nghiên cứu hiệu quả điều trị vô sinh nam bằng phương pháp tiêm tinh trùng đông lạnh thu nhận từ phẫu thuật vào bào tương noãn tại bệnh viện phụ sản trung ương

Vô tinh azoospermia hay còn gọi là vô sinhkhông tinh trùng là trường hợp nam giới không có tinh trùng trong tinh dịch.Nguyên nhân có thể là sự tắc nghẽn trong con đường di chuyển của t

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sự ra đời của Louise Brown – em bé thụ tinh trong ống nghiệm đầu tiên trênthế giới tại Anh năm 1978 thực sự là một phép nhiệm màu kỳ diệu mang lại niềmhạnh phúc lớn lao được làm cha, làm mẹ cho các cặp vợ chồng vô sinh tưởng chừngnhư hoàn toàn vô vọng Năm 1992, phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tươngtrứng (ICSI – Intracytoplasmic sperm injection) được giới thiệu sau hàng loạttrường hợp thành công của Palermo (Bỉ) và cộng sự Kỹ thuật này đã mở ra mộtthời đại mới trong điều trị hiếm muộn do nam cho những trường hợp trước đâykhông thể điều trị được Tại Việt Nam, tỷ lệ vô sinh chung từ 5 – 13%, trong đó vôsinh nam chiếm khoảng 40% [1] Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam,trong đó nguyên nhân không có tinh trùng trong tinh dịch (Azoospermia) chiếmkhoảng 12% trong số những ca tinh dịch đồ bất thường, điều đó cho thấy số bệnhnhân cần được điều trị là không nhỏ Vô tinh (azoospermia) hay còn gọi là vô sinhkhông tinh trùng là trường hợp nam giới không có tinh trùng trong tinh dịch.Nguyên nhân có thể là sự tắc nghẽn trong con đường di chuyển của tinh trùng (vôtinh bế tắc – obstructive azoospermia) hoặc sự giảm sinh tinh (vô tinh không bế tắc– non obstructive azoospermia).Việc thụ tinh trong ống nghiệm sử dụng tinh trùng

từ phẫu thuật đã được biết đến trên thế giới từ năm 1985 khi Temple-Smith và cộng

sự báo cáo trường hợp IVF thành công đầu tiên với tinh trùng thu nhận từ mào tinh.Tuy nhiên, phương pháp điều trị này cho khả năng thành công thấp do chất lượngtinh trùng trích từ mào tinh và tinh hoàn kém nên thường xảy ra thất bại thụ tinh.Với sự ra đời của kỹ thuật ICSI, tỉ lệ thụ tinh và tỉ lệ thai lâm sàng khi sử dụng tinhtrùng từ mào tinh đã được cải thiện đáng kể Sự kết hợp giữa phương pháp MESA –ICSI đã được chứng minh là cho tỉ lệ thành công cao hơn so với phương phápMESA – IVF Trường hợp thành công với phương pháp ICSI với tinh trùng từ môtinh hoàn cũng được báo cáo bởi Schoysman và cộng sự (1993) [2] Mặc dù làphương pháp điều trị hiệu quả cho các bệnh nhân vô tinh, việc phẫu thuật thu nhậntinh trùng kết hợp với ICSI vẫn còn nhiều hạn chế Đối với các trường hợp thất bại

sau một chu kỳ, quá trình phẫu thuật sẽ được lặp lại Việc phẫu thuật nhiều lần sẽgây tổn thương không phục hồi lên tinh hoàn hoặc mào tinh, tăng chi phí điều trị và

áp lực tâm lí cho bệnh nhân Kỹ thuật trữ lạnh tinh trùng giúp giải quyết được vấn

đề này Tuy nhiên, số lượng tinh trùng thu nhận từ phẫu thuật thường rất ít, chấtlượng tinh trùng kém nên khả năng thu nhận được tinh trùng sau trữ lạnh – rã đôngrất thấp Do đó, nhiều e ngại được đưa ra xung quanh hiệu quả của việc áp dụng quytrình trữ lạnh cho các tinh trùng này Kể từ trường hợp em bé sinh ra đầu tiên bằng

kỹ thuật ICSI sử dụng tinh trùng từ mào tinh, tinh hoàn đông lạnh, nhiều nghiên cứu

đã được thực hiện nhằm so sánh việc sử dụng tinh trùng tươi với tinh trùng trữ Hầuhết các kết quả nghiên cứu đều cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kêgiữa việc sử dụng tinh trùng thu nhận từ phẫu thuật tươi và đông lạnh – rã đông.Hiện tại, quy trình trữ lạnh tinh trùng thu nhận từ phẫu thuật đã được áp dụng tạinhiều trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm trên thế giới

Tại Việt Nam, kỹ thuật thu nhận tinh trùng từ mào tinh sử dụng cho ICSI đãđược thực hiện thành công, với sự ra đời của em bé đầu tiên vào năm 2002 Kỹthuật ICSI với tinh trùng từ mô tinh hoàn cũng được áp dụng thành công sau đó.Hiện nay có rất nhiều trung tâm đã thực hiện kỹ thuật này nhằm mang lại hiệu quảđiều trị tối ưu cho bệnh nhân vô sinh nam, tuy nhiên đông lạnh tinh trùng thu được

từ phẫu thuật mới chỉ được thực hiện tại một số trung tâm lớn Để không ngừngnâng cao chất lượng phục vụ bệnh nhân, để tìm hiểu một số yếu tố ảnh hưởng lênkết quả của phương pháp TTTON với tinh trùng đông lạnh thu nhận từ phẫu thuật

và mở rộng kỹ thuật này cho các trung tâm khác ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề

tài “Nghiên cứu hiệu quả điều trị vô sinh nam bằng phương pháp tiêm tinh trùng đông lạnh thu nhận từ phẫu thuật vào bào tương noãn tại Bệnh viện phụ sản Trung Ương” với các mục tiêu sau:

1 Đánh giá hiệu quả của phương pháp tiêm tinh trùng đông lạnh thu nhận

từ phẫu thuật vào bào tương noãn tại bệnh viện phụ sản Trung Ương.

2 Phân tích một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của phương pháp tiêm tinh trùng đông lạnh thu nhận từ phẫu thuật vào bào tương noãn.

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) [3], [4]

TTTON có nghĩa là cho tinh trùng thụ tinh với noãn và nuôi cấy thànhphôi trong ống nghiệm Sau đó, một số phôi sẽ được chuyển trở lại vào buồng

tử cung Quá trình phát triển của phôi và thai sẽ diễn ra hoàn toàn bình thườngtrong tử cung người mẹ

Kỹ thuật này được thực hiện thành công trên thế giới lần đầu tiên năm 1978 vàthành công lần đầu tiên ở Việt nam năm 1998

Một chu kỳ TTTON bao gồm: kích thích nang noãn, chọc hút lấy noãn rangoài cho kết hợp với tinh trùng trong phòng thí nghiệm, nuôi cấy thành phôi đểchuyển trở lại vào buồng tử cung

Có 3 phác đồ KTBT thường được sử dụng: Phác đồ dài (thường dùng trong IVF cổ điển): GnRH đồng vận (GnRH a) được bắt đầu từ ngày thứ nhất của chu kỳ

kinh hoặc từ ngày thứ 21 của chu kỳ và liên tục trong 14 ngày FSH được sử dụng

tiếp theo phối hợp với GnRH cho đến khi tiêm hCG Phác đồ ngắn: GnRHa được

tiêm cùng với FSH từ đầu chu kỳ Phác đồ ngắn thường được chỉ định cho những

phụ nữ có dự trữ buồng trứng kém GnRH đối vận (GnRH-antagonis) có thể sử

dụng thêm vào giai đoạn cuối để đề phòng đỉnh LH nội sinh Từ ngày thứ 8-13 củaFSH, thông thường khi siêu âm có > 1 nang 18mm hoặc > 3 nang noãn kích thước

> 16 mm thì cho thuốc rụng noãn (thường là hCG)

Chọc hút noãn sau tiêm hCG 34-36 giờ Noãn thu được sẽ ủ ấm trong tủcấy CO2, 370C khoảng 3-6h trước khi được cấy với tinh trùng hoặc cho thụtinh bằng kỹ thuật ICSI

