nghiên cứu sự ô nhiễm của thịt lợn tươi bởi một số chỉ tiêu vi khuẩn trên địa bàn thành phố thái nguyên

Trong đó, các vi khuẩn gây bệnh có vai trò đặc biệt quan trọng trong gây ô nhiễm thực phẩm, tác động gây bệnh bằng nhiều yếu tố khác nhau như nhiễm trùng huyết, sản sinh độc tố gây NĐTP,

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

DƯƠNG THUỲ DUNG

NGHIÊN CỨU SỰ Ô NHIỄM CỦA THỊT LỢN TƯƠI BỞI MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI KHUẨN TRÊN ĐỊA BÀN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

DƯƠNG THUỲ DUNG

NGHIÊN CỨU SỰ Ô NHIỄM CỦA THỊT LỢN TƯƠI BỞI MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI KHUẨN TRÊN ĐỊA BÀN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là luận văn do tôi thực hiện Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực Một số kết quả đã được công bố cùng TS Đặng Xuân Bình, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kì công trình nào khác Các tài liệu tham khảo, trích dẫn đều được ghi tên tác giả và tên tài liệu trích dẫn trong phần tài liệu tham khảo

Tác giả luận văn

Dương Thuỳ Dung

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS Đặng Xuân

Bình đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và

hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống – Đại học

Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Khoa SĐH, Khoa Sinh-KTNN - Trường

Đại học Sư Phạm Thái Nguyên, cùng toàn thể bạn bè đồng nghiệp đã tận tình giúp

đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các cơ quan trong địa bàn thành phố Thái

Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành luận văn Để góp

phần thực hiện thành công luận văn, tôi đã nhận được sự khích lệ, động viên của

gia đình và người thân Nhân dịp này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành

tất cả sự giúp đỡ quý báu đó

Thái Nguyên, tháng 8 năm 2010

Tác giả luận văn

Dương Thùy Dung

MỤC LỤC

Trang

1 Đặt vấn đề 1

1.6 Các chủng vi khuẩn chủ yếu gây ô nhiễm thịt 12 1.7 Tình hình nghiên cứu sự ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm ở

3.1 Khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn trên địa bàn thành

3.2 Xác định chỉ tiêu vi khuẩn nhiễm trên thịt lợn tươi 42

3.3 So sánh tỷ lệ nhiễm các vi khuẩn E coli, Salmonella, Bacillus

cereus, Staphylococcus aureus và Clostridium perfringens trên mẫu thịt

Bacillus cereus, Staphylococcus aureus và Clostridium perfringens

phân lập đƣợc

3.6 Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dƣợc của

các chủng vi khuẩn E coli, Salmonella, Bacillus cereus,

Staphylococcus aureus và Clostridium perfringens phân lập đƣợc 57

PHỤ LỤC ẢNH

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

B cereus: Bacillus cereus

Cl perfringens: Clostridium perfringens

E coli: Escherichia coli

Staph aureus: Staphylococus aureus

VSATTP: Vệ sinh an toàn thực phẩm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.2: Tiêu chuẩn đánh giá thịt tươi bằng các phản ứng sinh hóa học 8

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn trên địa bàn

Bảng 3.2: Kết quả xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí nhiểm trên

Bảng 3.3: Kết quả xác định vi khuẩn E coli nhiễm trên thịt lợn tươi 43

Bảng 3.4: Kết quả xác định vi khuẩn Salmonella nhiễm trên thịt lợn tươi 44

Bảng 3.5: Kết quả xác định vi khuẩn Bacillus cereus nhiễm trên thịt lợn

Bảng 3.8: Kết quả so sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E coli, Salmonella,

Bacillus cereus, Staphylococcus aureus và Clostridium perfringens trên thịt 48 Bảng 3.9: Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn

E coli phân lập được 50 Bảng 3.10: Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn

Salmonella phân lập được 51 Bảng 3.11 Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn

Bacillus cereus phân lập được 52

Bảng 3.12: Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn

Staphylococcus aureus phân lập được 53 Bảng 3.13 Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn

Clostridium perfringens phân lập được 54 Bảng 3.14: Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập được 55 Bảng 3.15 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của vi

Bảng 3.16 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dư ợc của vi

Bảng 3.17 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của vi

Bảng 3.18: Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược củ a vi

Bảng 3.19: Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của vi

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ngày nay, cùng với sự phát triển không ngừng của nền kinh tế - xã hội, thì chất lượng cuộc sống của người dân cũng ngày càng được nâng cao, do đó yêu cầu về vệ sinh thực phẩm trở thành vấn đề được quan tâm Thực phẩm phải đảm bảo tiêu chuẩn tươi, sạch, giàu dinh dưỡng và an toàn cho người sử dụng Trong

đó thịt lợn là một loại thực phẩm thông dụng thường xuyên được sử dụng để chế biến các loại món ăn trong thực đơn hàng ngày của mỗi gia đình Tuy nhiên, do quá trình chế biến con người thường chỉ quan tâm tới lợi nhuận trước mắt mà sẵn sàng bỏ qua các quy chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP), do vậy nguồn thực phẩm tươi sống nói chung thịt lợn tươi nói riêng bị ô nhiễm ngày càng lớn đe dọa sức khỏe của mọi người Theo đánh giá của tổ chức Y tế Thế giới (WHO) hàng năm có khoảng 1.300 triệu lượt người trên thế giới bị tiêu chảy trong đó nguyên nhân chính là do ăn phải thực phẩm bị ô nhiễm Mỗi năm Việt Nam có 8 triệu người (chiếm xấp xỉ 1/10 tổng dân số) bị ngộ độc thực phẩm (NĐTP) hoặc ngộ độc do liên quan đến thực phẩm

Vấn đề an toàn thực phẩm đang trở thành một vấn đề quan trọng đối với sức khoẻ cộng đồng ở hầu hết các nước phát triển và cả ở các nước đang phát triển Theo số liệu thống kê của trung tâm phòng chống dịch bệnh hàng năm có khoảng 76 triệu người bị các bệnh lây truyền qua thực phẩm ở Mỹ, gây thiệt hại khoảng 5 - 6 tỷ USD

Nguy cơ gây ô nhiễm thực phẩm trong quá trình giết mổ, chế biến và bảo quản thịt lợn bao gồm nhiều yếu tố như vi sinh vật, vật lý hoá học Trong đó, các vi khuẩn gây bệnh có vai trò đặc biệt quan trọng trong gây ô nhiễm thực phẩm, tác động gây bệnh bằng nhiều yếu tố khác nhau như nhiễm trùng huyết, sản sinh độc tố gây NĐTP, rối loạn tiêu hóa hấp thu Nếu bệnh xảy ra không được điều trị có thể gây chết

Với đặc trưng là trung tâm của vùng Việt Bắc, thành phố Thái Nguyên có

nhiều cơ quan, xí nghiệp, công ty, nhà máy đặc biệt có nhiều trường Đại học,

Cao đẳng, THCN nằm trên địa bàn nên nhu cầu tiêu thụ thực phẩm lớn Mặt

khác, việc giết mổ và bán thịt chủ yếu do tư nhân thực hiện, phương tiện vận

chuyển, dụng cụ bán thịt chưa đạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y Việc kiểm tra vệ sinh

thú y của cán bộ kiểm dịch còn gặp nhiều khó khăn, hiện chỉ dừng lại ở mức độ

kiểm tra cảm quan thịt được bày bán tại các chợ

Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên

cứu của bộ môn Công nghệ Vi sinh Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái

Nguyên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự ô nhiễm của thịt lợn tươi

bởi một số chỉ tiêu vi khuẩn trên địa bàn Thành phố Thái Nguyên”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định tình trạng ô nhiễm của thịt lợn tươi về một số chỉ tiêu vi khuẩn

gây bệnh như: Escherichia coli (E coli), Salmonella, Bacillus cereus

(B cereus), Staphylococus aureus (Staph aureus), Clostridium perfringens

(Cl perfringens)

- Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học đề xuất một số biện

pháp hạn chế tình trạng ô nhiễm vi khuẩn trên thịt lợn, từ đó góp phần đảm bảo

VSATTP, góp phần bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng

3 Nội dung nghiên cứu

- Lấy mẫu, phân lập và xác định chỉ tiêu tổng số VKHK trong 1gram thịt

lợn tươi

- Lấy mẫu, phân lập và xác định các vi khuẩn gây bệnh, bao gồm: Vi

khuẩn E coli, B cereus, Staph aureus, Cl perfringens trong 1gram thịt lợn tươi

- Lấy mẫu, phân lập và xác định các vi khuẩn Salmonella trong 25 gram

thịt tươi

- Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn E coli,

Salmonella, B cereus, Staph aureus, Cl perfringens phân lập được

- Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E coli, Salmonella, B cereus

