khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ duchenen bằng kỹ thuật mlpa

Bệnh nhân có các biểu hiện suy yếu cơ: khó đi lại, dễ ngã, khó đứng lênngồi xuống và khó khăn khi leo cầu thang; triệu chứng yếu cơ tiến triển ngàycàng nặng, cuối cùng dẫn tới tàn phế, m

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Việc được tiến hành nghiên cứu làm đề tài, khóa luận đã giúp tôi họchỏi được rất nhiều, đó không chỉ là kiến thức mà còn là tác phong và kinhnghiệm làm việc

Với tất cả tấm lòng trân trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS Trần Vân Khánh, trưởng bộ môn Bệnh học phân tử, phó giám đốc

trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, người đãgiúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa khóaluận cho tôi

GS.TS Tạ Thành Văn, PGS.TS Nguyễn Thị Hà, những người thầy

tuy không trực tiếp hướng dẫn tôi làm khóa luân nhưng đã nhắc nhở, độngviên không chỉ tôi mà tất cả các sinh viên, học viên đang tiến hành khóa luậntại trung tâm, tạo mọi thuận lợi cho chúng tôi thực hiện và hoàn thành khóaluận một cách tốt nhất

ThS Đỗ Ngọc Hải, khoa Hóa Sinh, bệnh viện Việt-Tiệp Hải Phòng, cùng tập thể labo nghiên cứu gen-protein Trường Đại Học Y Hà Nội đã

dành cho tôi sự giúp đỡ quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2013

Đỗ Thị Mai

Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc -*** -

LỜI CAM ĐOAN

Kính gửi: Phòng Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội

Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp.

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự giúp đỡ của thầy cô và các anh chị tại trung tâm nghiên cứu, tất cả các số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác

Hà nội, ngày 16 tháng 05 năm 2013

Người viết khóa luận

Đỗ Thị Mai

CARRIER Người lành mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử

bp

PCR

BasepairPolymerase chain reactionMLPA Multiplex Ligation - Dependent Probe Amplification

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne có tên tiếng anh là Duchenne MuscularDystrophy (DMD)hay còn gọi là bệnh teo cơ giả phì đại, được phát hiện trênnhiều chủng tộc khác nhau trên thế giới, là bệnh di truyền lặn liên kết với giớitính thường gặp với tần suất mắc bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai (7)

DMD là một trong các bệnh di truyền có tiên lượng xấu vì chưa cóphương pháp điều trị hiệu quả Bệnh nhân dần dần bị tàn phế và thường chết

do suy hô hấp, tổn thương cơ tim hoặc ở lứa tuổi thiếu niên hoặc trước 20tuổi Bệnh nhân có các biểu hiện suy yếu cơ: khó đi lại, dễ ngã, khó đứng lênngồi xuống và khó khăn khi leo cầu thang; triệu chứng yếu cơ tiến triển ngàycàng nặng, cuối cùng dẫn tới tàn phế, mất khả năng đi lại (7)

Nguyên nhân gây bệnh DMD là do đột biến gen dystrophin, gen này nằm

ở vị trí Xp21 trên NST giới tính X, có chiều dài 2500 Kb, bao gồm 79 exon với

7 promoter khác nhau Gen dystropin sao mã tạo ra mRNA dài 14kb và tổnghợp protein dystrophin Protein dystropin nằm ở màng bào tương của tế bào cơ,

có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định của màng, bảo vệ cơ khỏi bịtổn thương trong quá trình co cơ Gen dystropin bị đột biến, quá trình tổng hợpprotein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ của bệnh nhân bị thoái hóa dần vàgây nên bệnh DMD Một thể nhẹ hơn của DMD là Becker MuscularDystrophin (BMD), bệnh được phân biệt với DMD bởi lứa tuổi xuất hiện muộnhơn, triệu chứng lâm sàng nhẹ hơn và có cuộc sống kéo dài hơn.(7)

Các đột biến có thể xảy ra trên gendystropin là đột biến mất đoạn, độtbiến điểm, và lặp đoạn Mất đoạn là loại đột biến hay gặp nhất, chiếm khoảng65% trong số các đột biến Trong đó, đột biến mất đoạn hay xảy ra trong vùng

“hotspots”là vùng trung tâm và vùng tận cùng 5’của gen dystropin(7)

