xác định một số type hpv và các yếu tố liên quan trên các bệnh nhân ung thư cổ tử cung tại bệnh viện k trung ương

Từ thập niên 70 của thế kỷ trước, một số nhà khoa học đã tìm thấy mối liên quan chặt chẽ giữa ung thư CTC với một số type của HPV Human Papilloma Virus và các type này được mô tả như là

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư cổ tử cung (CTC) là loại ung thư phụ khoa gặp ở phụ nữ từ

20-75 tuổi, tuy nhiên độ tuổi thường gặp nhất là từ 35-55, chiếm 60% [1] Ở cácnước đang phát triển, ung thư CTC là loại ung thư đứng hàng thứ 2 sau ungthư vú ở phụ nữ, với tỷ lệ khoảng 9,8% trong số tất cả các loại ung thư [2].Theo ước tính, mỗi năm trên thế giới có gần 500.000 trường hợp mới mắc vàlàm tử vong 270.000 người [3] Khoảng 80% các trường hợp này tập trung ởcác nước đang phát triển [4] Năm 2005, Việt Nam có 4.471 ca ung thư CTCmới trong cả nước Tỷ lệ ung thư CTC ở miền Nam vào khoảng 16/100.000phụ nữ, ở miền Bắc vào khoảng 9,5/100.000 phụ nữ [3]

Từ thập niên 70 của thế kỷ trước, một số nhà khoa học đã tìm thấy mối

liên quan chặt chẽ giữa ung thư CTC với một số type của HPV (Human Papilloma Virus) và các type này được mô tả như là một trong những tác

nhân gây biến đổi tế bào CTC (loạn sản tế bào CTC), tiền đề của ung thưCTC Nhiễm HPV thường gặp trong các bệnh nhân nữ bị viêm nhiễm cơquan sinh dục (do nhiều căn nguyên khác nhau trong đó có HPV) HPV lâytruyền qua tiếp xúc trực tiếp, đặc biệt quan hệ tình dục có gây tổn thương

da và niêm mạc Biến chứng trầm trọng nhất của nhiễm HPV là các tổnthương tiền ung thư và ung thư CTC Theo một số tác giả gần như 100%các trường hợp ung thư CTC đều có nhiễm một hoặc nhiều type HPV nguy

cơ cao [3] Theo các nhà nghiên cứu, ung thư xâm lấn CTC có thể xảy rasau nhiễm HPV 15-20 năm [3] Một số nghiên cứu trên thế giới đã pháthiện HPV dương tính tại mô ung thư CTC 99%, 90% ở mô ung thư âm đạo

và 40% ở mô ung thư âm hộ [5]

Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm HPV ở phụ nữthành phố Hồ Chí Minh, Hà Nội cũng như trong cộng đồng Tuy nhiên chưa

có nhiều nghiên cứu về tình hình nhiễm HPV ở những phụ nữ có tổn thương usùi vùng CTC và đặc biệt là nhóm đã được xác định ung thư CTC thông quaxét nghiệm giải phẫu bệnh (xét nghiệm mô bệnh học) và đây là lý do để

chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định một số type HPV và các yếu tố liên

quan trên các bệnh nhân ung thư cổ tử cung tại bệnh viện K Trung ương”.

Đề tài có 2 mục tiêu sau:

1 Xác định tỷ lệ nhiễm một số type virus HPV trên các bệnh nhân ung

thư cổ tử cung đến khám và điều trị tại bệnh viện K Trung ương từ

tháng 7/2013 - 3/2014.

2 Xác định một số yếu tố liên quan đến tình trạng nhiễm HPV ở các đối tượng nghiên cứu.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 Human papilloma virus

1.1.1 Cấu tạo virus

HPV là virus thuộc họ Papillomavirus, gồm các virus lây lan qua con đường tiếp xúc trực tiếp, đặc biệt qua quan hệ tình dục Papillomavirus có các vật chủ khác nhau như chim (Avian papillomavirus-APV), bò (Bovin papillomavirus-BPV) Human papilloma virus (HPV) là loại Papilloma virus

gây tổn thương biểu mô da và niêm mạc đường sinh dục, hậu môn – trựctràng, hầu họng…của người [6]

