nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên her2 trong escherichia coli

HER2 thụ thể nhân tố phát triển biểu mô người 2 - human epidermal growth factor receptor 2 là 1 gen khác được tìm thấy trên bề mặt của các tế bào giữ vai trò then chốt trong điều hòa sự

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ THỊ MINH PHÚC

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN HER2

TRONG ESCHERICHIA COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2010

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS LÊ QUANG HUẤN

Hà Nội - 2010

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS TS

Lê Quang Huấn người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình ngay từ những bước đi đầu tiên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, dạy bảo tận tình của các cô chú, anh chị và các bạn đồng nghiệp trong phòng Công nghệ tế bào động vật – Viện Công nghệ Sinh học

Nhân dịp này tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo Trường Đại học Thái Nguyên; Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật và Viện Công nghệ Sinh học đã dạy bảo và giúp

đỡ tôi trong thời gian học tập, nghiên cứu

Bên cạnh đó tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè tôi đã tạo mọi điều kiện và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày 30 tháng 08 năm 2010

Học viên

Lê Thị Minh Phúc

MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined

1 BỆNH UNG THƯ VÚ Error! Bookmark not defined

1 1 Giới thiệu chung về bệnh ung thư và ung thư vúError! Bookmark not defined

1.2 Tình hình UTV trên thế giới và Việt

Nam……….… 2

1.3 Triệu chứng và bệnh sinh Error! Bookmark not defined

1.4 Phân loại UTV Error! Bookmark not defined

1.5 Điều trị Error! Bookmark not defined

2 KHÁNG NGUYÊN HER2 ĐẶC HIỆU TẾ BÀO UTVError! Bookmark not defined

2.1 Khái quát về gen HER2 và kháng nguyên HER2Error! Bookmark not defined

2.2 Cấu trúc của HER2 Error! Bookmark not defined

2.3 Mô hình cơ chế gây UTV của HER2 Error! Bookmark not defined

2.4 Các nghiên cứu về đột biến trên HER2 Error! Bookmark not defined

2.5 HER2 và UTV Error! Bookmark not defined

3 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ KHÁNG THỂ - KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNGError! Bookmark not defined

3.1 Cấu tạo chung của kháng thể (Immunoglobulin)Error! Bookmark not defined

3.2 Kháng thể đơn dòng Error! Bookmark not defined

3.3 Kháng thể đơn chuỗi – Mảnh kháng thể Error! Bookmark not defined

4 KỸ THUẬT PHAGE DISPLAY Error! Bookmark not defined

4.1 Giới thiệu chung Error! Bookmark not defined

4.2 Thực khuẩn thể M13 Error! Bookmark not defined

4.3 Tạo thư viện phage display Error! Bookmark not defined

4.4 Sàng lọc với thư viện phage Error! Bookmark not defined

5 CÁC HẠT NANO VÀNG VÀ ỨNG DỤNG Error! Bookmark not defined

5.1 Tổng hợp các hạt nano vàng Error! Bookmark not defined

5.2 Các ứng dụng của các hạt nano Error! Bookmark not defined

Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined

1 VẬT LIỆU Error! Bookmark not defined

1.1 Sinh phẩm Error! Bookmark not defined

1.2 Mồi Error! Bookmark not defined

1.3 Hóa chất và trang thiết bị Error! Bookmark not defined

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined

2.1 Các phương pháp thao tác với DNA Error! Bookmark not defined

2.2 Các phương pháp thao tác với protein tái tổ hợpError! Bookmark not defined

2.3 Các kỹ thuật phage display Error! Bookmark not defined

Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined

1 KẾT QUẢ TẠO KHÁNG NGUYÊN HER2 TÁI TỔ HỢPError! Bookmark not defined

1.1 Kết quả tách dòng gen mã hóa kháng nguyên HER2Error! Bookmark not defined

1.2 Tách chiết DNA plasmid và xác định trình tự nucleotide gen HER2Error! Bookmark not defined

1.3 Kết quả thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HER2Error! Bookmark not defined

1.4 Kết quả biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên HER2Error! Bookmark not defined

2 KẾT QUẢ GÂY MIỄN DỊCH GÀ BẰNG HER2Error! Bookmark not defined

3 KẾT QUẢ TẠO THƯ VIỆN scFv VÀ CHỌN DÒNG scFv ĐẶC HIỆU

HER2 Error! Bookmark not defined.

3.1 Kết quả thu nhận gen mã hóa scFv từ gà đặc hiệu

HER2……… 56

3.2 Kết quả tạo kháng thể phage đặc hiệu

HER2 61

4 KẾT QUẢ GẮN KHÁNG THỂ VỚI HẠT VÀNG ĐỂ TẠO KIT CHẨN

ĐOÁN Error! Bookmark not defined.

4.1 Chức năng hóa về mặt sinh học của các hạt nano vàng bởi protein

THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

STT Ký hiệu Tên đầy đủ

1 Amp Ampicillin

2 AuNPs Gold Nanoparticles (Các hạt nano vàng)

3 bp Base pair (Cặp bazơnitơ)

4 ddNTP Dideoxynucleotide

5 dNTP Deoxynucleotide

6 DNA Acid deoxyribonucleic

7 EDTA Ethylen Diamine Tetra acetic Acid

8 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Thí nghiệm hấp

13 Kb Kilo base pair

15 KTĐD Kháng thể đơn dòng

16 LB Môi trường Lauria Betani

17 NIR Near Infrared Region

18 NPs Nanoparticles

19 OD Optical Density (mật độ quang học)

20 PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

21 PEG Polyethylen Glycol

22 SDS Sodium Dodecyl Sulphate

23 TAE Tris - Acetate - EDTA

LỜI MỞ ĐẦU

HER2 là một loại thụ thể thuộc họ các yếu tố phát triển biểu mô (Human Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR), có hoạt tính tyrosine kinase, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và biệt hoá tế bào Cho đến nay, vẫn chưa tìm thấy ligand đặc hiệu của HER2 tuy nhiên nó có thể tạo dimer với bản thân nó hoặc với các thụ thể khác trong họ để hình thành đồng thụ thể (coreceptor) thúc đẩy các con

đường truyền tín hiệu Sự khuếch đại gen HER2 trên nhiễm sắc thể 17 dẫn đến sự tăng

biểu hiện thụ thể HER2 trên bề mặt tế bào ung thư vú Biểu hiện quá mức HER2 có thể biến đổi tế bào thành dạng ác tính và làm tăng quá trình hình thành khối u Theo nhiều nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung thư vú cho thấy có sự

khuếch đại gen HER2 hoặc biểu hiện quá mức gen này trong các tế bào ung thư Đặc

điểm này làm cho HER2 trở thành một marker hữu hiệu để chẩn đoán sớm ung thư cũng như đích tấn công của liệu pháp điều trị miễn dịch

Ung thư vú hiện nay đang là một trong hai loại ung thư chiếm tỷ lệ cao nhất trong các bệnh ung thư ở nữ giới Điều trị ung thư vú cũng như nhiều loại ung thư khác theo các liệu pháp truyền thống như hoá trị liệu và xạ trị liệu mặc dù hiệu quả tiêu diệt khối u cao nhưng lại có một nhược điểm rất lớn, đó là tác dụng lên cả các cơ quan bình thường xung quanh (non-targeted effect) Mặt khác, các phương pháp này

đa phần chỉ áp dụng đối với trường hợp các khối u đã phát triển và ở giai đoạn muộn nên có hiệu quả điều trị thấp Những nghiên cứu gần đây về các chỉ thị sinh học trong ung thư vú đã mở ra một hướng điều trị mới, thông minh và đầy triển vọng, liệu pháp điều trị tấn công đích (targeted therapy), có thể loại bỏ gần như hoàn toàn nhược điểm của các liệu pháp truyền thống Một trong số thuốc có bản chất kháng thể đặc hiệu HER2 đã được FDA chấp thuận để điều trị cho các bệnh nhân ung thư vú dương tính với HER2 ở giai đoạn cuối là Herceptin

Để góp phần nghiên cứu nhằm tạo các bộ kít chẩn đoán và các loại thuốc có hiệu quả điều trị cao đối với dạng ung thư vú dương tính với HER2 chúng tôi tiến

hành đề tài: “Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên HER2

trong Escherichia coli”

Đề tài được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào động vật – cụm phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen – Viện Công nghệ sinh học – Viện khoa học và công nghệ Việt Nam

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 BỆNH UNG THƯ VÚ

1 1 Giới thiệu chung về bệnh ung thư và ung thư vú

Ung thư là tên chung dùng để gọi một nhóm bệnh gồm trên 200 loại khác nhau

về nguồn gốc của tế bào, nguyên nhân gây bệnh và cách thức điều trị nhưng có những đặc điểm chung đó là sự phân chia không kiểm soát được của tế bào, khả năng tồn tại

và phát triển ở các cơ quan và tổ chức lạ [1,2,26]

Ung thư xảy ra như kết quả của các đột biến hay những thay đổi bất thường trong các gen chịu trách nhiệm cho việc điều hòa sự phát triển của các tế bào và giữ cho các tế bào luôn khỏe mạnh