DMD vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu Bởi vậy, việc chẩnđoán sớm, chính xác nhằm phát hiện đột biến gen trên bệnh nhân mắc bệnhloạn dưỡng cơ Duchenne và sớm có những can thiệp, hỗ trợ làm chậm lại cácbiến chứng, tiến triển của bệnh nâng cao chất lượng cuộc sống cho ngườibệnh là một việc làm hết sức cần thiết và có giá trị Ngoài ra,việc phát hiệnđột biến còngiúp xác định người lành mang gen bệnh, có ý nghĩa quan trọngtrong chẩn đoán trước sinh đối với những đối tượng có nguy cơ cao sinh con

bị bệnh Phương pháp MLPA (Multiplex Ligation-dependent ProbeAmplification) hiện đang là phương pháp tối ưu trong xác định đột biến xoáđoạn, được ứng dụng rộng rãi

Với những ý nghĩa trên đề tài: “Nghiên cứu phát hiện đột biến mất

đoạn gen Dystrophin trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne”

được thực hiệnnhằm mục tiêu:

Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenen bằng kỹ thuật MLPA.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh DMD.

1.1.1 Trên thế giới.

- Tháng 12-1851, Edward-Meryon, một thầy thuốc người Anh mô tả chitiết về 8 trẻ trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà về sau này được gọi làbệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (29)

- Năm 1861, Duchenne de Boulogne, một nhà thần kinh học người Pháp

mô tả dạng giả phì đại của bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻ trai, phânbiệt các bệnh cơ khác nhau và sau đó bệnh đã được mang tên ông (29)

- Năm 1879, Gowers thu thập 220 bệnh nhân và mô tả một cách kỹ càngbệnh này với những hình ảnh lâm sàng điển hình và rất chi tiết (29)

- Bệnh DMD đã được biết hơn 100 năm, trong suốt một thời gian dàibệnh chủ yếu chỉ được đánh giá ở mức độ lâm sàng và những chăm sóc hỗ trợtrong quá trình của bệnh đối với bệnh nhân

- Trước và sau năm 1980, các nghiên cứu tập trung vào chẩn đoán và đặcbiệt là chẩn đoán sớm bệnh DMD khi chưa có biểu hiện lâm sàng, phát hiện

dị hợp tử bệnh DMD bằng đo hoạt độ enzym Creatin Kinase (CK), phục vụcho điều trị và tư vấn di truyền(27)

- Cho đến năm 1981, Zatz và cộng sựphát hiện ra gen dystrophin nằm ở

di truyền nhằm hạn chế tới mức thấp nhất sự sinh ra những đứa trẻ bị bệnhDMD (23)

- Năm 1987 - 1988, các nhà nghiên cứu chỉ biết gen dystrophin gồm 60 exon

- Năm 1989, gen dystrophin được phát hiện với kích thước 2300 kb

- Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen dystrophin đã được phát hiệnđầy đủ gồm 79 exon

Từ năm 1993 trở lại đây, cơ chế sinh học phân tử của bệnh ngày càngđược làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen đã và đang được các nhà khoa học nỗlực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất khắc phục hậu quả nặng

nề của bệnh gây ra

1.1.2 Ở Việt Nam.

DMD là một bệnh di truyền khá phổ biến trên thế giới và tại Việt Nam

do đó đã có rất nhiều các đề tài, dự án nghiên cứu được tiến hành mang lại gíatrị to lớn và nâng cao tầm hiểu biết về căn bệnh này Cụ thể:

- Năm 1991, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Hoàn và CS nghiên cứuxác định số lượng bệnh nhân DMD trong vòng 10 năm (1981-1990) tại ViệnBVSKTE Hà nội, kết quả cho thấy có 131 bệnh nhân trong tổng số 107 giađình, trong đó có gia đình có tới 2, 3 hoặc 4 người con đều mắc bệnh (1)

- Năm 1998, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang sử dụng một cặpmồi đặc hiệu cho exon 48 để tiến hành phản ứng PCR thăm dò ở mức độ gencho hai bệnh nhân DMD trong gia đình có 2 thế hệ bị bệnh

- Năm 2000, Nguyễn Đình Lương và CS đã tiến hành xác định đột biếnxoá đoạn ở bệnh nhân DMD sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR(2)

- Năm 2001, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Trang, Vũ Chí Dũng công

bố tình hình bệnh DMD ở trẻ em Việt Nam tại hội nghị Nhi khoa quốc tế lầnthứ 23 (1)

- Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng năm 2002 nghiên cứu đột biến gengây bệnh DMD bằng phương pháp Multiplex PCR và đã phát hiện 6 trườnghợp xóa đoạn trong 11 bệnh nhân được nghiên cứu.