Staph aureus, Cl perfringens phân lập được

- Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của các

chủng vi khuẩn E coli, Salmonella, B cereus, Staph aureus, Cl perfringens

phân lập được

1.1.1 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm

Thực phẩm có nguồn gốc động vật và thực vật là nguồn thực phẩm thiết yếu của con người Việc lựa chọn thực phẩm và cách chế biến thực phẩm phù hợp khoa học đem lại cho con người nguồn dinh dưỡng quan trọng đảm bảo sức khỏe và chất lượng dân số Tuy nhiên, ngoài việc đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho con người thì các nguồn thực phẩm kém chất lượng có thể gây nguy hại đến sức khỏe con người

Ngộ độc thực phẩm xảy ra khi chúng ta dùng phải thức ăn, thức uống nhiễm bẩn, bảo quản không đúng cách hoặc bị nhiễm trùng, virus, ký sinh trùng, nấm mốc hay hóa chất độc hại Ở nước ta những năm gần đây các ca NĐTP có nhiều hướng gia tăng mà nguyên nhân chính là do các nguồn thực phẩm hay nước uống bị ô nhiễm Các thực phẩm có nguồn gốc động vật có xu hướng dễ bị nhiễm khuẩn hơn Nhiễm độc thực phẩm có thể chia làm hai loại: Nhiễm độc do hóa chất và nhiễm độc do các yếu tố sinh vật

Hóa chất độc bao gồm các hóa chất sử dụng trong công nghiệp và nông nghiệp Trong sản xuất nông nghiệp nhiều chất độc được sử dụng bảo vệ thực vật, đặc biệt là nhóm clo hữu cơ như diclo-diphenyl-tricloetan (DDT), dipteren, lindane, padane… Các hóa chất này tồn dư trong các sản phẩm nông sản rồi

động vật ăn vào theo đó thực phẩm có nguồn gốc động vật cũng bị nhiễm hóa chất độc tồn dư Người ta đã chứng minh rằng DDT có tác dụng giống như một hoocmon sinh học có thể gây ra rối loạn sinh sản và gây ra bệnh ung thư Các chất độc bảo vệ thực vật nhóm phosphose có thể gây nhiễm độc cấp tính ở vật nuôi và sự tồn dư của chúng trong thực phẩm có thể dẫn tới sự tích lũy trong cơ thể người, ảnh hưởng tới hệ thần kinh và miễn dịch của cơ thể Một số chế phẩm sinh học sử dụng kích thích sinh trưởng như thyroxine cũng gây những tác động xấu tới sức khỏe con người

Ngộ độc thực phẩm có thể gây ra do thực phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật và độc tố của nó Loại NĐTP này đang là mối quan tâm hàng đầu của con người thậm chí cả các quốc gia phát triển như Mỹ (Hoa Kỳ), Anh, Nhật Bản, Trung Quốc… cũng không phải là ngoại lệ Đầu tháng sáu 2008 vừa qua, báo chí Bắc

Mỹ có đề cập đến các ca NĐTP do một vài loại cà chua bị nhiễm khuẩn

Salmonella gây ra tại 17 tiểu bang Hoa Kỳ [57]

1.1.2 Thực trạng ngộ độc thực phẩm ở trong nước và trên thế giới

1.1.2.1 Thực trạng ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam

Ở Việt Nam NĐTP xảy ra hầu khắp các địa phương trong cả nước Gần đây, nhiều cơ quan liên bộ, liên ngành tham gia quản lý vấn đề này nhưng các ca ngộ độc vẫn gia tăng hàng năm Theo thống kê từ Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm - Bộ Y tế [2], thời gian 2001-2005 cả nước đã xảy ra gần 1.000 ca NĐTP, trong đó có 260 người chết Riêng năm 2005 xảy ra 150 ca với trên 4.300 người

bị NĐTP, làm chết hơn 50 người Năm 2006-2007 đã có 1.124 người bị NĐTP Năm 2008 số người NĐTP tăng 54%, số người chết tăng 53,6% so với năm

2007 Tình trạng mất an toàn thực phẩm ngày càng cao nhất là ở các bếp ăn tập thể như trường học, bệnh viện, khu công nghiệp nơi tập trung đông người

Theo thống kê từ Cục Chăn nuôi – Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn [3], tỷ lệ 2004-2008 có 906 ca NĐTP Như vậy, trung bình mỗi năm có 181

ca ngộ độc với 6.036 người bị NĐTP và khoảng 54 người chết Theo báo cáo

của 63 tỉnh thành phố, số ca ngộ độc từ năm 2004-2008 có xu hướng tăng, tuy nhiên số người bị ngộ độc có chiều hướng giảm Về nguyên nhân NĐTP, ngộ độc do vi sinh vật là ở mức cao, sau đó là hóa chất tồn dư và thực phẩm biến chất cuối cùng là ngộ độc do độc tố tự nhiên

1.1.2.2 Thực trạng ngộ độc thực phẩm trên thế giới

Trên thế giới, nền kinh tế của các nước đang ngày càng phát triển, đời sống vật chất được nâng cao, vấn đề sức khoẻ con người ngày càng được quan tâm Ngộ độc thực phẩm đang là mối đe doạ đối với người tiêu dùng trên toàn thế giới

Theo Noordhuizen [48] có hơn 200 bệnh lây truyền qua thực phẩm Những tác nhân gây bệnh gồm: Virus, vi trùng, ký sinh trùng, độc tố

Wall [56] cho biết, trong thời gian từ năm 1992-1996, tại Anh và xứ Wales đã xảy ra 2.877 ca ngộ độc mà nguyên nhân là do vi sinh vật có 26.711 người bị bệnh, trong đó có 9.160 người phải nằm viện và 52 người tử vong

Theo thống kê ở Đức, năm 1994 có 1,6 triệu người bị NĐTP do

Salmonella Tại Mỹ, mỗi năm có khoảng 1.126 người bị NĐTP [11]

Ca NĐTP do E coli xảy ra ở Sakai-Nhật Bản năm 1996 đã làm 6.500

người phải vào viện và làm 7 người thiệt mạng [24]

1.2 Thịt tươi và các dạng hư hỏng của thịt

1.2.1 Thịt tươi

Thịt tươi là thịt chưa bị biến chất bởi men của bản thân nó và của vi sinh vật, làm thay đổi cảm quan và hình thành những chất có hại Thịt tươi là một trong những sản phẩm động vật có giá trị dinh dưỡng cao, được sử dụng rộng rãi bởi thịt có đầy đủ những chất dinh dưỡng sinh học cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển và hoạt động sống của con người

Thành phần hóa học của thịt rất khác nhau, phụ thuộc vào các yếu tố giống, loài, lứa tuổi, độ béo gầy và điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng Nhưng nhìn chung thành phần hóa học của thịt bao gồm:

+ Nước : 50 - 75%

Đánh giá cảm quan đối với thịt tươi theo bảng 1.1 [13] và [31]

Bảng 1.1: Đánh giá kết quả cảm quan thịt

Hơi nhão, nhão, ấn ngón tay vào để lại vết nhẹ (thịt kém tươi), vết hằn sâu, không mất (thịt ôi)

4 Mỡ Màu sáng, độ rắn và mùi vị tự nhiên

của thịt tươi, không có mùi lạ

Màu tối, độ rắn giảm, có

vị ôi

5 Gân Gân trong, bám chặt vào thành ống

xương

Kém trong, độ đàn hồi kém

6 Tuỷ Tuỷ trong, bám chặt vào thành ống

Bảng 1.2: Tiêu chuẩn đánh giá thịt tươi bằng các phản ứng sinh hóa học

pH của nước thịt ngâm 5,4 - 6,4 6,5 - 6,7 Trên 6,7 Hàm lượng NH3 (mg) Dưới 1,26 1,27 - 1,68 Trên 1,68 Phản ứng CuSO4 làm sa

lắng protit

Nước thịt trong hoặc hơi đục

Nước thịt vẩn đục hoặc có hạt

Nước thịt đục có cặn sánh như keo

Phản ứng tìm

peroxydaza (thử

benzidin)

