nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của viêm loét giác mạc do virus herpes tại bệnh viện mắt trung ương

Việc chẩn đoán VLGM do HSV trong những trường hợpđiển hình chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng và xét nghiệm tế bào học,những trường hợp triệu chứng lâm sàng không điển hình hầu như chỉ

bỏ mắt gây ảnh hưởng nặng nề đến chất lượng cuộc sống của người bệnh

Ở Việt Nam do đặc điểm khí hậu nóng ẩm, ô nhiễm môi trường, mứcsống của người dân còn thấp, dân trí còn hạn chế, việc chăm sóc mắt chưađược quan tâm đúng mức, người dân chưa có thói quen bảo vệ và phòng bệnhcho mắt, khi bị bệnh không đi khám, chữa kịp thời ở giai đoạn sớm mà vẫn tự

ý dùng thuốc (đặc biệt là dùng Corticoid) làm tăng tỷ lệ mắc bệnh, bệnh trởnên trầm trọng, điều trị trở nên khó khăn, thời gian điều trị kéo dài dẫn đếnnhững hậu quả đáng tiếc

Trong 10 năm (1998-2007) tại Bệnh viện Mắt Trung ương, theo nghiêncứu của Lê Anh Tâm, VLGM do HSV chiếm tỷ lệ từ 10,3- 20,0% (tỷ lệ trungbình là 15.3%) [7] Việc chẩn đoán VLGM do HSV trong những trường hợpđiển hình chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng và xét nghiệm tế bào học,những trường hợp triệu chứng lâm sàng không điển hình hầu như chỉ dựa vàokinh nghiệm của các bác sỹ mà chưa có xét nghiệm đặc hiệu chứng minh sự

có mặt của HSV trong giác mạc tổn thương

Phản ứng chuỗi khuếch đại gen (PCR- Polymerase Chain Reaction) donhà hoá sinh học Kary Mullis tìm ra cuối thế kỷ 20 đã mang lại cho ông giảiNobel hoá học năm 1993 và làm nên cuộc đại cách mạng sinh học phân tử vớicác ứng dụng kỳ diệu trong mọi lĩnh vực Trên thế giới đã có nhiều nghiên

cứu về ứng dụng PCR chứng minh sự có mặt của HSV trong VLGM do HSV.

Tỷ lệ phát hiện ADN của HSV trong những trường hợp VLGM do HSV điểnhình lên đến trên 90% với độ chính xác và tin cậy rất cao [25], [34], [41]

Ở Việt Nam, PCR chưa được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng nhất làtrong ngành Nhãn khoa do PCR còn là một kỹ thuật mới, giá thành còn cao sovới khả năng chi trả của đa số bệnh nhân (máy và các mẫu thử đều phải nhập

từ nước ngoài), số phòng xét nghiệm có thể làm được PCR còn ít và cácnghiên cứu về ứng dụng của PCR chưa nhiều Tuy nhiên nhu cầu có một xétnghiệm đặc hiệu giúp chẩn đoán VLGM do HSV trong lâm sàng là rất lớn.Với mong muốn góp một phần vào việc chẩn đoán VLGM do HSV nhanhchóng và chính xác để điều trị bệnh đúng, có hiệu quả, giảm chi phí, rút ngắnthời gian điều trị và hạn chế những hậu quả không đáng có cho bệnh nhân,

chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng

của Viêm loét giác mạc do Virus Herpes tại Bệnh viện Mắt Trung ương”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giải phẫu, sinh lý và tổ chức học giác mạc:

Giác mạc là một màng trong suốt, rất dai, chiếm 1/ 5 phía trước vỏ ngoàinhãn cầu, liên tiếp tại vùng rìa với kết mạc và củng mạc Giác mạc có hìnhchỏm cầu, đường kính ngang 11-12 mm, đường kính dọc 9-11 mm, bán kínhcong mặt trước khoảng 7,8 mm, bán kính cong mặt sau khoảng 6,8 mm, giácmạc dày khoảng 0,50 mm ở trung tâm, ở rìa dày khoảng 1 mm, công suất hội

tụ là 43- 45D [6]

Phía sau giác mạc là tiền phòng chứa đầy thuỷ dịch Giác mạc được nuôidưỡng nhờ sự thẩm thấu từ nước mắt, thuỷ dịch và từ vùng rìa vào nhờ 2 cungmạch nông và sâu Giác mạc không có mạch máu, rất phong phú về thần kinh.Thần kinh cảm giác mạc chủ yếu từ là các dây thần kinh mi xuất phát từnhánh thần kinh mắt (V1), các dây thần kinh mi dài từ nhánh thần kinh mũi(V2), các dây thần kinh mi ngắn từ hạch mi