- Năm 2004, Trần Vân Khánh và cộng sự đã chẩn đoán 85 bệnh nhânViệt Nam mắc bệnh DMD/BMD bằng phương pháp PCR và phát hiện 38%

có đột biến xóa đoạn gen dystrophin

- Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Hoàn vào năm 2005 đã phát hiện

13 bệnh nhân có đột biến xóa đoạn gen trong 21 bệnh nhân được chẩn đoán

là DMD

- Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang năm 2006 đã nghiên cứu 58bệnh nhân DMD và đã phát hiện tỉ lệ xóa đoạn exon 46, 51 và cả hai exon là23/58, chiếm tỷ lệ 39,7%

1.2 Đặc điểm bệnh DMD

1.2.1 Đặc điểm lâm sàng của bệnh DMD

Hình 1.1 Người bình thường và bệnh nhân DMD

Bệnh DMD được biểu hiện qua 3 giai đoạn sau:

Giai đoạn 1 (khi trẻ được 3-5 tuổi) Trẻ có dấu hiệu chậm biết đi hoặc đi

lại hay vấp ngã, trẻ chưa có biểu hiệnteo cơ.

Giai đoạn 2 (khi trẻ được 6-7 tuổi) Trẻ có biểu hiện yếu cơ và xuất hiện

dấu hiệu Gowers rõ, trẻ đang ngồixổm phải đứng thẳng lên hoặc đangnằm phải ngồi dậy, trẻ phải quayngười sang một bên, gấp đầu gối vàomông, hai tay chống nạng đỡ lấy thân

để giữ một tư thế như quỳ bắn, sau

đó, bằng cách tỳ hai tay lần lượt lêncẳng chân, đầu gối và đùi, trẻ đẩy chothân thẳng dậy Sự tiếp nối các độngtác như vậy được xem là đặc hiệu chobệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến

Giai đoạn 3 (khi trẻ được12-15 tuổi) Trẻ thường mất khả năng đi lại lúc 12

tuổi, sau đó dấu hiệu teo cơ xuất hiện

do trẻ không đi lại được, cuối cùng trẻ

bị tử vong ở lứa tuổi 20-25 do tổnthương cơ tim và rối loạn hô hấp(7)

1.2.2 Xét nghiệm cận lâm sàng

1.2.2.1 Định lượng hoạt độ enzym Creatin Kinase (CK) trong huyết thanh

Creatin Kinase (CK) là enzym xúc tác phản ứng tạo hợp chất giàu nănglượng giúp quá trình co, duỗi cơ và quá trình chuyển hóa chất trong tế bào cơ

Creatine + ATP ⃗CK phosphocreatine + ADPPhosphocreatin là dạng dự trữ năng lượng cho hoạt động của cơ và vậnchuyển chất trong tế bào cơ

Có ba dạng isoenzym của CK, đó là CK-MM, CK-MB và CK-BB.Dạng đồng phân CK-MM chiếm 95% của CK toàn phần và tập trung chủ yếu

ở tổ chức cơ vân Dạng CK-MB chiếm khoảng 5% và tập trung chủ yếu ở mô

cơ tim Dạng CK-BB chiếm tỷ lệ không đáng kể và khu trú chủ yếu ở tổ chứcnão, nó không qua được hàng rào mạch máu não, do đó CK-BB không xuấthiện trong huyết thanh (11)

Chẩn đoán bệnh DMD thường dựa vào nồng độ enzym CK trong máu

Ở bệnh nhân DMD, gen dystrophin bị đột biến làm thay đổi cấu trúc poteindystrophin trên màng tế bào, dẫn đến tổn thương màng tế bào cơ và giảiphóng một lượng lớn enzym CK vào máu Ở bệnh nhân DMD, enzym CKtăng cao ít nhất 40 lần so với bình thường (bình thường <200 UI/l) Tuynhiên, ở giai đoạn muộn của quá trình bệnh, khối cơ còn lại ít và lượng cơthoái hóa cũng ítkhiến hoạt độ enzym này giảm thấp (23,11)

1.2.2.3 Sinh thiết cơ

Sinh thiết cơ là một tiêu chuẩn chẩn đoán chính xác nhất Phản ứng miễndịch huỳnh quang khi nhuộm tiêu bản sinh thiết cơ cho thấy sự vắng mặt hoàntoàn của protein Dystrophin trên bề mặt tế bào cơ Các sợi cơ với đường kínhkhông đều và có dấu hiệu của sự thoái hóa hoại tử, thâm nhiễm mô mỡ, mô liên

kết và những tế bào đơn nhân Một thể bệnh nhẹ của DMD rất hay gặp là loạndưỡng cơ Becker (BMD) Bệnh nhân BMD xuất hiện triệu chứng lâm sàngmuộn hơn DMD, biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn và thời gian tiến triển chậm hơn.Trên tiêu bản sinh thiết cơ, protein Dystrophin giảm đáng kể trên màng tế bàosợi cơ song không vắng mặt hoàn toàn như trong thể nặng DMD (20).