Cũng như các Papilloma virus khác, HPV có cấu trúc là chuỗi xoắn kép

ADN, dài khoảng 8000bp, có vỏ capsid đối xứng xoắn, không có vỏ baongoài Hạt virion có đường kính 52-55nm, vỏ capsid gồm 72 đơn vịcapsomer Mỗi capsomer là một pentamer được cấu tạo bởi 2 protein, proteinchính L1 và protein phụ L2, được mã hóa bởi 2 gen muộn L1, L2 Protein L1chiếm 80%, L2 chiếm 20% tổng protein của HPV Protein L1 có vai trò gắnkết capsid với capsomer, tương tác với liên kết trên màng của tế bào chủ giúpvirus dễ dàng xâm nhập, đồng thời chúng đóng vai trò như một kháng nguyêncủa virus [7]

Hình 1: Mô hình virus HPV

Chuỗi xoắn kép ADN có 10 khung đọc mở ORF, sự sao chép, phiên mãxảy ra trên một mạch và theo một chiều duy nhất Bộ gen được phân làm 3 vùng:

+ Vùng điều khiển dài LCR (Long Control Region) hay còn gọi là vùngđiều hòa thượng nguồn URR (Upstream Regulatory Region), chiếm khoảng10% chiều dài bộ gene, không có gene mã hóa, có chức năng điều hòa saochép và sự nhân lên của virus Vùng này có chứa promoter p97, là tiểu phầnkhởi động các tiểu phần kích hoạt và một số vùng gene câm Đây cũng làvùng biến động nhất trong bộ gene HPV

+ Vùng gene sớm: gồm 6 gene, ký hiệu là E1, E2, E4, E5, E6, E7, mãhóa cho các protein thúc đẩy sự nhân lên của virus Gene E1 mã hóa proteinnhận diện vùng bắt đầu nhân lên, protein E2 liên quan quá trình sao mã geneE6, E7 của virus Protein E4 liên quan đến giai đoạn cuối, E5 có lien quan đến

cả giai đoạn sớm và muộn của chu kỳ tế bào E6 và E7 can thiệp vào chu trìnhchết của tế bào

+ Vùng gene muộn gồm 2 gene, ký hiệu là L1, L2 mã hóa cho cácprotein L1, L2 của vỏ capsid [7]

1.1.2 Phân loại HPV

Virus HPV không phát triển trong điều kiện nuôi cấy ở phòng thí nghiệmnên việc nghiên cứu chỉ có thể dựa trên nghiên cứu in vivo trên người hayđộng vật bị nhiễm những mẫu nhiễm này có thể lưu trữ ở -200C trong thờigian dài mà không làm giảm khả năng hoạt động của virus Đến nay đã có gần

120 type được biết đến, trong đó 20-30% là những type chưa được phân loại

vì bộ gene chỉ mới được giải trình tự một phần

Sự định type HPV không dựa vào huyết thanh như những loại virus khác

mà dựa trên sự tương đồng ADN Gen L1 bền vững nhất trong bộ gen củaHPV, do đó, hơn 20 năm qua các nhà khoa học đã căn cứ vào sự tương đồng

nucleotide của gene L1 để định type HPV HPV được gọi là type mới nếutrình tự ADN L1 có sự khác biệt trên 10% so với type đã biết gần nhất, nếuchỉ khác biệt từ 2-10% thì được gọi là phân type (subtype), nếu dưới 2%,người ta coi đó như là biến thể hay các dạng đột biến [8].

Trên cơ sở tổn thương lành hay ác tính, HPV được chia thành 2 nhóm,nhóm nguy cơ cao và nhóm nguy cơ thấp HPV nhóm nguy cơ thấp chủ yếugây mụn cóc, u nhầy, u nhú ở da và niêm mạc HPV nhóm nguy cơ cao gâytổn thương da và niêm mạc ác tính như ung thư CTC, âm hộ, âm đạo, dươngvật, hậu môn, hầu họng [5] Theo dịch tễ học HPV lại được chia thành 3nhóm như sau [9]:

1.2 Cơ chế gây bệnh của virus HPV

Quá trình xâm nhập và nhân lên của virus được mô tả như sau: proteinL1 tương tác với liên kết màng tế bào chủ, giúp sợi ADN của virus dễ dàngxâm nhập Các gen sớm E biểu hiện ngay sau khi virus xâm nhập vào tế bàođáy của da hoặc niêm mạc tế bào chủ Đoạn gen E6, E7 tích hợp vào nhiễmsắc thể như thể bổ sung, thoát khỏi sự điều hòa của gen E2, chúng được sao

mã, tổng hợp protein E6, E7 Thoạt tiên, protein E6 và E7 được biểu hiện, tếbào phân chia mạnh mẽ mang theo ADN của virus [10] Sau đó, protein E1 vàE2 đóng vai trò duy trì ADN của virus như thể bổ sung (episome), tạo thuậnlợi cho sự phân chia của hệ gene trong suốt quá trình phân bào [11] Protein