Nước thịt ngâm, lọc có màu xanh lá

mạ, sau mấy phút chuyển màu nâu

Nước thịt ngâm, lọc không có hoặc lâu mới có màu xanh lá mạ

Nước thịt ngâm, lọc không biến đổi màu sắc

Phản ứng Nestler tìm

NH3

Nước thịt ngâm, lọc không màu

Nước thịt ngâm, lọc có màu vàng nhạt

Nước thịt ngâm, lọc có màu vàng vỏ

chanh Phản ứng tìm H2S

(dùng axetat chì)

Giấy lọc giữ nguyên màu

Giấy lọc có màu nâu nhạt

Giấy lọc có màu nâu sẫm hoặc đen

1.2.2 Các dạng hư hỏng của thịt

Thịt trong quá trình bảo quản có thể bị biến chất và hư hỏng Sau khi giết

mổ, thịt mới chưa bị biến chất Nhưng giữ thịt lâu chưa kịp tiêu thụ hoặc cất giữ dùng dần ở những điều kiện không thích hợp sẽ bị biến chất bởi các enzyme có sẵn trong thịt và vi sinh vật dẫn đến ôi thiu, hư hỏng về trạng thái cảm quan, hình thành những chất có hại

Những hiện tượng hư hỏng của thịt thường gặp là: Thịt nhớt, thối rữa, lên men chua, có các chấm màu trên bề mặt thịt, thịt mốc…[10]

Tuy nhiên trong thịt bảo quản lạnh vẫn có các vi sinh vật ưa lạnh như: Nhóm Pseudomonas, Achrmobacter, Flavobacterium, Alcaligenes,

Aerobacterium và một số loại cầu khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas như Pseudomonas fragi, Pseudomonas fluoresceus, Pseudomonas geniculata, ngoài

ra còn có nấm men, nấm mốc vẫn phát triển Thịt có mùi đất là do xạ khuẩn mọc Thịt muối vẫn tồn tại vi sinh vật ưa mặn và làm hỏng thịt [10]

1.3 Ô nhiễm thực phẩm nguồn gốc động vật

Trên bề mặt con vật chứa nhiều loài vi khuẩn khác nhau cũng tương tự hệ

vi sinh vật tự nhiên Ở trong hệ tiêu hóa của động vật chứa một số vi khuẩn như:

Salmonella, Staphylococcus, B subtilis, Streptococcus các chủng vi sinh vật

này dễ dàng phân lập được

Sự sinh trưởng của vi sinh vật trên bề mặt và trong thịt cũng làm cho số lượng vi sinh vật tăng lên Do nguồn nhiễm bẩn thịt hết sức phong phú nên có rất

nhiều loại vi sinh vật phát triển trên bề mặt thịt như: Pseudomonas,

Streptococcus, Proteus, Bacillus, Clostridium, E coli…Vì vậy, thực phẩm dễ

dàng bị ô nhiễm bởi vi khuẩn

1.4 Ô nhiễm thực phẩm do vi sinh vật

Ô nhiễm thực phẩm có nguồn gốc vi sinh vật là một vấn đề rất đáng lo ngại Trên lĩnh vực vệ sinh an toàn thực phẩm các loại thực phẩm ô nhiễm bởi vi sinh vật là mối quan tâm lớn Thực phẩm dễ dàng bị ô nhiễm bởi vi sinh vật Trong không khí và các dụng cụ giết mổ, chế biến thực phẩm đều có thể bị các

vi sinh vật có hại bám dính ở trên Chúng dễ dàng xâm nhiễm vào thực phẩm bằng nhiều con đường khác nhau Đặc biệt, nguồn thực phẩm tươi sống như thịt lợn, thịt bò, thịt gà, thịt vịt… là môi trường thuận lợi để chúng phát triển tăng sinh khối và dễ dàng sản sinh nội độc tố hoặc ngoại độc tố làm nguy hại tới sức khỏe người tiêu dùng

Theo Nguyễn Thị Hiền [8] còn cho biết thêm: Vi sinh vật cũng có thể được bảo vệ bởi chính thực phẩm mà nó nhiễm vào để chống lại môi trường axit

ở dạ dày Ví dụ Salmonella bị nhiễm từ socola hay Listeria monocitogenes từ

phomat, bột mịn vẫn có thể sống sót

1.5 Ô nhiễm thịt tươi do vi khuẩn

1.5.1 Ô nhiễm vi khuẩn từ động vật

Mọi cơ thể sống đều mang rất nhiều loài vi khuẩn, nhất là trên da và niêm mạc của các xoang tự nhiên thông với bên ngoài và đường tiêu hóa Những

giống vi khuẩn chủ yếu là: Staphylococcus, Salmonella, E coli, Aerobacter,

Cl perfringens…[10] Những vi khuẩn này theo thải ra ngoài và có khả năng

xâm nhiễm vào thịt qua nhiều con đường khác nhau Phân của người và gia súc

có chứa vô số loài vi khuẩn, do đó chúng dễ dàng phát tán vào môi trường, khu vực giết mổ chế biến nói chung và thịt tươi nói riêng [20]

và các hoạt động sản xuất

Nước bị ô nhiễm càng nặng thì số lượng vi sinh vật càng tăng, ở tầng nước sâu sẽ ít vi sinh vật hơn lớp nước trên bề mặt Nước sinh hoạt ở các thành thị là nước máy được khai thác ở tầng nước ngầm sâu, đã được xử lý bằng hệ thống lắng lọc, khử khuẩn nên số lượng vi sinh vật có ít hơn các loại nước khác

Ðể đánh giá chất lượng nước dưới góc độ ô nhiễm tác nhân sinh học,

người ta thường dùng chỉ số coliforms Ðây là chỉ số phản ánh số lượng trong nước vi khuẩn coliforms, thường không gây bệnh cho người và sinh vật, nhưng

biểu hiện sự ô nhiễm nước bởi các tác nhân sinh học Ðể xác định chỉ số

coliforms người ta nuôi cấy mẫu trong các dung dịch đặc biệt và đếm số lượng

chúng sau một thời gian nhất định Ô nhiễm nước được xác định theo các giá trị tiêu chuẩn môi trường [33]

1.5.3 Ô nhiễm vi khuẩn từ không khí

Không khí chuồng nuôi, sân bãi, nhà xưởng có thể chứa một lượng vi sinh vật lớn Độ ẩm không khí càng cao thì mật độ vi sinh vật càng lớn Đặc biệt môi trường không khí dễ làm phát tán nhanh chóng vi sinh vật nhất Bên ngoài

và bên trong khu vực chuồng nuôi gia súc, gia cầm, lò giết mổ có thể tìm thấy

những vi khuẩn gây bệnh như: Staphylococcus, Salmonella, Streptococcus,

E coli

Ngoài ra, đất chứa một số lượng lớn vi sinh vật có nguồn gốc khác nhau Những vi sinh vật này sẽ gián tiếp làm ô nhiễm thực phẩm Đầu tiên chúng nhiễm vào động vật sinh sống trên bề mặt, từ đó được phát tán vào không khí, nước và cuối cùng nhiễm vào thực phẩm Những gia súc nuôi theo cách chăn thả hoặc nuôi nhốt thì thường xuyên phải khử trùng tiêu độc chuồng trại và bãi chăn thả Trước khi giết mổ gia súc cần được tắm rửa sạch sẽ

1.5.4 Ô nhiễm vi khuẩn trong quá trình giết mổ, chế biến và bảo quản

Thịt động vật khỏe sẽ đảm bảo chất lượng và ít có nguy cơ bị xâm nhiễm của vi snh vật gây ô nhiễm Tuy nhiên quá trình giết mổ do không thực hiện nghiêm ngặt quy trình vệ sinh nên thịt dễ bị ô nhiễm Ngoài ra quá trình sơ chế sản phẩm (thái, lọc da, cạo lông ) thịt cũng dễ bị nhiễm vi khuẩn từ bề mặt của con vật (da, lông, sừng, móng, ống tiêu hóa chứa nhiều vi sinh vật) Mặt khác, khi giết mổ chính dao mổ, vải bọc, chân tay, quần áo bảo hộ lao động của công nhân không hợp vệ sinh cũng góp thêm một nguyên nhân làm ô nhiễm sản phẩm