Ung thư là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 3 sau bệnh tim mạch và đột quỵ ở các nước phát triển và là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 2 sau bệnh tim mạch ở Mỹ (http://www.cdc.gov) Những nghiên cứu đã thống kê là có khoảng 10 triệu ca mắc mới, 6 triệu ca tử vong và 22 triệu người chung sống với ung thư trên khắp thế giới năm 2000 Những con số này tương ứng với việc tăng tỷ lệ mắc và tử vong lên khoảng 22% so với những tỷ lệ này của năm 1990 Người ta ước lượng rằng con số các ca mắc ung thư mới trên khắp thế giới sẽ là 12.3 và 15.4 triệu người vào năm 2010 và 2020 theo thứ tự Năm 2008, ước tính ở Mỹ có tổng số 1.437.180 ca ung thư mới và 565.650 ca tử vong

Ung thư vú

Là một khối u ác tính được phát triển từ các tế bào vú Thông thường UTV hoặc là khởi phát trong các tế bào có khả năng sản sinh sữa của tiểu thùy tuyến vú, hoặc là trong các ống dẫn sữa từ các tiểu thùy ra núm vú Ít phổ biến hơn, UTV có thể khởi phát trong các mô đỡ nơi chứa các mô liên kết dạng sợi và các mô mỡ của vú

1.2 Tình hình UTV trên thế giới và Việt Nam

UTV trên thế giới

UTV là một trong những ung thư thường thấy nhất ở nữ giới và là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai sau ung thư phổi Ở các nước, tỷ lệ phụ nữ mắc UTV gia tăng đều đặn hằng năm, tính chung trên toàn thế giới UTV ở phái nữ được xếp vào hạng nguy cơ hàng đầu Theo thống kê, tỉ lệ tử vong do UTV ở phụ nữ tại Nhật Bản,

Mêxico, Venezuela là 2-5/100.000 người, tại Anh, Đan Mạch, Hà Lan, Hoa Kỳ và Canada là 25-35/100.000 người

Tỉ lệ UTV trên thế giới có chiều hướng gia tăng, nhưng tỉ lệ tử vong lại có chiều hướng giảm xuống do có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán và điều trị Theo nghiên cứu của hiệp hội ung thư, tỉ lệ UTV ở Mỹ đã tăng từ 80/100.000 người trong năm

1975 lên 105/100.000 người trong năm 1985 và 178/100.000 người trong năm 1998

Theo Nazario và cs, tỉ lệ UTV ở Puerto Rico đã tăng từ 15.3/100.000 người trong giai đoạn 1960-1964 lên 43.3/100.000 người trong giai đoạn 1985-1989 Tại Vaud, Thụy Sĩ, tỉ lệ UTV đã tăng từ 2.1/100.000 phụ nữ (1997-1979) lên 9.4/100.000 phụ nữ (1992-1994)

Tỉ lệ UTV ở châu Á có xu hướng tăng nhanh, đặc biệt ở Nhật Bản, Hồng Kông

và Singapore, nơi có lối sống tây hóa Điều này cho thấy các yếu tố môi trường, lối sống và đặc biệt là chế độ ăn uống đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của bệnh UTV Cũng theo số liệu thống kê ở Anh năm 2005, có 212.930 trường hợp mắc bệnh mới trong đó 40.840 ca tử vong Ở Mỹ, năm 2007 có 178.480 trường hợp mới được xác định mắc bệnh UTV trong đó 40.460 trường hợp tử vong (thống kê của Hiệp hội ung thư Mỹ năm 2007)

UTV ở Việt Nam

UTV là một loại ung thư rất phổ biến ở phụ nữ Việt Nam, đứng thứ hai trong các ung thư phụ khoa sau ung thư cổ tử cung tại miền Nam (theo thống kê của Trung tâm Ung Bướu TP HCM) và đứng hàng đầu trong số các bệnh ung thư phụ khoa ở các tỉnh phía Bắc Số ca mới mắc UTV hàng năm khoảng 800/2 triệu ca khám tại Hà Nội

và khoảng 600/3 triệu ca khám tại Thành phố Hồ Chí Minh và phần lớn các bệnh nhân

có độ tuổi trên 40 Thống kê trung bình mỗi năm có 150.000 bệnh nhân ung thư mới

được phát hiện, khoảng 75.000 người chết vì bệnh này và có đến 80% trường hợp chỉ

phát hiện khi bệnh đã ở giai đoạn muộn [2, vietnamnet, 2007]

1.3 Triệu chứng và bệnh sinh

Triệu chứng

Đa phần UTV được chính người bệnh phát hiện khi họ nhận thấy một sự thay đổi ở tuyến vú Thường gặp nhất là một khối bướu hay một chỗ dày cứng lên không đau ở vú

Ở giai đoạn sớm, bệnh thường không có các biểu hiện rõ rệt và không gây đau đớn cho người bệnh Khi khối u tiến triển, người bệnh sẽ thấy có các triệu chứng sau: khối u cứng, không đau, không đồng nhất, bờ không rõ, dính vào thành ngực hoặc da trên vú, khó di động; vú to ra hoặc có thay đổi hình dáng của vú, núm vú bị lún hoặc

xù xì, chảy máu; da vùng vú dày lên hoặc thay đổi màu sắc, sần sùi như vỏ quả cam

Bệnh sinh

Các yếu tố nguy cơ của UTV bao gồm cả những tác nhân không thể thay đổi như di truyền hay tuổi tác và có những tác nhân có thể thay đổi như cách sống

Tuổi: Tuổi càng cao nguy cơ mắc UTV càng tăng Người ta ước tính có khoảng

77% phụ nữ mắc UTV được chẩn đoán khi đã ở độ tuổi trên 50 Những phụ nữ trong

độ tuổi từ 20 đến 29 chỉ chiếm khoảng 0.3% trong tổng số các ca UTV

Bảng 1 Thống kê nguy cơ mắc UTV theo độ tuổi ở phụ nữ Mỹ

Nguy cơ mắc UTV ở phụ nữ tăng lên theo độ tuổi

Từ tuổi 30 đến 39 0.44% (1/227)

Từ tuổi 40 đến 49 1.49% (1/67)

Từ tuổi 50 đến 59 2.79% (1/36)

Từ tuổi 60 đến 70 3.38% (1/26)

Nguồn:Viện ung thư quốc gia, www.cancer.gov , 2004

Di truyền: Những thay đổi (hay các đột biến) của các gen quan trọng có thể là

nguyên nhân làm cho 1 vài tế bào trở thành ác tính Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh là có đến 10% trường hợp UTV là do di truyền Năm 1994, các nhà nghiên cứu

đã khám phá ra những phụ nữ mang các đột biến của BRCA1 (breast cancer gene 1) hay BRCA2 (breast cancer gene 2) có nguy cơ mắc UTV và ung thư buồng trứng cao hơn so với những phụ nữ không mang các đột biến này Gần đây, người ta nhận thấy phụ nữ mang những đột biến BRCA1 chiếm khoảng 5% trong tổng số tất cả các ca UTV được phát hiện

HER2 (thụ thể nhân tố phát triển biểu mô người 2 - human epidermal growth factor receptor 2) là 1 gen khác được tìm thấy trên bề mặt của các tế bào giữ vai trò

then chốt trong điều hòa sự phát triển tế bào Khi gen HER2 bị biến đổi có thể tạo ra số

lượng lớn thụ thể của HER2 Sự biểu hiện quá mức này của HER2 là nguyên nhân làm

gia tăng sự phát triển và tái sinh của tế bào kết quả dẫn đến sự phát triển mạnh của các

tế bào ung thư Slamon và cs đã chứng minh sự biểu hiện quá mức protein HER2 ảnh hưởng đến 25%-30% các bệnh nhân UTV [9,15,22,33]

Những đột biến của gen p53 có thể cũng làm tăng cường nguy cơ mắc UTV ở phụ nữ Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy phụ nữ với UTV giai đoạn sớm cho kết quả thử nghiệm dương tính với gen ức chế khối u p53 đã đột biến có xu hướng tiên lượng bệnh UTV xấu hơn so với những phụ nữ không mang gen p53 đột biến

Tiền sử cá nhân: Những phụ nữ đã từng bị ung thư ở 1 bên vú có nguy cơ mắc

UTV ở bên vú còn lại cao hơn gấp 3-4 lần so với những người chưa từng mắc bệnh

Tiền sử gia đình: Nếu trong gia đình có người đã bị UTV thì người đó sẽ có

nguy cơ mắc UTV cao hơn

Chu kì kinh nguyệt: Phụ nữ bắt đầu có kinh sớm (trước 12 tuổi) hay mãn kinh

muộn (sau 55 tuổi) có nguy cơ mắc UTV cao hơn

Rƣợu: Các nhà nghiên cứu đã thống nhất quan điểm uống rượu có thể làm tăng

nguy cơ mắc UTV Trong nghiên cứu thực hiện năm 2002, các nhà nghiên cứu đã phân tích chế độ ăn và thói quen uống rượu bia của trên 60.000 phụ nữ và đã rút ra kết luận là những phụ nữ nghiện rượu có nguy cơ mắc UTV cao hơn 30% so với những phụ nữ không uống rượu