E1, E2, E6, E7 được biểu hiện sớm trong quá trình virus nhân lên để đảm bảoduy trì thể bổ sung với số bản copy bộ gen ít [12] Khi tế bào mang virus pháttriển đến lớp thượng bì, protein L1 được biểu hiện cùng với L2 hình thànhcapsid của virus và tại thời điểm đó, tế bào biểu mô bong sẽ mang theo virusbắt đầu quá trình lây nhiễm [13].

Hơn nữa, cơ chế phân tử của gene gây ung thư bởi HPV 16 được Ishiji

T mô tả và nhấn mạnh đến vai trò biến nạp của gen E6 và E7 E6 và E7 đượcsao chép từ promoter P97 P97 lại được điều hòa bởi sự tương tác phức hợpgiữa yếu tố đa chiều và sản phẩm E2 của tế bào virus Phá vỡ cấu trúc E2 dẫnđến biểu hiện quá mức E6 và E7 Protein p53 đóng vai trò như protein điềuhòa phát triển tế bào, có nghĩa sau khoảng 30- 50 lần phân bào, thể múttelomere ngắn đi, làm cho nhiễm sắc thể co dúm lại, tế bào đi vào chu trìnhchết có lập trình (opoprosis) Khi protein E6 gắn vào và giáng hóa proteinp53, tế bào thoát khỏi quá trình opoprosis, liên tục phân chia, đó là cơ sở hìnhthành u Protein Rb (riboblastoma) tham gia quá trình sửa chữa ADN tronggiai đoạn nghỉ G1 và G2 của quá trình phân bào Nhưng, protein E7 làm thayđổi hình thái và ức chế protein Rb, khiến cho ADN bị tổn thương không đượcsửa chữa tiếp tục nhân lên không ngừng mà không có sự kiểm soát củaprotein p53 [14] [15] Đột biến gene p53 và Rb ở những bệnh nhân HPV âmtính và không có dòng tế bào ung thư cổ tử cung do HPV Như vậy vai trò bấthoạt pRb và p53 của E6 và E7 rất quan trọng trong gene ung thư CTC [16]

Chính quá trình vô hiệu hóa protein ức chế khối u, protein E6 và E7 đãđưa tế bào thoát khỏi chu trình chết có chương trình (optoprosis), tiếp tụcphân chia không kiểm soát Đó là cơ sở của quá trình hình thành u

Hình 2: Mô hình sự tiến triển của tổn thương CTC do HPV

1.3 Ung thư cổ tử cung

Ung thư CTC thường gặp ở lứa tuổi 35-55, triệu chứng hay gặp là ramáu bất thường, ra máu sau giao hợp hay ra máu sau mãn kinh Ở giai đoạnmuộn thì khí hư có lẫn máu, mủ hay mùi hôi Khi đặt mỏ vịt quan sát có thểthấy dạng sùi như hoa súp lơ, bở, dễ chảy máu [17]

Ung thư CTC thường xuất hiện ở vùng ranh giới vảy trụ, khoảng 95% trường hợp là ung thư vảy, 5-10% là ung thư biểu mô tuyến [18] Theophân loại mô học của Tổ chức y tế thế giới năm 2003[19], ung thư CTC đượcchia như sau:

90 Ung thư biểu mô vảy:

+ Ung thư biểu mô tế bào vảy không cần ghi chú thêm

+ Ung thư biểu mô tế bào vảy vi xâm nhập

- Ung thư biểu mô tuyến:

+ Ung thư biểu mô tuyến

+ Ung thư biểu mô tuyến vi xâm nhập

+ Ung thư biểu mô tuyến tại chỗ

-Các tổn thương tiền ung thư:

+ Ung thư biểu mô vảy tại chỗ

+ CIN III

Tỷ lệ mắc và tử vong do ung thư CTC có xu hướng giảm dần ở cácnước phát triển nhờ các thành tựu đạt được trong phòng bệnh, phát hiện bệnhsớm, cải thiện chất lượng chẩn đoán và điều trị, trong khi đó các tỷ lệ này lại

có xu hướng gia tăng ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam Dohầu hết phụ nữ ở các nước đang phát triển không được tiếp cận với cácchương trình y tế khám sàng lọc và điều trị Việt Nam với 30.77 triệu phụ nữtrên 15 tuổi trong độ tuổi nguy cơ mắc ung thư CTC, ước tính mỗi năm cókhoảng 5174 phụ nữ được chẩn đoán ung thư CTC và khoảng 2472 ngườichết vì ung thư CTC Ung thư CTC đứng thứ hai trong số các bệnh ung thư ởphụ nữ và đứng đầu trong số ung thư ở phụ nữ từ 15-40 tuổi