1.2.3 Điều trị bệnh DMD

Hiện nay phối hợp điều trị nội khoa và phục hồi chức năng nhằm trìhoãn sự tiến triển của bệnh Các thuốc điều trị nội khoa cho bệnh nhân DMDnhư: prednison, prednisolon và deflazacort (thuộc nhóm steroid) hoặcaminoglycoside (kháng sinh) có thể làm chậm mức độ phá hủy tế bào cơ Vật

lý trị liệu có tác dụng giúp cho trẻ hạn chế bớt mức độ co kéo cơ (30)

Hiện nay, liệu pháp gen trong điều trị căn bệnh này đang được thựchiện với mục đích đưa vào trong tế bào một hoặc nhiều gen có khả năng tổnghợp ra protein dytrophin và làm cho protein biểu hiện được ở màng tế bào cơ(16, 22).Hai phương pháp đã được thử nghiệm trên động vật là tiêm vào cơnhững plasmid và sử dụng vật truyền trung gian virut Nhưng phương phápnày còn nhiều hạn chế do gặp phải nhiều trở ngại nên chưa được áp dụng đểđiều trị bệnh trên người Trong vài năm trở lại đây, một hướng điều trị genmới, sau khi xác định được dạng đột biến của bệnh nhân, các nhà khoa học đãchọn lọc, xóa thêm một, hai hoặc nhiều exon của đoạn gen bị đột biến tạo ramột cắt đoạn lớn bên trong gen mà vẫn duy trì được khung dịch mã và proteinvẫn được sản xuất bán phần giúp cho người bệnh chuyển từ thể bệnh nặng(DMD) sang thể bệnh nhẹ (BMD) và giúp kéo dài thời gian sống

1.2.4 Phòng bệnh DMD

DMD là bệnh di truyền tiên lượng nặng, có thể dẫn đến tàn phế, mất khảnăng đi lại và chết trước tuổi trưởng thành Hiện nay, chưa có phương pháp

điều trị bệnh hiệu quả, các tác giả quan tâm đến bệnh DMD đều nhận địnhrằng, trong khi chưa tìm được phương pháp điều trị có hiệu quả cho bệnhDMD thì biện pháp cơ bản để hạn chế bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne đó làviệc phát hiện người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái trong gia đình bệnhnhân) và chẩn đoán trước sinh cho những những phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ

và đang mang thai có nguy cơ cao Phương pháp để phát hiện bệnh được đánhgiá có độ chính xác cao đang được sử dụng là kỹ thuật MLPA (Multiplexligation dependent probe amplification) và cách sàng lọc trước sinh cho phụ

nữ mang thai là chọc hút dịch ối, tách DNA của thai nhi và phân tích gendytrophin đột biến Trước khi phân tích DNA của thai nhi phải loại trừ khảnăng nhiễm DNA của người mẹ trong quá trình chọc hút dịch

1.3.Cơ chế di truyền của bệnh

DMD là bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính X Mẹ là ngườibình thường mang gen bệnh, di truyền bệnh cho con trai Trong một lần sinh,nguy cơ của những người mẹ này như sau:

* 50% số con gái là người bình thường mang gen bệnh

* 50% số con gái là người bình thường không mang gen bệnh

* 50% số con trai là người bình thường không mang gen bệnh

* 50% số con trai là người mắc bệnh DMD

Hình 1.2 Cơ chế di truyền bệnh DMD

(http://di truyền.com)

Trong một vài trường hợp nữmang gen có biểu hiện bệnh khi NST Xkhông mang gen bệnh bị bất hoạt và dẫn đến NST X còn lại mang gen bệnh sẽbiểu hiện bệnh Francke (1989) đã phát hiện ra một vài trường hợp nữ mang gen

có biểu hiện rõ ràng của bệnh DMD với một NST X bị bất hoạt Có khoảng 30%bệnh nhân DMD có nguyên nhân không phải di truyền từ bố mẹ mà do quá trìnhđột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử ở bố hoặc mẹ

1.4 Vị trí cấu trúc chức năng của gen Dystrophin

1.4.1 Vị trí của gen Dystrophin

Gen Dystrophin nằm ở vị trí Xp21 trên NST giới tính X

Hình 1.3: Vị trí của gen Dystrophin.

(ghr.nlm.nih.gov)

1.4.2 Cấu trúc gen Dystrophin

Hình 1.4: Cấu trúc gen Dystrophin.