Giác mạc được bảo vệ bởi màng nước mắt rất mỏng và mi mắt ở phíatrước, vì vậy nếu rối loạn về thành phần, số lượng nước mắt hoặc sự bấtthường của mi mắt (hở mi, lật mi…) làm mắt khô hay nhắm không kín, đều lànhững yếu tố nguy cơ gây tổn thương giác mạc [1]

Về phương diện mô học, giác mạc gồm có 5 lớp từ trước ra sau: biểu mô,màng Bowmann, nhu mô, màng Descemet và nội mô[6]

1.1.1 Biểu mô

Là lớp ngoài cùng của giác mạc, liên tiếp với biểu mô kết mạc và dễ bị tách

ra khỏi màng Bowmann ở dưới Biểu mô dày 32- 50 µm, gồm 5- 6 hàng tếbào không sừng hoá Khi bị tổn thương, lớp này tái tạo rất nhanh và không đểlại sẹo

Nhu mô chiếm 9/10 chiều dày giác mạc, là lớp tổ chức liên kết có cấu

trúc sắp xếp đặc biệt để đảm bảo tính trong suốt (các sợi collagen li ti có kíchthước đồng đều xếp song song xen kẽ với các sợi thần kinh không có vỏMyelin, các giác mạc bào và các chất ngoại bào) Nhu mô bị tổn thương sẽ đểlại sẹo vĩnh viễn

Các sợi thần kinh xuất phát từ thần kinh mi dài đi trong nhu mô theohình nan hoa và tận cùng ở giữa các tế bào biểu mô nên tổn thương giác mạccàng nông thì triệu chứng kích thích càng mạnh Trong VLGM do HSV, thầnkinh V bị tổn thương do virus nên cảm giác giác mạc bị giảm hoặc mất

1.1.4 Màng Descemet

Dày ~ 6µm, rất dai và rất đàn hồi Khi loét giác mạc sâu làm mất tổ chức

3 lớp trên, dưới áp lực của thuỷ dịch, màng Descemet có thể bị đẩy phồng ra phíatrước như “mắt cua” Khi bị tổn thương nhẹ, màng Descemet có thể hồi phục

1.1.5 Nội mô

Là lớp trong cùng của giác mạc nằm ở mặt sau màng Descemet, dày 4- 6

µm Nội mô có tầm quan trọng đặc biệt trong việc bảo vệ tính trong suốt củagiác mạc bằng cách điều hoà sự thẩm thấu nước vào giác mạc Nội mô chỉ cómột lớp tế bào dẹt hình đa giác không có khả năng phân chia, nên khi tế bàonội mô bị mất đi vì một lý do nào đó thì tế bào bên cạnh phải giãn to để bùđắp vào chỗ thiếu hụt Khi nội mô bị tổn thương nặng, mật độ tế bào nội môchỉ còn dưới 200 tế bào/ mm2 thì số tế bào nội mô còn lại sẽ mất khả năng bùtrừ làm giác mạc bị ngấm nước trở nên phù đục, loạn dưỡng

1.2 Đặc điểm của Herpes Simplex Virus ( HSV)

HSV nằm trong một họ lớn là Herpesviridae Họ này gồm 3 họ nhỏ: HọAlpha (α), họ Beta (β﴿ và họ Gamma (γ) [2] [3], [45]

Họ Alpha (dòng phụ α herpesvirinae) có một số tính chất chung như chu

kỳ phát triển ngắn, chúng gây ly giải tế bào nhiễm trùng và gây nhiễm trùngtiềm tàng ở các tế bào thần kinh

Họ Beta(Cytomegalovirus)

Họ Gamma(Epstein BarrVirus) )virus)

Herpes Simplex

Virus

Varicella- Zoster Virus

HSV- 1 HSV-2

- Lõi trung tâm: gồm một ADN chuỗi kép được bao quanh bởi một capsithình đa giác 20 mặt tạo ra hệ di truyền.

- Vỏ lipoprotein: bao quanh lõi, gồm 162 đơn vị axit amin kết hợp với nhau

- Màng: là phần dưới vỏ, nối liền giữa vỏ và bao Màng là một khối hìnhcầu có chỗ dày chỗ mỏng

- Bao: nằm ở ngoài cùng, có nguồn gốc từ màng nhân của tế bào bịnhiễm virus

HSV hoàn chỉnh (phải có đủ 3 thành phần: lõi, vỏ và bao) mới có khảnăng gây bệnh, còn khi chỉ có lõi và vỏ (không có bao) thì không có khả nănggây bệnh[2], [45]

1.2.2 Thành phần hoá học

Mỗi HSV chứa nhiều axit amin (tỉ lệ Adenin và Cytosin cao) và nhiềuloại protein khác Ước lượng HSV chứa đựng: protein 70%, phospholipit22%, hydrat carbon 1,5% và ADN 6,5% [45]