Tỷ lệ ung thư CTC ngày một gia tăng [20]

1.4 Các phương pháp phát hiện HPV

1.4.1 Phương pháp xét nghiệm tế bào âm đạo CTC (PAP).

Phát hiện HPV dựa trên xét nghiệm tế bào âm đạo, CTC (PAP) có thểđược coi là một phương pháp phát hiện HPV ra đời sớm nhất Nguyên lý củaphương pháp này là khi HPV xâm nhập vào các tế bào vảy của CTC sẽ làmbiến đổi chúng với một số hình ảnh đặc trưng: Tế bào bóng (tế bào rỗng,Koilocyte) và/hoặc tế bào loạn sừng và/hoặc đại bào Về nguyên tắc, nhữnghình ảnh biến đổi này của các tế bào bị nhiễm HPV sẽ dễ dàng được nhận thấydưới kính hiển vi quang học khi các phiến đồ tế bào CTC được nhuộm bằngcác phẩm nhuộm Papanicolaou (PAP), Giemsa hay Hematoxxylin- Eosin Đây

là phương phỏp phỏt hiện HPV rất rẻ tiền, dễ làm do kỹ thuật đơn giản, dễ lặplại song cú nhược điểm độ nhạy thấp, phụ thuộc vào khả năng, trỡnh độ ngườiđọc tiờu bản [21].

1.4.2 Phương phỏp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phản ứng khuếch đại chuỗi PCR l phản ứng dây chuyền nhờà phản ứng dây chuyền nhờ

polymerase do Kary Mullis phát minh năm 1983 Thực chất đây là một phơng

pháp nhân bản ADN in vitro, nghĩa là cũng nhằm mục đích thu nhận một lợnglớn bản sao của một trình tự xác định với độ chớnh xỏc cao

Cơ sở của phơng pháp PCR là dựa vào đặc tính hoạt động của các ADNpolymerase: chúng chỉ có khả năng tổng hợp một mạch mới từ một mồi (là 1trình tự ADN ngắn) đã bắt cặp sẵn với khuôn Trong thực nghiệm, mồi lànhững oligonuccleotide với chiều dài tối u là 15 – 25 base có khả năng bắtcặp bổ sung với một đầu của khuôn và enzyme chịu nhiệt ADN polymerase sẽnối dài mồi để hình thành mạch mới Các đoạn ADN mới lại đợc sử dụng làmkhuôn, sau một chu kỳ thì số lợng đoạn ADN đợc nhân lên theo cấp số nhân.Một gen trong một thời gian ngắn có thể đợc nhân lên hàng triệu lần

Các giai đoạn cơ bản trong một chu kỳ của phản ứng PCR gồm:

+ Biến tính ADN: là giai đoạn hình thành đoạn ADN sợi đơn đóng vaitrò làm khuôn, giai đoạn này cần nhiệt độ từ 94 0C đến 95 0C, thời gian kéodài từ 30 giây đến 1 phút

+ Bắt cặp: Là giai đoạn để mồi bắt cặp với khuôn, cần nhiệt độ từ 40 0C

- 700C, phụ thuộc vào độ dài và tỷ lệ G + C của mỗi mồi, thời gian kéo dài từ

30 giây đến vài phút

+ Tổng hợp: Là giai đoạn ADN polymerase (Taq polymerase) sẽ tổnghợp sợi ADN mới trên khuôn, thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút

 Phương phỏp PCR đặc hiệu theo nhúm (group-specific PCR)