Thuốc lá: Hút thuốc lá làm tăng nguy cơ mắc 1 vài loại ung thư trong đó có

ung thư vú

Chế độ ăn: Tỷ lệ mắc UTV ở các vùng có chế độ ăn giàu chất béo (như Mỹ)

cao hơn những vùng có chế độ ăn ít chất béo (như Nhật) Tuy nhiên, mối tương quan giữa chế độ ăn và nguy cơ mắc UTV là rất phức tạp và phụ thuộc vào loại chất béo có trong chế độ ăn của họ Các chất béo không bão hòa đơn, như dầu chiết xuất từ cây cải dầu hay dầu oliu có liên quan đến nguy cơ mắc UTV thấp hơn trong khi chế độ ăn cao các chất béo không bão hòa đa (polyunsaturated fats) như dầu ngô, bơ thực vật, và các chất béo bão hòa trong thịt có liên quan đến nguy cơ mắc UTV cao hơn

1.4 Phân loại UTV

UTV có thể được phân loại bằng nhiều cách phụ thuộc vào các đặc tính, giai đoạn phát triển của bệnh Cụ thể như sau:

Theo bệnh học (pathology): phân loại dựa trên sự biểu hiện về mô học bao gồm ung thư xâm lấn ống biểu mô (invasive ductal carcinoma), hình thành khối u ác tính ở các ống của tuyến vú (breast’s ducts), sự xâm lấn các thùy vú (lobular carcinoma) và ung thư ác tính các thùy vú

Theo mức độ phát triển của khối u (grade of tumor): phương pháp này được xác định dựa trên các cấp độ mô học của khối u dưới kính hiển vi gồm giai đoạn nhẹ (low grade - sự sai khác ít giữa tế bào bình thường với tế bào ung thư), giai đoạn nặng (high grade - có khối u khác biệt so với mô bình thường do tế bào bị rối loạn chức năng), và giai đoạn vừa (intermediate grade - nằm trong khoảng hai mức biểu hiện trên)

Theo sự biểu hiện của gen và protein: Tất cả các dạng của UTV có thể kiểm tra

sự biểu hiện hoặc những ảnh hưởng có thể nhận biết của ER (estrogen receptor), PR (progesterone receptor) và protein HER2/neu Hiện nay có nhiều gen hoặc protein đã

và đang được nghiên cứu như các dấu hiệu chuẩn (marker) dùng cho chẩn đoán bệnh UTV

Theo các giai đoạn của khối u: Đây là hệ thống phân loại miêu tả sự phát triển của khối u trong cơ thể bệnh nhân Trong đó, T (tumor) miêu tả kích thước của khối u,

N (lymph nodes) miêu tả các hạt lympho có liên quan và M (metastatic) dùng để miêu

tả sự di căn Hệ thống phân loại này được xây dựng và phát triển bởi UICC (International Union Against Cancer), nó cũng được AJCC (American Joint Committee on Cancer) sử dụng và được thống nhất thành một hệ thống phân loại với UICC vào năm 1987 Trong đó các đặc tính trên lại có các cấp độ phân loại nhỏ hơn

như sau: (i) Có 5 mức phân loại khối u (Tis, T1, T2, T3, và T4) Điểm khác nhau ở các

cấp độ phụ thuộc vào sự có mặt hoặc không của việc xâm lấn, hướng xâm lấn, và sự

xâm lấn ra các cơ quan bên ngoài vú (như phần da của vú, cơ hay dưới lồng ngực); (ii)

Có 4 mức độ phân loại dựa trên hạt lympho (N0, N1, N2 và N3), dựa vào số lượng,

kích cỡ và vị trí của tế bào ung thư vú có mặt trong hạt lympho; (iii) Có 2 mức phân

loại dựa trên sự di căn (M0 và M1), dựa trên sự có hay không có mặt của các tế bào UTV ngoài các vị trí ở vú

Một trong các hệ thống phân loại phổ biến hiện nay là hệ thống phân loại của

Tổ chức Y tế thế giới WHO Hệ thống này phân loại UTV thành 4 kiểu chính (hình 1): (1) Ung thư không xâm lấn (tại chỗ) gồm có ung thư ống tuyến tại chỗ và ung thư tiểu thùy tại chỗ; (2) Ung thư thâm nhiễm gồm có ung thư ống tuyến thâm nhiễm và ung thư tiểu thùy thâm nhiễm; (3) Ung thư viêm nhiễm; (4) Bệnh paget núm vú

Hình 1 Các dạng ung thư vú thường gặp

I-ung thư ống tuyến tại chỗ; II- ung thư tiểu thùy tại chỗ; III- ung thư ống tuyến thâm nhiễm; IV- ung thư tiểu thùy thâm nhiễm Trong đó, ở hình ảnh tuyến vú: A: ống tuyến; B: tiểu thuỳ; C: vùng giãn nở của ống tuyến để giữ sữa; D: núm vú; E: mô mỡ; F: cơ ngực; G: thành ngực, ở hình phóng to: A: tế bào ống/tiểu thuỳ bình thường; B: tế bào ống/tiểu thuỳ ung thư; C: màng rìa; D: lõi ống

1.5 Điều trị

Có nhiều phương pháp điều trị UTV, nhưng đối với những giai đoạn trễ mặc dù

đã có nhiều tiến bộ (phẫu trị, hóa trị, xạ trị, nội tiết) tỷ lệ tử vong vẫn còn rất cao

- Phẫu trị: bao gồm phẫu thuật bảo tồn như cắt khối u, nạo hạch nách sau đó xạ trị đối với các khối u < 3cm, hai ổ, ung thư tại chỗ lan tỏa

- Xạ trị: có tác dụng điều trị bổ túc, xạ trị có hệ thống sau phẫu thuật tận gốc để làm giảm nguy cơ tái phát

- Hóa trị: là dùng thuốc kháng ung thư có tác dụng điều trị toàn thân được sử dụng khi có các yếu tố nguy cơ tái phát, là phương pháp điều trị hỗ trợ rất cần thiết nhưng có nhiều tác dụng phụ và rất tốn kém

Liệu pháp đích

Các liệu pháp ung thư đích là các liệu pháp điều trị dựa trên các đặc tính đặc hiệu của các tế bào ung thư, ví dụ như protein Các liệu pháp đích thường ít gây hại đến các tế bào khỏe mạnh bình thường hơn liệu pháp hóa học Một vài liệu pháp đích

là các kháng thể mà có cơ chế hoạt động giống với các kháng thể được tạo ra trong tự nhiên bởi hệ thống miễn dịch của chúng ta Những loại liệu pháp đích này đôi khi được gọi là các liệu pháp đích miễn dịch

Hiện nay có 3 liệu pháp đích được các bác sĩ sử dụng cho điều trị các bệnh nhân UTV:

Herceptin (tên hóa học là trastuzumab) hoạt động chống lại UTV dương tính HER2 bởi ngăn chặn khả năng của các tế bào ung thư để nhận các tín hiệu hóa học nói cho tế bào biết tín hiệu để phát triển

Tykerb (tên hóa học là lapatinib) hoạt động chống lại UTV dương tính HER2 bởi hạn chế một số protein chủ yếu là nguyên nhân gây ra sự phát triển không kiểm soát của tế bào

Avastin (tên hóa học là bevacizumab) hoạt động bởi ngăn chặn sự phát triển các mạch máu mới mà các tế bào ung thư dựa vào đó để phát triển và thực hiện chức năng

2 KHÁNG NGUYÊN HER2 ĐẶC HIỆU TẾ BÀO UTV

2.1 Khái quát về gen HER2 và kháng nguyên HER2

Đặc điểm của các kháng nguyên trên bề mặt các tế bào ung thư là luôn luôn biến đổi để trốn tránh sự kiểm soát của hệ thống miễn dịch, do đó việc chọn lựa phân

tử biểu thị trên bề mặt làm chỉ thị cho tế bào ung thư là rất cần thiết Đối với mỗi dạng ung thư đều có một hoặc một vài kháng nguyên đặc trưng cho nó Với UTV, gen

HER2 là một gen chỉ thị đặc trưng được nhiều nhà khoa học quan tâm do nó có tính ổn

định cao và số bản lặp lại trong hệ gen thấp thuận tiện cho việc tách và nghiên cứu [20,23,49]

Các nhà khoa học sử dụng các đầu dò có đánh dấu huỳnh quang đã phát hiện vị

trí của HER2 gần tâm động của nhiễm sắc thể 17 và ở vị trí q11.2-q12.0 Đối với

phương pháp lai phân tử, từ tần xuất có phát màu có thể tính được số bản sao của gen Ngoài ra có thể quan sát trực tiếp sự biểu hiện của HER2 trên bề mặt các tế bào ung thư khi sử dụng phương pháp lai miễn dịch huỳnh quang, đây cũng chính là phương pháp sử dụng để phát hiện UTV dựa trên cơ sở miễn dịch phân tử Quá trình nhân bản

gen HER2 đã được tiến hành thành công và trình tự toàn bộ của gen này đã được đăng

ký trong ngân hàng gen quốc tế [45,60,61]

2.2 Cấu trúc của HER2

2.2.1 Cấu trúc gen HER2

Gen HER2 được nghiên cứu phát hiện ra với tên HER-2 và c-erbB-eerG bởi hai

nhóm nghiên cứu độc lập vào năm 1985 Tuy nhiên các nghiên cứu sau đó cho thấy

hai gen này hoàn toàn giống nhau và thống nhất đặt tên gọi HER-2/neu HER2 thuộc

họ gen mã hóa các thụ thể sinh trưởng của các tế bào biểu mô HER (Human Epidermal

