Khảo sát ảnh hưởng của cadmium lên kiểu phân loại và tần số sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho người chiếu bức xạ gamma

Sai hình nhiễm sắc thể được hình thành từ tổn thương phân tử ADN, như vậy bằng kỹ thuật phân tích kiểu sai hình có thể xác định được nguyên nhân nhiễm bẩn môi trường.. Kiểu hình của sai

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG TRANG

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CADMIUM LÊN KIỂU PHÂN LOẠI VÀ TẦN SỐ SAI HÌNH NHIỄM SẮC THỂ Ở TẾ BÀO LYMPHO NGƯỜI

CHIẾU BỨC XẠ GAMMA

CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN HỌC

MÃ SỐ: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN QUẾ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2010

LÔØI CẠM ÔN !

Tröôùc heât, tođi xin chađn thaønh cạm ôn TS Traăn Queẩ – tröôûng phoøng Cođng Ngheô Sinh hóc – Vieôn Nghieđn cöùu Hát nhađn – Ñaø Lát, ngöôøi thaăy ñaõ heât loøng taôn tình höôùng daên, giuùp ñôõ vaø quan tađm raât nhieău ñeơ tođi coù theơ hoaøn thaønh ñöôïc luaôn vaín

Cạm ôn caùc cođ, chuù, anh chò phoøng Cođng Ngheô Sinh Hóc – Vieôn Nghieđn cöùu hát nhađn – Ñaø Lát ñaõ nhieôt tình giuùp ñôõ, ñoông vieđn tođi vöôït qua khoù khaín trong cođng vieôc

Cạm ôn caùc thaăy cođ, anh chò phoøng SÑH – Tröôøng Ñái Hóc Khoa Hóc Töï Nhieđn TP Hoă Chí Minh ñaõ giuùp ñôõ cho tođi trong quaù trình hóc taôp

Cạm ôn cha mé, gia ñình vaø caùc bán beø, ñoăng nghieôp ñaõ hoê trôï tinh thaăn cho tođi raât nhieău ñeơ tođi coù theơ hoaøn thaønh cođng vieôc, tieâp böôùc vaø thaønh cođng trong cuoôc soâng, söï nghieôp

Xin chađn thaønh cạm ôn !

MỞ ĐẦU

Sự ra đời của kỹ thuật nuôi cấy tế bào lympho máu ngoại vi người năm

1960 được đánh giá là một trong ba chìa khoá mở ra sự phát triển về di truyền học, y học, miễn dịch học của thế kỷ XX Với đặc điểm tồn tại không phân chia, tế bào lympho có khả năng bảo toàn sai hình nhiễm sắc thể trong suốt đời sống trong cơ thể, và cũng chính đặc điểm này đảm bảo sự tương đồng giữa tác động

in vivo và in vitro Năm 1982, Cơ Quan Năng Lượng Nguyên Tử Quốc Tế

(IAEA) chọn kỹ thuật phân tích sai hình nhiễm sắc thể cho việc xác định liều lượng phóng xạ tác động lên cơ thể Sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho cũng được sử dụng như một biomarker làm chỉ thị và đánh giá mức độ nhiễm bẩn độc môi trường

Sai hình nhiễm sắc thể được hình thành từ tổn thương phân tử ADN, như vậy bằng kỹ thuật phân tích kiểu sai hình có thể xác định được nguyên nhân nhiễm bẩn môi trường Kiểu hình của sai hình nhiễm sắc thể phụ thuộc vào 3 quá trình sinh học: tổn thương phân tử ADN, phục hồi tổn thương và chu trình phân bào Trong thực tế phân tích định lượng thì “nhiễu” luôn là khó khăn cần khắc phục, sự có mặt của các yếu tố ngăn cản phục hồi tổn thương phân tử ADN trong môi trường là một trở ngại đối với công tác định liều sinh học cũng như đánh giá mức độ nhiễm bẩn khác

Cadmi thuộc nhóm chất độc bền có khả năng tích lũy sinh học ( PBT – persistent, Bioaccumulative and Toxic chemical), được xếp vào loại hoá chất cực độc đối với con người Cadmi được xác định là một mutagen, là thành phần nhiễm bẩn môi trường quan trọng, có khả năng gây tổn thương phân tử ADN và để lại những di chứng di truyền trong các vùng nhiễm bẩn Số liệu khảo sát các cộng đồng dân cư nhiễm bẩn cadmi cũng như arsen cho số liệu không thống nhất

và không có sự liên quan chặt chẽ với mức độ nhiễm bẩn, điều này đặt ra giả thiết cadmi chỉ là yếu tố “nhiễu” làm sai lệch số liệu do yếu tố khác gây nên Nghiên cứu tác động phối hợp cadmi với chiếu bức xạ gamma nhằm vào các mục tiêu:

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

* Xác định khả năng mutagen, kiểu gây tổn thương phân tử ADN của cadmi

* Xác định mức độ ảnh hưởng của cadmi lên kiểu phân loại và tần số sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho chiếu bức xạ gamma

* Biện pháp xử lý số liệu định liều sinh học khi có “nhiễu”

* Cảnh báo nguy cơ độc hại kép của cadmi đối với các công việc tiếp xúc với các yếu tố độc di truyền như hoá chất thí nghiệm, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, đặc biệt là phóng xạ

CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC

* Ảnh hưởng của các nồng độ cadmi lên chỉ số phân bào nguyên nhiễm tế bào lympho nuôi cấy in vitro

* Ảnh hưởng của cadmi lên kiểu phân loại và tần số sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho chiếu bức xạ gamma

ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN VĂN Kết quả nghiên cứu tác động kép của cadmi lên tế bào lympho chiếu bức xạ gamma chưa có công trình công bố trước đó, kết quả này đã được đăng trong tạp chí (Int J Low Radiation, Vol 7, No 2, 2010)

Danh mục bảng

Danh mục hình

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Phân tử ADN, nhiễm sắc thể, bộ nhiễm sắc thể người 3

1.1.1 Phân tử ADN 3

1.1.2 Nhiễm sắc thể (NST) 4

1.1.3 Bộ nhiễm sắc thể người 5

1.2 Các tác nhân gây tổn thương phân tử ADN 7

1.2.1 Tổn thương phân tử ADN do tia tử ngoại (UV) 8

1.2.2 Tổn thương phân tử ADN do bức xạ ion hóa 9

1.2.3 Tổn thương phân tử ADN do các tác nhân hóa học 10

1.3 Khả năng và các cơ chế phục hồi tổn thương phân tử ADN 11

1.4 Sai hình nhiễm sắc thể và cơ sở phân loại 13

1.4.1 Sai hình nhiễm sắc thể 13

1.4.2 Cơ sở phân loại và cơ chế hình thành sai hình nhiễm sắc thể 13

1.5 Tế bào lympho máu ngoại vi người và khả năng sử dụng kỹ thuật phân tích sai hình NST trong nghiên cứu tác động của mutagen và ứng dụng 20