1.2.3 Cơ chế gây bệnh:

HSV là vi sinh vật sống ký sinh trong tế bào vật chủ, nó không thể nhânlên ở ngoài tế bào Khi ở trong tế bào vật chủ, nó dùng chất liệu của tế bào đểtổng hợp ra ADN virus mới và làm cho tế bào chết HSV xâm nhập vào tế bàovật chủ qua 3 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Virus áp sát tế bào và bám chặt vào các điểm tiếp nhậnvirus ở trên màng tế bào

- Giai đoạn 2: Virus chui vào trong tế bào bằng cách đại thực bào hoặcmàng của tế bào và virus dính lại với nhau

- Giai đoạn 3: Do các men có trong tế bào, virus sẽ mất bao và vỏ chỉcòn lõi ADN Trong tế bào vật chủ, chúng có thể sinh sản hoặc sống màkhông sinh sản

HSV sinh sản trong nhân tế bào, chứ không phải ở chất nguyên sinh,bằng cách sao chép lại ADN của nó Mỗi tế bào có thể sao được 80 000 đến

120 000 ADN virus mới.Trong số đó chỉ có khoảng 20% có khả năng gâybệnh Trong nhân tế bào, HSV thông qua các ARN thông tin để tổng hợp mộtloạt các men như ADN-polymeraza, thymidinkinaza…Các men này tham giavào quá trình tổng hợp ADN của HSV

Sau khi hình thành vỏ, HSV sẽ áp sát vào màng nhân tế bào vật chủ đểtạo thành bao cho mình và lúc này virus đã hoàn chỉnh Người ta đã xác định

có 2 týp HSV là:

- HSV- 1: chủ yếu gây bệnh ở phần trên thắt lưng (miệng, họng, mặt,mắt, não…) Tổn thương tại mắt thường là viêm kết giác mạc, viêm màng bồđào, viêm hắc võng mạc…

-HSV- 2: chủ yếu gây bệnh ở phần dưới thắt lưng (bộ phận sinh dục)

Do HSV có nhân ADN nên ngoài khả năng ký sinh trong tế bào, chúng còn

có khả năng làm biến đổi tế bào (loạn sản) tức là tạo u (HSV- 1 có quan hệ với cácung thư ở đầu cổ, HSV- 2 có quan hệ với các ung thư cổ tử cung) [2]

1.3 Đặc điểm lâm sàng của viêm loét giác mạc do HSV

1.3.1 Đặc điểm gây bệnh của HSV

Vật chủ tự nhiên duy nhất của HSV là con người Khi vào cơ thể, virusgây sơ nhiễm cho người Trong lần sơ nhiễm này, chỉ có 10- 20% số ngườinhiễm có triệu chứng lâm sàng, 80- 90% không có biểu hiện lâm sàng Nhữngngười bị sơ nhiễm sẽ mang HSV tiềm tàng suốt đời và có kháng thể HSV đặchiệu trong máu HSV cư trú trong hạch thần kinh của họ, nhưng không gâybệnh Khi có điều kiện thuận lợi như sốt, rối loạn nội tiết, suy nhược cơ thể,sau phẫu thuật, dùng thuốc ức chế miễn dịch kéo dài, HIV/AIDS HSV hoạtđộng trở lại (tái hoạt), bệnh tái phát trên lâm sàng và là nguồn lây cho nhữngngười khác [1], [45]

Sơ nhiễm HSV ở người xảy ra ở phần cơ thể chi phối bởi dây thần kinh

số V, biểu hiện lâm sàng như một nhiễm trùng đường hô hấp trên không đặchiệu Trong thời kỳ sơ nhiễm, HSV đi từ biểu mô nhiễm trùng đến các tậncùng thần kinh cảm thụ của mô đó, rồi theo sợi trục thần kinh tới thân tế bàonằm ở hạch thần kinh cảm thụ Sau đó, HSV đi vào nhân của tế bào thần kinh

và tồn tại trong đó ở trạng thái tiềm tàng (không gây bệnh) Sơ nhiễm bất kỳmột trong ba nhánh của dây thần kinh số V có thể gây nhiễm trùng tiềm tàngcác tế bào thần kinh cảm thụ bên trong hạch thần kinh chi phối cả 3 nhánh củadây V do sự lây truyền HSV giữa các tế bào thần kinh trong thời kỳ sơ nhiễmhoặc tái hoạt Do đó, bệnh nhân có thể bị bệnh HSV mắt tái phát mà chưa hề

bị sơ nhiễm ở mắt

Khi gặp điều kiện thuận lợi, HSV ở hạch thần kinh được tái hoạt và theocác sợi trục thần kinh tới các tận cùng thần kinh cảm thụ rồi sang các tế bàobiểu mô của kết mạc, giác mạc Tại đó HSV sẽ sao chép, phân giải tế bào vàgây nên các triệu chứng lâm sàng Viêm nhu mô giác mạc tái phát do HSVgây tổn hại thị lực nhiều nhất Hầu hết bệnh nhân viêm nhu mô giác mạc cótiền sử viêm biểu mô trước đó hoặc đồng thời Có sự tương quan chặt chẽgiữa số lần tái phát của bệnh và nguy cơ xuất hiện viêm nhu mô giác mạc