Đánh giá thụ tinh được tiến hành 18-20h sau cấy với tinh trùng trong kỹ thuậtIVF cổ điển, 14-16h sau tiêm tinh trùng vào bào tương noãn Đánh giá thụ tinh bìnhthường khi thấy hai tiền nhân

Hiện nay, các trung tâm HTSS trên thế giới đánh giá chất lượng phôi chủ yếudựa vào hình thái và tốc độ phân chia của phôi Hình thái của phôi được theo dõi vàđánh giá từ hình thái noãn, hợp tử rồi đến phôi phân chia Đánh giá hình thái phôigiai đoạn phân chia sớm (ngày 2, 3) dựa vào các chỉ tiêu chính là số lượng phôi bào,

độ đồng đều giữa các phôi bào, tỷ lệ các mảnh vỡ (fragment) Các chỉ tiêu phụ gồm

có sự phân chia phôi bào đồng thời (synchronise - phân chia 2-4-8), mật độ hạttrong bào tương, số lượng hạt nhân, không bào trong phôi bào Đánh giá hình tháiphôi nang dựa vào độ nở rộng của phôi, hình thái của khối tế bào nội phôi (innnercell mass- ICM) và lá nuôi (trophectoderm- TE)

Hình 1.1 Quy trình thụ tinh ống nghiệm

Các phôi tốt nhất sẽ được chọn để chuyển phôi Hiện nay đa số các trung tâmlớn ở Mỹ và Châu Âu thường chuyển 1-2 phôi ngày 5 (phôi nang)

Hai tuần sau khi chuyển phôi, người phụ nữ được lấy máu để thử thai Nếukết quả thử thai dương tính (hCG > 50 IU/l), 2-3 tuần sau, sản phụ sẽ được siêu âm

để xác định túi ối và tim thai trong buồng tử cung

Tỉ lệ thành công của mỗi chu kỳ điều trị TTTON trung bình trên thế giới hiệnnay khoảng 25%-70% Tỉ lệ này phụ thuộc vào tuổi bệnh nhân, chỉ định điều trị vàphác đồ điều trị của từng trung tâm

Chọc hút noãn qua âm đạo

Nuôi cấy phôi

Chuyển phôiKích thích nang noãn

1.2 Một số kỹ thuật hỗ trợ sinh sản thông dụng kèm theo TTON

1.2.1 Đông lạnh phôi

Đây là kỹ thuật phổ biến ở hầu hết các trung tâm làm thụ tinh trong ốngnghiệm Nguồn phôi đông lạnh chủ yếu từ các phôi thừa sau chu kỳ chuyển phôitươi, hoặc từ phôi của các bệnh nhân vì một số lý do không chuyển được phôi tươihay từ phôi của người hiến tặng Phôi có thể được đông lạnh ở các giai đoạn pháttriển khác nhau của phôi và bằng các phương pháp đông lạnh khác nhau như đônglạnh chậm, đông phôi thuỷ tinh hoá Trong đó, phương pháp đông phôi thủy tinhhóa là phổ biến nhất hiện nay

1.2.2 Đông tinh trùng

Kỹ thuật này được chỉ định cho các trường hợp chồng khó lấy tinh trùng hoặctrước khi đi xa hay điều trị tia xạ, hoá chất Tuy nhiên, cần phân tích chất lượng tinhtrùng trước đông để khi rã đông sẽ có những chỉ định thích hợp cho mẫu tinh trùng đó

1.2.3 Đông noãn

Đông noãn thường được chỉ định cho các trường hợp: Chồng không lấy đượctinh trùng trong ngày vợ chọc hút noãn mà không muốn xin tinh trùng của ngườikhác; Các trường hợp xin noãn mà chưa chuẩn bị niêm mạc tử cung phù hợp; trướckhi điều trị tia xạ, hoá chất; Bảo tồn khả năng sinh sản

Noãn sau khi rã đông muốn thụ tinh được phải làm ICSI để khắc phục khảnăng thụ tinh thấp do thay đổi cấu trúc màng trong suốt khi đông lạnh Tỷ lệ thailâm sàng từ các chu kỳ đông noãn còn thấp

1.2.4 Xin, cho phôi, noãn, tinh trùng

Có nhiều trường hợp không có tinh trùng hoặc không có noãn, do vậy cần phảidùng noãn hoặc tinh trùng của người cho Một số trường hợp không có phôi củachính mình mà muốn có con có thể xin phôi hiến

1.2.5 Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI)

ICSI (intra-cytoplasmic sperm injection) là kỹ thuật dùng hệ thống vi thao tác

xử lý tiêm tinh trùng vào bào tương noãn Kỹ thuật này giúp kiểm soát được tỷ lệthụ tinh, đảm bảo khả năng có phôi Do vậy, ICSI góp phần trong sự ổn định và giatăng hiệu quả của một chu kỳ HTSS

1.2.6 Kỹ thuật lấy tinh trùng từ tinh hoàn và mào tinh

Các kỹ thuật này thực hiện cho các bệnh nhân vô sinh nam xuất tinh không cótinh trùng (azoospermia) do tắc hoặc không tắc ống dẫn tinh Tinh trùng thu đượcchưa trưởng thành hoàn toàn, do vậy phải tiến hành ICSI để thụ tinh với noãn

1.2.7 Hỗ trợ phôi thoát màng (assisted hatching)

Kỹ thuật này giúp phôi dễ thoát màng nhằm tăng tỷ lệ có thai và ‘làm tổ’ củaphôi Đến nay, trên thế giới đã có 4 phương pháp được áp dụng để hỗ trợ phôi thoátmàng: Làm mỏng hoặc làm thủng màng trong suốt bằng cơ học, bằng men pronase,bằng acid Tyrode và bằng tia laser Có nhiều tranh cãi xung quanh chỉ định cho đốitượng TTTON nào thì hiệu quả

1.2.8 Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ (PGD)

Chẩn đoán di truyền trước làm tổ được tiến hành nhằm sàng lọc phôi không cóbất thường về di truyền trước khi chuyển phôi, đôi khi có thể thực hiện trên noãn trướckhi cho thụ tinh Kỹ thuật này cho phép các cặp vợ chồng có nguy cơ truyền bệnh ditruyền cho con có cơ hội sinh con không mắc bệnh, không phải bỏ thai khi thai đã lớn,tránh được những hậu quả xấu ảnh hưởng lên tâm lý của người mẹ và gia đình

1.2.9 Nuôi cấy noãn non (IVM)

Trưởng thành trứng non (In vitro maturation- IVM) là kỹ thuật nuôi trứng nonđến giai đoạn trưởng thành ở môi trường nuôi cấy chuyên biệt ngoài cơ thể Trứngsau khi đã trưởng thành sẽ được thụ tinh bằng phương pháp IVF/ICSI và nuôi cấytiếp như các trường hợp TTTON thông thường

1.3 Quá trình sinh tinh trùng [5].

Sinh tinh trùng ở người là một chuỗi các quá trình phức tạp với mục đích tạo

ra những tinh trùng trưởng thành có khả năng thụ tinh với noãn Tinh trùngđược xem là một tế bào có kích thước nhỏ nhất trong cơ thể Đây là loại tế bào

có tính biệt hóa cao độ để chứa thông tin di truyền từ người cha, có khả năng dichuyển trong đường sinh dục nữ, nhận biết và thụ tinh với noãn

Quá trình sinh tinh được diễn ra ở trong lòng ống sinh tinh của tinh hoànthông quá quá trình nguyên phân để gia tăng số lượng và giảm phân để tạo bộ

nhiễm sắc thể đơn bội Sau khi được tạo thành, tinh trùng di chuyển vào màotinh và trưởng thành ở đây trước khi được xuất tinh ra ngoài.