Phương phỏp khỏc phỏt hiện ADN của HPV trong bệnh phẩm bằngphương phỏp PCR dựa trờn sự nhõn lờn của chuỗi ADN của HPV với mồi

nucleotide đặc hiệu để tạo ra số lượng lớn sản phẩm ADN virút Có nhiều mồiđặc hiệu khác nhau cho phản ứng khuếch đại ADN HPV bằng phương phápPCR Sau đó, các genotype HPV sẽ được phát hiện bằng phản ứng lai giữasản phẩm ADN đã được khuếch đại với mồi đặc hiệu cho từng genotype Sảnphẩm được tạo ra có thể phát hiện bằng phương pháp trên giếng, điện di trêngel hoặc bằng Southern-blot, dot-blot Do PCR là xét nghiệm có độ nhạy nêntrong quá trình thực hiện cần kiểm soát hiện tượng tạp nhiễm, độ tinh sạchcủa sản phẩm Về lý thuyết, PCR có thể phát hiện được 1 đoạn gen sao chép,nhưng trên thực tế có thể phát hiện 10 – 100 ng/µl của ADN, tương đương 10– 100 đoạn gen sao chép Kỹ thuật PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhưngphức tạp hơn và cần nhiều bước hơn phương pháp lai bắt giữ

Các mồi sử dụng trong phản ứng PCR thường để khuếch đại vùng genL1 HPV Cặp mồi được sử dụng nhiều nhất là GPMY09/GPMY11 khuếch đại

450 bp trên đoạn L1 ORF và cặp mồi GP5+/GP6+ khuếch đại 140 bp vùngL1 Đây là hai loại mồi có độ nhạy cao, có thể khuếch đại từ 10-200 bản copyADN Khi so sánh giữa 2 loại cặp mồi trên, GPMY09/GPMY11 có thể xácđịnh sai lệch 7% UTCTC do sự vắng mặt của HPV ADN trong tế bào ung thư

và sản phẩm PCR sản phẩm HPV ADN đã bị đứt gãy và làm mất vùng L1ORF trong tế bào ung thư Trong phản ứng PCR lồng (nested PCR), nghiêncứu có thể sử dụng cả hai loại mồi GPMY09/GPMY11 và GP5+/GP6+ sẽ chophản ứng có độ nhạy cao hơn

Hiện nay, phương pháp PCR còn sử dụng loại cặp mồi mới ký hiệu làSPF10 nhằm khuếch đại 65-bp trên vùng L1 ORF Loại mồi này có độ đặchiệu rất cao và thực hiện được hầu hết các loại bệnh phẩm, kể cả những bệnhphẩm đã có định bằng formalin Với các loại mồi khác, phản ứng PCR khóthành công với sản phẩm dài với ADN khuôn kém chất lượng, đặc biệt là

ADN tách từ mẫu cố định trong formalin Do đó, SPF10 có lợi thế hơn khisàng lọc HPV trên các loại bệnh phẩm khác nhau

 Phương pháp PCR đặc hiệu theo type (type-specific PCR)

Phương pháp PCR đặc hiệu theo type là phương pháp PCR phát hiệnriêng cho từng type HPV khác nhau Việc xác định các type riêng biệt củaHPV dựa vào sự khác nhau trên vùng gen E6 và E7 Hai oncogen này quyếtđịnh khả năng gây bệnh của HPV

Hiện nay, đã có khoảng 14 cặp mồi đặc hiệu cho 14 genotype HPVnhóm “nguy cơ cao” dựa trên khả năng khuếch đại 100 bp trên vùng gen E7HPV Các genotype HPV có cạp mồi đặc hiệu được phát hiện là HPV 16, 18,

Các phương pháp PCR thông thường chỉ đánh giá định tính mà khôngđánh giá định lượng vi rút Phương pháp real-time PCR thực hiện nhanh, phù

hợp, không đắt, và định lượng được sản phẩm ADN và ARN Real-time PCRhoặc PCR sao chép ngược (reverse transcriptase-PCR, RT-PCR) có thể pháthiện mức độ nhân lên của ADN dựa trên mức độ chất chỉ thị mầu được giảiphóng sau khi sản phẩm ADN được khuếch đại Phương pháp này có thể pháthiện được 10.000 chuỗi gen sao chép/phản ứng (khoảng 100 tế bào bị nhiễm).

Việc xác định số lượng vi rút cho phép xác định được mARN đánh giá

sự hoạt động của gen E6 và E7 Khi 2 vùng gen này hoạt động sẽ gây ranhững biến đổi cũng như cho các sản phẩm của các vùng gen này Đây làphương pháp có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 70%

1.5 Một số yếu tố nguy cơ nhiễm HPV và ung thư CTC.

- Tuổi: Ung thư CTC thường gặp ở lứa tuổi 35-55, tuổi càng tăng thì tỉ

lệ nhiễm HPV sinh dục càng giảm Nhiễm HPV cao nhất ở độ tuổi 15-25, sau

đó giảm dần khi tuổi tăng lên và ổn định sau 40 tuổi Tuy nhiên ở một số quầnthể nghiên cứu có nguy cơ ung thư CTC cao, có thêm một đỉnh gia tăng tỷ lệnhiễm HPV ở phụ nữ hậu mãn kinh [21]