1.6 Cadmi 21

1.6.1 Cadmi, sự nhiễm bẩn của cadmi cũng như các hoá chất nhóm PBT trong môi trường 21

1.6.2 Khả năng mutagen của cadmi cũng như các hoá chất nhóm PBT 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào lympho máu ngoại vi người 26

2.2.2 Phương pháp cố định tế bào, làm tiêu bản hiển vi 29

2.2.3 Thiết kế thí nghiệm xử lý cadmi, gamma 30

2.3 Phương pháp phân tích sai hình nhiễm sắc thể 35

2.4 Phương pháp xử lí số liệu 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 40

3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của cadmi (Cd2+) lên chỉ số phân bào nguyên nhiễm và sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho người phơi nhiễm in vitro liều đơn 40

3.1.1 Chỉ số phân bào nguyên nhiễm ở tế bào lympho xử lý cadmi liều đơn40 3.1.2 Sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho xử lý cadmi liều đơn 43

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của bức xạ gamma lên chỉ số phân bào nguyên nhiễm và sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho người phơi nhiễm in vitro liều đơn 44

3.2.1 Chỉ số phân bào nguyên nhiễm ở tế bào lympho chiếu bức xạ gamma44 3.2.2 Sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho chiếu bức xạ gamma 46

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của cadmi (Cd2+) lên chỉ số phân bào nguyên nhiễm và sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho người phơi nhiễm in vitro kết hợp chiếu bức xạ gamma 50

3.3.2 Sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho xử lý cadmi phối hợp với chiếu bức xạ gamma 54

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bảng 2.1: Thiết kế các tổ hợp thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cadmi lên tế

bào lympho in vitro

Bảng 2.2: Các tổ hợp thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng phối hợp của cadmi và bức xạ gamma lên tế bào lympho người

Bảng 3.1: Số liệu khảo sát chỉ số phân bào nguyên nhiễm của tế bào lympho trên hệ thống thử nghiệm máu toàn phần xử lý liều đơn cadmi

Bảng 3.2: Sự phụ thuộc của chỉ số phân bào nguyên nhiễm vào liều bức xạ gamma

Bảng 3.3: Tần số các kiểu sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho chiếu bức xạ gamma

Bảng 3.4: Số liệu khảo sát chỉ số phân bào nguyên nhiễm ở tế bào lympho xử lý phối hợp cadmi / bức xạ gamma

Bảng 3.5: Số liệu khảo sát tần số các kiểu sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho xử lý phối hợp cadmi và bức xạ gamma

Hình 1.1: Cấu trúc xoắn kép của phân tử ADN

Hình 1.2: Cầu nối hydrogen giữa các cặp A – T và G – C

Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo và các mức độ nén của NST

Hình 1.4: Bảng phân nhóm bộ NST người

Hình1.5 a: Karyotype người nữ bình thường

Hình1.5 b: Karyotype người nam bình thường

Hình 1.6: Các kiểu tổn thương phân tử ADN

Hình 1.7: Các kiểu sai hình do tổn thương chuỗi đôi kép trên 2 NST

Hình 1.8: Các kiểu sai hình hình thành từ đứt gãy đôi kép trên 3 NST

Hình1.9a: Các kiểu sai hình hình thành từ đứt gãy đôi kép trên 2 vai của 1NST.Hình 1.9b: Các kiểu sai hình hình thành từ đứt gãy đôi kép trên 1 vai của 1 NST Hình 1.10: Các kiểu sai hình radical do SSB trên 2 NST trước pha S

Hình 1.11: Các kiểu sai hình radical do 2 đứt gãy đơn kép trên 3 NST

Hình 1.12: Các sai hình do đứt gãy đơn kép trên cùng vai của 1 NST

Hình 1.13a: Các kiểu sai hình NST do đứt gãy đơn kép trên 2 sợi đơn khác vai Hình 1.13b: Các kiểu sai hình NST do đứt gãy đơn kép trên 1 sợi đơn khác vai Hình 1.14: Cadmi dưới dạng đơn chất

Hình 3.1: Biểu đồ chỉ số phân bào nguyên nhiễm của tế bào lympho máu ngoại

vi xử lý đơn cadmi

Hình 3.2: Sai hình đa tâm phát hiện ở tổ hợp 3

Hình 3.3: Sai hình minute phát hiện ở tổ hợp 3

Hình 3.4: Sai hình đa tâm phát hiện ở tổ hợp 4

Hình 3.7: Sai hình mảnh không tâm phát hiện ở tổ hợp 7

Hình 3.8: Sai hình đa tâm phát hiện ở tổ hợp 10

Hình 3.9: Sai hình mảnh không tâm phát hiện ở tổ hợp 10

Hình 3.10: Biểu đồ phân bố liều-hiệu ứng sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho chiếu bức xạ gamma

Hình 3.11: Biểu đồ chỉ số phân bào nguyên nhiễm in vitro ở tế bào lympho xử lý

phối hợp cadmi với bức xạ gamma

Hình 3.12: Sai hình đa tâm kèm theo mảnh không tâm phát hiện ở tổ hợp 5

Hình 3.13: Sai hình minute phát hiện ở tổ hợp 8

Hình 3.14: Sai hình chuyển đoạn phát hiện tổ hợp 11

Hình 3.15: Sai hình minute phát hiện ở tổ hợp 12

Hình 3.16:Sai hình vòng có tâm và mảnh không tâm phát hiện ở tổ hợp 19.Hình 3.17: Sai hình đa tâm kèm theo mảnh không tâm phát hiện ở tổ hợp 17Hình 3.18: Sai hình mảnh không tâm phát hiện ở tổ hợp 20

Hình 3.19: Sai hình minute phát hiện ở tổ hợp 24

Hình 3.20: Biểu đồ tần số sai hình nhiễm sắc thể kiểu đa tâm (đỏ) và mảnh không tâm (sáng) ở các tổ hợp xử lý cadmi và bức xạ gamma

Hình 3.21: Hình vẽ mô tả các kiểu tổn thương phân tử ADN dẫn đến sai hình nhiễm sắc thể

ADN :Acid Deoxyribonucleic

NST: Nhieãm saéc theå

A: Adenine

T: Thymine

G: Guanine

C: Cytosine

DSB: Double strand break

SSB: Single strand break

PHA: Phytohemaglutinine

PBT: Persistent, bioaccumulative and toxic chemical IAEA: International Atomic Energy Agency

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phân tử ADN, nhiễm sắc thể, bộ nhiễm sắc thể người

1.1.1 Phân tử ADN

ADN là một đại phân tử có cấu trúc xoắn kép với đường kính khoảng 2nm; là một polymer được hình thành từ các monomer gọi là nucleotit Do cấu trúc của các base mà cấu trúc của khung ADN bắt buộc liên kết hydrogen giữa các base với nhau phải là các cặp liên kết giữa purine và pyrimidine (liên kết bổ sung, hình 1.1 và hình 1.2) Đặc điểm cơ bản của cấu trúc này được tìm ra bởi James Watson và Francis Crick vào năm 1953 [3], [4], [6], [33]