1.3.3 Triệu chứng lâm sàng

1.3.3.1 Triệu chứng cơ năng

Bệnh nhân có các triệu chứng kích thích như: co quắp mi, chói, chảynước mắt, đau nhức mắt, nhìn mờ Tuy nhiên ở nhiều bệnh nhân (nhất lànhững bệnh nhân bị tái phát) các triệu chứng trên lại rất nhẹ nhàng, bệnh nhânchỉ thấy mắt hơi đỏ, hơi cộm mặc dù ổ loét giác mạc có thể rất rộng.Thường không có sự tương xứng giữa triệu chứng chủ quan của bệnh nhân vàtổn thương thực thể khi thăm khám bằng sinh hiển vi Trường hợp không cóloét giác mạc thì các triệu chứng chủ quan của bệnh nhân lại càng nghèo nàn,bệnh nhân không thấy mắt kích thích hoặc kích thích rất ít Triệu chứng chủquan buộc bệnh nhân đến khám là nhìn mờ và thấy đám trắng ở giác mạc.Nếu không thăm khám kỹ có thể nhầm với sẹo giác mạc và bỏ qua [1], [5]

+ Nhiễm HSV ở mắt tái phát: Có nhiều loại: Viêm mi- kết mạc, viêmbiểu mô giác mạc hình cành cây hoặc hình bản đồ, viêm nhu mô giác mạc,viêm màng bồ đào [1], [3], [5]

không

-Viêm biểu mô giác mạc hình cành cây: Lúc đầu tổn thương trên giácmạc có thể là một viêm biểu mô chấm riêng rẽ, sau đó nhập lại thành hình câygồm những tế bào biểu mô sưng và mờ đục Những cành cây này thường ởtrung tâm giác mạc nhánh phình ra Sau vài ngày, các tế bào nhiễm virus ởtrung tâm cành cây bị phân giải và tróc ra tạo nên một vết loét hình cành câyđiển hình, các nhánh hơi lõm xuống so với bề mặt giác mạc, bờ có các tế bàođục dày lên, có thâm nhiễm mờ ở xung quanh Tổn thương khu trú ở biểu mô,không đi qua màng Bowmann, không ăn sâu xuống nhu mô và không có phảnứng màng Descemet.

- Loét biểu mô hình bản đồ: Từ dạng cành cây, ổ loét lan rộng ra vàđào sâu xuống để hình thành loét địa đồ Ổ loét rộng nhưng nông, hình dạngbất thường, màu xám vàng, bờ ổ loét dày đục, bắt màu Fluorescein Thâmnhiễm ăn sâu xuống tới lớp nông của nhu mô, chưa có tân mạch, có thể cóphù nhu mô, cảm giác giác mạc giảm hoặc mất

bồ đào

Viêm nhu mô giác mạc có 2 hình thái: không hoại tử và hoại tử

- Viêm nhu mô giác mạc không hoại tử (viêm giác mạc hình đĩa) biểuhiện bằng một vùng phù giác mạc hình đĩa, thị lực giảm nhanh, phù nhu mô,tủa sau giác mạc, nếp gấp màng Descemet, không kèm theo tân mạch nhu mô.Ngoài ra còn có dấu hiệu chấm lắng cặn trên màng Descemet và vành thâmnhiễm hình nhẫn bao quanh tổn thương hình đĩa Các dấu hiệu này xuất hiệnsau tổn thương hình đĩa và tồn tại cả khi tổn thương hình đĩa đã rút đi.Trườnghợp viêm giác mạc hình đĩa trầm trọng có thể có phù nhu mô rõ rệt, phù biểu

mô vi nang và bọng nước

- Viêm nhu mô giác mạc hoại tử: Biểu hiện bằng một hoặc nhiều thâmnhiễm hoại tử trắng giống pho mát, có tân mạch nhu mô đi từ rìa giác mạcvào vùng thâm nhiễm Tổ chức hoại tử tróc dần ra tạo một ổ loét rộng, ăn sâuxuống, rất khó liền, gây phồng màng Descemet hoặc thủng giác mạc.