Tinh hoàn mỗi ngày sản xuất ra trên 100 triệu tinh trùng Hiểu rõ quá trìnhsinh tinh có thể giúp cải thiện chức năng sinh sản cũng như phòng chống cácảnh hưởng bất lợi lên quá trình này

 Các vị trí có thể thu nhận được tinh trùng từ cơ quan sinh dục

Cơ quan sinh dục nam bao gồm tinh hoàn, mào tinh, ống dẫn tinh, túi tinh,dương vật với hành niệu đạo, các tuyến phụ của hệ sinh dục như tuyến tiền liệt,tuyến tinh, tuyến hành niệu đạo Nắm vững giải phẫu học và sinh lý sinh tinhtrùng, sự di chuyển từ nơi tạo thành đến khi được xuất ra ngoài qua quá trìnhxuất tinh giúp ta có thể xác định được các vị trí có thể thu nhận được tinh trùng

từ cơ quan sinh dục

Hình 1.2 Cơ quan sinh dục nam

Tinh trùng (giao tử đực) được tạo ra từ bên trong các ống sinh tinh Các ốngsinh tinh này nằm xen lẫn giữa các tế bào kẽ (hay còn gọi là tế bào Leydig), vốn cóchức năng sản xuất hormone sinh dục Ngay từ giai đoạn phôi thai, các tế bào mầmsinh dục đã được tìm thấy trong các ống sinh tinh ở tinh hoàn Các tế bào này sau

đó sẽ nguyên phân tạo ra các tinh nguyên bào.Tinh nguyên bào nằm ở thành ốngsinh tinh, xen lẫn với các tế bào Sertoli, tạo thành hàng rào máu miễn dịch.Các tinhnguyên bào ở trạng thái bất hoạt cho đến tuổi dậy thì Đến giai đoạn này, tinhnguyên bào sẽ phân chia liên tục nhờ quá trình nguyên phân, đảm bảo duy trì nguồn

tế bào mới liên tục

Một số tinh nguyên bào ngừng nguyên phân và bước vào giai đoạn biệt hóathành tinh trùng sơ cấp Mỗi tinh trùng sơ cấp trải qua lần giảm phân thứ nhất tạothành 2 tinh trùng thứ cấp Sau khi lần giảm phân thứ hai kết thúc, bốn tinh tử đơnbội được tạo thành Quá trình này vẫn diễn ra ở thành ống sinh tinh

Hình 1.3 Quá trình sinh tinh trùng ở thành ống sinh tinh

Để trở thành tinh trùng, tinh tử phải trải qua quá trình biệt hóa về cấu trúc.Tinh

tử dài ra, hình thành đuôi Trong lúc quá trình này diễn ra, tinh tử vẫn liên kết chặtchẽ với lớp tế bào Sertoli thông qua lớp cầu nối tế bào chất Chỉ đến khi tinh tửhoàn thành quá trình biệt hóa thành tinh trùng, chúng mới được giải phóng vào lòngống sinh tinh Từ ống sinh tinh, tinh trùng đi vào mào tinh, tiếp tục hoàn thiện quátrình trưởng thành Tại đây, tinh trùng trải qua những biến đổi về hình thái, sinh lý,sinh hóa và chuyển hóa Mào tinh là một ống xoắn với tổng chiều dài lên đến 5 –7m, gồm 3 phần: phần đầu, phần thân và phần đuôi [6] Trong đó, phần đuôi được

xem là nơi dự trữ và phân hủy tinh trùng nếu không có hiện tượng xuất tinh xảy ra.Người ta ghi nhận khả năng di động và thụ tinh tăng dần khi tinh trùng di chuyển từđầu đến cuối ống mào tinh.

Theo lý thuyết, ta có thể thu nhận được tinh trùng bằng cách thực hiện phẫuthuật ở bất kỳ vị trí nào trong cơ quan sinh dục có sự hiện diện của tinh trùng Tuynhiên, trên thực tế, người ta chỉ lấy tinh trùng từ mào tinh và tinh hoàn vì hai bộphận này có kích thước tương đối lớn và nằm bên ngoài cơ thể (ở bìu)

1.4 Vô tinh: phân loại và điều trị [7].

Vô tinh là tình trạng không có tinh trùng trong tinh dịch khi xuất tinh Đâyđược xem là dạng bất thường nặng nhất trong các bất thường của nam giới

1.4.1 Phân loại và nguyên nhân.

 Theo cấu trúc giải phẫu: vô tinh do các tổn thương xảy ra:

- Trước tinh hoàn: các trường hợp suy tinh hoàn do suy trung tâm(hypogonadotropi hypogonadism), bẩm sinh (hội chứng Kallmann), mắc phải( chấn thương, khối u) hoặc vô căn

- Tại tinh hoàn: Do tổn thương cấu trúc các ống sinh tinh: nguyên nhân bẩmsinh (hội chứng Klinefelter, mất đoạn NST Y), hay mắc phải sau xạ trị, hóa trị, xoắntinh hoàn, quai bị có biến chứng viêm tinh hoàn

- Sau tinh hoàn: tắc ống dẫn tinh/ phóng tinh, rối loạn quá trình xuất tinh (xuấttinh ngược dòng) Tắc nghẽn có thể do bẩm sinh (bất sản ống dẫn tinh), hoặc mắcphải sau phẫu thuật vùng bẹn bìu, triệt sản hoặc nhiễm các bệnh lây truyền quađường tình dục

 Theo mô bệnh học của tinh hoàn: chia làm 2 loại:

- Vô tinh do tắc nghẽn (Obstructive azoospermia - OA): thắt ống dẫn tinh, bấtsản ống sinh tinh, viêm mào tinh hoàn, hay một số nguyên nhân hiếm gặp khác nhưhội chứng Young, tổn thương tinh hoàn

- Vô tinh không do tắc: (non obstructive azoospermia - NOA) 60% là do tinhhoàn, có thể do suy tuyến sinh dục từ trung tâm, một số bệnh lý di truyền như hộichứng Klinefelter, đứt nhánh dài NST Y

1.4.2 Các biện pháp điều trị cho bệnh nhân vô tinh

Với tiến bộ của kỹ thuật hỗ trợ sinh sản, đặc biệt là kỹ thuật tiêm tinh trùngvào bào tương noãn (ICSI), cơ hội có con của những trường hợp vô tinh với chínhtinh trùng của mình ngày càng được cải thiện, bên cạnh việc phải xin tinh trùng.Đặc biệt với sự tiến bộ vượt bậc của kỹ thuật đông lạnh tinh trùng và mô tinhhoàn, bệnh nhân vô tinh không phải chịu đau đớn, tốn kém và các biến chứng khiphải chọc hút nhiều lần

 Những bệnh nhân vô tinh do tắc: Vì hoạt động sinh tinh trong tinh hoàn

vẫn bình thường nên việc thu nhận tinh trùng có thể dựa trên phẫu thuật nối ống dẫntinh, mào tinh hay phẫu thuật thu nhận tinh trùng từ mào tinh hay tinh hoàn

- Phẫu thuật được thực hiện theo kiểu nối ống tận tận và có thể là một biệnpháp điều trị có hiệu quả về mặt kinh tế trong một số trường hợp Tuy nhiên vi phẫukhông thể áp dụng cho những trường hợp vô tinh do bất sản ống dẫn tinh hai bên(CBAVD), thời gian theo dõi kéo dài cũng là vấn đề bất lợi Bên cạnh đó, kết quảcũng phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm và tay nghề của kỹ thuật viên

- Phẫu thuật lấy tinh trùng kết hợp với ICSI Đây là lựa chọn hàng đầu cho cáctrường hợp CBADV, người vợ lớn tuổi, có tổn thương vòi trứng, giảm dự trữ buồngtrứng hay nhu cầu có con sớm Trong những trường hợp này tinh trùng có thể đượcthu nhận từ mào tinh hay tinh hoàn Hiện nay, hai phương pháp lấy tinh trùng từphẫu thuật thường được sử dụng nhất là PESA và TESE

 Vô tinh không do bế tắc: thường phức tạp hơn Bên cạnh việc xin tinh

trùng, một số trường hợp vẫn có thể có con với chính tinh trùng của mình

- Những trường hợp vô tinh do suy tinh hoàn từ trung tâm (hypogonadotropichypogonadism), FSH/LH hoặc GnRH analogue theo xung để kích thích quá trìnhsinh tinh có thể được sử dụng

- Có khoảng 50% trường hợp vô tinh không do bế tắc có giãn tĩnh mạch thừngtinh, hiệu quả của việc phẫu thuật trong điều trị bệnh nhân vô tinh do NOA vẫn cònchưa được thống nhất

- Phẫu thuật lấy tinh trùng từ tinh hoàn cho những bệnh nhân NOA cũng cóthể là biện pháp được lựa chọn Kỹ thuật TESE vi phẫu có thể tăng khả năng tìmthấy tinh trùng và biến chứng ít hơn kỹ thuật TESE thông thường.