(actionduchene.com)

Gen Dystrophin là một trong những gen lớn nhất của người đã đượcbiết tới, gen có kích thước khoảng gần 3000kb, trong đó hơn 99% chiều dàigen là intron

Gen Dystrophin gồm 7 promoter: Promoter não, promotor cơ, promotortiểu não, promoter Dp 260, Dp 140, Dp 116, Dp 71

Gen Dystrophin gồm 79 exon, là vùng gen mã hoá để phiên mã thànhmRNA, chứa đựng thông tin di truyền cho sự tổng hợp protein Dystrophin Cácvùng intron xen kẽ các vùng exon đóng vai trò quan trọng cho quá trình hoànthiện mRNA và nó được loại bỏ khi quá trình hoàn thiện mRNA kết thúc

Hình 1.5:Kích thước của các exon trên gen dystropin

(cureduchene.org)

1.5 Cấu trúc và chức năng của protein Dystrophin

Protein Dystrophin gồm 3685 acid amin, dài 427 kD, nằm ở màng bàotương của tế bào cơ, có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định màng,bảo vệ cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ

Dystrophin được phân chia làm 4 vùng khác nhau bao gồm: Vùng gắnvới actin, vùng cấu trúc xoắn bậc 3, vùng giàu cystein và vùng C-tận Bốnvùng này có chức năng rất khác nhau, một số tác giả đã chứng minh rằngvùng N-tận, vùng giàu cystein và vùng C-tận có vai trò rất quan trọng vớichức năng của dystrophin, bệnh nhân có đột biến vùng này biểu hiện triệuchứng lâm sàng rất nặng nề

Dystrophin liên kết với phức hợp Dystrophin- glycoprotein-complex(DGC) thông qua sự sự tương tác của vùng C-tận với phức hợp Dystroglycan vàSyntrophin DGC có vai trò quan trọng đối với chức năng của Dystrophin trong

sự ổn định màng bào tương và là cầu nối tế bào cơ với vùng ngoại bào(7)

Hình 1.6: Cấu trúc mô phỏng của Dystrophin tại màng tế bào cơ

(actionduchene.org.com) 1.6 Các dạng đột biến cấu trúc của gen Dystrophin

1.6.1 Đột biến mất đoạn gen Dystrophin

Đột biến mất đoạn là dạng đột biến thường gặp nhất ở bệnh nhânDMD Đột biến này chiếm khoảng 6065% trong tổng số các dạng đột biến.Đột biến gặp chủ yếu ở 2 vùng trọng điểm (hotspots region) đó là vùng tậncùng 5’ (exon 119) và vùng trung tâm (4360) Khi tiến hành phân tích độtbiến gen Dystrophin, người ta thường hay tập trung phân tích hai vùng nàytrước để phát hiện đột biến mất đoạn [29]

1.6.2 Đột biến điểm

Đột biến điểm đứng thứ 2 về mức độ thường gặp, chiếm 25  30%,hầu hết đột biến điểm là dạng tạo ra mã kết thúc sớm (nonsense mutation) và

gây nên thể bệnh nặng, đột biến điểm nằm rải rác khắp chiều dài gen đã gâynên một trở ngại lớn khi xác định đột biến [29].

1.6.3 Đột biến lặp đoạn trong gen Dystrophin

Đột biến lặp đoạn chiếm tỉ lệ thấp hơn, khoảng 10  15%, tập trungchủ yếu ở đầu 5’ tận của gen Dystrophin

1.7 Các kỹ thuật sinh học phân tử được dùng trong chẩn đoán mất đoạn gen dystropin.

1.7.1 Phương pháp khuếch đại DNA dò – MLPA (Multiplex Dependent Probe Amplification)

Ligation-Kỹ thuật MLPA là một phương pháp được ưu tiên chọn lựa trongchẩn đoán đột biến mất đoạn, lặp đoạn gen, cho phép phát hiện các tổnthương gen một cách nhanh chóng

Kỹ thuật sử dụng bộ kit Salsa MLPA do MRC-Holland, Amsterdam,

Hà Lan sản xuất Các qui trình kỹ thuật đều thực hiện theo hướng dẫn của nhàsản xuất

 Nguyên lý: Đột biến được phát hiện bằng các đoạn dò (probe) Mỗiprobe gồm hai chuỗi oligonucleotid, các probe này lai đặc hiệu với 79 exon củađoạn gen đích Mỗi chuỗi đều có vị trí gắn đặc hiệu với exon đích và có gắnsẵn mồi, khi hai chuỗi này đã gắn được vào vị trí exon đích, enzym ligase sẽgắn 2 chuỗi thành probe hoàn chỉnh Nếu gen bị đột biến, probe tương ứng vớiexon bị xóa không được hình thành do 2 chuỗi không gắn được vào exon này