Viêm nội mô giác mạc biểu hiện bằng lớp nội mô phù dày lên, có tủa saugiác mạc thường kèm theo viêm mống mắt thể mi, tăng nhãn áp, teo biểu mô

sắc tố và teo nhu mô mống mắt dạng mảng

1.3.3.3 iểu hiện lâm sàng của những trường hợp đã dùng Corticoid

Những bệnh nhân đã dùng Corticoid trước đó, hình ảnh lâm sàng thườngkhông còn điển hình như đã mô tả ở trên, ổ loét phát triển rất nhanh cả về chiều rộng và chiều sâu, giác mạc mất tổ chức nhiều dẫn đến phồng màng Descemet, thủng giác mạc [2], [40]

1.3.3.4 Biến chứng của VLGM do HSV

- Bệnh biểu mô dạng xoắn hoặc dạng chấm toả lan: Do độc tính củathuốc kháng virus tại chỗ

- Tróc biểu mô tái phát ở vùng tổn thương cũ: Do chấn thương màng đáy

- Khuyết biểu mô dai dẳng do dinh dưỡng thần kinh: Có thể xuất hiện ởnhững bệnh nhân bị mất cảm giác giác mạc

- Loét giác mạc do dinh dưỡng thần kinh: Có hình tròn hoặc hình bầudục nằm ở trung tâm hoặc phần dưới giác mạc Bờ ổ loét màu xám, nổi lên,

có vẻ cuộn lại Nếu không khỏi sẽ dẫn đến mỏng nhu mô và thủng giác mạc

- Sẹo giác mạc và loạn thị không đều: Xảy ra ở những bệnh nhân viêmnhu mô giác mạc mạn tính hoặc tái phát, gây ảnh hưởng nhiều đến thị lực

- Bệnh giác mạc lipit: Xảy ra ở những bệnh nhân viêm nhu mô giác mạcmạn tính có tân mạch giác mạc

1.4 Đặc điểm cận lâm sàng của viêm loét giác mạc do HSV

Để chẩn đoán xác định VLGM do HSV, ngoài triệu chứng lâm sàng điểnhình cần làm một số xét nghiệm cận lâm sàng đặc hiệu Đơn giản nhất là làmxét nghiệm tế bào học với mục đích tìm các biến đổi của tế bào biểu mô giácmạc khi bị nhiễm HSV [22] Ngoài ra, để xác định chính xác hơn sự có mặtcủa HSV trong mô tổn thương cần làm xét nghiệm như: nuôi cấy phân lậpvirus, phản ứng PCR…

1.4.1 Cách lấy bệnh phẩm

Tốt nhất là phải lấy bệnh phẩm trước khi điều trị, nếu bệnh nhân đang

điều trị thì phải dừng tra thuốc 12- 24 giờ

cùng đồ kết mạc phía dưới của mắt tổn thương (không chạm vào bề mặt nhãncầu), cho vào lọ vô khuẩn hoặc môi trường vận chuyển virus

Dùng thìa nạo chắp hoặc Spatule hoặc kim tiêm vô khuẩn nạo nhẹ ở bờ ổloét Sau đó bệnh phẩm được dàn lên lam kính sạch hoặc cho vào môi trườngvận chuyển virus

chuyên lấy dịch tiền phòng chọc qua giác mạc rìa vào tiền phòng hút lấy 0,1

ml thuỷ dịch cho vào môi trường vận chuyển virus

Các bệnh phẩm làm xét nghiệm tế bào học (nước mắt hoặc thuỷ dịch sẽđược li tâm lấy cặn) được dàn đều lên lam kính sạch Các bệnh phẩm làm

C tới khi làm phản ứng PCR

1.4.2 Xét nghiệm tế bào học

Là xét nghiệm thường quy làm tại Labo Vi sinh Bệnh viện Mắt Trung

ương nhằm đánh giá các biến đổi của tế bào biểu mô giác mạc khi bị nhiễm HSV

1.4.2.1 Quy trình làm xét nghiệm: Quy trình được tiến hành như sau:

- Dàn bệnh phẩm trên lam kính sạch rồi để khô tự nhiên

- Cố định tiêu bản bằng cồn Methanol

- Phủ dung dịch Giemsa ( được pha với tỷ lệ 1:4 ) lên tiêu bản, để 45 phút

- Rửa nhanh bằng cồn Ethanol 95%, để khô tự nhiên

- Soi tiêu bản đã nhuộm dưới vật kính dầu và đọc kết quả

+ Tế bào biểu mô kết mạc và giác mạc bình thường: Hơi to hơn bạchcầu, có nhân tròn ở trung tâm và bào tương thuần nhất, nhân tế bào bắt màuxanh tím, bào tương bắt màu hồng Tế bào vảy và tế bào biểu mô có thể cókhối hình vuông và tập trung thành các lớp [22].