1.5 Các kỹ thuật thu nhận tinh trùng trong các trường hợp vô tinh

1.5.1 Lấy tinh trùng từ mào tinh bằng vi phẫu thuật (Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration-MESA)

MESA là phương pháp thu tinh trùng bằng phẫu thuật ở mào tinh, đầu tiênđược áp dụng thành công ở những người không tinh trùng do bất sản hai ống dẫntinh bẩm sinh (Silber et al, 1988) Trong kỹ thuật này, tinh hoàn sẽ được bộc lộ

và qua đó, tinh trùng từ các ống tuyến trong mào tinh sẽ được thu thập Theothống kê vào năm 1994, khi kết hợp với IVF, MESA cho tỷ lệ có thai vàokhoảng 10-14% Tuy nhiên với ICSI, tỷ lệ này tăng lên khoảng 34-35%(Devroye và cs, 1994; Tournaye và cs, 1994)[8] Người ta thấy rằng tỷ lệ thànhcông trong việc thu được tinh trùng bằng MESA thường từ 90% trở lên (Holden

1.5.2 Lấy tinh trùng từ mào tinh bằng xuyên kim qua da (Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration-PESA)

So với MESA, PESA là một phương pháp ít xâm lấn được Craft và Shrivastav

đề nghị năm 1994 (PESA), có thể được thực hiện với gây tê tại chỗ, với tỷ lệ thànhcông khoảng 65% Lợi điểm của PESA là ít xâm lấn, có thể thực hiện được nhiềulần, đơn giản hơn và mẫu tinh trùng thu được thường ít lẫn máu và xác tế bào Hơnnữa, PESA không cần đòi hỏi kỹ thuật cao, tỷ lệ thành công cũng tương đương vớiMESA (Meniru et al, 1997) Nhiều nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt về tỷ

lệ thụ tinh cũng tỷ lệ thai lâm sàng giữa kỹ thuật MESA và PESA

Hình 1.4 Lấy tinh trùng từ mào tinh bằng chọc kim qua qua (PESA)

1.5.3 Lấy tinh trùng từ tinh hoàn bằng chọc hút (Testicular Sperm Aspiration-TESA)

Có nhiều phương pháp để thu được tinh trùng từ tinh hoàn hoặc để chẩn đoán

tế bào học Khi một kim số 21 G hay nhỏ hơn nữa được sử dụng, kỹ thuật này cótên là Fine Needle Aspration-FNA) Đây là những kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện

và có thể không cần gây mê toàn thân

Ở những người sinh tinh bình thường, tỷ lệ thu được tinh trùng là 96% khi sửdụng kỹ thuật FNA (Tournaye và cs, 1998) [8] Trong một nghiên cứu so sánh hiệuquả giữa TESE và FNA, người ta thấy không có sự khác biệt giữa tỷ lệ thụ tinh,phân chia phôi hay tỷ lệ có thai với kỹ thuật ICSI

1.5.4 Lấy tinh trùng từ tinh hoàn bằng phẫu thuật xẻ tinh hoàn (Testicular Sperm Extraction-TESE)

Kỹ thuật này tương tự sinh thiết tinh hoàn trong chẩn đoán Để có thể thu đượctinh trùng trong kỹ thuật này, các mẫu lấy được sẽ được tách nhỏ hoặc được sửdụng một số loại men để tăng khả năng thu được tinh trùng từ các ống sinh tinh nhưHyaluronidase, DNAase Ở những bệnh nhân có rối loạn quá trình sinh tinh, tỷ lệthu được tinh trùng vào khoảng 50% (Turek và cs, 1999) Một số nghiên cứu chothấy ở những người có hội chứng Klinfelter (47, XXY), tinh trùng có thể thu được

từ khoảng 50% bệnh nhân (Tournaye và cs, 1996)[8] và ghi nhận đứa bé đầu tiên đã

ra đời từ cặp vợ chồng có hội chứng này vào năm 1997

Ở những đối tượng này, các tác giả khuyến cáo nên sử dụng kỹ thuật TESEhơn là TESA (Ezeh và cs, 1998) Quá trình sinh tinh diễn ra bất thường và thường

xuất hiện rải rác, thành lập từng khu vực có sinh tinh xen lẫn với không sinh tinh(foci) Mặc dù để chẩn đoán, sinh thiết với nhiều mẫu kim đâm có thể cho kết quảtương đối tin cậy (Turek và cs, 1997), kỹ thuật này có thể cho tỷ lệ thu được tinhtrùng thấp hơn TESE Hơn nữa, một trong những lợi điểm của TESE là có thể trữlạnh mẫu mô tinh hoàn để sử dụng sau này

Hình 1.5 Lấy tinh trùng từ tinh hoàn bằng phẫu thuật xẻ tinh hoàn (TESE)

Hình 1.6 Tinh trùng trong dịch mô tinh hoàn 1.6 Kỹ thuật trữ lạnh trong hỗ trợ sinh sản [9]

1.6.1.Định nghĩa

Trữ lạnh là kỹ thuật được thực hiện nhằm lưu trữ giao tử, phôi ở nhiệt

độ Nitơ lỏng (- 196oC) trong một thời gian cho đến khi được sử dụng lại

1.6.2 Lich sử về kỹ thuật trữ lạnh

Năm 1776, Spallazani lần đầu tiên báo cáo về khả năng sống sót của tinh trùngsau khi được lưu trữ trong tuyết Năm 1866 Mategazza đã đưa ra những gợi ý về 1ngân hàng lưu trữ tinh trùng Nhưng phải đến năm 1949, khi Pole và đồng sự đãkhám phá ra khả năng bảo vệ tế bào ở nhiệt độ thấp của glycerol, thì trữ lạnh tinhtrùng mới thực sự trở thành 1 trong những kỹ thuật quan trọng và được phát triển

Năm 1953 Sherman và Bunge đã đông lạnh tinh trùng trong glycerol 10% trênbăng khô, với tỉ lệ sống là 67% Cũng ngay sau đó, Sherman và Bunge đã báo cáo 3

ca có thai nhờ phương pháp thụ tinh nhân tạo sử dụng tinh trùng trữ Từ đó,Sherman tiếp tục nghiên cứu phát triển các kỹ thuật bảo quản và trữ lạnh tinh trùngtrong đó có kỹ thuật đông lạnh khô (Sherman, 1954, 1963) Một trong những khámphá quan trọng nhất của Sherman đó là sử dụng Nitơ lỏng để lưu trữ tinh trùng.Nhiệt độ của nitơ lỏng ở -196oC có tỏ ra ưu việt hơn nhiệt độ trữ lạnh -75oC củabăng khô Hơn nữa, khi lưu trữ tinh trùng ở Nitơ lỏng trong 1 năm, độ di động củatinh trùng không giảm, trong khi giảm đáng kể khi lưu trữ ở nhiệt độ -75oC(Sherman, 1963)

Trước năm 1964, mọi ca thai lâm sàng của tinh trùng trữ lạnh đều chỉ sử dụngtinh trùng được trữ trong thời gian rất ngắn Từ năm 1964, Perloff và đồng sự báocáo các ca thai lâm sàng sử dụng tinh trùng trữ trong thời gian từ 1 đến 5,5 tháng

Từ những năm 70 của thế kỷ trước các ngân hàng tinh trùng đã được thành lập

ở nhiều quốc gia Châu Âu, nhằm đem lại cơ hội sinh sản sau này cho các trườnghợp phải phẫu thuật thắt ống dẫn tinh

Tại Việt Nam, trữ lạnh tinh trùng được thực hiện ở bệnh viện Từ Dũ lần đầutiên năm 1995

Phôi động vật đầu tiên được trữ thành công là phôi chuột vào năm 1972 Tiếpsau đó, kỹ thụật trữ phôi được phát triển và áp dụng cho trữ phôi gia súc Mãi đếnnăm 1983 phôi người đầu tiên mới được trữ thành công Trong một thời gian ngắn

kỹ thuật trữ phôi được nghiên cứu phát triển, các quy trình trữ được đơn giản và tối

