di chuyển trongmôi trường nước tốt hơn nên có hiệu quả tạo biofilm cao hơn Ngoài ra,chúng còn có ưu thế trong việc di chuyển đến một bề mặt giá thể xác định,nơi có điều kiện thuận lợi cho việc hình thành biofilm, đồng thời giúp choviệc bám dính ban đầu của tế bào với bề mặt

Tuy nhiên một số loài không có phần phụ trợ tế bào nhưng vẫn có khảnăng hình thành biofilm mạnh dựa vào khả năng tự tổng hợp sẵn các chấtngoại bào như lipopolysaccharide, glycoprotein tạo thành cấu trúc màng giáp(capsule), màng nhày (slime) bao quanh tế bào [1] Đặc tính này tạo tính tự

kết dính cho tế bào, đặc biệt là những vi sinh vật gây bệnh như: Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Xanthomonas, Bacillus anthracis [13].

1.4 Các phương pháp phân loại vi sinh vật

Vi sinh vật rất đa dạng trong tự nhiên Tuy nhiên, chỉ một phần nhỏtrong số chúng là có thể nuôi cấy được trong điều kiện phòng thí nghiệm Do

đó, việc phân loại chúng gặp nhiều khó khăn Hiện nay có nhiều phương pháp

để phân loại vi sinh vật Các phương pháp cổ điển chỉ dựa vào các đặc điểmsinh lý, sinh hóa và hình thái cấu tạo bên ngoài để phân loại vi sinh vật, cònphương pháp hiện đại lại chú trọng nhiều đến việc nghiên cứu các phân tửacid nucleic như DNA, RNA để áp dụng trong phân loại Từ đó có thể thành

lập cây phát sinh chủng loại, phản ánh mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa cácloài với nhau.

1.4.1 Phương pháp phân loại truyền thống

Phương pháp phân loại cổ điển sử dụng hình thái kết hợp những đặcđiểm hình dạng bên ngoài và các đặc điểm sinh lý để phân loại Các phươngpháp cổ điển thường dùng các chỉ tiêu để phân loại là:

- Các đặc điểm về hình thái: màu sắc, kích thước của khuẩn lạc pháttriển trên môi trường; các đặc điểm giống nhau về hình dạng, kíchthước, có hay không có tiên mao của tế bào vi khuẩn

- Các đặc điểm về sinh hóa: phản ứng nhuộm Gram, sự kháng chấtkháng sinh, sự trao đổi chất và dinh dưỡng, đối tượng vật chủ, phântích phân tử acid teichoic

Ngoài ra, còn nhiều phương pháp khác như: kiểm tra các phản ứng sinhhóa của vi sinh vật với các chất phản ứng khác nhau, các phản ứng miễn dịchcủa các kháng nguyên là thành phần cấu tạo của tế bào như kháng nguyên Ocủa lipopolysaccharide hay của bao nhầy thường được sử dụng để phân biệtcác chủng của một loài

1.4.2 Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử

Hiện nay, các phương pháp phân loại hiện đại thường dựa trên việcđánh giá mức phân tử acid nucleic Trên cơ sở trình tự DNA, người ta cónhiều phương pháp khác nhau để tiến hành phân loại Từ cuối thế kỷ 20, đặcbiệt là những năm 1980 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh họcphân tử, người ta đã sử dụng một phương pháp nghiên cứu mới cho phân loại

vi sinh vật đó là “phân loại học phân tử” Phương pháp mới này có thể pháthiện, mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử giữa các loài vàtrong phạm vi loài trong thời gian ngắn và có độ chính xác cao

Trước đây, việc phân loại vi sinh vật đôi khi gặp khó khăn và thiếu

chính xác Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, việc phân loạingày nay dựa chủ yếu vào nghiên cứu trên các phân tử acid nucleic (DNA,RNA) Các phương pháp này phản ánh chính xác hơn mối quan hệ về mặt tiếnhóa giữa các nhóm sinh vật Tuy nhiên, không thể phủ nhận vai trò của cácphương pháp phân loại dựa trên các đặc điểm bên ngoài Do vậy, cần kết hợp

cả hai phương pháp để kết quả phân loại được chính xác

Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA được coi là phương pháp hữuhiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các vi sinh vật, vìrRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có chức năng xác định và là trình tự

có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật Dựavào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinhchủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật Trong 3 loại gen rRNA của vikhuẩn (5S, 16S, 23S) thì gen 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứuphân loại Gen mã hóa cho 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotide,

dễ đọc và so sánh trình tự, nhưng lại không đủ để phân biệt một cách chitiết giữa các chủng Ngược lại, gen mã hóa 23S rRNA lại có kích thướclớn (3000 nucleotide) do đó gây khó khăn cho việc tách dòng, đọc và sosánh trình tự Chỉ có gen 16S rRNA với kích thước khoảng 1500 nucleotidevừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi s inh vật và cũng không gâykhó khăn trong nghiên cứu Do đó, nó được ưu tiên chọn lựa trong việcphân loại vi khuẩn Gen mã hóa cho cấu trúc 16S rRNA đã được các nhàkhoa học nghiên cứu kỹ lưỡng và họ đã thiết lập được rất nhiều các c ặpmồi để nhân đoạn chúng bằng kỹ thuật PCR Đây là một thuận lợi lớn chocác nghiên cứu phân loại dựa trên gen mã hóa 16S rRNA [25]

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu nước thải được lấy tại cống thoát nước ở bể chứa kho xăng dầu Đỗ

Xá, Thường Tín, Hà Nội, được lưu trữ ở phòng Công nghệ sinh học môitrường, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Namtrong vòng 24 giờ để phân tích

2.1.2 Hóa chất, môi trường

Mồi xuôi (341F) : 5’ - CCTACGGGAGGCAGCAG - 3’

Mồi ngược (907R) : 5’ - CCGTCAATTCMTTTGAGTTT - 3’ [34]

 Môi trường nuôi cấy:

Môi trường LB dịch (g/l) Môi trường MPA dịch (g/l)

- Môi trường MPA thạch (g/l):

Công thức các hóa chất giống môi trường MPA dịch nhưng có bổ sungthêm từ 18-20 g agar, nước máy vừa đủ 1lớt

Môi trường khoáng Gost dịch (g/l) Môi trường hiếu khí tổng số dịch

giàu dinh dưỡng (g/l)

- Môi trường khoáng Gost thạch:

Công thức các hóa chất giống môi trường Gost dịch nhưng có bổ sungthêm từ 18 – 20 g agar, nước máy vừa đủ 1 lớt

- Môi trường hiếu khí tổng số thạch giàu dinh dưỡng (g/l):

Công thức các hóa chất giống môi trường hiếu khí tổng số dịch nhưng

có bổ sung thêm từ 18 – 20 g agar, nước máy vừa đủ 1 lớt

- Nước muối sinh lý (0,85%)

Trong quá trình nghiên cứu, các thiết bị, máy móc đã được sử dụng có

độ chính xác cao tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường vàphòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về công nghệ Gen – Viện Công nghệsinh học

Dụng cụ chứa mẫu: chai nhựa PE có nắp đậy đã được làm sạch

Dụng cụ lấy mẫu: que khuấy, gáo múc nước đã được rửa sạch bằng xàphòng và tráng qua nước cất

2.2Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu

- Địa điểm: cống thoát nước thải ở bể chứa kho xăng Đỗ Xá, ThườngTín, Hà Nội

- Cách lấy mẫu: tại các vị trí lấy mẫu, ta tiến hành khuấy đảo để trộn đều