Trên bề mặt thịt, vi sinh vật sẽ sinh sản, phát triển và lan dần vào bên trong làm hư hỏng thịt Tuy nhiên thời gian gây ôi thiu, hỏng thịt còn phụ thuộc vào phẩm chất và chủng loại thịt, các chủng vi sinh vật và điều kiện môi trường (nhiệt độ, độ ẩm…)

1.6 Các chủng vi khuẩn chủ yếu gây ô nhiễm thịt

1.6.1 Sự ô nhiễm thịt về chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí

Thuật ngữ “vi khuẩn hiếu khí” (VKHK) trong vệ sinh thực phẩm được hiểu là bao gồm cả VKHK và vi khuẩn yếm khí tùy tiện Sự phân chia vi khuẩn thành hai nhóm dựa trên cơ sở nhiệt độ phát triển giữa chúng Theo Avery [32]

hệ vi khuẩn có mặt trong thịt được xác định thành 2 nhóm dựa theo nhiệt độ của chúng:

- Nhóm vi khuẩn ưa nhiệt: Phát triển tốt ở nhiệt độ 37oC và ngừng phát triển ở 1o

vi khuẩn ưa lạnh có thể phát triển ở nhiệt độ từ 0 - 30oC và nhiệt độ tối ưu là 10 -

15oC Tuy nhiên, có một số tác giả khác như Gram [36] lại cho rằng nhiệt độ tối

ưu đối với sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn ưa lạnh là 20o

C và khó phát triển ở nhiệt độ 35 - 37o

C

Hệ VKHK ở thịt thay đổi theo thời gian và điều kiện bảo quản Vi khuẩn

ưa nhiệt có thể nhiễm vào thân thịt ngay sau khi giết mổ Do đó những thực phẩm có nguồn gốc động vật thường được kiểm tra loại vi khuẩn này với nhiệt

độ 35 - 37o

C [39]

Đối với hệ VKHK ở thịt thay đổi theo thời gian và điều kiện bảo quản Vi khuẩn ưa nhiệt có thể nhiễm vào thân thịt ngay lập tức sau khi giết mổ, do đó những thực phẩm có nguồn gốc động vật thường được kiểm tra loại vi khuẩn này với nhiệt độ nuôi cấy là khoảng 350

C-370C Sự phát hiện ra số lượng lớn vi khuẩn này trong thân thịt chứng tỏ rằng vệ sinh trong khâu giết mổ kém Vì thế muốn ước tính được số lượng VKHK có mặt trong thân thịt một cách chính xác

thì khi phân lập và nuôi cấy cần tạo được môi trường nuôi cấy có nhiệt độ thích hợp với nhiệt độ mà sản phẩm được kiểm tra và bảo quản

Xác định tổng số VKHK trong thực phẩm được sử dụng như một nhân tố chỉ điểm về điều kiện vệ sinh, nhiệt độ và thời gian chế biến, vận chuyển và bảo quản thực phẩm Nó được tin cậy là phương pháp tốt nhất để ước lượng vi khuẩn xâm nhập vào thực phẩm

1.6.2 Sự ô nhiễm thịt về chỉ tiêu vi khuẩn E coli

Trực khuẩn ruột già Escherichia coli còn có tên gọi Bacterium coli

commune (vi khuẩn thường trú trong ruột già của động vật máu nóng), được

Escherich phân lập từ phân trẻ em năm 1885 [34]

Từ ruột già, vi khuẩn E coli thường xuyên được bài xuất ra ngoài môi trường Do vậy, chỉ số E coli trong nước là một tiêu chuẩn để đánh giá mức độ ô

nhiễm về mặt vi sinh của nguồn nước đó

E coli là nguyên nhân gây ra một số bệnh ở người và động vật

1.6.2.1 Hình thái và tính chất bắt màu

E coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, di động được do có lông, vi khuẩn

không sinh nha bào, có thể có giáp mô Đường kính ngang tế bào dưới 1m, chiều dài thay đổi, kích thước trung bình từ 0,3-0,6 x 2-3m [12]

Vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu Nhuộm vi khuẩn từ khuẩn lạc nhày có thể thấy giáp mô, khi soi tươi không nhìn thấy được

1.6.2.2 Tính chất nuôi cấy

E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, có

thể sinh trưởng phát triển được từ 5-45o

C, pH từ 5,5-8, thích hợp ở 37oC, pH

=7,2-7,4 [4] và [5]

- Môi trường nước thịt: Phát triển tốt, môi trường đục, cặn màu tro lắng

xuống đáy, có mùi Indole (mùi phân thối) do phản ứng Indole dương tính

- Trên môi trường thạch thường: Vi khuẩn phát triển, sau 24h tạo thành

những khuẩn lạc dạng S, hơi vồng, tròn trơn nhẵn, đường kính 2-3mm màu xám nhạt Nuôi lâu khuẩn lạc trở thành màu tro nhạt, mọc rộng ra, có thể quan sát

thấy cả khuẩn lạc dạng R (nhám, xù xì), và khuẩn lạc dạng M (nhầy)

- Môi trường thạch MacConkey: Hình thành khuẩn lạc dạng S, màu đỏ

cánh sen (do lên men đường lactoza sản sinh axit), xung quanh có vùng mờ

sương (do lên men đường lactoza, sinh hơi)

- Môi trường thạch Brilliant green: Khuẩn lạc dạng S màu vàng chanh

- Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc dạng S hoặc M (nhầy), có thể dung

huyết hoặc không

- Môi trường thạch Deoxycholate citrate: Vi khuẩn E coli không mọc do

không sử dụng được nguồn cabon tỷ lệ citrate

- Môi trường thạch Triple Sugar Iron (TSI): Vi khuẩn phát triển nhưng

không sản sinh H2S (không làm đen môi trường)

E coli lên men đường lactoza, maltoza, mannit, mannoza, sorbitol,

xyloza, saccaroza (26-70%) Hầu hết E coli đều lên men sinh hơi đường lactoza

- H2S (-), Indole (+), VP (-), MR (+), Ureaza (-), Citrate (-)

- Sữa tươi: Đông tụ sau 24h/37oC

1.6.2.3 Sức đề kháng

Như các vi khuẩn không sinh nha bào khác, E coli không chịu được nhiệt

độ Đun 55o

C/1h, 60oC/30 phút, đun sôi 100oC chết ngay

Các chất sát trùng thông thường axit phenic, formol 0,3% diệt vi khuẩn sau 5 phút Ở ngoài môi trường vi khuẩn có thể tồn tại đến 4 tháng

1.6.2.4 Tính gây bệnh

E coli có sẵn trong ruột của động vật, bệnh xảy ra do nhiễm trùng kế phát

dưới ảnh hưởng của nhiều yếu tố: Dinh dưỡng, sự thiếu hụt kháng thể sữa đầu, khí hậu thời tiết, nhiệt độ, ẩm độ, trạng thái stress, loạn khuẩn đường ruột, sự có

mặt của chủng E coli độc…

E coli có thể gây bệnh cho gia súc non (lợn, bê, dê, cừu, chó) dưới 1 tuần

tuổi, gây bệnh cho gia cầm (gà) ở mọi lứa tuổi

Thể bệnh do E coli gây ra ở gia súc, gia cầm mỗi lứa tuổi khác nhau

cũng sẽ khác nhau, cả về các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn, mức độ trầm trọng, đặc điểm triệu chứng lâm sàng Chẳng hạn: Gây bệnh cho lợn dưới 1 tuần tuổi, ở

3 thể; thể bệnh tiêu chảy từ chết 90-100%; thể nhiễm trùng máu; thể viêm màng não, kháng nguyên bám dính F4, F5, F6, F18 Gây bệnh sau cai sữa, thể bệnh phù đầu, triệu chứng thần kính, chết đột ngột, kháng nguyên O139, O141, yếu tố bám dính F107

Vi khuẩn E coli gây bệnh ở người như tiêu chảy, NĐTP do ăn phải thịt

nhiễm khuẩn, sản sinh độc tố gây bệnh Các triệu chứng điển hình và thể bệnh

do E coli gây ra là viêm dạ dày ruột, viêm đường tiết niệu sinh dục, viêm màng não, nhiễm trùng huyết, nhiễm độc huyết… Có 5 chủng E coli gây bệnh