ưu hóa Kể từ đó, kỹ thuật trữ phôi trở thành một bộ phận không thể thiếu của kỹthuật điều trị vô sinh bằng thụ tinh trong ống nghiệm

Xét về tính chất, so với trữ phôi thì trữ trứng giúp hạn chế được những rắc rốipháp lý về quyền sở hữu phôi cũng như giúp cho việc cho trứng đơn giản và an toànhơn Tuy nhiên xét về kỹ thuật, mặc dù trữ trứng động vật cũng như trứng người đãđược thực hiện thành công, hiệu quả của kỹ thuật này vẫn còn rất thấp Vào thời điểmhiện nay chỉ có kỹ thuật trữ phôi, và trữ tinh trùng là khả thi để áp dụng trên lâm sàng

1.6.3 Tác động của nhiệt độ thấp lên hệ sinh vật

Ở nhiệt độ thấp, mọi hoạt động sinh học đều ngừng lại

Từ những năm cuối thế kỷ 18, các nhà khoa học đã tiến hành các thử nghiệm

về tác động của nhiệt độ thấp lên hệ sinh học, làm nền tảng cho các học thuyết vềtrữ lạnh Cho tới khi Pole và đồng sự ngẫu nhiên tìm ra các chất bảo quản đônglạnh, đặc biệt là glycerol đã giúp cho các nhà khoa học thấu hiểu về những biến đổivật lý, hóa học trong quá trình đông của tế bào, sự hình thành tinh thể đá nội ngoạibào, cũng như ảnh hưởng của tốc độ làm lạnh, rã đông và nhiệt độ bảo quản…

1.6.3.1.Cơ chế vật lý của sự đông lạnh tế bào:

Nước chiếm 90% thể tích của tế bào, có vai trò quan trọng trong duy trì sựsống của tế bào Chính vì thế mà cơ chế quan trọng nhất của quá trình đông lạnh tếbào đó là số phận của nước trong suốt quá trình đông lạnh Để hiểu rõ cơ chế nàyphải biết về hiện tượng chậm đông của chất lỏng

* Chậm đông (supercooling) là thuật ngữ mô tả hiện tượng nước và chất lỏngđược làm lạnh dưới điểm đông mà chưa thay đổi trạng thái (chưa chuyển từ dạng lỏngsang dạng rắn) Trong tình trạng này nếu nước hoặc chất lỏng được chạm vào bởi 1 vậtkim loại thì sự kết tinh sẽ xảy ra và nhiệt độ ngay lập tức tăng trở lại điểm đông Kỹthuật này gọi là “seeding” và được ứng dụng để kiểm soát sự đông Tinh thể được tạothành do các thành phần của môi trường, sự rung của máy, hoặc do bề mặt ráp

* Tăng nhiệt độ tiềm ẩn (latent heat plateau): Sau khi mầm đá được hình thành

và trước khi hình thành tinh thể đá, nhiệt độ tăng trở lại tới điểm tan và còn duy trì ởmức đó trong suốt quá trình hình thành đá, sau đó giảm nhanh xuống theo nhiệt độcủa môi trường (tăng nhiệt độ tiềm ẩn)

Xu hướng chậm đông của hệ thống phụ thuộc vào các yếu tố: nhiệt độ, tốc độ làmlạnh, các thành phần của môi trường Tránh tổn thương tế bào bởi hiện tượng chậm đông

và hình thành tinh thể đá nội bào là nguyên tắc chính trong kỹ thuật trữ lạnh

Kỹ thuật seeding nhằm kiểm soát sự hình thành tinh thể đá là chìa khóa cho sựsống còn của tế bào khi trữ lạnh và rã đông Nhiệt độ của straw được hạ xuống -7oC,người ta sẽ chạm vào straw vùng ngoài vùng chứa tế bào bằng 1 forcept đã được làm

lạnh, nhiệt độ của vùng này sẽ tăng trở lại điểm tan của môi trường và hình thành đá,sau đó giảm nhanh xuống – 7oC với tốc độ 2.5oC/ phút Vùng ngoại bào hình thành đálàm tăng nồng độ các chất ngoại bào, tăng áp suất thẩm thấu ngoại bào kéo nước từ tếbào ra Đây chính là cơ chế của kỹ thuật đông chậm (slow freezing).

Việc kiểm soát sự hình thành tinh thể đá trong quá trình làm lạnh là chìa khóađảm bảo sự sống của tế bào trong suốt quá trình làm lạnh và rã đông

Dưới -5oC, tế bào và môi trường xung quanh vẫn chưa bị đông do hiện tượngchậm đông và do giảm nhiệt độ của điểm đông do các chất bảo quản đông lạnh tantrong môi trường Từ -5oC tới – 15oC bắt đầu hình thành đá ở môi trường ngoại bào(do tự nhiên, hoặc do kết quả của “seeding”), nước nội bào chưa đông do cơ chếbảo vệ của màng tế bào, do đó nồng độ các chất tan ngoại bào tăng lên, làm tăng áplực thẩm thấu ngoại bào, nước từ trong tế bào sẽ đi ra

Nếu tốc độ làm lạnh chậm, tế bào duy trì được mức cân bằng thẩm thấu vớimôi trường xung quanh và nước ra hết, không hình thành tinh thể đá nội bào Nếutốc độ làm lạnh quá nhanh, tế bào không kịp khử nước và hình thành tinh thể đá nộibào gây chết tế bào Trong phương pháp thủy tinh hóa, tốc độ làm lạnh cực nhanh,tinh thể đá chưa kịp hình thành, mọi vật chất đều ở dạng thủy tinh

Hình 1.7 Hiện tượng vật lý xảy ra trong quá trình đông lạnh.

Vì vậy điều quan trọng nhất trong quá trình đông lạnh là phải tính toán tốc độ làmlạnh tối ưu nhất để tránh sự hình thành tinh thể đá Tốc độ làm lạnh phụ thuộc vào:

- Tỷ lệ thể tích tế bào/ diện tích bề mặt

- Tính thấm nước của màng tế bào.

- Năng lượng hoạt hóa tính thấm

- Loại chất bảo quản và nồng độ sử dụng

Đối với phôi và trứng, có tỷ lệ diện tích/ thể tích thấp, tính thấm nước củamàng tế bào thấp, nên để tránh hình thành tinh thể đá nội bào cần làm lạnh với tốc

độ chậm Đối với tinh trùng có tỉ lệ diện tích/ thể tích cao, tính thấm nước của màng

tế bào cao, nên tốc độ làm lạnh nhanh hơn

1.6.3.2 Các tổn thương của tế bào trong quá trình đông lạnh:

Các tổn thương có thể gây chết cho tế bào xảy ra ở khoảng nhiệt độ từ - 15octới -60oC mà tế bào phải trải qua 2 lần: một lần trong quá trình đông lạnh, và mộtlần khi rã đông Ở nhiệt độ - 196oC, không một phản ứng nào có thể xảy gây chết tếbào Ở nhiệt độ này, chỉ có tia bức xạ ion hóa có thể gây tổn thương DNA của tếbào, và không có enzyme nào hoạt động ở nhiệt độ này nên các tổn thương DNAkhông được sửa chữa, khi tế bào được rã đông trở về nhiệt độ sinh lý, tổn thươngnày sẽ gây chết tế bào

- Từ nhiệt độ 15 xuống – 5oC, yếu tố gây tổn thương chính cho tế bào chủ yếu

là tổn thương các giọt lipid của tế bào chất và tổn thương các siêu ống bao gồm cảdây thoi vô sắc Trong khi các tổn thương sau này đều có thể phòng tránh được, thìtổn thương ở khoảng nhiệt này không có biện pháp khắc phục, và gây chết cho tếbào trữ lạnh, đặc biệt các tế bào giàu lipid như trứng hoặc phôi của 1 số loài

- Từ nhiệt độ -5o xuống – 60oC sự hình thành tinh thể đá nội bào và ngoại bào

là nguyên nhân chủ yếu gây tổn thương tế bào Như đã trình bày ở trên tinh thể đángoại bào hình thành trước, có thể gây chèn ép tế bào, tăng nồng độ các chất tanngoại bào, nếu nước kéo ta quá nhanh có thẻ gây vỡ màng tế bào Tinh thẻ đá nộibào hình thành gây chiếm thể tích trong tế bào gây vỡ tế bào, đồng thời cũng làmtăng nồng độ chất tan trong tế bào gây độc cho tế bào