Tế bào biểu mô giác mạc bị nhiễm HSV sẽ có các hình thái sau [22]:+ Tế bào biểu mô đa nhân khổng lồ: Hình ảnh tế bào có nhiều nhân donhân không phân chia được trong quá trình phân bào hoặc do sự hợp nhất củanhiều tế bào tạo nên

+ Tế bào biểu mô đa hình thái: Nhân tế bào không còn là hình tròn mà

có thể là hình hạt đậu, hình nhiều cạnh hoặc không xác định được hình dạng + Hiện tượng đông đặc chất nhiễm sắc quanh rìa: Chất nhiễm sắc củanhân tụ tập hoặc kết thành khối dọc theo rìa nhân

+ Thể vùi trong nhân (thể vùi Lipschutz): Những thể vùi ưa eosin trongnhân dễ phát hiện bằng nhuộm Papanicolaou hơn là nhuộm Gram Một quầngsáng nhạt bao quanh thể vùi, nhân bị di lệch Để phát hiện thể vùi trong nhân

và hiện tượng đông đặc chất nhiễm sắc quanh rìa phải có kính hiển vi điện tử

và bệnh phẩm phải được nhuộm bằng phương pháp Papanicolaou

1.4.2.2 Đánh giá kết quả

Chẩn đoán dương tính khi có ít nhất một trong các đặc điểm sau trên tiêu bản: + Tế bào biểu mô đa nhân khổng lồ

+ Tế bào biểu mô đa hình thái

+ Hiện tượng đông đặc chất nhiễm sắc quanh rìa

+ Thể vùi trong nhân với viền sáng bao quanh (thể vùi Lipschutz)

1.4.3 Phản ứng PCR

1.4.3.1 Sơ lược lịch sử phát triển

Năm 1983, từ một ý tưởng « Dùng nhiệt độ tách sợi đôi ADN thành

hai mạch đơn » khi nhìn thấy hình ảnh hai làn bánh xe mới tách khỏi hai làn

bánh xe cũ mà Kary Mullis đã phát minh ra kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗitrùng hợp) vào năm 1985 và tạo nên một cuộc đại cách mạng trong sinh họcphân tử Năm 1993, Kary Mullis được trao giải Nobel hoá học nhờ phát minhnày Sau đó, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinhhọc và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau như: phát hiện các bệnh ditruyền, nhận dạng vân tay ADN, chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, tách dònggene, xác định huyết thống…

1.4.3.2 Ứng dụng của PCR trong y học

- Chẩn đoán bệnh ung thư, nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người

- Phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh trong các trường hợp:

* Tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các virus (viêm gan B,viêm gan C, Dengue, HIV, HSV, CMV, EBV, HPV, SARS, H5N1…), các vi

khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma,Treponema llidum…).

* Tác nhân nuôi cấy thường quy cho kết quả chậm: M tuberculosis.

* Tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm hoặc đã bịđiều trị kháng sinh trước đó (Lao thất bại khi nuôi cấy, viêm màng não mủ đãdùng kháng sinh làm mất triệu chứng điển hình…)

- Quá trình sao chép được thực hiện trong một chu trình nhiệt lặp lại với

sự tham gia của men Polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase có hoạt tính tối

đa ở 72oC và bền với nhiệt độ); các desoxy- nucleotide triphosphat tự do(dNTP) là Adenine, Thymine, Guanine, và Cytosine (dATP, dTTP, dGTP, vàdCTP) và các đoạn mồi đặc hiệu cho đoạn ADN định sao chép.

- Sản phẩm PCR được phát hiện bằng kỹ thuật điện di trên gel agarosa

•Tách ADN của HSV trong bệnh phẩm:

- Phá tế bào giải phóng AND: Cho dung dịch ly giải tế bào vào mỗi

bệnh phẩm Lắc kỹ bằng máy trong 10 phút Ly tâm lấy cặn

- Tinh sạch AND: Rửa 2 lần bằng Ethanol 70% Rửa 1 lần bằng

acetone Phơi khô trong bể nước 56oC (10-15 phút)

- Thu hồi AND: Cho dung dịch gồm Tris-HCl pH 8 + EDTA vào mỗi

Tách nước nổi chứa ADN và sử dụng để chạy PCR

•Cho mẫu vào ống phản ứng PCR:

Dung dịch chứa ADN (tách từ bệnh phẩm) được cho vào ống phản ứng

đã chứa sẵn hỗn dịch trộn Mỗi bệnh phẩm cần có hai ống phản ứng: Ống A

sử dụng để chạy phản ứng với bệnh phẩm, ống B dùng để kiểm tra chất ứcchế (nếu có) trong bệnh phẩm, ống B ngoài ADN tách từ bệnh phẩm còn được

cho thêm ADN mồi.