Growth Factor Receptor) Nó còn có các tên gọi khác như v-erb-b2, Neu, TKR1, NGL,

HER2, nằm ở nhiễm sắc thể số 17, gần với tâm động, ở vị trí q11.2 q12.0 HER2 là

một gen tiền ung thư (proto-oncogen) có chiều dài 30528 bp chứa 27 exon, tổng chiều dài các exon là 4477 bp trong đó exon dài nhất có 969 bp, exon ngắn nhất có chiều dài

48 bp, gen này có 3 bản sao tương đồng tương ứng với 3 allele B1( Ile-654/Ile655); allele B2 (Ile-654/Val-655); allele B3 (Val-654/Val-655) Mặc dù kích thước gen

HER2 trong hệ gen là rất lớn nhưng quá trình hiệu chỉnh sau khi phiên mã tạo ra

mARN trưởng thành với khoảng 1800 bp [7,29,34,53]

2.2.2 Cấu trúc protein HER2

HER2 là thành viên của họ thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì có hoạt tính tyrosine kinase (EGFR – Epidermal Growth Factor Receptor) nằm trên bề mặt tế bào ở

người, nó tương đương với protein neu ở chuột [64] Các thành viên của họ thụ thể này

có vai trò quan trọng đối với sự sinh sản, biệt hóa và phát triển của tế bào Thụ thể có hoạt tính tyrosine kinase là các thụ thể nằm trên bề mặt tế bào có ái lực cao đối với các nhân tố phát triển (GF – Growth Factor) có bản chất là polypeptide, các cytokine và các hormone Trong số khoảng 90 gen mã hóa cho thụ thể tyrosine kinase ở người đã được biết đến, có khoảng 58 gen mã hóa cho các thụ thể tyrosine kinase có bản chất là protein Thụ thể tyrosine kinase có vai trò điều hòa, giúp cho các quá trình trong tế bào được diễn ra bình thường, ngoài ra nó còn có vai trò quan trọng trong việc hình thành

và phát triển của nhiều dạng ung thư trong đó có UTV [11,12,13,50]

Họ các thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu mô gồm 4 loại thụ thể: HER-1, HER-2, HER-3 và HER-4 Trong đó được biết đến và được nghiên cứu nhiều nhất là HER-2 Đây là một protein có khối lượng phân tử khoảng 185 kDa (còn được gọi là p185HER2), cấu trúc không gian của nó gồm 3 phần:

+ Một vùng ngoại bào giàu Cystein có chứa phần đầu N của thụ thể Nằm ở vùng ngoại bào này là một vùng lớn có khả năng gắn kết với các yếu tố tăng trưởng biểu mô

+ Vùng xuyên màng lipit

+ Vùng nội bào có chứa đuôi C có mang các gốc tyrosine được phosphoryl hóa chịu trách nhiệm cho hoạt tính tyrosine kinase của thụ thể

Hình 2 Cấu trúc của protein HER2

Cấu trúc của HER2/neu: (1): Vùng ngoại bào gồm có 2 vùng liên kết với chất cảm ứng LD1, LD2 (Ligand binding regions); (2): Hai vùng giàu Cystein (CR1 và CR2); (3): Một vùng xuyên màng (TM – transmembrane); (4): Một vùng có hoạt tính tyrosine kinase (TK); (5): Một đuôi Cacboxyl (CT – Carboxyl terminal)

Thụ thể HER2 bao gồm phần ngoại bào khoảng 632 aa, vùng chuyển màng đơn chuỗi dài 22 aa và vùng tyrosine kinase nội bào được cấu trúc từ 580 aa Vùng ngoại bào của HER2 gồm 4 tiểu vùng: Tiểu vùng I bao gồm các gốc aa từ vị trí số 1 đến vị trí 195 (SEQ1); tiểu vùng II từ 196 - 319 (SEQ2); tiểu vùng III từ 320 - 488 (SEQ3); tiểu vùng IV từ 489 -630 (SEQ4) Thụ thể HER bình thường tồn tại ở trạng thái đơn phân bất hoạt Sự hoạt hóa thụ thể xảy ra khi có ligand bám vào và làm hoạt hóa một dãy các quá trình dẫn đến sự nhị hợp giữa các thụ thể, và cuối cùng làm trung gian cho các quá trình sinh học như sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào [11,18,19,57]

Hình 3 Các thành viên của họ thụ thể HER (Cho

Thụ thể HER2 không cần có các chất liên kết để hoạt hóa mà cấu trúc của nó luôn luôn trong trạng thái “mở”, bắt chước trạng thái liên kết với ligand, làm cho nó có khả năng bắt cặp hình thành trạng thái nhị hợp (dimer) với bản thân nó hoặc với các thành viên khác trong họ như HER1, HER3, HER4 mà chúng ở trạng thái đã liên kết với ligand để hoạt động Quá trình nhị hợp vùng ngoại bào làm hoạt hoá vùng xuyên màng của thụ thể, dẫn đến sự tự phosphoryl hóa hàng loạt gốc tyrosine của vùng nội bào Các gốc đã được phosphoryl hoá đó hoạt động như một trung tâm liên kết của protein có chứa Src homology 2 (SH2) hoặc vùng liên kết phosphotyrosine (PTB) Nó còn gồm có các protein liên kết như Shc, Crk, Grb2, Grb7, kinase như phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), protein phosphatase tyrosine SHP1 và SHP2 và yếu tố trao đổi nucleotide guanidin như SOS Mỗi thụ thể đều có một vùng liên kết riêng khác biệt qua đó sẽ hình thành các phức hệ protein nối khi có sự phosphoryl hóa Điều này dẫn đến hàng loạt các con đường mà chúng kích hoạt Hai con đường quan trọng nhất được hoạt hoá bởi sự nhị phân trong họ HER là PI3K/Akt kích hoạt cho các

tế bào khối u sống sót và con đường hoạt hoá MAPK (mitogen – Activated protein kinase) kích thích quá trình biệt hoá tế bào (hình 4) Cả hai con đường này đều dẫn truyền tín hiệu đến đích cuối cùng là nhân và kích hoạt sự hoạt động của gen đích [27,31,34,39,44,51,62]

2.3 Mô hình cơ chế gây UTV của HER2

Sự biểu hiện quá mức của HER2 là tác nhân làm tăng dimer hóa giữa HER2 với chính nó và các thụ thể khác (HER1, HER3) Đó cũng là những tín hiệu khởi đầu cho các con đường sinh ung thư khác nhau Tuy nhiên mối liên quan giữa các con đường

đó là rất khó để có thể xác định Dưới đây là một đề xuất của Moasser về con đường sinh ung thư do sự biểu hiện quá mức của HER2

Sự biểu hiện quá mức của HER2 là nguyên nhân của sự tăng dimer hóa Tăng dimer HER2-EGFR dẫn tới sự tăng sinh và sự xâm lấn của tế bào Sự tăng dimer hóa đồng hình HER2 làm mất tính phân cực của tế bào Sự tăng dimer HER2-HER3 có ảnh hưởng tới sự tăng sinh, khả năng tồn tại, tính xâm lấn và chức năng trao đổi chất của tế bào Tăng sự biểu hiện quá mức của HER2 làm tăng isoform hiếm HER2 dẫn tới tăng cường độ truyền tín hiệu Một vài yếu tố phiên mã được cảm ứng trong những

tế bào có sự biểu hiện quá mức HER2 là kết quả của những sự thay đổi biểu hiện gen

ở mức dư thừa

Feldman và cs đã đưa ra mô hình về con đường truyền tín hiệu của những thụ thể hoạt động này (hình 6) Ở trạng thái hoạt động nó kích thích con đường truyền tín hiệu phosphatidyl inositol 3′-kinase (PI3K) thông qua việc gắn tiểu phần p85 vào Akt, dẫn tới hoạt hóa Akt Akt làm bất hoạt các phân tử tiền apoptosis bao gồm Bad, caspase-9, và p53 Thêm vào đó, dưới tác động của Akt, các hoạt động chuyển hóa glucose, các kênh vận chuyển glucose (GLUT) (nhờ sự phosphoryl GSK3) và sự tổng hợp protein, chu trình phát triển của tế bào (thông qua sự phosphoryl hóa của protein p90RSK, p70S6K, mTOR) đều tăng lên là những nhân tố ngăn chặn quá trình apoptosis Hơn thế nữa, sự hoạt hóa các yếu tố phiên mã B (nuclear factor B) còn kích ứng sự biểu hiện của các gen kháng apoptosis thông qua các protein c-IAP1-2,

Hình 5 Sự bất thường trong việc truyền tín hiệu do sự biểu hiện quá mức của HER2

TRAP 1-2, và A1/Bfl-1 Kết quả của sự tăng sinh này cũng là một trong những nguyên nhân dẫn tới quá trình hình thành ung thư [21,24]