E coli (EAEC) Chỉ tìm thấy ở người

Vi khuẩn E coli có khả năng sản sinh hai loại độc tố: Độc tố chịu nhiệt

(Heat Stable Toxin - ST) và độc tố không chịu nhiệt (Heat Labile Toxin - LT)

Những chủng E coli sản sinh độc tố là nguyên nhân gây nên bệnh tiêu chảy ở

người Trong đó, độc tố chịu nhiệt ST (ST) chịu được 1200

C trong vòng 1h và bền vững khi ở nhiệt độ thấp (bảo quản ở 200C) nhưng bị phá hủy nhanh chóng

khi hấp cao áp Còn độc tố không chịu nhiệt (LT) bị vô hoạt ở 600

C trong vòng 15phút

Những Serotype của E coli có khả năng gây ngộ độc thức ăn như: O26,

O56, O86, O111, O119, O125, O126, O127, O157H7 [29]

E coli được coi như là nhân tố chỉ điểm trong VSATTP Mặc dầu E coli

có xuất hiện trên thực phẩm đặc biệt là thịt tươi sống nhưng lại không liên quan trực tiếp đến sự xuất hiện của vi khuẩn gây bệnh, tuy nhiên thực phẩm đã bị

nhiễm E coli với số lượng lớn chứng tỏ mối nguy hiểm về khả năng chứa các

loại vi khuẩn gây bệnh Do đó với các loại thực phẩm tươi sống nhất là các sản

phẩm có nguồn gốc động vật, việc xác định tổng số E coli là việc rất quan trọng

bắt buộc Đây là một trong những tiêu chuẩn cần thiết để đánh giá tình trạng VSATTP

1.6.3 Vai trò của vi khuẩn Salmonella gây ô nhiễm thịt

Salmonella được phát hiện lần đầu tiên năm 1885 bởi Salmon và Smith là Salmonella choleraesuis Năm 1934 chính thức được đặt tên Salmonella [50]

Đến nay đã phát hiện hơn 2000 serotype Salmonella khác nhau, có khả

năng gây bệnh, gây ô nhiễm thực phẩm cho cả người và động vật

Gây bệnh ở người: Salmonella typhi (gây bệnh thương hàn), Salmonella

paratyphi và Salmonella schottmuelleri (gây bệnh phó thương hàn) Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium gây NĐTP

1.6.3.1 Hình thái và tính chất bắt màu

Trực khuẩn Salmonella có dạng hình gậy ngắn, kích thước

0,4-0,6x1-3m, không có giáp mô, không sản sinh nha bào, di động được do có lông, từ

7-12 lông (trừ Salmonella pullorum và Salmonella gallinarum là không có lông),

vi khuẩn bắt màu Gram âm [57]

1.6.3.2 Tính chất nuôi cấy

Salmonella sống hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện, dễ mọc trên các môi

trường nuôi cấy thông thường Nhiệt độ thích hợp 37oC (sống được từ 7-45o

C),

pH = 7,2-7,4 (tồn tại được ở pH = 5,0)

- Môi trường nước thịt: Sau 24h/37oC, vi khuẩn phát triển làm đục đều

môi trường, trên mặt tạo màng mỏng, đáy lắng cặn

- Môi trường thạch thường: Hình thành những khuẩn lạc dạng S, trơn,

tròn sáng, bóng, màu trắng đục

- Môi trường thạch nghiêng Triple Sugar Iron agar (TSI agar): Sinh H2S

ở phần thạch nghiêng

- Môi trường Xylose, Lysine Deoxycholate agar (XLD agar): Vi khuẩn

phát triển tạo thành khuẩn lạc dạng S, màu đỏ, giữa có chấm đen (do sản sinh

H2S)

- Môi trường MacConkey agar: Khuẩn lạc dạng S, màu trắng

- Môi trường Brilliant green agar:Khuẩn lạc dạng S, màu đỏ

- Chuyển hoá đường: Mỗi loài Salmonella có khả năng lên men một số

loại đường và không đổi Salmonella lên men sinh hơi sản sinh axit đường glucoza, mannoza, sorbitol, mannit Tất cả các loài Salmonella đều không lên men đường lactoza và saccaroza

- Phản ứng đỏ metyl MR (+), H2S (+), Indole (-),Citrate (+), ure (-)

1.6.3.3 Sức đề kháng

Salmonella tồn tại trong đường tiêu hoá của cả động vật máu nóng và máu

lạnh (các loài cá, động vật thủy sản), trong môi trường tự nhiên, phân, đất, nước thải, đặc biệt trong thực phẩm có nguồn gốc động vật như bột thịt xương, bột

trứng, bột cá… tồn tại được 9 tháng hoặc lâu hơn Salmonella sống trong thịt

ướp muối 29% được 4-8 tháng ở nhiệt độ 6-12o

C

- Với nhiệt độ, vi khuẩn có sức đề kháng yếu, 50oC bị diệt sau 1h, 70o

C trong 20 phút, sôi 100oC sau 5 phút, khử trùng bằng phương pháp Pasteur cũng diệt được vi khuẩn

- Ánh sáng mặt trời diệt khuẩn trong môi trường nước, sau 5h ở nước trong và 9h ở nước đục

- Các chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn dễ dàng: Axit phenic 5%,

formol 0,5% diệt khuẩn sau 15-20 phút

1.6.3.4 Tính gây bệnh

Salmonella gây bệnh cho người và vật nuôi (gia súc, gia cầm và loài

chim) Bình thường vi khuẩn có thể được phát hiện trong đường ruột của người

và gia súc khoẻ mạnh (lợn nái…) Khi sức đề kháng của vật chủ giảm sút sẽ tạo

điều kiện thuận lợi cho Salmonella tác động gây bệnh

Ngoài khả năng gây bệnh, Salmonella còn là tác nhân gây NĐTP cho cả

người và động vật bằng nội, ngoại độc tố do vi khuẩn sản sinh trong khi sinh

trưởng, phát triển

1.6.4 Vai trò của vi khuẩn Bacillus cereus gây ô nhiễm thịt

Bacillus cereus đó được công nhận như một tác nhân NĐTP từ năm 1955.

B cereus là loài vi khuẩn hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả năng sinh nha

bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955

Từ những năm 1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm do

B cereus được phát hiện và chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm

B cereus phân biệt với các loài khác trong Bacillus nhóm 1 như

B anthracis gây bệnh than cho người, B thuringiensis tạo độc tố kết tinh gây

bệnh cho côn trùng, B mycoides, B megaterium dựa vào các đặc tính sinh hóa

1.6.4.1 Hình thái và tính chất bắt màu

B cereus là trực khuẩn, Gram dương, nha bào không làm biến dạng hình

thái vi khuẩn (nội bào tử) Kích thước 0,5-1,5 x 2-4 µm Vi khuẩn không tạo

giáp mô, không có khả năng di động

1.6.4.2 Tính chất nuôi cấy

Là loại vi khuẩn dễ mọc hiếu khí và kị khí tùy tiện Nhiệt độ 50

C- 500C, tối ưu 350

C - 400C pH= 4,5-9,3, thích hợp nhất pH=7-7,2

- Trên môi trường thạch thường: Sau 24 h tạo khuẩn lạc dạng R, nhăn

nheo, xù xì

- Trên môi trường thạch máu tạo dung huyết rộng

- Trên môi trường thạch Mannitol Egg Yolk Polymixin: Khuẩn lạc dạng R chung quanh có vùng sáng

- Trên môi trường thạch Mossel: Khuẩn lạc dạng R chung quanh có vùng sáng

- Trên môi trường canh nước thịt dinh dưỡng Nuitrient Broth (NB): Đục tạo váng, sau cặn lợn cợn

Bào tử của B cereus có khả năng bám vào các tế bào Caco-2 (trên các tế

bào biểu mô của người) Sau khi bám vào, các bào tử này nảy mầm một cách

nhanh chóng (trong vòng 1h), hình thành tế bào B cereus sinh dưỡng trên đỉnh

của các tế bào biểu mô, tiếp đó là sản sinh ra độc tố, nếu độc tố này xuất hiện trong đường ruột, độc tố đường ruột sẽ tập trung khoanh vùng ở vùng ngoại biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn trong lumen và vì vậy gây nên mối nguy lớn hơn và gây bệnh một cách trầm trọng

B cereus type 1 bền với nhiệt 450C/30phút; type 2 bền với nhiệt

1200C/90phút Trong đó, type 1 chịu được pH = 4-11; type 2 pH = 2-11 Cả 2 loại này đều nhạy cảm với enzyme protease và trypsin