Mồi gắn sẵn trên probe có trình tự giống hệt nhau, nên chỉ cần một cặpmồi duy nhất để khuếch đại tất cả probe

Riêng ở chuỗi dài có thêm một đoạn đệm có số nucleotid khác nhau,nhờ đó các probe có sự khác biệt về kích thước, giúp phân tách khi điện

di mao quản sau khuếch đại probe

Kết quả phân tích sẽ cho 79 đỉnh có kích thước tương ứng với 79 probeđặc hiệu với 79 exon, khi không thấy xuất hiện đỉnh có nghĩa đã xảy ra độtbiến mất đoạn trên exon.

Cấu trúc probe:

Hình 1.7: Cấu trúc của probe

- Chuỗi oligonucleotid ngắn gồm 2 đoạn:

+ Đoạn 1 có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích và sẽ laivới DNA đích khi tiến hành phản ứng lai Đoạn này có khoảng 21-30nucleotid nằm ở đầu 3’ của probe

+ Đoạn 2 chứa khoảng 19 nucleotid Trình tự nucleotid của đoạn nàygiống nhau cho tất cả các probe Đây là vị trí gắn với mồi xuôi

- Chuỗi oligonucleotid dài gồm 3 đoạn:

+ Đoạn 1’ chứa 25-43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ở đầu tận 5’,+ Đoạn 2’ gồm 36 nucleotid ở đầu 3’,trình tự nucleotid giống nhau chotất cả các probe Đây là vị trí gắn mồi ngược

+ Đoạn 3’ còn gọi là đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai đoạn 1’

và 2’,cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid Trình tự nucleotid không đặc hiệuvới DNA đích nên nó không gắn vào DNA đích Chiều dài đoạn stuffer khácnhau ở các probe, vì vậy các probe khác nhau sẽ có chiều dài khác nhau Do

đó, sản phẩm khuếch đại của các probe sẽ được phân tách bằng điện di (6)

Vị trí gắn đặc hiệu trên gen đích

Đoạn đệm

Mồi ngược

Các bước của kỹ thuật MLPA

Hình 1.8 Sơ đồ quy trình kỹ thuật MLPA

MLPA cũng có thể coi là một loại phản ứng PCR, tuân theo một quy trình nhiệt gồm nhiều bước.

 Bước 1: Biến tính (ngày 1): Biến tính DNA trong môi trường nhiệt độcao (98 oC trong 5’) Bước này giúpDNA mạch đôi tách ra thành 2 mạch đơn

Biến tính và lai hóa

probeGen đích

Nối ghép sau lai

Khuếch đại

 Bước 2: Lai hóa (ngày 1): Cho thêm probe, tạo điều kiện cho cácprobe gắn vào các vị trí đích trên mạch DNA sợi đơn Tiếp tục chu trìnhnhiệt: 95 oC trong 1’ rồi ủ qua đêm từ 16-24h (60 oC)

 Bước 3: Nối ghép sau lai(ngày 2): Probe đã gắn vào đọan DNAđích Giai đoạn này hai mồi đặc hiệu trên hai chuỗi ngắn và dài kích hoạt kéodài mạch theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA đích và nối liền hai chuỗilại với nhau Như vậy sản phẩm thu được là các probe khác nhau với haichuỗi oligonucleotid ngắn và dài đã được nối liền

 Bước 4: Phản ứng PCR (ngày 2) sản phẩm là các probe đã được nốiliền được cung cấp thêm các thành phần cần thiết và thực hiện theo chu trìnhnhiệt đã được cài đặt đểnhân bản các probe lên nhiều lần (23, 24)

Sản phẩm sau khi khuếch đại được điện di phân tách trên hệ thốngCEQ 8000 (Beckman Coulter) Sau khi điện di mao quản, kết quả được phântích bằng phần mềm Gene Marker Kết quả phân tích được biểu thị dưới dạngbiểu đồ sóng và dưới dạng bảng Các vị trí gen bị mất đoạn sẽ không có đỉnhtín hiệu xuất hiện

1.7.2 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR):

PCR là kỹ thuật nhân bản gen trong ống nghiệm.Kỹ thuật này dựa trênnhững nguyên tắc cơ bản của quá trình sao chép DNA trong cơ thể sống Từmột khuôn ban đầu sẽ cho ra sản phẩm là một lượng lớn các đoạn gen đíchcần nghiên cứu