Hình 1.1: Cấu trúc xoắn kép của phân tử ADN

Hình 1.2: Cầu nối hydrogen giữa các cặp (A – T) và (G – C)

Hàm lượng ADN trong nhân tế bào luôn là một hằng số ổn định, đặc trưng cho mỗi loài và có khả năng tự tái bản một cách chính xác Các acid nucleic hấp thu rất mạnh tia tử ngoại, đặc biệt ở các bước sóng từ 254 - 260 nm Vì vậy, phân tử ADN mẫn cảm với tia tử ngoại hơn các đại phân tử sinh học khác [4], [5], [6], [33]

1.1.2 Nhiễm sắc thể (NST)

Khác với vi sinh vật (prokaryote), tế bào của sinh vật nhân thực (eukaryote) chứa nhiều phân tử ADN, các phân tử ADN có cấu trúc đơn vị độc lập gọi là NST Mỗi NST chứa duy nhất một phân tử ADN, liên kết với các phân tử protein (histon và khác histon) và co ngắn theo các bậc cấu trúc đặc biệt Với cấu trúc điển hình ở metaphase, mỗi NST có 1 tâm động và 2 vai (q- vai dài, p – vai ngắn) (hình 1.3) Cuối mỗi vai là trình tự lặp lại bộ 6 TTAGGG Ngoài ra, ở các NST tâm mút còn quan sát thấy thể kèm, một cấu trúc độc lập liên kết NST qua eo thứ cấp [3], [6], [13], [33]

Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo và các mức độ nén của NST

Toàn bộ NST trong một tế bào soma ở giai đoạn “metaphase” của mỗi sinh vật được gọi là kiểu nhân hay karyotype của sinh vật đó Karyotype được biểu thị bằng các đặc điểm số lượng, kích thước tương đối, chỉ số tâm động, eo thứ cấp (thể kèm), phân bố band của các NST

Hình 1.4: Bảng phân nhóm bộ NST người

1.1.3 Bộ nhiễm sắc thể người

Ở người, bộ NST chứa toàn bộ bộ gen người với khoảng 3 tỷ cặp

Bộ NST gồm 46 chiếc tồn tại thành từng cặp tương đồng trừ cặp NST giới tính Mỗi cặp NST trong genome đều mang tính đặc trưng về kích thước tương đối và chỉ số tâm động Bộ NST người được sắp xếp thành 7 nhóm theo kí tự A,

* Đặc điểm phân loại 2 cặp nhiễm sắc thể nhóm B: Gồm 2 cặp NST số 4 và số 5 Cặp số 4 dài hơn cặp số 5 một ít, cả 2 đều là tâm lệch với vai ngắn tương đối ngắn so với cặp số 2

* Đặc điểm phân loại 3 cặp nhiễm sắc thể nhóm C: Nhóm gồm 7 cặp NST tâm lệch từ số 6 đến số 12 và NST giới tính X Về kích thước, trật tự được sắp xếp : 6-7-X-8-9-10-11-12

* Đặc điểm phân loại 3 cặp nhiễm sắc thể nhóm D: Nhóm gồm 3 cặp

13, 14 và 15 với đặc trưng là nhóm NST tâm mút, luôn có thể kèm

* Đặc điểm phân loại 3 cặp nhiễm sắc thể nhóm E: Gồm các cặp NST số 16, 17 và 18 Cặp 16 có đặc điểm tâm gần giữa, cặp 17 và 18 tâm lệch hơn cặp 16

* Đặc điểm phân loại 3 cặp nhiễm sắc thể nhóm F: Gồm 2 cặp NST số 19 và 20 Chúng dễ dàng được phân biệt với các cặp NST khác bởi kích thước bé và vị trí tâm động ở giữa

* Đặc điểm phân loại 3 cặp nhiễm sắc thể nhóm G: Gồm các cặp số

21, 22 và NST giới tính Y Chúng đều là các NST tâm mút Cặp số 21 và 22 đều có thể kèm Hai cặp NST này khó phân biệt, chỉ có thể phân biệt được chúng bằng phương pháp nhuộm băng

1.2 Các tác nhân gây tổn thương phân tử ADN

Evans, Van Zeland, Natarajan đã sử dụng mô hình tổn thương phân tử ADN sau đây để diễn tả tác động của các mutagen:

Hình 1.6: Các kiểu tổn thương phân tử ADN

1.2.1 Tổn thương phân tử ADN do tia tử ngoại (UV)

Tia tử ngoại (ultraviolet light), có bước sóng nằm trong khoảng 100 – 400

nm (tia Rưntgen có bước sóng từ 0,001 – 100 nm) Các nghiên cứu ở cấp độ phân tử đã chứng minh khả năng gây tổn thương cấu trúc phân tử protein, màng tế bào Phân tử ADN có khả năng hấp thụ tia tử ngoại cao ở bước sóng 254 - 260

nm Chính vì vậy, tia tử ngoại là một trong những tác nhân gây tổn thương phân tử ADN Hầu hết các tổn thương phân tử ADN do UV đều là pyrimidin dimer với

3 kiểu thymine dimer, cytosine dimer và thymine - cytosine dimer Tổn thương pirimidine - pyrimidone và liên kết protein – ADN cũng được phát hiện ở tế bào chiếu tia tử ngoại

Con đường phục hồi các tổn thương phân tử ADN do tia tử ngoại được thực hiện bởi cơ chế quang hoạt và phục hồi trong tối Sự khuyết phục hồi các

tổn thương này có thể dẫn đến việc tạo nên các tổn thương chuỗi đôi thứ cấp và

gián tiếp hình thành sai hình NST [25]

1.2.2 Tổn thương phân tử ADN do bức xạ ion hóa

Bức xạ ion hóa là những tác nhân khi tác động lên vật chất có khả năng gây nên hiện tượng ion hóa Bức xạ ion hóa là một tập hợp nhiều loại bức xạ(,, , ) Chúng có bản chất khác nhau, năng lượng, mật độ và độ xuyên thấu khác nhau

Bức xạ ion hóa tác động lên sinh học gây nên hiệu ứng sinh học Hiệu ứng sinh học phản ánh 3 quá trình tác động của bức xạ ion hóa, đó là quá trình vật lý, quá trình hóa học và quá trình sinh học Hiệu ứng sinh học được biết với khái niệm định tính và định lượng Hiệu ứng sinh học, như vậy, sẽ phụ thuộc vào loại bức xạ ion hóa, liều lượng và suất liều Trong các nghiên cứu hiệu ứng sinh học, liều bức xạ ion hóa bao gồm các khái niệm: liều chiếu, liều hấp thụ và liều tương đương Liều tương đương là liều hấp thụ nhân với trọng số mô sinh học Bức xạ ion hóa gây tổn thương sinh học trực tiếp hoặc gián tiếp ở các cấp độ phân tử, tế bào, cơ thể [23], [24]