- Ống A: 10µl dung dịch ADN tách từ bệnh phẩm

- Ống chứng dương: 10 µl ADN của HSV.

- Ống chứng âm: 10 µl dung dịch Tris-HCl pH 8 + EDTA

Bước 1 (Khởi đầu): Đun hỗn hợp ở 96°C trong 5 phút để sợi ADN và

mồi được làm nóng ADN- polymerase được cho vào hỗn hợp trong bướcnày, hoặc ngay sau bước này

Bước 2 (Biến tính): Nhiệt độ 94- 96°C sẽ phá vỡ các liên kết hydro của

mạch đôi ADN để tách thành hai sợi ADN đơn ADN được biến tính đến thờigian mở chuỗi để đảm bảo mẫu ADN và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉcòn dạng sợi đơn

Bước 3 (Gắn mồi): Sau khi 2 sợi ADN đơn tách ra, nhiệt độ được hạ

thấp xuống (55 - 65°C) để đoạn mồi có thể gắn vào sợi ADN đơn Nhiệt độ trongbước này phụ thuộc vào đoạn mồi ADN Sử dụng sai nhiệt độ sẽ dẫn đến việcđoạn mồi gắn không hoàn toàn hay gắn một cách tùy tiện vào ADN mẫu

Bước 4 (Kéo dài): ADN- polymerase gắn vào và hoạt động dọc theo sợi

ADN Nhiệt độ được đưa lên 72°C là nhiệt độ thích hợp cho hoạt động củaADN- polymerase để tổng hợp mạch bổ xung Thời gian của bước này phụthuộc vào ADN-polymerase và chiều dài mảnh ADN cần khuếch đại, với quytắc 1000bp/ 1 phút

Bước 5: Các bước từ 2 đến 4 được lặp lại 25 lần (từ một ADN đích đã

•Điện di sản phẩm PCR:

Sản phẩm PCR được nhận biết qua sắc ký gel agarose (nhỏ mẫu sảnphẩm PCR vào gel agarose, sau đó chạy điện di) Kết quả là các đoạn ADNnhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn các đoạn ADN lớn qua gel từ cực âm đếncực dương Kích thước của sản phẩm PCR được xác định bằng việc so sánhvới thang AND mẫu (chứa các ADN đã biết trước kích thước) Gel được lấy

ra và nhuộm trong dung dịch Ethidium bromide 0.2µg/ml trong 20 phút

1.5.Các nghiên cứu về VLGM do HSV và ứng dụng PCR trong chẩn đoán VLGM do HSV ở Việt Nam và trên thế giới:

Theo các điều tra dịch tễ học có 80% dân số thế giới có sơ nhiễm vớiHSV nhưng chỉ có 10- 20% có biểu hiện lâm sàng [11], [12]

Theo nghiên cứu của Lies Remeijer và cộng sự, khoảng 45- 88% ngườitrưởng thành có kháng thể HSV- 1 trong máu, 70- 80% người khoẻ mạnh cóADN của HSV-1 trong hạch thần kinh sinh ba và chỉ 5% bệnh mắt do HSV

là nhiễm khuẩn sơ phát [38] Theo Liesegang và cộng sự, tỷ lệ mắc HSV sơnhiễm là khoảng 8,4 bệnh nhân trong 100 000 người hàng năm và ước tínhhàng năm có khoảng 149 bệnh nhân trong 100 000 người mắc bệnh mắt doHSV []

Hassanain cùng các cộng sự cũng chỉ ra tỷ lệ tái phát sau viêm biểu môgiác mạc hoặc viêm nhu mô giác mạc là khoảng 10% hàng năm [19], còn tỷ lệnày theo A.Tullo là khoảng 50 000 bệnh nhân mới hoặc tái phát hàng năm ở

Trong nghiên cứu của M.A Khodadoost và cộng sự, kết quả PCR dươngtính là 88% khi lấy chất nạo giác mạc của 25 bệnh nhân VLGM điển hình doHSV [25]

Tỷ lệ dương tính của PCR đạt tới 100% trong các nghiên cứu của M.Fukuda khi tiến hành trên những bệnh nhân viêm biểu mô điển hình và khuyết

biểu mô dai dẳng [15] Trong một nghiên cứu khác của M Fukuda trên nhữngbệnh nhân viêm biểu mô giác mạc, viêm nhu mô giác mạc và khuyết biểu mô daidẳng cũng cho kết quả PCR dương tính tương ứng là 81%; 59% và 88,9% [34] Theo nghiên cứu của Lê Anh Tâm tại Bệnh viện Mắt Trung ương trong