1.6.4.4 Tính gây bệnh

Vi khuẩn B cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức

ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây NĐTP

Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố:

- Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin Vi khuẩn sản sinh độc

tố trên thịt , rau quả, gia vị Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng

- Độc tố gây nôn mửa (Type 2): Emetic toxin Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày

Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh

có thể gây chết người Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đó góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn

Triệu chứng trúng độc: Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây độc Biểu hiện đau bụng, buồn nôn và nôn sau 1-5h ăn phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn Triệu chứng này có thể kéo dài 24 h Trường hợp nhiễm type 1 có triệu chứng đau bụng tiêu chảy nhưng không sốt Bắt đầu sau 4-16h sau khi ăn thực phẩm nhiễm khuẩn và kéo dài 12-24h

1.6.5 Vai trò của vi khuẩn Staphylococcus aureus gây ô nhiễm thịt

Tụ cầu khuẩn là những vi khuẩn hình cầu, tụ lại tỷ lệng đám giống như

chùm nho Hội nghị Quốc tế về phân loại Micrococcus (Warsaw, 1975) thì giống bao gồm 3 loài (species): Staphylococcus aureus (Staph aureus),

Staphylococcus epidermidis (Staph epidermidis) và Staphylococcus saprophyticus (Staph saprophyticus)

- Staph aureus là loài gây bệnh hay gặp, chủ yếu cho người và vật nuôi Khoảng 30% người khoẻ mang Staph aureus trên da và niêm mạc, tỷ lệ này ở

gia súc chăn nuôi công nghiệp còn lớn hơn nhiều Do vậy, khi có tổn thương ở

da và niêm mạc hoặc những rối loạn về chức năng thì nhiễm trùng kế phát do

Staph aureus dễ dàng xuất hiện

Staph aureus cũng gây nên các nhiễm trùng ở gia súc, nhất là trong các

cơ sở chăn nuôi tập trung có mật độ đàn lớn gây nhiều thiệt hại về kính tế chăn

nuôi (thí dụ bệnh viêm vú bò sữa do Staph aureus)

Nhiễm trùng do Staph aureus có thể gây nên nhiều biểu hiện khác nhau,

như các nhiễm trùng da, tổ chức dưới da hoặc trong các cơ quan nội tạng, gây

mưng mủ, một số trường hợp chuyển sang nhiễm trùng huyết, bại huyết (do

nhiễm độc huyết) Staph aureus còn hình thành độc tố trong thực phẩm, gây

nên chứng NĐTP và viêm ruột cấp tính

- Staph epidermidis cư trú chủ yếu trên da và niêm mạc của người, có

khả năng gây nhiễm trùng khi cơ thể người và động vật suy yếu, giảm sức đề

kháng

- Staph saprophyticus được phân lập ở hầu hết trong các nhiễm trùng

đường tiết niệu (có vai trò trong các nhiễm trùng đường tiết niệu)

Việc phân biệt giữa Staph aureus với Staph epidermidis và

Staph saprophyticus có thể dựa vào phản ứng coagulaza (phản ứng đông huyết

tương người và thỏ) và phản ứng lên men đường mannit Staph aureus có khả

năng lên men đường mannit và gây đông vón huyết tương (phản ứng dương tính)

còn Staph epidermidis và Staph saprophyticus thì không có khả năng này

(phản ứng âm tính)

1.6.5.1 Hình thái và tính chất bắt màu

Tế bào tụ cầu khuẩn Staph aureus hình tròn, đường kính 0,5-1m, không

di động, không sinh nha bào, không có vỏ capsule (giáp mô), không có lông, bắt

màu Gram dương [37] Trong bệnh phẩm tụ cầu thường tụ tập thành đám nhỏ

như những chùm nho Trong môi trường canh khuẩn xếp thành những đám lớn

1.6.5.2 Tính chất nuôi cấy

Tụ cầu Staph aureus sống hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện, dễ mọc trên các

môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ = 30-37o

C, pH từ 7,2-7,6 [28]

- Môi trường nước thịt: Sau 5-6h nuôi cấy ở điều kiện 37oC vi khuẩn phát

triển làm đục môi trường, sau 24h độ đục tăng, lắng cặn nhiều, không tạo màng

trên mặt môi trường

- Môi trường thạch thường: Sau 24h nuôi cấy ở điều kiện 37oC, vi khuẩn

hình thành những khuẩn lạc dạng S, màu trắng, vàng thẫm hoặc vàng chanh

- Môi trường thạch máu: Vi khuẩn mọc tốt, sau 24h/37oC hình thành

những khuẩn lạc dạng S, màu trắng, có thể gây dung huyết

- Môi trường thạch Chapman Stone: Chapman Stone agar là môi trường

chọn lọc để phân lập vi khuẩn tụ cầu Sau 24h/30oC, tụ cầu khuẩn Staph aureus

lên men đường mannit (mannitol) làm giảm pH môi trường (từ pH= 7,2 giảm

xuống pH =6,8), tạo thành những khuẩn lạc dạng S, màu vàng

- Chuyển hoá đường: Tụ cầu khuẩn có khả năng lên men đường glucoza,

lactoza, levuloza, mannoza, mannit, saccaroza, không lên men đường galactoza

- Phản ứng Catalase: dương tính

1.6.5.3 Sức đề kháng

Tụ cầu Staph aureus có sức đề kháng kém với nhiệt độ và hoá chất; ở

điều kiện thường, nhiệt độ 70oC chết trong 1h; 80oC chết trong 10-30 phút;

100oC chết trong vài phút

Axit phenic 3-5%, diệt vi khuẩn trong vài phút; formol 1% diệt vi khuẩn trong 1h Nơi khô, lạnh vi khuẩn có sức đề kháng tốt Trong điều kiện thường, vi khuẩn sống được trên 200 ngày

Ngoại độc tố do tụ cầu sản sinh có sức đề kháng mạnh với nhiệt độ

1.6.5.4 Tính gây bệnh

Tụ cầu Staph aureus thường ký sinh trên da, niêm mạc của người và gia

súc Khi sức đề kháng giảm sút, tổ chức bị tổn thương vi khuẩn sẽ xâm nhập và

gây bệnh Vi khuẩn Staph aureus có thể gây ra những ổ mủ ở ngoài da và niêm

mạc Một số trường hợp xâm nhập vào máu gây nhiễm khuẩn huyết, huyết nhiễm mủ

Ngoài coagulase và yếu tố kết cụm, tụ cầu còn sản xuất một số enzim quan trọng góp phần tạo nên độc lực mạnh mẽ của chủng vi khuẩn này

- Hyaluronidase: Enzim này có khả năng phá hủy chất cơ bản của tổ chức,

giúp vi khuẩn có thể phát tán trong tổ chức

- Hemolysine và leukocidine: phá hủy hồng cầu (tan máu) và gây chết các

tế bào hạt cũng như đại thực bào

- Exfoliatine: là các enzim phá hủy lớp thượng bì Men này gây tổn

thương da tạo các bọng nước Ví dụ điển hình là hội chứng Lyell do tụ cầu

- Năm độc tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E) bền với nhiệt Các độc tố

ruột này đóng vai trò quan trọng trong NĐTP

- Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc: là nguyên nhân gây nên hội chứng

sốc nhiễm độc, một hội chứng sốc trầm trọng

Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được enzim penicillinase

(beta-lactamase) Enzim này phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh

này mất tác dụng

Ngộ độc thực phẩm là bệnh điển hình nhất do độc tố ruột bền với nhiệt của tụ cầu Sau khi ăn các thức ăn nguội hoặc kể cả các thức ăn nhiễm tụ cầu đã

được nấu chín Có thể phân thành hai thể:

- Viêm dạ dày ruột: Nguyên nhân do ăn phải các thức ăn nhiễm độc tố tụ

cầu Bệnh thường xảy ra trong thời gian ngắn với triệu chứng nôn mửa dữ dội,

tiêu chảy phân tóe nước, không sốt Bệnh thường lành nhanh chóng và không

cần điều trị kháng sinh

- Viêm ruột non - đại tràng: Nguyên nhân do thức ăn nhiễm một lượng

lớn vi khuẩn tụ cầu (>105 vi khuẩn/g thức ăn) hoặc do vi khuẩn tăng sinh trong

lòng ruột (có đến 2-30% số người mang vi khuẩn này trong ruột) Triệu chứng

bệnh lý ở đường tiêu hóa như đau bụng, nôn mửa, tiêu chảy kéo dài hơn và cần

phải điều trị kháng sinh

1.6.6 Vai trò của vi khuẩn Clostridium perfringens gây ô nhiễm thịt

Clostridium perfringens là vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm Ở Anh và Mỹ