Đối với phân tử ADN, bức xạ ion hóa gây tổn thương chuỗi phân tử ADN, gồm các tổn thương chuỗi đơn (SSB), chuỗi đôi (DSB), các tổn thương bazơ nitơ Từ các tổn thương phân tử, bức xạ ion hóa gây nên các triệu chứng lâm sàng ở sinh vật như nôn mửa, rối loạn tiêu hóa, ung thư, vô sinh, con cái khuyết tật … Hiệu ứng sinh học gây bởi bức xạ ion hóa có thể phụ thuộc liều lượng (hiệu ứng có ngưỡng, hiệu ứng tiền định) hoặc không có ngưỡng Hiệu ứng di truyền là

lượng bức xạ Hiệu ứng gây chết tế bào là hiệu ứng có ngưỡng, phụ thuộc vào liều lượng phóng xạ.[6], [14]

Các tổn thương chuỗi phân tử ADN là cơ sở để tạo nên sai hình NST Các kiểu sai hình NST phụ thuộc vào kiểu tổn thương phân tử ADN, phụ thuộc vào số khả năng tái liên kết các đầu dính được tạo thành Năm 1982, Cơ Quan Năng Lượng Nguyên Tử Quốc Tế đã chọn hiệu ứng sai hình NST ở tế bào lympho máu ngoại vi người làm tham số định liều phóng xạ Cho đến nay, phương pháp định liều sinh học sử dụng kỹ thuật phân tích sai hình NST đang được phổ biến rộng rãi trên toàn thế giới [18]

1.2.3 Tổn thương phân tử ADN do các tác nhân hóa học

Dựa trên bản chất tổn thương phân tử ADN có thể phân loại tác động của hóa chất theo cơ chế tử ngoại và theo cơ chế bức xạ ion hóa Theo cơ chế tử ngoại, các chất hóa học gây tổn thương phân tử bằng các phản ứng cạnh tranh như alkyl hóa, oxi hóa, methyl hóa, đề amin hóa, đề purine hóa Các hoá chất thuộc nhóm này bao gồm:

+ Nhóm các chất ức chế tổng hợp base trong cấu trúc ADN như: coffein, ethyl uretan,

+ Nhóm các chất đồng đẳng với base như 5-bromuracil (5-BU),… chúng là các base đồng dạng, gây sự liên kết nhầm khi tổng hợp

+ Nhóm các chất alkyl hoá có khả năng cắt mạch ADN như nitrosoguadin (NG), etylmethanesulfonate (EMS),

+ Nhóm các chất oxy hoá khử, có thể gây biến đổi trực tiếp trên ADN

+ Nhóm các chất chèn vào phân tử ADN làm thêm hoặc mất base, gây đột biến lệch khung [6], [7], [29], [33]

Theo cơ chế tác động bức xạ ion hóa, các tác nhân hóa học thuộc nhóm này còn gọi là nhóm bắt chước phóng xạ (radiomimetic chemical agent) Thuộc nhóm này có bleomicine, phleomicine, neocarzinostatin … và mới đây nhất là công bố của Trần Quế về tác động kiểu bức xạ của dimethoat (hoạt chất trừ sâu lân hữu cơ) Các loại hóa chất này có khả năng gây tổn thương chuỗi phân tử ADN kiểu đứt gãy đôi và đứt gãy đơn, qua đó trực tiếp hình thành sai hình NST [11], [18], [20]

Các khảo sát tại các vùng đân cư vùng nhiễm độc arsen (As) ở Ấn Độ, Banglades, Chile đã phát hiện sai hình NST cao hơn bình thường Các nghiên cứu tính độc di truyền của các hợp chất As3+, As5+, Cd3+ đã chứng minh khả năng gây tổn thương phân tử ADN dẫn đến sai hình NST của chúng Bản chất tác động của As3+, As5+, Cd3+ không chỉ giới hạn ở khả năng gây tổn thương mà còn ức chế các enzim phục hồi; qua đó, làm trầm trọng hơn các tổn thương do các tác nhân đột biến khác gây ra [18]

1.3 Khả năng và các cơ chế phục hồi tổn thương phân tử ADN

Biểu hiện kiểu sai hình NST phụ thuộc 3 cơ chế sinh học chủ yếu: kiểu tổn thương phân tử ADN, phục hồi tổn thương và chu trình phân bào [37] Phục hồi tổn thương phân trử ADN là một đặc điểm quan trọng của sinh vật, đã được phát hiện ở cả sinh vật nhân sơ lẫn sinh vật nhân chuẩn Các tổn thương theo kiểu UV được phục hồi chủ yếu theo cơ chế quang hoạt, cắt bỏ hoặc dung nạp Các tổn thương base và các tổn thương liên kết đều được phục hồi theo cơ chế

cắt lọc Các tổn thương chuỗi đơn được phục hồi theo cơ chế liên kết bổ sung Phục hồi tổn thương chuỗi đôi cũng đã được phát hiện ở một số vi khuẩn kháng

xạ như Dinococcus radiodurans theo cơ chế tái liên kết các đầu dính Nhiều loại

enzim phục hồi có ở sinh vật nhân sơ đã được phát hiện ở sinh vật nhân chuẩn Một trong những phát hiện gần đây được công bố bởi Heartlein và Preston khi thêm enzim Cytosine Arabinose (AraC) vào môi trường nuôi cấy tế bào lympho chiếu bức xạ LET thấp (sử dụng tia gamma) thấy tần số đứt gãy chuỗi đôi tăng lên Natarajan, Van Zeland giải thích rằng, quá trình phục hồi các tổn thương base đã bị khuyết hoặc nhầm dẫn đến sự lạm dụng quá mức enzim cắt lọc làm cho chuỗi mang tổn thương bị khoét rộng quá mức tạo nên tổn thương chuỗi đôi [34], [35]

Một số chất hóa học như dung môi gốc benzen, các hợp chất của arsen, cadmi, muối kim loại nặng,… không những có khả năng gây tổn thương phân tử ADN mà còn có khả năng ức chế enzim hoặc làm sai lệch quá trình phục hồi tổn thương phân tử ADN do các tác nhân khác gây ra [19] Cadmi là một hóa chất được liệt vào nhóm chất độc bền có khả năng tích lũy sinh học (PBT – persistent, bioaccumulative and toxic chemical) Flessel (1997) với thí nghiệm trên vi sinh vật đã công bố các hợp chất arsen, crom, molipden gây ảnh hưởng đến tính chính xác của quá trình phục hồi Hamadedeh (2002) phát hiện As3+làm giảm biểu hiện của gen p53 và gen liên kết ADN - protein liên quan đến phục hồi tổn thương ADN ở người [21], [22] Jha (1992) sử dụng tế bào lympho người xử lý phối hợp arsen với chiếu bức xạ Rơngen cho thấy có sự giảm quá trình phục hồi, ức chế hoạt tính enzim ligase, tăng sao chép tái tạo, tăng tổn thương do UV hoặc Rơngen [22], [23] Các thí nghiệm của Danaee (2004), Tapio (2005), Chen (2005) không những khẳng định sự ảnh hưởng của hợp chất arsen

lên hệ thống phục hồi tổn thương phân tử ADN mà còn xác nhận tính đa dạng về

cơ chế tác động của chúng lên hệ thống này ở các tế bào khác nhau [18 ]