Ở động vật có vú, thụ thể HER2 có vai trò quan trọng trong sự phát triển của tim và thần kinh, các thí nghiệm với chuột bị bất hoạt cả hai allene cho thấy các mô

tim và thần kinh phát triển Oncogen HER2 có thể bị kích hoạt bởi các đột biến điểm

làm gen này được khuếch đại và được biểu hiện mạnh

2.4 Các nghiên cứu về đột biến trên HER2

Trong khi gen neu ở loài gặm nhấm đòi hỏi cần có đột biến để hoạt hóa sự hình thành ung thư thì gen HER2 lại được xem như gen có khả năng sinh ung thư chỉ thông

qua sự biểu hiện quá mức của protein Bằng kỹ thuật di truyền các đột biến điểm được tạo ra tại các vị trí khác nhau trên cả 3 vùng (minh họa ở hình 7) Trong đó hầu hết chúng đều làm thay đổi hoạt tính tyrosine kinase và ảnh hưởng tới sự hình thành khối

u Đồng thời một số đột biến cũng được phát hiện trên mô hình nghiên cứu UTV trên chuột hay được tìm thấy trong tự nhiên (tóm tắt ở bảng 2) [28,36,56]

Hình 6 Cơ chế gây ung thư của HER2

Hình 7 Cấu trúc protein HER2 và các vị trí đột biến được nghiên cứu Các ký

tự phía bên trái gồm 2 vùng gắn ligand là LD1 và LD2, 2 vùng giàu cysteine (CR1 và CR2), đoạn protein xuyên màng (TM), vùng xúc tác tyrosine kinase (TK), các đuôi cacboxyl (CT) Nhiều điểm phosphoryl hóa tyrosine (P) trong vùng TK và CT, các chữ cái bên phải tượng trưng cho các điểm đặc biệt đã được thay đổi hoặc làm đột biến để nghiên cứu về UTV

Các chữ cái ở hình 7 (A, B, C, D) là các vị trí đột biến trên thụ thể HER2 đã

được nghiên cứu, chúng có thể là các đột biến nhân tạo hay các đột biến được tìm thấy trong tự nhiên Nhưng nhìn chung, những sự thay đổi này đều làm ảnh hưởng tới cấu trúc và chức năng truyền tín hiệu của HER2 Các ký hiệu và miêu tả tóm tắt được trình bày như ở bảng 2

Bảng 2 Một số thuật ngữ chung của HER2/neu từ chuột và người [36]

ung thư neu,

neu-v664E

Vùng protein chuyển màng từ chuột gây đột biến

C Được tìm thấy trong

mô hình ung thư ở chuột

neu8142, neu8342 Vùng ngoại bào được

gây đột biến từ chuột

A Ung thư của chuột

chuyển gen c-neu

HER2V659E Đột biến gây biến dạng

HER2 từ người, tương đồng với neu T

C Không thấy trong tự

của HER2 và làm tăng hoạt tính kinase

Chức năng của HER2 ở tế bào bình thường chưa được biết rõ, tuy nhiên một số nghiên cứu trên tuyến vú của chuột và tế bào vú ung thư ở người cho thấy có thể protein này liên quan đến sự biệt hóa tạo sữa của tế bào tuyến vú Do đó HER2 được dùng làm dấu hiệu để chẩn đoán UTV, hơn thế HER2 còn có thể đánh giá khả năng sống sót của bệnh nhân cũng như thời gian sống của người bệnh, thông qua mật độ

biểu hiện của gen HER2 trên bề mặt tế bào ung thư [52,59,60,61]

Ở tế bào bình thường, gen HER2 chỉ tồn tại hai bản sao, còn ở tế bào UTV có thể có tới 25 - 30 bản sao của gen HER2 và làm tăng 40 - 100 lần sự biểu hiện của

protein HER2 (lên đến hơn 2 triệu thụ thể trên bề mặt tế bào khối u), từ đó qua các con đường dẫn truyền khác nhau, tín hiệu được truyền vào bên trong tế bào đến nhân và

Hình 8 Tỷ lệ UTV dương tính với HER2

kích hoạt gen đích hoạt động, phiên mã và dịch mã mà tế bào không kiểm soát được [49,60]

3 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ KHÁNG THỂ - KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG

3.1 Cấu tạo chung của kháng thể (Immunoglobulin)

Kháng thể là các immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B, các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tổng hợp và tiết ra giúp hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus

Các kháng thể có cấu tạo hình chữ Y, có hai bộ “cành” gắn vào một “thân” Các đầu của Y (Fab) được gọi là các vùng biến đổi, ở phía đầu các cành chứa các vùng gắn kết kháng nguyên (vùng quyết định bổ trợ, CDR) và thân (Fc) là một vùng hằng định Kháng thể gồm 4 chuỗi polypeptide, 2 chuỗi nặng và 2 chuỗi nhẹ Chuỗi nặng và chuỗi nhẹ được nối với nhau bằng 1 cầu disulfide, hai chuỗi nặng được nối với nhau bởi 2 cầu disulfide Kiểu của chuỗi nặng quyết định phụ dạng của Ig (IgA, IgD, IgG, IgM và IgE) Mỗi chuỗi có vùng biến đổi và vùng hằng định (vùng không biến đổi) Vùng biến đổi nằm ở đầu amino (NH2-) của chuỗi polypeptide (các amino acid từ 1-110) [48]

CH 2

CH 3

μ, γ, δ, α hoặc ε Gắn đại thực bào

hợp các kháng thể đồng nhất cùng nhận biết và gắn kết với một epitope Ngược lại, các kháng thể đa dòng là tập hợp nhiều loại kháng thể không đồng nhất và nhận biết các epitope khác nhau

3.3 Kháng thể đơn chuỗi – Mảnh kháng thể

Mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv) là một protein dung hợp của các vùng biến đổi của chuỗi nặng (VH) và chuỗi nhẹ (VL) của các globulin miễn dịch, được nối với nhau bằng một đoạn peptide nối ngắn khoảng 15 aa có trình tự (Gly4Ser)3 và được biểu hiện như một chuỗi polypeptide đơn Đoạn peptide nối này thường giàu Glycine

để tạo tính linh hoạt, cũng như giàu Serine và Threonine cần cho khả năng hòa tan và

có thể kết nối vùng đầu N của VH với vùng đầu C của VL hay ngược lại Protein này giữ lại được tính đặc hiệu của globulin miễn dịch gốc mặc dù đã loại bỏ đi vùng hằng định và đưa thêm vào một đoạn peptide nối Đoạn nối cho phép vùng biến đổi của chuỗi nặng (VH) kết hợp với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ (VL) tạo thành phân tử đơn chuỗi Phân tử tái tổ hợp tạo ra vẫn bảo tồn hoạt tính nhận biết và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích

Không giống các kháng thể đơn dòng thường được tạo ra trong nuôi cấy tế bào

động vật có vú, scFv thường được tạo ra trong nuôi cấy tế bào vi khuẩn như E.coli

Hình 10 Sơ đồ cấu tạo của mảnh kháng thể đơn chuỗi

3.4 Kháng thể đơn dòng sử dụng trong điều trị UTV

Hiện nay trên thế giới bệnh UTV đang có xu hướng giảm xuống có thể là do chẩn đoán bệnh khi còn ở giai đoạn sớm và có sự tiến bộ mạnh trong các phương pháp điều trị Việc chẩn đoán đúng các giai đoạn UTV là yếu tố rất quan trọng trong việc lựa chọn phương pháp điều trị hiệu quả Phương pháp điều trị UTV có sự khuếch đại

và biểu hiện mạnh HER2 chủ yếu là phương pháp trị liệu, phẫu thuật và xạ trị Tuy nhiên, các phương pháp này đa phần chỉ áp dụng đối với các trường hợp khối u đã phát triển và ở giai đoạn muộn nên có hiệu quả thấp Các nhà khoa học của Genetech

(Genetech, Inc 4817400, South San Francisco, CA 94080-4990) đã nghiên cứu và tạo

ra kháng thể đơn dòng đặc hiệu HER2 sử dụng trong điều trị UTV di căn có biểu hiện mạnh HER2 Hiện nay, sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp các nhà khoa học đã nghiên cứu để tạo ra các kháng thể đơn dòng tái tổ hợp đặc hiệu với HER2 giúp cho sự chẩn đoán và điều trị UTV mang lại hiệu quả cao hơn [33,37]

Ở Việt Nam, các thuốc chữa ung thư có bản chất kháng thể đơn dòng cũng đã xuất hiện nhưng với giá thành rất cao, phạm vi áp dụng hẹp, không thể đáp ứng được nhu cầu chữa trị của bệnh nhân Do đó việc nghiên cứu và đưa vào sản xuất các thuốc chữa trị ung thư bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đang rất được quan tâm

Dưới đây là một số loại kháng thể đang được sử dụng trong điều trị UTV dương tính với HER2

Herceptin

Herceptin (còn được gọi là Trastuzumab) là một kháng thể đơn dòng có nguồn gốc từ DNA chuột, trực tiếp chống lại vùng ngoại bào (ECD) của thụ thể HER2 Cũng như các kháng thể đơn dòng kháng HER2, Herceptin là một phân tử kháng thể IgG1 của người với vùng quyết định bổ sung của kháng thể chuột - 4D5 với nhiều ưu điểm như vùng không biến đổi ở người làm trung gian cho toàn bộ hoạt động tác động đối với vật chủ, có vai trò trong sự phát triển HAMA (Human Antimouse Antibody – hiện tượng cơ thể sinh kháng thể chống lại kháng thể chuột), và làm cho ái lực liên kết với kháng nguyên cũng được tăng lên [8,19,46,47]