Cl perfringens chúng được coi là một trong ba vi khuẩn có hại nguy hiểm nhất

Vi khuẩn này chủ yếu gây bệnh thông qua con đường tiêu hóa gây tiêu chảy

thậm chí có thể gây tử vong ở người Cl perfringens dễ dàng bám dính và xâm

nhập vào thực phẩm, chúng thích ứng nhanh và sản sinh độc tố mạnh có khả

năng kháng kháng thể của người nên khả năng gây bệnh càng nguy hiểm

1.6.6.1 Hình thái và tính chất bắt màu

Clostridium perfringens là trực khuẩn yếm khí, hình gậy hai đầu tròn,

Gram dương, kích thước 0,6-0,8 x 2-4 µm, không di động do không có lông Ít khi tạo nha bào, nếu có thì nha bào hình oval, dùi trống hay vợt Nha bào lớn hơn thân nên làm biến dạng vi khuẩn Vi khuẩn thường sinh sản giáp mô trong

cơ thể vật chủ [41]

1.6.6.2 Tính chất nuôi cấy

Cl perfringens là yếm khí triệt để, nhiệt độ thích hợp 370C, pH= 7,2-7,4

- Môi trường nước gan yếm khí: Vi khuẩn Cl perfringens phát triển làm

đục môi trường, sinh hơi mạnh

- Môi trường thạch máu: Cl perfringens tạo khuẩn lạc dạng S, trơn, sáng

bong, màu xám nhạt, kích thước 2-3cm, thường gây dung huyết đôi kiểu “bia bắn hai vòng” rất đặc trưng: vòng trong dung huyết hoàn toàn bởi độc tố theta (θ-toxygengenn); vòng ngoài dung huyết không hoàn toàn bởi alpha (α-

toxygengenn)

- Môi trường litmus milk: Dịch bệnh phẩm (nếu kiểm tra Cl perfringens

nguồn nước phải xử lý 800

C/10-15 phút để kiểm tra tạp khuẩn) nuôi cấy trong 5 ngày liên tục ở 370C, 24h kiểm tra 1 lần Kết quả dương tính: Sinh hơi mạnh, sản sinh axit lactic do lên men đường glucoza, lactoza gây đông tụ casein sữa, môi

trường chuyển tỷ lệ màu xanh (màu của chỉ thị litmus) sang màu hồng

- Đặc tính sinh hóa: Chuyển hóa đường: Cl perfringens lên men axit

đường glucoza, lactoza, saccaroza, maltoza

Các phản ứng khác: Có lecithinaza (photpholipaza- enzyme phá hủy màng

tế bào có cấu tạo bởi photpholipt như màng hồng cầu), Indole âm tính, không di

động, đông tụ casein sữa, làm mất màu chất chỉ thị litmus khi phát triển trong môi trường litmus milk

1.6.6.3 Sức đề kháng

Vi khuẩn Cl perfringens có sức đề kháng yếu với nhiệt độ, nước đun sôi

1000C/5 phút sẽ diệt được vi khuẩn này nhưng nha bào có sức kháng nhiệt tốt Khi đun sôi 1000

C trong 1-2h hoặc hấp ướt 1210C/1atm/15 phút mới vô hoạt được nha bào Một số chất sát trùng như formol 3% sau 24h vô hoạt nha bào vi

khuẩn Cl perfringens; axit phenic 15% mất 5h; ánh sáng mặt trời chiếu trực xạ 1

tháng mới vô hoạt được nha bào Nếu phơi khô nha bào trên gỗ, sau 11 năm nha

bào vẫn sống; nếu ở trong bóng tối nha bào Cl perfringens có thể tồn tại được

10 năm

1.6.6.4 Tính gây bệnh

Cl perfringens sản sinh ngoại độc tố dung huyết, gây chết, hoại tử tổ

chức, viêm ruột, gây độc thần kinh Bao gồm các độc tố chủ yếu (alpha, beta, epsilon, iota) và độc tố thứ yếu (theta-haemolysin, kappa-collagenaza, mv-hyluronidaza, nv-ADNaza)

- Độc tố alpha (α-toxygengenn) được sản sinh ra bởi tất cả các type

Cl perfringens, độc tố enzyme bản chất lecithinaza nên phá hủy (các tế bào có

bản chất lecithin-photpholipit) hồng cầu, các tổ chức phần mềm, tạo vòng dung huyết không hoàn toàn trên môi trường thạch máu

- Độc tố beta (β-toxygengenn) được sinh ra bởi Cl perfringens type B, C

độc tố gây chết và hoại tử, mẫn cảm với trypsin (proteaza) Gia súc non mẫn cảm mạnh hơn gia súc trưởng thành do sữa đầu đã vô hoạt trypsin của dịch tụy dẫn đến không vô hiệu được độc tố beta sản sinh trong đường ruột

- Độc tố epsilon (ε-toxygengenn) được sản sinh bởi Cl perfringens type

B, D, độc tố có tác dụng gây đầu độc hệ thần kinh, gây phù não (độc tố thần kinh); gây viêm ruột (độc tố đường ruột) Khi được tiết ra, ngoại đốc tố có dạng tiền độc tố (protogengenn), được hoạt hóa ở ruột non nhờ trypsin Do vậy, gia

súc trưởng thành thường mẫn cảm mạnh hơn so với gia súc non Nguyên nhân là

sữa đầu khi gia súc non bú chứa anti-trypsin đã vô hoạt trypsin của dich tụy dẫn

đến không còn trypsin để hoạt hóa protogengenn trở thành epsilon-toxygengenn

- Độc tố iota (ι-toxygengenn) được sản sinh dưới dạng tiền độc tố bởi

Clostridium perfringens type E, cũng có thể Clostridium difficile hoặc

Clostridium spiroforme

Phân loại nhóm vi khuẩn gây bệnh theo tính chất sinh học

(Nguồn: Quinn P.J et al, 1994) [50])

Vi khuẩn trên môi trường thạch máu

Hình gậy Hình cầu Macconkey agar (+) Macconkey agar (-)

(phát triển) (không phát triển)

Dài Ngắn Catalase(+) Catalase(-) Oxydase(+) Oxydase(-) Oxydase(+) Oxydase(-)

S Streptococcus Proteus

Loại khác

Bacillus

(Clostridium)

1.7 Tình hình nghiên cứu sự ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm ở trong nước và trên thế giới

1.7.1.Tình hình nghiên cứu sự ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm ở Việt Nam

Tại Việt Nam, việc đảm bảo VSATTP là vấn đề gặp rất nhiều khó khăn Đặc biệt là tình trạng các loại thịt tươi, thịt đã được chế biến sẵn bán tại các chợ rất phổ biến, trong đó điều kiện vệ sinh chợ, vệ sinh dụng cụ chế biến và người trực tiếp chế biến thực phẩm chưa đảm bảo

Quá trình chăn nuôi đến sản xuất, chế biến, lưu thông và tiêu dùng nhiều mặt hàng thực phẩm của Việt Nam được các chuyên gia WHO khẳng định là chưa an toàn và chưa sạch

Đã có một số công trình của các tác giả trong nước về vấn đề này: Đặng Thị Hạnh [6] đã nghiên cứu tình hình nhiễm khuẩn trên thịt heo của một số chợ

của Thành Phố Hồ Chí Minh Lê Minh Sơn [23], [24] nghiên cứu phân lập xác định một số độc tố và độc lực vi khuẩn Staph aureus trong thịt lợn và nghiên

cứu một số vi khuẩn gây ô nhiễm thịt lợn vùng hữu ngạn sông Hồng Trần Thị

Hạnh [7] nghiên cứu tình trạng ô nhiễm E coli và Salmonella trong thực phẩm

có nguồn gốc động vật trên địa bàn Thành Phố Hà Nội và kết quả phân lập vi khuẩn.Tô Liên Thu [27] đã nghiên cứu tình trạng ô nhiễm một số vi khuẩn vào thịt sau giết mổ của Hà Nội và một số phương pháp làm giảm sự nhiễm khuẩn

trên thịt Võ Thị Trà An [1] nghiên cứu tình hình nhiễm Salmonella trong phân

và thân thịt (bò, heo, gà) tại một số chợ tỉnh phía Nam

1.7.2 Nghiên cứu sự ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm trên thế giới

Trên thế giới, trong lĩnh vực vệ sinh an toàn thực phẩm, sự ô nhiễm của vi sinh vật trên thực phẩm được rất nhiều nhà khoa học quan tâm tới Hauge [38]

nghiên cứu Bacillus cereus như là thủ phạm gây NĐTP Herbert E.Hall [41] nghiên cứu Clostridium perfringens trong thịt và sản phẩm thịt Kim, H U., và J