Mặc dù còn ít số liệu nghiên cứu về cadmi hơn so với các nghiên cứu đã được tiến hành trên arsen Tuy nhiên, khi cadmi được xếp cùng nhóm hoá chất độc như arsen thì những nghi vấn về nó như là một tác nhân có vai trò ức chế enzim phục hồi tổn thương phân tử ADN phải được đặt ra

1.4 Sai hình nhiễm sắc thể và cơ sở phân loại

1.4.1 Sai hình nhiễm sắc thể

Sai hình NST là những biến đổi bất thường về đặc điểm karyotype Sự hình thành sai hình NST liên quan đến các đứt gãy trực tiếp hoặc gián tiếp của chuỗi đôi ADN và sự tái liên kết giữa các đầu mút bị mất các trình tự telomere [9], [10], [11], [33], [37] Kiểu sai hình NST được quyết định bởi 3 quá trình sinh học: kiểu tổn thương phân tử ADN, khả năng phục hồi các tổn thương và chu trình tế bào Tổn thương chuỗi đôi phân tử ADN là cơ sở của sự hình thành sai hình NST Tổn thương chuỗi đôi có thể được tạo ra một cách trực tiếp do tác động của các mutagen kiểu bức xạ ion hoá hoặc gián tiếp do sự khuyết phục hồi hoặc phục hồi nhầm các tổn thương khác Trong cùng chu trình tế bào, nếu xảy

ra tổn thương chuỗi đôi trước pha S sẽ hình thành sai hình kiểu NST; sau pha S sẽ hình thành sai hình kiểu nhiễm sắc tử [37]

1.4.2 Cơ sở phân loại và cơ chế hình thành sai hình nhiễm sắc thể

 Tổn thương vô sắc (Gap)

Gap có kiểu hình là vạch vô sắc trên 1 hoặc cả 2 nhiễm sắc tử của NST Dưới kính hiển vi điện tử, “gap” vẫn còn sợi ADN Hiện nay, “gap” được coi là lỗi về sự duỗi xoắn các phân tử ADN trong một thời điểm nào đó

 Đứt gãy nguyên thủy (primery breaks) Tổn thương chuỗi đôi phân tử ADN tự nó cũng có thể tạo nên các kiểu sai hình NST mà không qua quá trình tái liên kết Ở cấp độ NST, sai hình là các mảnh không tâm Ở cấp độ nhiễm sắc tử, sai hình là các đứt gãy nhiễm sắc tử

 Sai hình kiểu nhiễm sắc thể

Cơ chế hình thành sai hình NST được giải thích trên cơ sở thuyết tái hợp (breakage- reunion theory) và thuyết trao đổi (exchange theory) giữa các mảnh có “đầu dính” của Evans, Natarajan, Revell, Sax Các nghiên cứu phân loại sai hình NST của Bender, Chadwick, Leendhout, Savage cũng sử dụng cơ chế tái liên kết giữa các mảnh có “đầu dính” để giải thích cơ chế hình thành các kiểu sai hình NST Kiểu sai hình NST phụ thuộc vào số lượng đứt gãy đôi để tạo ra các “đầu dính” và sự tái liên kết của các mảnh có đầu dính đó [37]

Trường hợp chỉ có 1 tổn thương chuỗi đôi: Quá trình tái liên kết các “đầu dính” xảy ra thì tổn thương được phục hồi, nếu không sẽ tạo nên sai hình mảnh không tâm và 1 NST ngắn hơn

Trường hợp có 2 hoặc hơn 2 tổn thương chuỗi đôi: Tái liên kết các mảnh có “đầu dính” do nhiều tổn thương chuỗi đôi để hình thành các kiểu sai hình khác nhau phụ thuộc vào các tổ hợp tái liên kết các mảng có đầu dính Trong trường hợp tế bào có 1 đứt gãy đôi kép trên 2 NST (hình 1.7), từ 4 “đầu dính”

của 2 mảnh có tâm và 2 mảnh không tâm có thể tái liên kết hoàn toàn theo từng cặp để tạo nên 1 sai hình 2 tâm kèm 1 mảnh không tâm (a); hoặc chuyển đoạn thuận nghịch (b); hoặc xảy ra liên kết không hoàn toàn tạo nên 2 mảnh có tâm (c); hoặc 2 mảnh không tâm; hoặc 1 mảnh có tâm và 1 mảnh không tâm (e và f)

A b c d e f Hình 1.7: Các kiểu sai hình do tổn thương chuỗi đôi kép trên 2 NST Trong trường hợp tế bào có 2 đứt gãy đôi kép trên 3 NST (hình 1.8), 8

“đầu dính” theo 2 nhóm cơ hội liên kết giữa 4 “đầu dính” trong mỗi nhóm tương đương nhau Vị trí khác nhau của đứt gãy đôi trên NST khác nhau đã tạo nên các kiểu sai hình khác nhau ngay cả khi các liên kết tương hỗ giữa các mảnh có

“đầu dính”xảy ra hoàn toàn

Các đứt gãy đôi trên xảy ra trên 2 vai của 1 NST sẽ tạo nên sai hình 3 tâm, các đứt gãy đôi xảy ra trên cùng vai sẽ tạo nên sai hình 2 tâm Biểu hiện của các liên kết không hoàn toàn là 8 kiểu sai hình NST khác nhau bao gồm các sai hình 2 tâm, chuyển đoạn, mảnh không tâm

2 DSB kép khác vai 2 DSB kép cùng vai

Liên kết hoàn

toàn

Liên kết hoàn toàn

Hình 1.8: Các kiểu sai hình hình thành từ đứt gãy đôi kép trên 3 NST

Trong trường hợp đứt gãy đôi kép xảy ra trên 2 vai của 1 NST (hình 1.9a), đứt gãy đôi xảy ra trên 2 vai của 1 NST sẽ tạo ra 4 “đầu dính” Sự liên kết hoàn toàn giữa các đầu dính sẽ tạo nên kiểu sai hình vòng có tâm kèm mảnh không tâm (a); hoặc đảo đoạn (b) Liên kết không hoàn toàn sẽ tạo nên 4 kiểu sai hình: hoặc vòng kèm 2 mảnh không tâm (c), hoặc 1 NST ngắn kèm 1 mảnh không tâm (d), hoặc 1 NST ngắn kèm 1 mảnh không tâm khác (e và f)