- Nhiệt độ từ - 60oC xuống – 150oC có thể tổn thương vỡ màng zona của trứnghoặc màng bào tương, tuy nhiên cơ chế chưa được biết đến rõ ràng

- Dưới -150oC thì hầu như không còn nguy hiểm

Ngoài ra còn hình thành bọt khí là hệ quả của hình thành tinh thể đá: Tinh thể

đá hình thành làm giảm độ hòa tan của các khí trong môi trường Bên cạnh các khíhòa tan theo nồng độ, môi trường nuôi cấy tế bào thường dùng CO2 làm hệ đệm đểcân bằng pH trong môi trường Khi làm lạnh, các khí này không còn ở dạng hòa tannữa mà tách ra thành bọt khí Trong quá trình tan ra, trong vài phút, bọt khí pháttriển thành không bào rất to trong nội bào, làm tế bào phồng to lên và phá hủy vùngtrong suốt, gây vỡ màng tế bào

Để tránh các tổn thương trên trong kỹ thuật trữ lạnh cần lưu ý các điểm sau:

- Kiểm soát tốc độ làm lạnh

- Sử dụng chất bảo quản đông lạnh để loại nước

- Kỹ thuật seeding

- Kiểm soát tốc độ rã đông

- Quá trình loại chất bảo quản đông lạnh khỏi tế bào khi rã đông

1.6.4 Chỉ số đánh giá hiệu quả của trữ đông tinh trùng.

Các nguyên nhân gây tổn thương tinh trùng trong kỹ thuật trữ đông tinh trùng

đã được biết đến như: sốc nhiệt, sự hình thành tinh thể đá nội bào và ngoại bào, mấtnước trong tế bào, biến đổi áp suất thẩm thấu(Stanic, 2000) hay do sự tái kết tinhcủa tinh thể đá (Said và cs, 2010) Kết quả của quá trình này là tinh trùng giảm hàngloạt các chỉ số như: sức sống(Said, 2010);hình dạng (Eilish và cs, 2001), khả năng

di động (Critser 1998; Endlert, 1989), khả năng thụ tinh, toàn vẹn DNA(Mahadevan và Trounson, 1984; Cross NL và cs, 1991; Royere D và cs, 1991;Guruprasad Kalthur) và giảm thiểu được tất cả những ảnh hưởng này

1.6.5.Các quy trình đông lạnh tinh trùng thu nhận từ phẫu thuật[10]

1.6.5.1 Giới thiệu

Năm 1985, Temple-Smith và cộng sự báo cáo trường hợp thụ tinh trong ốngnghiệm (phương pháp IVF cổ điển) thành công đầu tiên với tinh trùng thu nhận từmào tinh Sự kiện này đã mở ra một cơ hội mới cho các bệnh nhân vô tinh Sau đó,khi kĩ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI) ra đời vào năm 1992, kĩthuật ICSI với tinh trùng từ mào tinh nhanh chóng được áp dụng trên các bệnh nhân

vô tinh Năm 1993, tinh trùng thu nhận từ mô tinh hoàn đã được sử dụng thành côngcho ICSI bởi Schoysman và cộng sự [2]

Mặc dù mang đến cơ hội được làm cha ở các bệnh nhân vô tinh, quy trình thunhận tinh trùng từ phẫu thuật nếu lặp lại nhiều lần sẽ gây những bất lợi sau:

của tinh hoàn, làm teo tinh hoàn không phục hồi, gây tổn thương lên quá trình sinhtinh và đặc biệt có thể làm mất chức năng nội tiết của tinh hoàn [11], [12]

Đặc biệt, đối với bệnh nhân vô tinh không bế tắc (non-obstructive), một sốtrường hợp vẫn không tìm thấy tinh trùng khi thực hiện TESE vào ngày chọc húttrứng mặc dù kết quả giải phẫu bệnh là có tinh trùng Trong khi đó, quy trình kíchthích buồng trứng đã được tiến hành.Trữ lạnh tinh trùng sẽ giúp đảm bảo có tinhtrùng cho ICSI vào ngày chọc hút trứng Do đó, nhiều nghiên cứu trữ lạnh tinhtrùng thu nhận từ phẫu thuật (bao gồm tinh trùng từ mào tinh và từ mô tinh hoàn) đãđược tiến hành ngay sau đó [13], [14] Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới, không

có sự khác biệt về kết quả thụ tinh khi sử dụng tinh trùng mào tinh hoặc tinh hoànđông lạnh so với tinh trùng từ mào tinh và tinh hoàn tươi [8], [15] Riêng đối vớitinh trùng từ mô tinh hoàn, có nghiên cứu cho rằng mặc dù tỉ lệ thụ tinh là như nhaunhưng tỉ lệ làm tổ khi sử dụng tinh trùng mô tinh hoàn tươi cao hơn so với sử dụngtinh trùng từ mô tinh hoàn trữ lạnh – rã đông [16] Vấn đề này gây nhiều tranh cãi

và vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu

1.7 Các phương pháp trữ lạnh tinh trùng

Quy trình trữ lạnh tinh trùng ở các trung tâm thụ tinh trong ống nghiệmthường khác nhau về chi tiết và tùy thuộc vào từng điều kiện của mỗi trung tâm.Tuynhiên, các quy trình này về cơ bản là giống nhau Đối với tinh dịch, trước khi trữlạnh, mẫu được đánh giá chất lượng tinh trùng theo tiêu chuẩn của tổ chức y tế thếgiới (WHO) Sau đó, chất bảo quản lạnh được nhỏ từng giọt và trộn đều vào tinh

dịch theo tỉ lệ 1:1 Các mẫu có mật độ tinh trùng cao có thể bổ sung chất bảo quảntheo tỉ lệ 2:1, hoặc thậm chí 3:1 Các mẫu có mật độ thấp với thể tích tinh dịch cao

có thể được ly tâm, loại bỏ phần dịch ở trên và thu nhận tinh trùng với một thể tích

cô đặc Sau khi bổ sung chất bảo quản, mẫu tinh dịch được cho vào ống trữ lạnh(cryovial) hoặc cọng rạ (straw)… và để cân bằng ở nhiệt độ phòng khoảng 10-15phút trước khi trữ lạnh

Chương trình trữ lạnh cũng khác nhau ở các trung tâm Mẫu tinh trùng có thểđược đông lạnh bằng hơi ni-tơ lỏng bằng cách đặt mẫu bên trên mực ni-tơ lỏng mộtkhoảng 18 cm trong 30 phút Trong trường hợp này, tốc độ làm lạnh khoảng

10oC/phút, sau đó, mẫu được cho vào ni-tơ lỏng [17] Việc sử dụng máy hạ nhiệt độvới chương trình cài đặt sẵn có thể giúp cải thiện tỉ lệ tồn tại của tinh trùng sau rãđông Tuy nhiên, với hầu hết các mẫu tinh dịch có chất lượng tốt, trữ lạnh tinh trùngbằng hơi ni-tơ lỏng có thể đáp ứng được yêu cầu sử dụng của tinh trùng sau rã đông.Trữ lạnh tinh trùng thu nhận từ mào tinh (PESA hoặc MESA) được thực hiệntương tự như trữ lạnh tinh dịch Tuy nhiên, số lượng và chất lượng tinh trùng thunhận từ mào tinh thường kém hơn so với tinh trùng từ tinh dịch bình thường Dịchmào tinh thu nhận bằng phương pháp MESA hay PESA thường có lẫn hồng cầu Sốlượng hồng cầu ít hay nhiều phụ thuộc vào vị trí thu mẫu trên mào tinh, số lượngmẫu và sự khéo léo của phẫu thuật viên Tuy nhiên, lượng hồng cầu trong trườnghợp này thường ít hơn trường hợp mẫu từ mô tinh hoàn Ngoài ra, dịch mào tinhcòn lẫn nhiều cặn bã được cho là xác tinh trùng đã chết do bị tắc nghẽn lâu ngày.Đối với dịch mào tinh có chất lượng tương đối tốt, tinh trùng có thể được lọc rửatrước khi trữ lạnh để tránh những tác hại của các chất có lẫn trong dịch mào tinh.Đối với trữ lạnh tinh trùng từ mô tinh hoàn, mẫu mô cần được xé nhỏ để xácđịnh sự hiện diện của tinh trùng trước khi trữ Có nhiều phương pháp xử lý mô tinhhoàn để thu nhận tinh trùng Phương pháp cổ điển và phổ biến nhất là phương phápnghiền mẫu mô trong ống nghiệm bằng chày thủy tinh của Oates và cs [30] Mộtphương pháp cơ học khác là sử dụng kim 22G để cắt nhỏ mẫu mô Mô tinh hoàncũng có thể xử lý bằng enzym collagenaz loại IV (Sigma, Heidelberg, Đức) và chất