- Nhóm HPV nguy cơ cao, đặc biệt là các typ HPV 16, HPV 18 là haityp có khả năng sinh ung thư cao nhất

- Hành vi quan hệ tình dục: nhiều bạn tình, bạn tình bị nhiễm HPV, cácbệnh lây truyền qua đường tình dục (HIV, Chlamydia, Neisseria,Trichomonas, Herpes simplex virus typ 2…) làm tăng nguy cơ nhiễm HPV vàung thư CTC [22], [23]

- Biện pháp tránh thai: theo nghiên cứu của Moreno năm 2002 cho thấynguy cơ ung thư CTC tại chỗ và xâm lấn tăng lên ở các phụ nữ nhiễm HPVuống thuốc tránh thai liên tục trên 4 năm [24] Kết quả nghiên cứu của TrầnThị Lợi cho thấy những cặp vợ chồng sử dụng bao cao su tránh thai thường

xuyên có khả năng bảo vệ khỏi nhiễm HPV khoảng 2 lần so với những ngườikhông sử dụng hoặc sử dụng không thường xuyên[3]

- Số lần sinh con: theo nghiên cứu của Munoz và cộng sự năm 2002 chothấy nguy cơ ung thư CTC tăng lên 3,8 lần ở những phụ nữ mang thai đủtháng từ 7 lần trở lên[9]

- Tình trạng miễn dịch: dễ bị nhiễm HPV đối với những người có HIV(+), có thai, tiểu đường, người được ghép mô, điều trị Corticoids [24]

- Phụ nữ hút thuốc lá hay cả hai vợ chồng cùng hút thì có nguy cơ nhiễmHPV cao gấp 3 lần những phụ nữ hoàn toàn không tiếp xúc với khói thuốc[3]

1.6 Một số nghiên cứu trong nước và trên thế giới

Theo thống kê của trung tâm kiểm soát và phòng chống bệnh tật (CDC)Hoa Kỳ, HPV là thủ phạm của hầu hết các trường hợp ung thư CTC (99%),40% ung thư âm hộ, 90% ung thư âm đạo [25]

Theo nghiên cứu của Wu Y và cộng sự, 92.8% trường hợp nhiễm HPVtrong 223 bệnh phẩm ung thư CTC tại Trung Quốc Trong đó HPV 16 chiếm70.4% [26]

Từ những năm 1995, kết quả nghiên cứu 1000 mẫu bệnh phẩm

UTCTC ở 32 bệnh viện của 22 quốc gia trên thế giới của F Xavier Bosch chothấy 93% mẫu bệnh phẩm có HPV dương tính, trong đó HPV 16 dương tính50%, HPV 18 dương tính 14%, HPV 45 dương tính 8% và HPV 31 dươngtính 5% [21]

Nghiên cứu trên 77 mẫu sinh thiết loạn sản cổ tử cung và ung thư tiếtniệu sinh dục của phụ nữ phía Tây Australia, HPV dương tính tại 43 trên 54 caung thư xâm lấn Trong đó, 24 trường hợp nhiễm HPV type 16, 5 trường hợpnhiễm HPV 11 và chỉ có 1 trường hợp nhiễm HPV 18; 6 trường hợp ung thư tế

bào vảy đồng nhiễm HPV 11 và 16, 2 trường hợp đồng nhiễm HPV 16 và 18.HPV 16 liên quan chặt chẽ với loạn sản nặng và ung thư cổ tử cung [23].

Theo nghiên cứu của Phạm Việt Thanh ở 488 trường hợp có kết quả tếbào âm đạo, CTC bất thường tại bệnh viện Từ Dũ cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV

là 62.1% Trong đó nhiễm HPV typ nguy cơ cao là 71.3% và nguy cơ thấp là14.2% Tỷ lệ nhiễm HPV tăng theo mức độ tổn thương CTC trên xét nghiệm

tế bào CTC [27]

Nghiên cứu của Lê Trung Thọ và cộng sự trên 1500 phụ nữ trong độtuổi 18-69 tại thành phố Hà Nội cho biết tỷ lệ nhiễm HPV trong cộng đồng là5.13% Trong đó nhóm nguy cơ cao chiếm 68.95% (hay gặp theo thứ tự là 18,