a b c d e f

Liên kết hoàn toàn Liên kết không hoàn toàn

Hình1.9a: Các sai hình hình thành từ đứt gãy đôi kép trên 2 vai của 1NST

Trong trường hợp đứt gãy đôi kép xảy ra trên 1 vai của 1 NST (hình 1.9b),

2 đứt gãy đôi kép trên cùng vai 1 NST, sự liên kết giữa 2 “đầu dính” của đoạn

trung tâm sẽ tạo nên vòng có tâm (a); liên kết hoàn toàn giữa các đầu dính còn lại tạo ra đảo đoạn ngoài tâm (b) Nếu chỉ có 2 “đầu dính” của mảnh trung tâm liên kết sẽ tạo nên kiểu sai hình (c); nếu liên kết xảy ra giữa 2 mảnh cuối sẽ tạo nên kiểu sai hình (d); nếu liên kết chỉ xảy ra giữa 2 mảnh không tâm sẽ có sai hình (e) và nếu liên kết xảy ra giữa mảnh trung tâm và mảnh có tâm sẽ hình thành sai hình kiểu (f)

a b c d e f

Hình 1.9b: Các kiểu sai hình hình thành từ đứt gãy đôi kép trên 1 vai của 1 NST

 Sai hình kiểu nhiễm sắc tử

Sai hình kiểu nhiễm sắc tử là các kiểu sai hình chỉ làm thay đổi 1 trong 2 nhiễm sắc tử của NST

Sai hình kiểu nhiễm sắc tử có thể do các đứt gãy đôi sau pha S hoặc đứt gãy đơn trước pha S của chu trình phân bào Sai hình nhiễm sắc tử phức tạp về hình thái, phụ thuộc số lượng tổn thương tham gia tạo nên các “đầu dính”, hình thức liên kết và quan hệ tương đồng hoặc không tương đồng của các NST tham gia vào quá trình

Trường hợp tổn thương SSB trên 2 NST trước pha S (hình 1.10), có việc tái liên kết hoàn toàn của 4 “đầu dính” tạo nên các kiểu sai hình radical a, b, c,

d Trong đó, a và c được gọi là radical kiểu chữ U, b và d được gọi là radical kiểu chữ X Khi không có tái liên kết hoàn toàn sẽ tạo nên các kiểu sai hình radical kiểu U hở e, g, i, k và radical X hở f, h, j, l

a b c d e f g h i j k l Liên kết hoàn toàn Liên kết không hoàn toàn

Hình 1.10: Các kiểu sai hình radical do SSB trên 2 NST trước pha S Trường hợp có 2 đứt gãy đơn kép trên 3 NST, tái liên kết hoàn toàn các mảnh tạo nên 6 kiểu sai hình radical (hình 1.11) và sự tái liên kết không hoàn toàn sẽ tạo nên các kiểu radical phức tạp

Hình 1.11: Các kiểu sai hình radical do 2 đứt gãy đơn kép trên 3 NST Trường hợp đứt gãy đơn kép trên cùng vai của 1 NST: Kiểu tổn thương này có thể xảy ra giữa 2 sợi đơn khác nhau hoặc trên cùng một sợi đơn (hình

1.12) Cả 4 “đầu dính” đều có khả năng liên kết tương hỗ nhau Các trường hợp

liên kết hoàn toàn sẽ tạo nên các sai hình a, b; nếu tái liên kết không hoàn toàn

sẽ tạo nên các kiểu sai hình c, d, e, f

Trường hợp đứt gãy đơn kép khác vai của 1 NST: kiểu tổn thương có

thể xảy ra trên 2 sợi đơn khác nhau (hình 1.13a) hoặc xảy ra trên cùng một sợi

đơn (hình 1.13b)

Hình 1.13a: Các kiểu sai hình NST do 1.13b: Các kiểu sai hình NST do đứt

đứt gãy đơn kép trên 2 sợi đơn khác vai gãy đơn kép trên 1 sợi đơn khác vai

1.5 Tế bào lympho máu ngoại vi người và khả năng sử dụng kỹ thuật phân tích sai hình NST trong nghiên cứu tác động của mutagen và ứng dụng Tế bào lympho xuất phát từ tế bào gốc tạo máu (hematopoietic stem cell) qua quá trình tăng trưởng, biệt hoá và trưởng thành ở các cơ quan lympho, tham gia vào quá trình tạo nên các đáp ứng miễn dịch bảo vệ cơ thể Chúng có chức năng là bộ nhớ của hệ miễn dịch nên luôn mang các dấu chuẩn di truyền riêng Các dòng tế bào được tạo ra từ tế bào lympho gọi là lymphoblast Các dòng lymphoblast mang các dấu chuẩn di truyền khác nhau, là đối tượng quan trọng trong nghiên cứu di truyền và y học [5], [8].

Ở người bình thường, số lượng tế bào lympho trong cơ thể lên đến 2.1012, phân bố đều theo hệ thống máu ngoại vi khắp cơ thể, có thời gian sống khoảng 3.5 – 4 năm, có khi tới 20 năm Trong cơ thể, có đến khoảng 99% tế bào lympho luôn tồn tại ở pha Go của chu trình phân bào mà ở pha này tế bào bị mất khả năng phân chia, từ đó có thể tạo điều kiện để tích lũy các sai hình NST gây ra do tổn thương chuỗi xoắn kép ADN bởi các mutagen Tính đồng bộ pha của quần thể này là một đối tượng hiếm phục vụ công tác nghiên cứu các cơ chế biến đổi

di truyền học dưới ảnh hưởng của môi trường lên cơ thể

Ở tế bào lympho, sai hình NST được tích luỹ trong suốt đời sống của nó Đồng thời, khả năng biểu hiện hiệu ứng sai hình NST trong tình trạng in vitro không sai khác so với in vivo do sai hình NST ở tế bào lympho là loại hiệu ứng ít chịu ảnh hưởng của các cơ chế sinh học Do vậy, có thể xem sai hình NST như một hiệu ứng chỉ thị để đánh giá ảnh hưởng các chất độc của môi trường lên tế bào cơ thể [2],[10], [23], [24], [29]

Năm 1960, Nowell phát hiện khả năng kích thích phân chia tế bào lympho

in vitro bởi một số lectin thực vật, trong đó có phytohemaglutinine (PHA) đã mở

ra một triển vọng sử dụng nguồn tế bào đồng bộ hoá này trong việc phân tích cơ chế gây tổn thương phân tử ADN và ảnh hưởng của các hoá chất ức chế phục hồi tổn thương do các mutagen gây ra Giá trị của hiệu ứng sai hình NST ở tế bào lympho phụ thuộc vào thời gian của thế hệ tế bào Sai hình NST ở lần phân chia thứ nhất có giá trị biểu hiện tác động của ngoại cảnh lên cơ thể, có tính định lượng, sai hình NST ở lần phân chia thứ hai không còn tính chất này nhưng lại là điều cần thiết trong nghiên cứu các độc chất trong tình trạng in vitro [23], [30], [35] Sai hình NST không chỉ được gây ra bởi các bức xạ ion hoá mà còn được gây ra bởi các mutagen hoá học Kỹ thuật phân tích sai hình NST ở tế bào lympho cho phép phân loại kiểu gây tổn thương phân tử ADN của các nhóm tác nhân gây đột biến Đối với đặc điểm thiếu ổn định, nhiều công trình nghiên cứu xác nhận vai trò của yếu tố sinh lý cá thể Song, trong nỗ lực tìm kiếm nguyên nhân dẫn đến sự bất ổn định về tác hại phóng xạ ở vùng liều thấp, nhóm các yếu tố độc môi trường có vai trò ức chế phục hồi tổn thương phân tử ADN được đặc biệt quan tâm [2], [27], [28], [30]