ức chế trypsin (Sigma) [12], [18] Mô tinh hoàn có thể được trữ dưới dạng khối mô.Các khối mô với kích thước bằng hạt gạo được cho vào ống trữ lạnh có chứa sẵn 0,5

ml dung dịch chất bảo quản Sau khi rã đông, mẫu mô được xé nhỏ và xử lý để thunhận tinh trùng cho sử dụng [19],[20].Tuy nhiên, phần lớn các trung tâm đều xé nhỏmẫu mô trước khi trữ lạnh nhằm tăng khả năng tiếp xúc với chất bảo vệ đông lạnh.Mẫu mô được trữ dưới dạng dung dịch đồng nhất trong các ống trữ lạnh Tuy nhiên,đối với một số mẫu có chất lượng kém, tinh trùng rất ít nên khả năng đánh mất mộtphần tinh trùng trong quá trình trữ lạnh và lọc rửa trước khi sử dụng là rất lớn.Năm 1991, Cohen và cs đã mô tả phương pháp trữ lạnh tinh trùng sử dụngmàng zona của trứng làm vật chứa cho các trường hợp có ít hơn 100 tinh trùng trongphần dịch đồng nhất mô tinh hoàn thu được Màng zona được hút hết tế bào chất bêntrong bằng bộ vi thao tác Dịch chứa tinh trùng và 10% polyvinylpyrrolidone (PVP)được tiêm vào trong màng zona và trữ lạnh bằng cọng rạ (straw) với chương trình trữlạnh chậm và 8% glycerol làm chất bảo quản Kết quả cho thấy tỉ lệ phục hồi của tinhtrùng là 75% và tỉ lệ thụ tinh sau ICSI là 78% Mặc dù phương pháp sử dụng màngzona cho tỉ lệ phục hồi của tinh trùng cao và khả năng đánh mất tinh trùng là rất thấpnhưng phương pháp này không được khuyến khích sử dụng Nguyên nhân là nguồnmàng zona ở người là rất ít, chủ yếu là sử dụng màng zona của chuột hamster và khi

đó, nguy cơ truyền vi rút từ chuột sang người là khó có thể tránh khỏi vì tinh trùngsau khi rã đông được tiêm trực tiếp vào bào tương trứng

Năm 1995, Craft và Tsirigotis đưa ra phương pháp trữ lạnh tinh trùng từ môtinh hoàn bằng dầu paraffin Dịch đồng nhất mô tinh hoàn có bổ sung glycerolđược đặt trong giọt dầu paraffin chứa trong ống ly tâm và trữ lạnh Một phươngpháp khác được Schuster và cs đưa ra vào năm 2003 là sử dụng cryoloop bằngnylon (Hampton Research, Mỹ) Cryoloop tạo ra một màng mỏng dung dịch vàkhoảng 5 µl dịch đồng nhất được bơm lên màng Cryoloop được nhúng trực tiếpvào ni-tơ lỏng và chứa trong các ống trữ lạnh (cryovial) [12]

Trữ lạnh tinh trùng thu nhận từ phẫu thuật thường được thực hiện nhiều ống

để có thể kiểm tra được khả năng sống của tinh trùng sau rã đông trước khi tiếnhành chọc hút trứng Trong trường hợp không có tinh trùng sống sau rã đông, có

thể tiến hành một trong các lựa chọn sau: lặp lại quy trình phẫu thuật thu tinhtrùng, xin tinh trùng, trữ trứng.

Phương pháp đông lạnh tối ưu: Trong kỹ thuật ICSI, vấn đề cần quan tâm

không phải là số lượng mà là chất lượng tinh trùng Trong đó, toàn vẹn DNA là yếu

tố quyết định sự thành công của kỹ thuật hỗ trợ sinh sản Tác động của quá trình trữđông trên khả năng thụ tinh, độ di động, hình thái học và khả năng sống của tinhtrùng đã được chứng minh, nhưng hiện vẫn còn những tranh cãi trong y văn về việctrữ đông có tác động đến tính toàn vẹn của nhiễm sắc thể hay không

Một số quy trình đông lạnh và rã đông tinh trùng cổ điển.

Phương pháp

CPA/dịch chứa tinh trùng

Quy trình rã

Tác giả/ nhà sản xuất 20-25 0 C 37 0 C

Sherman,1954, 1963;Manhadevan vàTrounson,1983

Manhadevan vàTrounson,1983 Prins

và Weidel, 1986Chậm, bằng tay

Human spermpreservationmedium

1:1 5 phút 10 phút Centola G.M và cs, 1992

Chậm, bằng máy Test egg yolk

phút 0 giây Donneylly E.T và cs 2001

Foundation 2004Chậm, bằng tay Freezing medium 1:1 5 phút 20 phút The Irvine Scientific 2004Nhanh, thủy tinh

1.7.1 Các chất bảo quản đông lạnh (CPAs)

Là các chất được sử dụng để hạn chế tấc hại của quá trình làm lạnh lên tế bào

Có 2 loại chất bảo quản đông lạnh: chất bảo quản đông lạnh thấm qua màng, và chấtbảo quản đông lạnh không thấm qua màng

* Chất bảo quản đông lạnh thấm qua màng (EG – ethylene glycol , DMSO –dimevhjthyl sulfoxide, PROH – 1,2-propanediol, glycerol…) là các chất phân tửnhỏ, có khả năng thấm qua màng tế bào trao đổi với nước, các chất bảo quản đi vàotrong tế bào do sự chênh lệch thẩm thấu, và nước đi ra khỏi tế bào, từ đó ngăn chặnhình thành tinh thể đá nội bào Ethylen glycol là chất bảo quản đông lạnh hay được

sử dụng nhất Người ta có thể kết hợp 2 hoặc 3 loại chất bảo quản đông lạnh đểtránh nồng độ quá cao các chất khi sử dụng đơn lẻ dễ gây độc tế bào Nếu chỉ sửdụng 1 loại chất bảo quản đông lạnh thường dùng Ethylen glycol và kết hợp với 1hoặc 2 chất bảo quản đông lạnh không thấm qua màng

* Chất bảo quản đông lạnh không thấm qua màng là các đường đơn hoặcđường đôi như sucrose, dextran, raffinose, glycine… không có khả năng thấm quamàng Để loại hết nước ra khỏi tế bào, cần nồng độ cao các chất bảo quản thấm quamàng, và cần thời gian để nước ra khỏi tế bào, tuy nhiên các chất bảo quản đônglạnh cũng gây độc tế bào nếu ở nồng độ cao, vì thể người ta cho thêm chất bảo quảnđông lạnh không thấm qua màng vào môi trường trữ để giảm bớt nồng độ chất bảoquản trong tế bào Chất bảo quản đông lạnh không thấm qua màng sử dụng phổ biếnnhất đó là sucrose

1.7.2 Dụng cụ trữ đông

Nhiều dụng cụ được chế tạo từ nhiều loại vật liệu khác nhau đã được thửnghiệm để lưu trữ tinh trùng Mặc dù vậy, cho đến nay vẫn chưa có những nghiêncứu ngẫu nhiên nào được xây dựng để chứng minh dụng cụ nào là tốt nhất để lưutrữ những mẫu tinh trùng, đặc biệt là những mẫu có số lượng ít

Dụng cụ trữ đông và các ưu khuyết điểm.