10 năm (1998- 2007) VLGM do HSV chiếm tỷ lệ từ 10,3-20,0% (tỷ lệ trungbình là 15.3%), tỷ lệ dương tính của xét nghiệm tế bào học là 46,03% [7].Đến nay ở Việt Nam, mới có 1 công trình nghiên cứu của tác giả PhạmThị Thu Lan và các đồng nghiệp được báo cáo năm 2009 về ứng dụng củaphản ứng PCR trong chẩn đoán bệnh VLGM do HSV- 1 Tác giả nghiên cứutrên 130 mẫu bệnh phẩm là chất nạo giác mạc, nước mắt và thuỷ dịch của 83bệnh nhân VLGM nghi do HSV đến khám và điều trị tại BVMTW từ 8/2008đến 5/2009 Tỷ lệ PCR dương tính là 66,6% trên mẫu chất nạo giác mạc,21,5% trên mẫu nước mắt [4]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm và đối tượng nghiên cứu

Tất cả những bệnh nhân được chẩn đoán bệnh VLGM (lần đầu hoặc táiphát) có triệu chứng lâm sàng điển hình hoặc nghi ngờ do HSV (không kểtuổi, giới, thời gian bị bệnh, số lần tái phát) được khám tại phòng khám hoặcđiều trị nội trú tại khoa Kết- Giác mạc Bệnh viện Mắt Trung ương từ 12/2011đến 9/2012

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

- Bệnh nhân bị VLGM lần đầu hoặc tái phát có các triệu chứng lâm

sàng sau:

+ Loét giác mạc hình cành cây, địa đồ

+ Viêm nhu mô giác mạc

+ Viêm nội mô giác mạc

- Bệnh nhân VLGM nghi ngờ do HSV, viêm khuyết biểu mô dai dẳngđiều trị bằng các phương pháp khác không tiến triển

- Bệnh nhân có điều kiện và đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân đã được chẩn đoán xác định VLGM do các nguyên nhânkhác (vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng…)

- VLGM do cơ chế miễn dịch

- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

- Nghiên cứu mô tả cắt ngang.

- Cỡ mẫu tính bằng công thức:

N = Z²1- α / 2 2

) 1 (

d là sai số tuyệt đối, chọn d = 0,1

Theo công thức trên, ta tính được số mẫu tối thiểu là 50 mắt

2.2.2 Phương tiện nghiên cứu

- Bảng thị lực Snellen

- Hộp kính thử

- Máy sinh hiển vi khám mắt

- Test nhuộm màu Fluorescein:

- Phiếu nghiên cứu

- Các phương tiện ghi lại hình ảnh nghiên cứu

- Dụng cụ lấy mẫu bệnh phẩm và môi trường bảo quản bệnh phẩm thu được

2.3 Các bước tiến hành lấy số liệu

2.3.1 Hỏi bệnh: Các thông tin được điền vào phiếu nghiên cứu.

- Hành chính: Họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, nghề nghiệp

- Hỏi bệnh:

+ Lý do đến khám

+ Bị bệnh lần đầu hay tái phát, tái phát lần thứ mấy

+ Thời gian bị bệnh trước khi vào viện

+ Các triệu chứng cơ năng: nhìn mờ, cộm vướng, đỏ mắt, chảynước mắt, nhức mắt…

+ Yếu tố thuận lợi gây bệnh:

+ Quá trình điều trị trước khi đến khám: Thuốc đã dùng, diễn biến củacác triệu chứng, thời gian dùng thuốc…

2.3.2 Khám lâm sàng: Các triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân được khám

và phân loại bởi một bác sỹ chuyên khoa Mắt

- Thử thị lực không kính và qua kính lỗ và đánh giá thị lực theo quyđịnh của Tổ chức Y tế Thế giới năm 1997:

+ Thị lực kém: ≤ 20/60

+ Thị lực khá: 20/50 – 20/30.

+ Thị lực tốt: ≥ 20/25

- Khám mắt bằng sinh hiển vi:

+ Khám tình trạng mi mắt, kết mạc

+ Thử cảm giác giác mạc bằng test sợi bông:

một miếng bông vê đầu hơi nhọn đưa từ phía bên chạm nhẹ vào giác mạc.Không chạm bông vào kết mạc, lông mi

lại Bệnh nhân có cảm giác kích thích ở giác mạc và chớp mắt ở cả hai bên

mạnh hơn mới có cảm giác hoặc cảm giác không rõ ràng

bông chạm vào

Hình 1.1 Test sợi bông đơn giản

+ Khám tổn thương giác mạc không nhuộm và có nhuộm Fluorescein

đĩa