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳgồm ba bước được điều hòa bởi nhiệt độ

- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation) Phân tử DNA được biến

tính ở nhiệt độ cao, thường là 94oC - 95oC trong vòng 30 – 60 giây Bước nàyDNA sợi kép tách ra thành hai mạch đơn

- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ được hạ thấp cho

phép các mồi cặp với khuôn là các DNA mạch đơn, dao động trong khoảng

40oC – 70oC tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài 30 – 60 giây

- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extennsion) Nhiệt độ tăng

lên 720C là nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme Taq polymerase hoạt độngtổng hợp sợi DNA mới bằng cách kéo dài sợi mồi sử dụng 4 loại nucleotid(dATP, dCTP, dGTP, dCTP) Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tựDNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Hình 1.9 Các giai đoạn trong phản ứng PCR

Sau mỗi chu kỳ, các đoạn DNA được tổng hợp sẽ được dùng làmkhuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo Như vậy sảnphẩm của phản ứng sẽ tăng theo cấp số nhân sau mỗi chu kỳ Vậy sau n chu

kỳ số lượng DNA thu được là 2n bản copy Tuy nhiên, thông thường hiệu suấtcủa phản ứng sẽ không đạt 100% và chúng ta tiến hành 25-40 chu kỳ tùy theonồng độ sản phẩm của DNA

Kết quả là từ một lượng nhỏ chất khuôn ban đầu, chúng ta có thể thuđược một lượng lớn DNA Song điều đó cũng có nghĩa là, trong quá trình tiếnhành PCR việc nhiễm một lượng nhỏ DNA ngoại lai cũng có thể đưa tới sựthất bại của phản ứng, khiến chúng ta không thu được hoặc chỉ thu được mộtlượng nhỏ sản phẩm DNA mong muốn(6).

1.7.3.Giải trình tự gen (DNA sequencing):

Giải trình tự gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 nucleotid(A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine)) trên phân tử DNA

Hiện này phương pháp enzyme của Sanger được sử dụng phổ biến cả ởViệt Nam lẫn thế giới Phương pháp của Sanger sử dụng ddNTP(dideoxyribonucleoside triphosphate) là các đồng phân của dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate Cấu trúc ddNTP tương tự dNTP chỉ cómột điểm khác biệt duy nhất là ddNTP không có gốc OH ở đầu 3’ (vị trícarbon 3 của deoxyribose), là vị trí để các dNTP tiếp theo gắn vào Do đó,phản ứng tổng hợp DNA sẽ được dừng lại tại ngay vị trí mà ddNTP được gắnngẫu nhiên vào thay cho dNTP

Hình 1.10 Hình ảnh minh họa kỹ thuật giải trình tự theo phương pháp

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Nhóm chứng (n=2): Gồm 2 người nam bình thường, tiền sử gia đìnhkhông có ai mắc bệnh di truyền Nhóm chứng được dùng như chứng bìnhthường

- Nhóm nghiên cứu: gồm 6 bệnh nhân được chẩn đoán bị mắc bệnh loạndưỡng cơ Duchenne dựa vào một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng điểnhình Bệnh nhân có tiền sử gia đình rõ ràng

2.2 Phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp phân tích bệnh chứng

Thiết kế nghiên cứu

Bước 1: Lấy mẫu máu

Bước 2: Tách chiết DNA từ máu ngoại vi theo phương pháp

phenol/Chloroform

Bước 3: Xác định độ tinh sạch và nồng độ bằng kỹ thuật điện di DNA tổng số

đo OD (mật độ quang) trên máy NanoDrop1000

Bước 4: Thực hiện kỹ thuật MLPA xác định đột biến xóa đoạn

Bước 5: Thực hiện các phản ứng PCR và giải trình tự khi muốn kiểm định lạikết quả

2.3 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

2.3.1 Dụng cụ, trang thiết bị

- Tủ lạnh : 40C, -20 ºC ( SANYO)

- Pipet định mức và đầu côn các loại 1000µl, 200µl, 100µl, 20µl, 10µl, 2.5µl

- Ống Eppendorf

- Găng tay, giấy thấm vô trùng

- Máy điện di: Mupid (Nhật Bản)

- Máy soi gel và chụp ảnh tự động: EC3 Imaging system

- Máy đọc huỳnh quang

- Máy đo OD: Nanodrop 1000

- Máy PCR: Eppendorf

- Máy chạy MLPA

2.3.2 Hóa chất

- Hóa chất tách chiết DNA:

+ Dung dịch Lysis buffer RBC gồm: 4,3g NH4 Cl + 0,5g KHCO3 + 0,03gEDTA + 500ml H2 0, pH 7,1-7,4