Hình 1.14: Cadmi dưới dạng đơn chất

Tuy nhiên, trong tự nhiên, cadmi chỉ tồn tại ở dạng hợp chất (oxide và muối), đặc biệt là các dạng muối nitơ, chlor, sulfate, sulfide tan trong nước, các dạng oxide và carbonate của cadmi thường lẫn trong mỏ kẽm, chì và đồng đỏ Các hợp chất của cadmi còn tồn tại dưới dạng hạt bụi trong không khí Cadmi có thể biến đổi dạng chất nhưng không mất đi trong môi trường [13], [16], [38], [39], [40], [41] Cadmi tồn tại trong thực phẩm, đặc biệt là cao nhất ở thủy hải sản; mỗi điếu thuốc lá chứa trung bình từ 1 – 2g Nếu một người hút mỗi ngày một gói thuốc lá sẽ bị nhiễm từ 1-3g cadmi, trong đó 40 – 60% được đưa qua phổi Sinh vật nhiễm cadmi từ nước, không khí và thực phẩm Cadmi khi vào cơ thể tồn tại một thời gian dài và có thể tích lũy qua nhiều năm Hàng năm, theo ước đoán có khoảng từ 25000 – 30000 tấn cadmi được thải vào môi trường Trong đó, hơn một nửa được rửa trôi ra biển Các hoạt động của con người như đốt than đá, rác thải, bón phân, khai thác mỏ, nước thải sinh hoạt, thải ra 4000 – 13000 tấn cadmi mỗi năm [39], [40]

1.6.2 Khả năng gây đột biến của cadmi và các hoá chất nhóm PBT Một số muối kim loại nặng như chì, kẽm, arsen, cadmi, là những tác nhân không chỉ trực tiếp gây tổn thương phân tử ADN mà còn gây ảnh hưởng

đến hệ thống phục hồi tổn thương do các tác nhân khác Các yếu tố ức chế phục hồi tổn thương phóng xạ trong môi trường có thể làm tăng mức độ nguy hiểm của phóng xạ ngay cả ở những giới hạn liều được coi là an toàn Với kết quả phân tích kiểu và tần số sai hình NST ở tế bào lympho người xử lí As 

và Pb trước hoặc sau chiếu xạ gamma của nhóm Trần Quế, Mitsuaki Yoshida (2006) đã chỉ ra arsenic ở liều 0,05g/ml (chuẩn an toàn cho nước uống của Việt Nam, WHO) có ảnh hưởng mạnh mẽ đến chỉ số phân bào của tế bào lympho người Arsen không trực tiếp gây tổn thương phân tử ADN dẫn đến sai hình NST nhưng có khả năng làm sai lệch tần số các kiểu sai hình NST sau khi chiếu bức xạ gamma Điều này có nghĩa, arsen là yếu tố gây nên sự bất ổn định về hiệu ứng sai hình NST do bức xạ Nhiều dung môi hữu cơ gốc benzen, một số hợp chất của arsen, cadmi, muối thiếc, muối chrom, muối mangan, không những có khả năng gây tổn thương phân tử ADN theo kiểu bắt chước phóng xạ mà còn làm bất hoạt hệ thống các enzim phục hồi Khi có mặt các loại hoá chất này thì không những thành phần phân loại sai hình mà tần số sai hình NST gây nên bởi phóng xạ cũng sẽ thay đổi [14], [17]

Đã có nhiều nghiên cứu về tác hại của cadmi đối với cơ thể người và động vật Cadmi gây ra mất chất khoáng trong xương, tăng huyết áp, thiếu sắt, bệnh gan, thận, ảnh hưởng thần kinh, Vì vậy, cadmi được xếp vào loại hoá chất cực độc đối với con người Ở người, cadmi gây bệnh đường ruột ở trẻ em và có thể gây sinh non ở thai phụ, khó truyền từ mẹ sang con nhưng vẫn tìm thấy một

ít qua nhau thai và sữa mẹ Nhiễm cadmi ở mức cao gây hại phổi nghiêm trọng, gây rối loạn hoạt động tim, loét bao tử, nôn mửa, tiêu chảy và ở mức nặng có thể gây tử vong Đồng thời, hóa chất này còn là tác nhân gây ung thư, bệnh tuyến tiền liệt Cadmi là một mutagen hoạt động, ảnh hưởng đến sự sinh sản của

tế bào và ức chế quá trình sửa chữa sai sót ở AND [16], [19], [39] Nghiên cứu ở động vật (chuột) cho thấy, nhiễm cadmi trong suốt thời gian mang thai có làm thay đổi hành vi, khả năng nhận biết, có thể ảnh hưởng đến trọng lượng và sự phát triển bộ xương, mật độ xương của con non Và nếu chế độ ăn ít canxi, sắt, protein và nhiều chất béo sẽ dễ bị nhiễm cadmi hơn một chế độ ăn uống cân đối [39], [40], [41] An toàn cadmi luôn được WHO đặc biệt quan tâm Ở Mỹ, nhiều tổ chức hoạt động nhằm đảm bảo đưa ra khuyến cáo và luật định về an toàn cadmi như: Food and Drug Administration (FDA), Environmental Protection Agent (EPA), Occupational Safety and Health Administration (OSHA), Agen for Toxic Substances and Disease Registration (ATSDR), National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH).[36], [39] Guidline của WHO đối với chuẩn nước uống là 5ppb, thực phẩm là 2-40 ppm, không khí là 100g/ m3 Hầu hết các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam áp dụng chuẩn nước uống với nồng độ cadmi cho phép là 0,05mg/l

Phần lớn cadmi vào cơ thể người được đưa đến giữ lại ở gan, thận để được thải dần qua nước tiểu và các chất cặn bã Cadmi vào máu liên kết với metallothionein trong huyết tương tạo phức hợp cadmi – metallothionein, từ đó được loại thải dần Nếu không, cadmi sẽ được tích luỹ và gây nguy hiểm cho sức khỏe con người Dư lượng cadmi tích luỹ trong gan, thận được sử dụng như những dấu chuẩn sinh học (biomarker) để đánh giá mức độ nhiễm bẩn cadmi trong môi trường [36], [41]

Hiệu ứng tế bào học, di truyền học là những chỉ thị sinh học quan trọng được sử dụng để đánh giá tính độc của cadmi trên các hệ thống in vitro cũng như

in vivo Tần số cao các hiệu ứng di truyền học như tổn thương phân tử ADN, sai

hình NST, đứt gãy nhiễm sắc tử đã được phát hiện ở những đối tượng liên quan đến môi trường nhiễm cadmi