58, 16), nhóm nguy cơ thấp chiếm tỷ lệ 27.27% [28]

Năm 2005, nghiên cứu khảo sát tỷ lệ nhiễm HPV qua phiến đồ tế bàoCTC của 300 phụ nữ khám phụ khoa tại bệnh viện nhân dân Gia Định củaTrần Thị Lợi và Nguyễn Thị Mỹ Phượng cho thấy, tỷ lệ nhiễm HPV trong sốphụ nữ đến khám là 10.3% và trong nhóm có phiến đồ tế bào CTC bất thường

là 86.1%[29]

Trong nghiên cứu 106 trường hợp có tổn thương tế bào CTC từASCUS trở lên của Vũ Thị Nhung, tỷ lệ nhiễm HPV là 73.6% Bệnh nhânđồng nhiễm type nguy cơ cao và nguy cơ thấp là 10.4% Trong số các typenguy cơ thấp, type 11 chiếm tỷ lệ cao nhất, type 16 chiếm tỷ lệ cao nhất trongcác type nguy cơ cao[30]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

- Các bệnh nhân ung thư cổ tử cung đến khám và điều trị tại bệnh viện

K Trung ương từ 1/7/2013-1/3/2014

- Các thông tin được thu thập qua bộ câu hỏi phỏng vấn được thiết kế sẵn

2.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

- Các bệnh nhân khám sinh thiết CTC, xác định ung thư CTC bằng xétnghiệm giải phẫu bệnh

- Các bệnh nhân ung thư CTC được chỉ định điều trị phẫu thuật

- Loại trừ những bệnh nhân ung thư CTC giai đoạn muộn phải điều trị

xạ trị

Những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đồng ý làm xét nghiệm PCR xác địnhHPV-AND và tham gia nghiên cứu

2.3 Địa điểm nghiên cứu

- Bệnh viên K trung ương: Thu thập bệnh phẩm, thông tin phỏng vấnbệnh nhân, kết quả xét nghiệm mô bệnh học của khoa GPB bệnh viện KTrung ương

- Các xét nghiệm xác định HPV-ADN và các genotype HPV được thựchiện tại trường Đại học Kanazawa, Nhật Bản

2.4 Vật liệu nghiên cứu:

- Các dụng cụ pippet, typ eppendof, cryotype, đầu typ các loại

- PCR mix, primers GP5+/GP6 modified

- Kít giải trình tự gen: Big Dye terminator (Applied biosystems)

- Máy ly tâm thường, ly tâm lạnh, tủ cấy vô trùng Bioclass II, tủ lạnhbảo quản mẫu, cân điện tử, máy Vortex, máy Spidow, Block nhiệt

- Máy quang phổ kế, tủ ấm Hệ thống máy PCR

- Hệ thống máy điện di Gel-XL Ultra V2 và chụp ảnh gel UPV.

- Hệ thống máy giải trình tự gen ABI PRISM®3130 Genetic Analyzer

2.5 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang nhằm xác định tỷ lệ nhiễm một số HPVtrên các bệnh nhân ung thư cổ tử cung

Cách lấy mẫu: mẫu nghiên cứu được chọn trên cơ sở lấy mẫu có chủđích Các mẫu nghiên cứu được thu thập liên tục cho đến khi đáp ứng đủ cỡmẫu nghiên cứu Cỡ mẫu ước tính khoảng 200 mẫu

Qui trình chấp thuận tham gia nghiên cứu và thu thập mẫu

- Cung cấp thông tin về nghiên cứu cho đối tượng nghiên cứu (Giới thiệu

về đề tài nghiên cứu, mục đích của nghiên cứu, giới thiệu về người nghiêncứu, qui trình thực hiện nghiên cứu, những rủi ro có thể xảy ra, lợi ích củangười tham gia nghiên cứu, đảm bảo tính bí mật của người nghiên cứu, nghĩa

vụ của người tham gia nghiên cứu, sự tình nguyện tham gia hoặc rút ra khỏinghiên cứu)

- Lấy chấp thuận nghiên cứu

- Phỏng vấn toàn bộ đối tượng nghiên cứu theo mẫu câu hỏi soạn sẵn

TÓM TẮT QUI TRÌNH LẤY VÀ BẢO QUẢN BỆNH PHẨM

TẠI BV K TRUNG ƯƠNG

- Dùng ống ependof đã có 500µl dd

formaldehyd

- Ghi họ tên, ngày tháng năm sinh,

ngày lấy, loại mô

- Gửi lên khoa giải phẫu bệnh trong

2.5 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.5.1 Tách ADN của virus

Các mẫu mô bệnh học cổ tử cung sau sinh thiết được tiến hành tách chiếtADN tổng số bằng kit Smitest EX-R&D (Genome science laboratories,Fukushima, Japan)