+ Dung dịch Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 :1)

+ Dung dịch Chloroform : Isoamyl (24 : 1)

+ Ethanol 100%, ethanol 70% bảo quản lạnh

+ Sodium acetat CH3COONa 3M (pH=5.2)

+ Dung dịch hòa tan DNA: đệm TE (Tris - EDTA)

- Hóa chất cho PCR:

+ GoTag chứa: dNTPs, Taq polymerase, MgCl2

+ Primers: mồi xuôi, mồi ngược

- Hóa chất chạy điện di:

+ Dung dịch đệm TBE (Tris Borate EDTA) 1X gồm: Tris base, boricacid và EDTA (pH 8.0) Khi sử dụng pha thành 10X

+ Agarose( dạng bột)

+ Ethidium bromid

- Hóa chất chạy MLPA:

Kit Salsa MLPA bao gồm các thành phần sau:

 SALSA Enzym Dilution Buffer( ống nắp xanh da trời)

 SALSA Polimerase (Ống nắp da cam)

Ngoài ra : Taq polymerase, nước cất hai lần

2.4 Quy trình kỹ thuật:

2.4.1 Lấy mẫu máu

Lấy 3ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA (1mg EDTA/1ml máu toànphần) Quy trình đảm bảo tuyệt đối vô trùng

Mẫu máu nên được dùng để tách DNA càng sớm càng tốt Khi chưadùng ngay cần bảo quản ở 4 ºC đến 8 ºC trong tối đa 4h(nếu lâu hơn phảitách huyết thanh) Huyết thanh giữ ở -20 ºC

2.4.2 Tách chiết DNA từ máu ngoại vi

+ Loại dịch nổi, thu cặn

Lặp lại quy trình này 2 lần cho tới khi thấy tủa trắng (nhân và xác tế bào)

- Bước 2: Phá vỡ bạch cầu

+ Thêm 1ml dd BPS, vontex nhẹ

+ Ly tâm 4000v/phút x 10 phút/4ºC

+ Loại dịch nổi, thu cặn

Chú ý: Lặp lại bước trên khi quan sát thấy tủa còn màu nâu để thu đượctủa trắng ở đáy ống

+ Thêm 650µl dung dịch Lysis buffer HD + 5µl proteinase K

+ Sau đó đem ủ ở 56ºC/qua đêm hoặc khi quan sát thấy tủa tan hếtthành dung dịch đồng nhất

o Lắc đều, để -20°C/2h để kết tủa DNA

o Ly tâm 15000v/phút x 20 phút/4ºC thu tủa

o Thêm 1ml Ethanol 70% , trộn đều

o Ly tâm 15000v/phút x 20 phút/4ºC thu được tủa DNA

o Tủa DNA để khô tự nhiên (56 ºC), sau đó hòa tan bằng đệm TE

2.4.3 Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA

Sử dụng hai kỹ thuật:

1.Điện di DNA tổng số

+ Đổ bản gel agarose 1%

+ Hút 5µl sản phẩm DNA tách chiết được vào các giếng.

+ Đặt thời gian 30 phút, điện thế 90 V

+ Nhuộm bản gel điện di

+ Chụp ảnh gel

2.Đo mật độ quang trên máy Nanodrop

+ Sản phẩm DNA tách chiết được sẽ được kiểm tra nồng độ và độ tinhsạch bằng đo mật độ quang trên máy Nano Drop ở bước sóng 260nm và 280nm

+ Sản phẩm đạt yêu cầu khi tỉ lệ A260/A280 = 1.8-2.0, nồng độ DNA

>50ng/ µl

Chú ý: Sản phẩm DNA tách chiết được bảo quản ở 4ºC trong thời gian

ngắn hoặc lưu giữ ở -20ºC trong thời gian dài

2.4.4 Thực hiện kỹ thuật MLPA.

Trước tiên cần đo lại nồng độ DNA và kiểm tra độ tinh sạch củamẫu Qui trình kỹ thuật

o Bước 1: Biến tính DNA (ngày 1)

1 Chuẩn bị ống effendorf loại 0,2 ml chạy PCR

2 Cho 5 µl dung dịch DNA chứa 60ng DNA (sử dụng nồng độ đo đượcbằng máy NanoDrop100 để tính toán pha bằng nước cất cho vừa đủ)

3 Bắt đầu chu trình nhiệt đã được cài sẵn: biến tính ở 98ْ C trong 5’, rồigiữ ở 25 ْ C

o Bước 2 : Lai hóa( ngày 2)

1 Chuẩn bị master mix: Mỗi phản ứng