Một sự nỗ lực tìm kiếm cơ chế tác động của cadmi lên tế bào ở mức phân tử cũng giống như arsen là những tác nhân gây bất hoạt hệ thống phục hồi tổn thương phân tử ADN Như vậy, cadmi là yếu tố trực tiếp gây nên tổn thương phân tử ADN hay gián tiếp làm tăng tần số sai hình NST do tác động làm bất hoạt hệ thống enzim phục hồi tổn thương phân tử ADN hay cả hai là vấn đề cần đặt ra Chưa có nhiều số liệu, bằng chứng thuyết phục chứng minh cadmi là yếu tố có tính đa dạng về cơ chế tác động, ảnh hưởng đến cơ chế phục hồi bộ gen hoặc cơ chế phục hồi bổ sung như As3+ ở nồng độ 2.5M ở tế bào dòng

fibroblast (Hartwig - 1997) Tuy nhiên, khả năng ảnh hưởng của cadmi đến hệ

thống phục hồi tổn thương do các yếu tố khác đã được chứng minh Andesen et al.,(1983) nuôi cấy tế bào lympho người cho thấy rằng cadmi ở nồng độ 1.1 mg/l có thể gây ức chế hiệu quả phân bào và khả năng tổng hợp metallothionein Ngay cả ở những nồng độ không độc tế bào thì cadmi vẫn là yếu tố ức chế phục hồi bộ gen, ức chế phục hồi sao chép bổ sung, ức chế phục hồi cắt lọc [36], [38], [39], [40], [41]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tế bào lympho máu ngoại vi của người khỏe mạnh, chưa phải điều trị bằng liệu pháp phóng xạ, không sống trong vùng chất độc chiến tranh, được xác định tần số sai hình nhiễm sắc thể không vượt tần số khảo sát ngẫu nhiên

Dung dịch chuẩn cadmi, Cd(NO3)2trong dung dịch HNO3 0,1M với nồng độ Cd 1000g/ml (hãng Wako, Japan)

Nguồn bức xạ gamma Co60 suất liều 0,0514 Gy/s, được che chắn bởi 2 buồng chì

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào lympho máu ngoại vi người

 Chuẩn bị dụng cụ

Danh mục dụng cụ cần chuẩn bị gồm:

Lọ thủy tinh đựng môi trường 100 – 500 ml

Lọ nuôi cấy tế bào 10ml

Nút cao su

Micro pipet (pipetman)

Pipet pasteur

Tất cả dụng cụ cho thao tác nuôi cấy đều phải là thủy tinh trung tính được rửa sạch các vết bẩn và hoá chất, được vô trùng nhiệt, tiến hành theo các bước nghiêm ngặt sau:

Rửa dụng cụ bằng xà phòng  tráng sạch bằng nước thường  ngâm trong dung dịch NaOH 5% trong 5 giờ  tráng sạch bằng nước thường ngâm trong dung dịch HCl 5% trong 5 giờ  tráng sạch bằng nước thường  ngâm và tráng lại 2 lần bằng nước cất  sấy khô, làm nút bông, đóng gói  hấp tiệt trùng 1 atm trong 30 phút  bảo quản

 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy tế bào

* Thành phần hoá chất:

Môi trường bột F10 (Difco)

PHA – Phytohemaglutinin (Sigma)

Fetal calf serum (Gibco)

Litium Heparine 400U

L-glutamine

Kanamicine

Colchicine

 Môi trường cơ bản:

Hỗn hợp gồm 197.9 g môi trường bột F10 + 24gr NaHCO3 + 20 lít nước cất

2 lần đã kiểm tra chí nhiệt tố Lắc cho tan hết Chỉnh pH dung dịch bằng NaHCO3 và HCl về pH = 7.2 - 7.4 Lọc vô trùng bằng filter 0.22m Bảo quản lạnh

Huyết thanh vô trùng được bất hoạt ở nhiệt độ 560C / 1 giờ

Heparine pha loãng trong nước cất vô trùng đến 400 E / 1 ml

Kanamicine 20 000U trong nước cất vô trùng

L – glutamin pha loãng đến 200 mM Lọc vô trùng

PHA: 5 ml nước muối sinh lý vô trùng / lọ

Colchicine: Pha loãng trong nước cất vô trùng đến 160g/ lít

 Môi trường nuôi cấy:

Tất cả hoá chất, môi trường cơ bản đều phải vô trùng và được bảo quản ở điều kiện lạnh sâu (-100C đến -200C )

Môi trường nuôi cấy được chuẩn bị ngay trước khi tiến hành nuôi cấy theo công thức:

Môi trường cơ bản: 100 ml

Huyết thanh thai bò: 15 ml

Heparin 400 E: 12.5 ml

Kanamicine: 0.6 ml

PHA: 5 ml

 Thường qui nuôi cấy tế bào lympho máu ngoại vi người

Thường qui kỹ thuật nuơi cấy tế bào lympho máu tồn phần được thực hiện theo các bước sau:

+ Máu ven được lấy bằng dụng cụ vô trùng, trong điều kiện thao tác vô trùng Mẫu máu được bảo quản với heparine chống đông ở 40C

+ Chuẩn bị mơi trường nuơi cấy 370C trong ống plastic vơ trùng hoặc lọ thuỷ tinh trung tính vơ trùng (10 ml mơi trường /ống 15 ml hoặc 5 ml mơi trường / lọ 10 ml)

+ Thêm máu tồn phần vào ống nuơi cấy, lắc đều, đặt nghiêng trong khay nước 370 C, sau đĩ chuyển vào tủ 370C Thời gian ủ 48 giờ

+ Tại thời điểm 46 giờ, các ống nuơi cấy được thêm 50 µl dung dịch colchicine 160 µg/l

+ Thu hoạch ở thời điểm nuơi cấy đạt thời gian 48 giờ

2.2.2 Phương pháp cố định tế bào, làm tiêu bản hiển vi

 Phương pháp cố định tế bào

+ Chuyển huyền dịch nuôi cấy vào ống ly tâm 6ml, ly tâm 800 –1000 vòng / phút trong thời gian 7 phút Sau đó, lấy tế bào và lắc nhẹ cho tan tế bào trong 5ml hỗn hợp dung dịch nhược trương KCl 0.075M + citratnatri 1% trỉ lệ 3 :1, giữ ổn nhiệt 37oC / 20 phút

+ Ly tâm lần 2, 800 – 1000 vòng / phút / 7 phút, lấy cặn tế bào, làm tan lại trong 5ml dung dịch cố định cacnoa (3 thể tích methanol : 1 thể tích acid acetic), giữ 5 phút

+ Tiếp tục ly tâm 800 – 1000 vòng / phút / 7 phút, lấy cặn tế bào

+ Tiếp tục thay mới dung dịch cố định và ly tâm 2 lần nữa để rửa trôi các mảnh tạp có trọng lượng thấp hơn tế bào