Herceptin liên kết với thụ thể HER2 trên bề mặt tế bào ung thư làm hạn chế khả năng phát triển và phân chia của tế bào ung thư, nhận biết nó như là một tế bào bất thường, và sau đó trực tiếp kích thích lên hệ miễn dịch của cơ thể và huỷ diệt tế bào

đó Herceptin tác dụng theo 3 con đường khác nhau:

- Ức chế sự phát triển của khối u: Herceptin liên kết với thụ thể protein HER2 trên bề mặt tế bào khối u, kéo thụ thể lùi vào trong tế bào Khi HER2 không còn ở trên bề mặt tế bào thì chúng sẽ không thể tạo nên tín hiệu làm tăng trưởng và phân chia tế bào

- Làm tín hiệu cho hệ miễn dịch: Herceptin gắn vào thụ thể HER2 trên bề mặt

tế bào khối u Sau đó, có một số tế bào trong hệ miễn dịch có thể là các tế bào diệt tự nhiên (NK – Natural Killer), gắn với Herceptin Các tế bào NK có khả năng nhận ra các tế bào khối u đó là bất thường và giết chết các tế bào khối u

- Tác động kết hợp với hoá trị liệu: Herceptin và hoá trị liệu tác động ở các con đường khác nhau, nhưng khi kết hợp cùng nhau, cả hai loại thuốc đó có thể tạo nên tác động cộng hợp Ví dụ, khi Herceptin được sử dụng với hoá trị liệu mà tấn công và phá huỷ DNA trong nhân của các tế bào khối u, Herceptin ngăn chặn không cho tế bào sửa chữa chúng Do đó sự sửa chữa không được thực hiện và dẫn đến tế bào sẽ

bị chết Điều này làm chậm lại quá trình sinh trưởng của khối u

Herceptin (Tratuzumab) gắn kết với vùng ngoại bào của thụ thể HER2 trên bề mặt

tế bào UTV, ức chế sự phân cắt vùng này để tương tác với các thụ thể khác trong họ HER, làm cảm ứng sự chết theo chương trình của tế bào ung thư, giảm sự biệt hóa tế bào, làm giảm sự biểu hiện của HER2…

Herceptin được FDA chấp thuận sử dụng lần đầu tiên kết hợp với paclitaxel trong việc điều trị UTV di căn dương tính với sự biểu hiện quá mức thụ thể HER2 [47]

Các chất kết hợp với kháng thể kháng HER2 (T-DM1)

Các nhà khoa học đã thử nghiệm một phiên bản thuốc có hiệu lực hơn bằng cách gắn phân tử Herceptin với phân tử DM1 có độc tính cao và có hiệu lực gấp nhiều lần thuốc paclitaxel (Taxol), nhưng cơ chế tác dụng thì giống nhau Phân tử Herceptin - DM1 gắn vào

tế bào UTV giống như Herceptin thông thường, nhưng không giống Herceptin ở chỗ nó được đưa vào trong tế bào và DM1 được giải phóng, do đó tiêu diệt các tế bào này DM1 chỉ được giải phóng sau khi phân tử này vào trong tế bào, vì thế độc tính giới hạn ở tế bào và không gây hại cho tế bào xung quanh Các nhà khoa học nhận thấy khi tiêm Herceptin – DM1 vào chuột bị ung thư vú có nồng độ protein HER2 cao, các khối u biến mất trên tất cả chuột thử

Hình 11 Cơ chế tác động của Herceptin đối với tế bào UTV

nghiệm Tuy nhiên, Herceptin chỉ làm chậm sự phát triển của khối u Theo các nhà khoa học thì hợp chất này rất đặc hiệu với HER2, nhưng HER2 lại được biểu hiện ở một số mô gồm cả

mô tim, vì vậy cũng cần nghiên cứu thêm để xác định chắc chắn về độ an toàn của hợp chất này khi sử dụng trên người

Pertuzumab

Pertuzumab (rhu mAb-2C4) là một loại kháng thể được tạo ra bởi hãng Genetech Pertuzumab liên kết với vùng nhị hợp của HER2 và bất hoạt quá trình nhị hợp của thụ thể HER2 với chính nó hoặc với các thành viên khác trong họ HER, qua đó làm bất hoạt cả chất liên kết hoạt hóa tín hiệu HER2 Trong một số nghiên cứu, Pertuzumab không giống như Herceptin, nó được phát hiện là có hoạt tính trong cả khối u không có sự biểu hiện mạnh HER2

Tykerb (Lapatinib)

FDA đã chấp nhận việc sử dụng thuốc Tykerb điều trị UTV di căn Tykerb là một phân tử nhỏ có chức năng như một chất kìm hãm kinase hoạt động thông qua con đường (đích tác động) lấy đi tín hiệu cần thiết cho sự phát triển của khối u Không như Trastuzumab – một kháng thể đơn dòng, là một phân tử protein có kích thước lớn tác động lên một phần của protein HER2 bên ngoài tế bào, Tykerb là một phân tử nhỏ tác động ở bên trong tế bào và khoá chức năng hoạt động của protein HER2 và một số protein khác Qua các nghiên cứu in vitro, Tykerb ức chế sự biệt hóa của các tế bào ung thư và nó cũng đáp ứng lại đối với sự biểu hiện HER2 và ức chế sự phosphoryl hóa HER2, và các protein trung gian như Raf, Akt, Erk Tykerb tác động đến một số tế bào UTV dương tính với HER2 đã

có sự điều trị với Herceptin lâu dài mà không có hiệu quả hoặc có hại đối với hệ thần kinh trung ương

và chết

Các liệu pháp trị liệu khác có đích là HER2

Có một số phương pháp đã được tìm ra mà đích tác dụng là HER2 allylominogeldanamycin, chất ức chế Hsp90 đầu tiên được thử nghiệm, làm giảm hàm lượng HER2 như đối với Hsp90 Liệu pháp gen với các nhân tố phiên mã, PEA3 và protein E1A của Adenovirus typ 5 cũng được nghiên cứu trong việc điều hòa sự biểu hiện HER2 Các phương pháp thử nghiệm khác có đích là m-RNA HER2 như rybozyme, antisense, các siRNA cũng được đề cập đến Các vaccine cũng được thử nghiệm để phản ứng với các kháng nguyên HER2 Tuy nhiên các phương pháp này hiện nay còn đang được nghiên cứu

17-và chưa được đưa 17-vào thử nghiệm lâm sàng

4 KỸ THUẬT PHAGE DISPLAY

4.1 Giới thiệu chung

Kỹ thuật biểu lộ trên phage (phage display) do G Smith mô tả năm 1985 là kỹ thuật biểu lộ các phân tử peptide hay protein trong đó có cả các phân tử kháng thể được biểu lộ trên bề mặt thực khuẩn thể hình sợi (filamentous bacteriophage)

Nguyên tắc của kỹ thuật này là trình tự DNA mã hóa cho protein quan tâm được gắn vào vị trí xác định trên hệ gen của thực khuẩn thể hình sợi, do đó mà protein

nó mã hóa được biểu hiện và “bộc lộ” trên bề mặt dưới dạng sản phẩm gắn kết với một trong các loại protein vỏ của thực khuẩn thể [2] Do đó, thư viện thực khuẩn thể chứa tới vài tỷ các biến thể được sử dụng thay cho việc sử dụng công nghệ gen để tạo ra từng phân tử protein hoặc peptide khác nhau

Điều đặc biệt của phage display là sự liên kết kiểu hình của protein hoặc peptide với kiểu gen của nó được đóng gói trong cùng một thực khuẩn thể Sau khi sàng lọc và chọn được các kiểu hình (các phân tử kháng thể được bộc lộ trên bề mặt hạt phage) có ái lực cao đối với kháng nguyên đích có thể thu nhận được gen mã hóa cho nó

được bao bởi 2 protein vỏ phụ: một đầu gồm 5 bản sao của pVII và pIX, đầu kia chứa

5 bản sao của pIII và pVI Ngoài các protein vỏ, M13 còn tạo ra 6 protein khác là pII,

pX, pV, pI, pIV, pXI [30]

Chu kỳ sống

Quá trình xâm nhiễm bắt đầu khi phage tiếp xúc với bề mặt vi khuẩn thông qua

tương tác giữa pIII với tiêm mao F của E coli Sau đó phage chuyển bộ gen của nó

vào tế bào chủ và các protein vỏ gắn với màng vi khuẩn [41] Bên trong vi khuẩn bộ gen của phage chuyển thành DNA mạch kép nhờ các enzyme của vi khuẩn và bắt đầu tổng hợp 11 protein của M13 (hình 13)

Khi các protein của phage và bộ gen DNA mạch đơn tích lũy đủ trong vi khuẩn

bị nhiễm quá trình lắp ráp hạt virus bắt đầu Các protein cấu trúc pVIII, pVII, pIX, pVI

và pIII đồng thời gắn với màng trong vi khuẩn và chờ đợi bộ gen DNA mạch đơn tái bản Khi đủ nồng độ, pV bọc bộ gen mạch đơn mới tổng hợp của phage và ngăn cản

sự chuyển hóa nó thành DNA mạch kép Sau đó hạt virus lắp ráp và được đẩy ra khỏi

vi khuẩn Một chú ý quan trọng là M13 là thực khuẩn thể không sinh tan nên tế bào chủ không bị chết sau khi nhiễm [30]