M Geopfert [44] nghiên cứu sự ô nhiễm Bacillus cereus trong thực phẩm khô

chọn lọc Ingram và Simonsens [42] đã nghiên cứu hệ vi sinh vật ô nhiễm vào

thực phẩm Reid C.M [52] đã tìm ra phương pháp phát hiện nhanh Salmonella

trên thịt và sản phẩm của thịt Varhagen, Cook và Avery [55] so sánh các

phương pháp phân lập và giám định sinh hoá của Clostridium perfringens

Grant, I.R C.R Mixon và M.F Patterson [37] nghiên cứu hiệu quả thấp trong

việc sinh sản độc tố bởi Staphylococcus aureus và Bacillus cereus trong thịt bò

nướng và nước thịt bò nướng Mpamugo, Donovan và Brett (1995) phân lập

Salmonella typhimurium trong ngộ độc ở thịt bò nhiễm khuẩn Mervat A.M

Abostate [45] nghiên cứu hệ gene và tác động phóng xạ tới việc sản sinh độc tố

bởi Bacillus cereus Stanley, Wallae và Jore [53] nghiên cứu sự liên quan của

Campylobacter và hệ vi sinh vật trong thịt bò Nortje [49] nghiên cứu sự ô nhiễm Bacillus cereus và Yersinia enterocolitica trên thịt bán lẻ ở Nam Phi. Mervat

A.M Abostate [46] nghiên cứu tỷ lệ nhiễm Bacillus cereus trong thịt và ảnh hưởng của tia bức xạ gamma tới độc tố của Bacillus cereus Husein HS [40] nghiên cứu độc tính gây bệnh và sự chiếm ưu thế của độc tố Shiga của E coli tới

bò và các sản phẩm có nguồn bò F Nili, SM Saleh Tabib, E Amini, F Nayeri, M Aligholi và M Emaneini [35] nghiên cứu tần số nhiễm vi khuẩn yếm khí trong việc phát hiện sớm sự nhiễm trùng

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Các mẫu thịt lợn tươi lấy tại các chợ trung tâm trên địa bàn TP Thái Nguyên

- Môi trường thông thường và đặc hiệu để nuôi cấy, phân lập và giám định

tổng số VKHK, E coli, Salmonella, B cereus, Staph aureus, Cl perfringens

Môi trường được sử dụng là những môi trường chế biến sẵn ở dạng tổng hợp, khi dùng pha theo công thức hướng dẫn

+ Môi trường Plate Count Agar: Dùng để đếm tổng số VKHK

+ Môi trường thạch Macconkey: Dùng để phân lập vi khuẩn E coli

+ Môi trường thạch máu: Dùng để phân lập và thử khả năng dung huyết

của vi khuẩn E coli, B cereus, Staph aureus, Cl perfringens

+ Môi trường TSI (Triple Sugar Iron Agar): Dùng để kiểm tra khả năng lên men đường glucose, lactose, saccarose, sinh hơi, sinh H2S của vi khuẩn E

coli, huyết tương thỏ để thử phản ứng coagulase của vi khuẩn Staph aureus

+ Môi trường nước gan (Liver - Liver Broth) để phân lập vi khuẩn

Cl perfringens

+ Môi trường Nutrient Broth, thuốc thử kovac’s: Dùng để kiểm tra đặc

tính sinh Indole của vi khuẩn E coli

+ Nước muối sinh lý 0,9‰: Dùng để pha loãng mẫu

- Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: tủ lạnh, nồi hấp ướt, tủ ấm, buồng cấy

vô trùng, pipetman, ống durham, bình tam giác các loại, đĩa petri, cân, que cấy, bông cồn, giá đựng, ống nghiệm đựng mẫu, túi nilon, cối, chày sứ và các dụng

cụ thí nghiệm khác

- Khoanh giấy kháng sinh

- Chuột bạch khỏe khối lượng từ 18 – 20 g/con

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: từ tháng 5/2009- 8/2010

- Địa điểm:

+ Bộ môn Công nghệ vi sinh Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên

+ Một số chợ trung tâm trên địa bàn thành phố Thái Nguyên

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện đề tài này, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu thường quy trong phòng xét nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn Quốc tế (ISO)

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm

Lấy mẫu thịt lợn tươi theo TCVN 4833-1:2002, TCVN 4833-2:2002, ISO 3100-1:1991 [15]

- Thu thập mẫu thịt theo phương pháp ngẫu nhiên từ các quầy bán thịt ở các chợ trong Thành phố Thái Nguyên

- Với mẫu thịt: Lau dao bằng cồn 700, sau đó dùng dao cắt lấy 200gram thịt/mẫu; cho mẫu vào túi nilon vô trùng và ghi nhãn có các thông tin cần thiết

100-2.3.2 Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong thịt lơn tươi

Xác định chỉ tiêu tổng số VKHK trong thịt tươi áp dụng theo TCVN 5667:1992 [16]

* Nguyên tắc

Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy láng, đếm vi khuẩn trên môi trường Plate Count Agar (PCA) có pH = 7,0 ± 0,2; ủ hiếu khí ở 370C trong thời gian 24h Số lượng vi khuẩn hiếu khí có trong 1gram mẫu theo số khuẩn lạc đếm được từ đĩa thạch nuôi cấy theo các nồng độ khác nhau

* Môi trường và hóa chất

- Môi trường sử dụng là Plate Count Agar có pH = 7,0 ± 0,2 Môi trường được pha chế theo tỷ lệ 225gram trong 1000ml nước cất Cho môi trường vào trong bình thủy tinh vô trùng, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút Sau đó để môi trường nguội ở 450C, đổ ra các đĩa petri trong buồng nuôi cấy vô trùng bên cạnh ngọn lửa đèn cồn

- Dung dịch muối sinh lý 0,9 ‰: Dùng để pha loãng mẫu Dung dịch này được chứa trong các bình có thể tích 500ml hoặc 1000ml, hấp khử trùng và được phân phối thành các thể tích chính xác 9ml vào các ống nghiệm vô trùng

* Cách tiến hành

- Chuẩn bị trước khi nuôi cấy: Trước khi tiến hành phân tích thực hiện đồng nhất các bước như sau: Lấy thịt lợn ngẫu nhiên ở các vị trí khác nhau, cho vào cối sứ vô trùng nghiền nhỏ Cân chính xác trong điều kiện vô trùng 10gram mẫu rồi cho vào bình tam giác đã chứa sẵn 90ml dung dịch muối sinh lý 0,9 ‰

đã được hấp khử trùng Lắc đều trong một thời gian nhất định đảm bảo cho mẫu thịt tan hoàn toàn trong dung dịch muối sinh lý

Đối với mẫu dạng lỏng, hút 10ml dịch cho vào bình tam giác chứa sẵn 90ml nước muối sinh lý 0,9‰ Sau khi đồng nhất mẫu, dung dịch thu được có độ pha loãng 10-1 so với ban đầu

Dung dịch đồng nhất tiếp tục được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman với đầu hút vô trùng chuyển 1ml dung dịch mẫu ở bình tam giác đậm độ 10-1

sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước muối sinh lý 9‰; ta thu được dung dịch có độ pha loãng 10-2 Sau đó sử dụng pipetman có đầu hút vô trùng khác hút 1ml dung dịch mẫu ở ống nghiệm có đậm độ pha loãng 10-2chuyển sang ống nghiệm có chứa sẵn 9ml nước muối sinh lý 9‰; ta thu được dung dịch có độ pha loãng 10-3 Thao tác tương tự như vậy để có được các dung dịch mẫu có nồng độ pha loãng 10-3

, 10-4… cho đến khi có được dung dịch mẫu

có độ pha loãng cần thiết