Dụng cụ trữ

cryogenic Đơn giản, thuận tiện,thích hợp cho những

mẫu tinh trùng tốt

Không thích hợp vớimẫu kém; mất tinh trùng

do dính vào vật chứa

Màng zona

trống

Borini A và cs 2000Cohen J và cs 1997Walmsley R và cs 1998Levi-Setti PE và cs 2003

Dễ tìm tinh trùng diđộng Không mất tinhtrùng khi thêm vào hayloại bỏ chất bảo quản

Nguy cơ nhiễm chéo

Vi giọt

Gil-Salom M và cs 2000 Sereni E và cs 2008Quintans C và cs 2000Bouamama N và cs 2003

Tránh mất tinh trùng

do dính vào thànhdụng cụ chứa

Nguy cơ nhiễm chéo,hình dạng vật chứa lớn,khó khăn trong đônglạnh và lưu trữ

Pipette ICSI 2001 Sohn JO và cs 2003Gvakharia M và cs Vô trùng, đơn giảnvà thuận tiện

Thời gian trữ ngắn,Pippette ICSI dễ gãy,nguy cơ nhiễm chéo

Khối cầu

Volvox Just A và cs 2004 Tỷ lệ tinh trùng saurã đông cao

Nhiễm với vật liệu ditruyền từ tảo, nguồntảo hiếmAlginate beads Herrler A và cs 2006 Tính trơ của Alginate

beads

Giảm độ di động củatinh trùng

Cryoloop

Nawroth F và cs 2002Schuster TG và cs 2003Isachenko E và cs 2004Desai N và cs 2004

Vật chứa rất tốt chotrữ đông bằngphương pháp thủytinh hóa, không cần

sự chuẩn bị nào khác

Hệ thống mở, nguy cơnhiễm chéo

Agarose

microspheres Isaev DA và cs 2007 Vật chứa không sinhhọc

Giá trị lâm sàng củaphương pháp này chưađược đánh giá

straws

Desai N và cs 1998Isachenko V và cs 2005Koscinski I và cs 2007

Vô trùng, đơn giản

và thuận tiện

Không thích hợp chotinh trùng có chất lượngkém, mất tinh trùng dodính vào vật chứa

1.7.3 Các nghiên cứu trên thế giới về hiệu quả của ICSI giữa sử dụng tinh trùng tươi, tinh trùng đông thu nhận từ mào tinh và tinh hoàn.[21],[22],[23]

Nguồn gốc

Tinh hoàn

25 chu kỳ tinh trùng tươi

14 chu kỳ tinh trùng đông

Không có sự khácbiệt (P>0,05) Friedler và cs 199712chu kỳ tinh trùng tươi

34 chu kỳ tinh trùng đông

Không có sự khácbiệt (P>0,05) Ben và cs 2003

14 chu kỳ tinh trùng tươi

8 chu kỳ tinh trùng đông

Không có sự khácbiệt (P>0,05) Huang và cs 2000

65 chu kỳ tinh trùng tươi

35 chu kỳ tinh trùng đông

Có sự khác biệt(P<0,05)về tỷ lệ thụtinh và sinh sống

40chukỳ tinh trùng đông

Không có sự khácbiệt (P>0,05) Sukcharoen và cs 200153chu kỳ tinh trùng tươi

13chukỳ tinh trùng đông

Không có sự khácbiệt (P>0,05) Sukcharoen và cs 20015chu kỳ tinh trùng tươi

13chukỳ tinh trùng đông

Có sự khác biệt(P<0,05) Shibahara và cs 1999

61chukỳ tinh trùng đông

Không có sự khácbiệt (P>0,05) Borges và cs 2007

1.8 Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI) và nuôi cấy phôi

1.8.1 Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI – Intracytoplasmic Sperm Injection)[24],[25].

Năm 1992, Palermo và cộng sự đã báo cáo trường hợp có thai đầu tiên với sự

hỗ trợ thụ tinh bằng phương pháp ICSI Quá trình tiêm tinh trùng vào bào tươngtrứng được tiến hành dưới kính hiển vi đảo ngược, độ phóng đại 200 lần, sử dụng hệthống vi thao tác và các kim thủy tinh với đường kính cực nhỏ Kỹ thuật được ra đờinhằm khắc phục tình trạng tỉ lệ thụ tinh thấp hoặc không thụ tinh khi thực hiện thụtinh trong ống nghiệm do sự bất thường của quá trình thụ tinh, chất lượng tinh trùngthấp, đặc biệt là các trường hợp thu nhận tinh trùng từ phẫu thuật do không có tinhtrùng trong tinh dịch Với kỹ thuật này, người ta có thể tạo một hợp tử hoàn chỉnhbằng một trứng và một tinh trùng duy nhất Đây được xem là một cuộc cách mạngtrong điều trị vô sinh do nguyên nhân ở nam giới

Kỹ thuật ICSI thường cho tỉ lệ thụ tinh cao hơn, làm số phôi có được nhiềuhơn, nhiều khả năng chọn lọc được phôi tốt để chuyển vào buồng tử cung, dẫn đến

tỉ lệ có thai cao hơn Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy, đối với cáctrường hợp vô sinh không liên quan đến nam giới, tỉ lệ thành công của ICSI tươngđương với kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm cổ điển Kỹ thuật ICSI hiện nay cóthể thực hiện với tinh trùng tươi hoặc sau trữ lạnh, tinh trùng trong tinh dịch haytinh trùng sinh thiết từ mào tinh và tinh hoàn

Hình 1.8 Kỹ thuật ICSI

Mặc dù có một số quan ngại, cho đến nay, ICSI được xem là một kỹ thuật điềutrị an toàn và đang được áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới Các nghiên cứu trên thếgiới về di truyền học và sự phát triển tâm sinh lý của các trẻ sinh ra với kỹ thuậtICSI cho đến nay đều không thấy sự khác biệt nhiều so với dân số chung [15] Hiệnnay, người ta tìm thấy khoảng 10% nguyên nhân vô sinh nam có liên quan đến ditruyền Các bệnh lý này có thể truyền cho con khi thực hiện kỹ thuật ICSI Đa số,các nguyên nhân này chỉ ảnh hưởng đến khả năng sinh sản, ít ảnh hưởng đến cácchức năng khác của cơ thể Do đó, các cặp vợ chồng thực hiện kỹ thuật ICSI cầnđược tham vấn trước khi quyết định điều trị.

1.8.2 Nuôi cấy phôi

Sau khi thực hiện tiêm tinh trùng vào bào tương trứng, trứng được nuôi cấytrong điều kiện 37oC, 6% CO2, 5% O2.Việc kiểm tra thụ tinh được tiến hành vào thờiđiểm 16 – 18 giờ sau ICSI.Trứng được ghi nhận là thụ tinh với sự xuất hiện của haitiền nhân.Chất lượng phôi được đánh giá vào giai đoạn phân chia (ngày 2, ngày 3 sauICSI) hoặc giai đoạn phôi nang (ngày 5 sau ICSI) Hiện tại, có nhiều hệ thống đánhgiá chất lượng phôi được áp dụng tại các trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm trên thếgiới Nhìn chung, các hệ thống này có thể chia thành hai phương pháp là dựa vàohình thái và dựa vào chuyển hóa của phôi Tiêu chuẩn về hình thái có thể được ghinhận qua các giai đoạn phát triển của phôi dựa trên một số tiêu chí như tốc độ pháttriển, độ đồng đều giữa các phôi bào, tỉ lệ mảnh vỡ tế bào… Đây được xem là tiêuchuẩn đánh giá phôi được sử dụng phổ biến nhất hiện nay tại các trung tâm IVF

1.9 Một số yếu tố ảnh hưởng đến kết quả của kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn sử dụng tinh trùng đông lạnh thu nhận từ phẫu thuật.

1.9.1 Vị trí thu nhận tinh trùng [20],[26],[27].

Mục tiêu của thu nhận tinh trùng là nhằm thu được tinh trùng chất lượng tốtnhất nếu có thể, số lượng tinh trùng đủ để thực hiện ICSI ngay tức thì và đủ để trữlạnh dành cho những lần ICSI sau Trong những trường hợp vô tinh, tinh trùng cóthể trích từ ống dẫn tinh, mào tinh hay tinh hoàn Tinh trùng từ ống dẫn tinh thường

“già”, nhiều khả năng ADN bị hư hại nên kỹ thuật này ít được thực hiện Tinh trùng