Hình 12 Cấu trúc của thực khuẩn thể M13

Hình 13 Chu kì sống của thực khuẩn thể M13 trong E coli

4.3 Tạo thƣ viện phage display

Về cơ bản, để tạo ra thư viện kháng thể cần khuếch đại các đoạn gen chuỗi nặng chuỗi nhẹ từ mô bạch huyết hoặc lympho bào máu ngoại biên bằng phiên mã ngược và PCR Cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme giới hạn và tách dòng vào vector phagemid để có thể biểu hiện khi dung hợp với protein của phage [30]

Để có thể bộc lộ các peptide hoặc protein sử dụng hệ thống phagemid, bổ sung helper phage vào canh trường vi khuẩn mang DNA phagemid để tạo ra hạt virus sử dụng trong sàng lọc Khi nhiễm vào vi khuẩn mang phagemid, bộ gen của helper phage bắt đầu tổng hợp tất cả các protein của phage kiểu dại Khi quá trình lắp ráp phage bắt đầu, các hạt virus ưu tiên sử dụng DNA phagemid hơn là DNA của helper phage vì nó mang tín hiệu đóng gói đầy đủ chức năng

Các hạt phage được tiết ra sẽ biểu lộ trình tự ngoại lai trên protein vỏ và mang phagemid mã hóa trình tự này [30] Một số thư viện đã được tạo ra và sử dụng phổ biến là Nissim Library, được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Dr G Winter tại Cambridge (1994), và thư viện của De Kruif và cs (1995) [42] Nổi bật nhất là thư viện tổng hợp Fab và scFv do Griffiths và cs tạo ra [65]

4.4 Sàng lọc với thƣ viện phage

Hầu hết các thủ tục sàng lọc dựa trên nguyên lý chọn lọc ái lực và gồm các bước cơ bản sau: 1) khuếch đại thư viện và tạo phage; 2) cho phage tiếp xúc với đích; 3) loại bỏ phage không gắn bằng cách rửa; 4) tách phage gắn và 5) tái xâm nhiễm vào

vi khuẩn chủ để khuếch đại chúng lên (hình 14) Các vòng sàng lọc này sau đó được lặp lại nhiều lần

5 CÁC HẠT NANO VÀNG VÀ ỨNG DỤNG

Công nghệ nano là một lĩnh vực nghiên cứu liên ngành liên quan đến hóa học, công nghệ, sinh học và y học có tiềm năng to lớn trong việc thăm dò sớm, chẩn đoán chính xác và điều trị ung thư [15,16] Các hạt nano thường có kích thước nhỏ hơn vài trăm nanomet so với các đại phân tử sinh học như các enzyme, các thụ thể và các kháng thể Với kích thước nhỏ hơn khoảng vài trăm đến 10 nghìn lần so với các tế bào người, các hạt nano này có thể tạo ra các tương tác không tiên đoán trước được với các phân tử sinh học cả trên bề mặt lẫn bên trong tế bào điều này có thể dẫn đến cuộc cách mạng trong chẩn đoán và điều trị ung thư Các hạt nano được nghiên cứu kỹ nhất gồm quantum dot, carbon nanotube, các hạt nano thuận từ, liposome [44], các hạt nano vàng, và nhiều loại hạt khác (Hình 15)

Hình 14 Sơ đồ quá trình sàng lọc với thư viện phage

Trải qua một thập kỷ, đã có nhiều trung tâm công nghệ nano được thành lập trên khắp thế giới Chỉ tính riêng ở Mỹ, đã có hơn 6 tỷ đô la được đầu tư cho các nghiên cứu về công nghệ nano và hơn 60 trung tâm, mạng lưới và thiết bị đã được trợ cấp bởi nhiều tổ chức đang hoạt động hay sẽ đưa vào hoạt động trong tương lai gần Sau khi đã thiết lập được mạng lưới công nghệ nano liên ngành, người ta mong muốn rằng trong tương lai gần công nghệ nano sẽ phát triển theo hướng có nhiều ứng dụng y học

5.1 Tổng hợp các hạt nano vàng

Các hạt nano vàng hình cầu

Các hạt nano vàng hình cầu cũng được biết như các hạt keo vàng có đường kính

từ 2nm đến trên 100nm có thể được tổng hợp bởi điều khiển sự khử dung dịch HAuCl

4

sử dụng các tác nhân khử khác nhau dưới các điều kiện khác nhau Tác nhân khử được

sử dụng rộng rãi nhất là citrate, chất khử này có thể tạo ra hầu hết các hạt nano vàng hình cầu đơn phân tán Kích thước của các hạt nano hình cầu có thể được kiểm soát

Hình 15 Các hạt nano đã được nghiên cứu cho các ứng dụng y

sinh học đích ung thư như quantum dot, liposome, nanotube…

bởi sự đa dạng trong tỷ lệ citrate/vàng Thông thường, số lượng citrate nhỏ hơn sẽ tạo

ra lượng hạt nano hình cầu lớn hơn

Các thanh nano vàng

Các thanh nano vàng thường được tổng hợp bằng cách sử dụng phương pháp khuôn trên cơ sở lắng đọng điện hóa của vàng bên trong các lỗ của màng khuôn polycarbonate hay oxit nhôm Kích thước của thanh nano vàng được xác định bởi kích thước lỗ của màng khuôn, trong khi chiều dài của thanh nano có thể được kiểm soát thông qua lượng vàng lắng đọng bên trong các lỗ của màng

Tổng hợp qua trung gian mầm có lẽ là phương pháp tốt nhất để chuẩn bị thanh nano vàng, có thể cung cấp tỷ số hình dạng cao hơn so với khi được chuẩn bị bằng các phương pháp khác Thông thường các mầm vàng được tạo ra bằng cách khử hóa học các muối vàng với các chất khử mạnh như NaBH

4 Các mầm này đóng vai trò như các

vị trí trung tâm của các thanh nano, sau đó thêm vào các dung dịch nuôi mầm của muối vàng một chất khử yếu như acid ascorbic và hexadecyltrimethylammonium bromide Tỷ số hình dạng của thanh nano vàng có thể được kiểm soát bởi sự thay đổi

số lượng mầm vàng Hơn nữa, thanh nano vàng có thể được tạo ra với số lượng xác định khi thêm AgNO3

Liệu pháp ung thư

Các chiến lược truyền thống để can thiệp và xử lý ung thư bao gồm phẫu thuật, hóa trị liệu và xạ trị liệu Dựa trên những thuận lợi về các tính chất duy nhất của

chúng, nhiều nghiên cứu về liệu pháp ung thư trên cơ sở các hạt nano vàng đã sử dụng liệu pháp quang nhiệt để phá hủy các tế bào ung thư hay các mô khối u Khi chiếu xung laser hội tụ với bước sóng phù hợp, các hạt nano vàng hình cầu, thanh nano đích

có thể giết chết vi khuẩn và các tế bào ung thư Người ta ước tính là nhiệt độ sẽ đạt 70–80 oC nhờ việc hấp thụ ánh sáng của các hạt nano vàng và có đến 150 kháng thể có thể liên kết với lớp vỏ nano thông qua một phân tử PEG nối hai chức năng Một quan sát đáng chú ý là hầu hết các nghiên cứu này có đích là EGFR hay thụ thể nhân tố phát triển biểu mô người số 2 (HER2)

Dẫn thuốc

Một vài nghiên cứu đã báo cáo về việc sử dụng các hạt nano vàng làm phương tiện để dẫn thuốc Nhân tố hoại tử khối u alpha (TNF-α), một cytokine với hiệu quả kháng khối u thông minh, tạo nên tính gây độc hệ thống điều này gây nên những hạn chế nghiêm trọng trong các ứng dụng liệu pháp của chúng Hệ thống dẫn truyền các hạt nano chứa các hạt vàng được phủ bằng PEG cộng với TNF-α đã được tạo ra nhằm mục đích tối đa hóa khả năng gây tổn thương khối u đồng thời tối thiểu hóa tính độc

hệ thống của TNF-α Tổ hợp của sự nung nóng cục bộ và dẫn truyền trên cơ sở các hạt nano của TNF-α dẫn tới kết quả tăng cường tính hiệu quả của liệu pháp hơn khi sử dụng riêng lẻ

Ứng dụng của hạt nano vàng trong thăm dò UTV

Trong nghiên cứu được công bố tháng 7 năm 2007 trên tạp chí Analytical Chemistry, các nhà khoa học đến từ trường đại học Purdue (Mỹ) đã trình bày chi tiết việc sử dụng các hạt nano vàng để thăm dò UTV Nguyên lý hoạt động bởi nhận dạng

ra các protein được tìm thấy trên bề mặt của các tế bào ung thư Các loại ung thư khác nhau có các protein khác nhau nằm trên bề mặt của chúng giữ vai trò như các chỉ thị đặc hiệu Thanh nano, các hạt nano vàng có dạng hình que, sử dụng các kháng thể đặc hiệu để bám vào các chỉ thi protein của UTV Sau khi các thanh nano gắn với các protein trong mẫu máu, người ta xem xét chúng tán xạ ánh sáng như thế nào Mỗi tổ hợp protein-thanh nano tán xạ ánh sáng theo cách duy nhất do đó cho phép chẩn đoán chính xác bệnh

Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 VẬT LIỆU

1.1 Sinh phẩm

- Thư viện thực khuẩn thể Griffin.1 (Human Synthetic VH + VL scFv Library)

từ trung tâm nghiên cứu protein (Cambridge, Anh)

- Helper phage M13K07 (Invitrogen, CA, USA)

- Vi khuẩn E coli chủng TG1, TOP10, HB2151

- Enzyme T4 DNA ligase và các enzyme giới hạn bao gồm NdeI; XhoI và SfiI

(BioLabs- New England)

- Kháng thể cộng hợp kháng M13 (anti-M13 horseradish peroxidase-conjugate, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)

1.2 Mồi

Đề tài sử dụng các cặp mồi với ký hiệu và trình tự như sau

HER2F:5’- CAT ATG GTG TGC ACC GGC ACA GAC ATG AAG - 3’

HER2R:5’- CTC GAG AAC CAC CGT AGA GAT GAT G - 3’

ExHer4F:5'- GGC GCC TCT GCC ACC AGC TGT GCG CCC GAG -3'

ExHer4R:5'- AGC CGG CGG CTC TCT GCT CGG CGG GGC -3'

CKJo-B: 5’-GGAAGATCTAGAGGACTGACCTAGGACGGTCAGGG-3’

CSCVHo-FL: 5’-GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCC GGTGGTGGCGGTTCCGCCGTGACGTTGGACGAG-3’

CSCVHoF:5’-GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGCCGTGACGTTGGAC GAG -3’

1.3 Hóa chất và trang thiết bị

Hóa chất

Các hoá chất tinh khiết được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học phân tử của

BioLabs; Invitrogen; Sigma và Bioscience gồm: Taq-polymerase, dNTPs, Agarose,

Polyacrylamide, Glycerol, EtBr, Comassie Blue, APS, BSA

Các loại kháng sinh: Ampicilline, Kannamycine

Các môi trường tăng sinh và dung dịch đệm: LB, 2xTY, PBS 1X, TAE 1X,

SDS-PAGE 1X được trình bày chi tiết ở phụ lục 3

Trang thiết bị

Lò vi sóng (SamSung, Hàn Quốc) Tủ cấy vô trùng (Sanyo, Nhật)

Máy li tâm (Eppendorf, Đức) Bộ điện di protein (Bio-Rad)

Máy đo pH (Metter, Thuỵ Sĩ) Máy Vortex (Rotolab OSI)

Máy soi gel (Pharmacia, Mỹ) Máy đọc trình tự (Mỹ)

Máy lắc ổn nhiệt 37o

C, 30oC, 28oC Bể ổn nhiệt (Teche, OSI) Cân phân tích 10-4 g (Mettler Toledo) Pipetman các loại (Gilson)

Cân điện 10-1

g (Ohaus) Bộ điện di DNA

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Các phương pháp thao tác với DNA

Các phương pháp thao tác với DNA chủ yếu thực hiện theo Sambrook và cộng

sự (1989), một số phương pháp tiến hành theo các kit và hướng dẫn của nhà sản xuất

2.1.1 Tách chiết RNA từ máu

Quá trình tách chiết RNA được thực hiện (theo Kit S.N.A.P của hãng Invitrogen) trong điều kiện các dụng cụ đều được xử lý bằng DEPC 0.1% qua đêm để loại bỏ RNase Sau đó khử trùng hơi trong điều kiện nhiệt độ và áp suất cao (140 oC; 0.8 atm; thời gian 45 phút)

Bệnh phẩm ung thư vú sau khi nhận từ bệnh viện Quân y 108 về chúng tôi tiến hành tách ngay RNA tổng số theo quy trình sau:

Bước thứ nhất: tách acid nucleic tổng số

 Lấy 200l máu vào ống Eppendoft free RNase

 Bổ sung proteinase K Vortex 30 giây, ủ 20 phút ở 37 oC

 Ly tâm 12.000 v/p, thu dịch

 Bổ sung 400l isopropanol, đảo đều Chuyển dịch sang cột S.N.A.P

 Ly tâm 1 phút, 12.000 v/p, bỏ dịch ly tâm

 Rửa 2 lần bằng dung dịch rửa 1X

 Sau 2 lần rửa ly tâm cột, thời gian 2 phút để loại hết dịch

 Dùng 135l nước không chứa RNase để thu aicd nucleic tổng số

Bước thứ hai: loại DNA

 Thêm 15l đệm 10X và 1l (2 đơn vị) DNase (không chứa RNase)

 Ủ 37 o

C trong 10 phút

 Thêm 450l đệm gắn kết, đảo ngược ống 5-6 lần

 Thêm 300l isopropanol và đảo ống 6-10 lần

 Chuyển dịch vào một cột S.N.A.P mới

 Ly tâm tốc độ tối đa trong 1 phút Loại dịch ly tâm

 Rửa 2 lần bằng dung dịch rửa 1X

 Sau 2 lần rửa ly tâm cột, thời gian 2 phút để loại hết dịch

 Dùng 125l nước không chứa RNase để thu RNA tổng số

2.1.2 RT-PCR nhân bản gen mã hóa kháng nguyên, kháng thể

Phản ứng RT-PCR dựa trên nguyên tắc của chuỗi phản ứng trùng hợp PCR, trong đó có sử dụng enzyme phiên mã ngược có khả năng sử dụng RNA làm khuôn tổng hợp DNA Phản ứng RT-PCR gồm hai giai đoạn chính là giai đoạn tổng hợp cDNA từ mRNA nhờ tác dụng của enzyme phiên mã ngược và giai đoạn tổng hợp

DNA dưới tác dụng của DNA-polymerase

Quá trình nhân đoạn gen mã hóa các kháng nguyên từ bệnh phẩm, gen mã hóa vùng hằng định của kháng thể người hoặc gen mã hóa các kháng thể gà từ tủy xương

gà đã gây miễn dịch với các kháng nguyên đặc hiệu HER2 sau khi đã tách RNA tổng

số được tiến hành theo quy trình sử dụng kit “one-step RT-PCR” của hãng Invitrogen với cặp mồi đặc hiệu cho gen cần tách dòng Thành phần phản ứng nhân bản gen từ RNA tổng số được trình bày ở bảng 3

Bảng 3 Thành phần phản ứng RT-PCR

Hỗn hợp phản ứng (đệm phản ứng) 2X 25

RNA đặc hiệu đối với gen HER2 200 pg 15

Mồi xuôi đặc hiệu gen HER2 10 pM 1.5

Mồi ngược đặc hiệu gen HER2 10 pM 1.5

Sau khi đã trộn đều các thành phần, phản ứng RT-PCR được tiến hành trên máy PCR với chu trình nhiệt như sau:

Bước 1: 50 C thời gian 30 phút

Bước 2: 94 C thời gian 2 phút

Bước 3: 94 C thời gian 15 giây

Bước 4: 57 C thời gian 30 giây

Bước 5: 72 C thời gian 1 phút 30 giây

Bước 6: Lặp lại 30 chu kì từ bước 3 đến bước 5

Bước 7: 72 C thời gian 8 phút

Bước 8: bảo quản ở 4 C

Sản phẩm RT-PCR sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8%

2.1.3 Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vector pTZ57R/T

Các sản phẩm của phản ứng PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng pTZ57R/T Điều này có thể thực hiện được khá dễ dàng là do khả năng tổng hợp thêm

một Adenine ở đầu 3’ của sản phẩm PCR dưới tác dụng của enzyme Taq DNA

polymerase mà không phụ thuộc vào trình tự DNA khuôn Trong khi đó vector tách

dòng pTZ57R/T được thiết kế có chứa một nucleotide T ở đầu 3’ Do vậy, khi có mặt

enzyme topoisomerase, sản phẩm của phản ứng RT-PCR có thể được gắn chính xác

vào vector tách dòng Thành phần phản ứng gắn sản phẩm RT-PCR vào vector pTZ57R/T được trình bày ở bảng 4

Bảng 4 Thành phần phản ứng gắn

T4 ligase 1 l Vector pTZ57R/T 1 l Nước tinh khiết 4 l

Hỗn hợp phản ứng gắn được ủ ở nhiệt độ 22 oC, thời gian 30 phút sau đó được giữ tại 4 oC trong thời gian chuẩn bị để biến nạp vào tế bào khả biến

2.1.4 Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli

Chuẩn bị tế bào khả biến

- Lấy chủng tế bào được cất giữ ở -75 oC

- Cấy vạch tế bào trên đĩa môi trường LB đặc, ủ đĩa cấy qua đêm ở 37 oC Nhặt

một khuẩn lạc nuôi cấy trong 2ml môi trường LB lỏng

- Cấy chuyển 2% dịch nuôi tế bào qua đêm sang 2ml môi trường LB lỏng Nuôi lắc ở 37 oC, 200v/p trong 90 phút đến khi OD600 đạt 0.5-0.7

- Chuyển dịch tế bào sang ống Eppendorf vô trùng, để trên đá 10 phút

- Ly tâm thu sinh khối (5000v/p, 4 oC trong 10 phút)

- Loại dịch nổi, đặt ống chứa tế bào trong đá 10 phút

- Hòa tan cặn tế bào trong 1ml CaCl2 100mM, búng nhẹ