Qui tr×nh nh sau:

Specimen Dilution (II) 380µl

2 Huyền dịch mô K của bÖnh nh©n 100µl

3 Protein Dissolvent (III) 250àl

7 Nhắc lại bớc 6 thêm một lần Để khô phần cặn ở đáy typ

8 Hoà tan phần cặn đã khô (ADN) với 30àl nớc cất siêu sạch

ADN này đợc làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR ADN khuôn đợc bảoquản trong tủ -800C cho đến thời điểm tiến hành phản ứng

2.5.2 Chạy PCR khuếch đại vựng gen L1: Dựng kỹ thuật Realtime-PCR để

khuyếch đại vựng gen L1 của HPV với cặp mồi GP5+/GP6+ modifile với chu

kỳ nhiệt đó được chuẩn húa

2.5.3 Kỹ thuật Dot-blot xỏc định nhiễm và tỡnh trạng đồng nhiễm nhiều genotype của HPV

Sản phẩm PCR sau khuếch đại được chuyển trực tiếp sang màng và laihúa trực tiếp với đầu dũ đặc hiệu Kỹ thuật này khụng phải qua giai đoạn điện

di trờn gel và khụng qua giai đoạn chuyển màng Phương phỏp này cho phộpxỏc định 105 – 106 bản ADN sao chộp của HPV Trong quỏ trỡnh lai ngược,ADN được đỏnh dấu và được sử dụng như mẫu dũ để lai trờn màng cú nhiệt

độ cao

2.5.4 Giải trình tự trực tiếp và sau clone với một số chủng khó xác định được genotype và đồng nhiễm bằng kỹ thuật Dot-blot: Bằng kit Big Dye

terminator (Applied biosystems) trên máy phân tích trình tự ABIPRISM®3130 Genetic Analyzer

+ Khuếch đại ADN bằng các dideoxynucleotid đã đánh dấu huỳnhquang Seq-mix: (12µl DW; 3,5µl 5X buffer; 1,0µl BigDye; 1,5µl PrimerF/R), sản phẩm PCR: 2,0µl Chu trình nhiệt: (96oC/10 giây; 50oC/5 giây;

60oC/4 phút) lặp 25 chu kỳ; 4oC/ dừng phản ứng

+ Tinh sạch sản phẩm

 Bổ xung 2 µl dung dịch 125mM EDTA pH 8; 0, 2 µl dung dịch NaOAc và

50 µl Ethanol 99% vào mỗi ống chứa 20 µl sản phẩm ở phản ứng trên

 Votex và để ở nhiệt độ phòng 15 phút

 Ly tâm 14.000 vòng trong 20 phút, hút bỏ dịch nổi

 Bổ xung 70 µl dung dịch Ethanol 70%, lắc đều

 Ly tâm 14.000 vòng trong 10 phút, hút bỏ dịch nổi

 Để khô AND ở nhiệt độ phòng trong buồng tối

 Cho 25 µl Hi-Di formanide, votex

 Biến tính trên máy ủ nhiệt 95 oC trong 2 phút rồi cắm nhanh trên đá 15 phút

 Đưa mẫu vào máy xác định trình tự tự động ABI 3100

TÓM TẮT QUI TRÌNH XẾT NGHIỆM XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM

VÀ ĐỒNG NHIỄM CÁC GENOTYPE CỦA HPV

2.6 Phân tích số liệu

- Sử dụng phương pháp thống kê y sinh học

- Phân tích các kết quả thu được theo chương trình SPSS 16.0

- Test χ2 và Fisher’s Exact Test được sử dụng để so sánh các kết quả

- Sử dụng thuật toán OR để đánh giá mối liên quan giữa các yếu tố nguy cơ

2.7 Đạo đức trong nghiên cứu

- Nghiên cứu được thực hiện với sự đồng ý của bệnh nhân

Bệnh phẩm

Tách ADN

Thực hiện phản ứng Realtime PCR

Giải phẫu bệnh

Dot-blot xác định nhiễm và tình trạng đồng nhiễm nhiều genotype của HPV

Giải trình tự trực tiếp và sau clone với một số chủng khó xác định được genotype

và đồng nhiễm bằng kỹ thuật Dot-blot