nghiên cứu tách dòng và đọc trình tự gen cry1ab, cry1ac mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy từ các chủng bacillus thuringiensis phân lập từ một số mẫu đất thuộc tỉnh thái nguyên

thuringiensis là vi khuẩn gram dương, mang các gen cry sinh tổng hợp bào tử và protein tinh thể độc tố có hiệu quả diệt đối với nhiều loài côn trùng thuộc các bộ cánh vảy, cánh cứng và

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

==========

TRƯƠNG PHÚC HƯNG

THUỘC TỈNH THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Thái Nguyên là một tỉnh miền núi trung du, nằm trong vùng trung du

Với địa hình thấp dần từ núi cao xuống núi thấp, trung du, đồng bằng theo hướng Bắc – Nam làm cho khí hậu Thái Nguyên chia thành ba vùng rõ rệt trong mùa đông: vùng lạnh, vùng lạnh vừa, vùng ấm và hai mùa rõ rệt mùa mưa và mùa khô Do ảnh hưởng của địa hình, đất đai ở Thái Nguyên được chia thành ba loại chính,

trên các đá Macma, đá biến chất và trầm tích, độ cao trên 200m, tạo điều kiện cho phát triển lâm nghiệp, trồng rừng, cây đặc sản….đất đồi chiềm 31,4% chủ yếu hình thành trên cát kết, bột kết phiến sét và một phần phù sa cổ kiến tạo,

độ cao từ 150 – 200m, phù hợp với cây ăn quả lâu năm, cây công nghiệp và

sử dụng Kết cấu của đất, điều kiện khí hậu và đặc điểm về địa hình đã tạo ra cho Thái Nguyên sự đa dạng về thực vật, động vật, cũng như các loài vi sinh

vậtt rong đó có vi khuẩn Bacillus thuringiensis[23]

B thuringiensis là vi khuẩn gram dương, mang các gen cry sinh tổng

hợp bào tử và protein tinh thể độc tố có hiệu quả diệt đối với nhiều loài côn trùng thuộc các bộ cánh vảy, cánh cứng và hai cánh Trong những năm gần

đây các chủng Bt đã được các nhà khoa học phân lập với số lượng rất phong

có chứa gen cry mong muốn, tạo dòng và xác định trình tự gen độc tố đó là

vấn đề rất cần thiết, nó làm cơ sở cho các nghiên cứu đi sâu tiếp theo đối với

những gen cry này như: nhằm tạo ra các chủng B thuringiensis tái tổ hợp mới

có phổ diệt sâu rộng, hoạt lực diệt sâu cao hơn đối với nhiều loài côn trùng

quan trọng; việc biến nạp các gen độc tố cry thích hợp vào từng loại cây trồng

để bảo vệ chúng trước sự tấn công của côn trùng Protein tinh thể độc cry1Ab, cry1Ac là một trong nhiều protein có hoạt tính cao chống lại côn trùng bộ cánh vảy Xuất phát từ mục đích này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu Tách dòng và đọc trình tự gen cry1Ab, cry1Ac mã hóa

protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy phân lập từ một số mẫu đất thuộc tỉnh Thái Nguyên”

2 Mục tiêu của đề tài

- Sàng lọc được các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt côn

trùng bộ cánh vẩy

- Tách dòng và đọc trình tự được các chủng Bt nghiên cứu mang gen cry1Ab và gen cry1Ac

3 Nhiệm vụ của đề tài

- Thu thập các chủng Bt đã được phân lập chưa qua tuyển chọn từ đất Thái

Nguyên;

- Phân loại các chủng Bt var kurstaki bằng phương pháp huyết thanh;

- Phát hiện gen cry1Ab và gen cry1Ac bằng phương pháp PCR;

- Sàng lọc các chủng Bt var kurstaki có hoạt tính diệt sâu tơ;

- Tách dòng gen cry1Ab và gen cry1Ac;

- Xác định trình tự đoạn gen cry1Ab và đoạn gen cry1Ac đã được tách dòng từ các chủng Bt nghiên cứu và so sánh với trình tự gen ở Ngân hàng Gen

quốc tế

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Lược sử nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis (Bt) trên thế giới

Năm 1901, nhà khoa học Nhật Bản Sigetane Ishiwata đã phát hiện ra

một loại vi khuẩn gây bệnh sotto ở trên tằm và ông đặt tên là Bacillus sotto

Năm 1911, nhà khoa học Đức E Berline cũng đã phân lập được một loại vi

khuẩn tương tự từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải, Anagasta

kaenniella Mãi đến năm 1915, vi khuẩn này mới chính thức được mang tên Bacillus thuringiensis do vi khuẩn này được phân lập từ vùng Thuringen của Đức Đến năm 1930, Bt đã được thử nghiệm chống sâu đục thân ở Châu Âu

Năm 1938, chế phẩm Bt đã được sản xuất lần đầu tiên để diệt sâu hại lúa mỳ

tại Pháp Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có bản chất protein Năm 1956, Angus đã chứng minh hoạt tính diệt sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào và bào tử Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) đã sản xuất ra một số lượng lớn thuốc trừ sâu Thuricide từ chủng

Bt var kurstaki Đến năm 1962, de Barjac và Bonnfoi đã đưa ra một phương pháp phân loại mới cho các chủng Bt và Bacillus sphaericus (Bs) bằng phương pháp huyết thanh Vào những năm 1960 – 1976, nhiều chủng Bt có

hoạt tính diệt sâu cao đã được phân lập và ứng dụng Năm 1977, Goldberg và

Margarit đã phát hiện ra Bt var isralensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ

hai cánh Năm 1981, Schnepf và Whiteley đã lần đầu tiên phân lập và tách

dòng gen độc tố mã hoá protein tinh thể diệt sâu của chủng Bt var kurstaki HD-1 gọi là gen cry1 và biểu hiện ở E coli Từ đó, một số lượng lớn các gen

đã được tách dòng và đọc trình tự Năm 1983, Krieg và cộng sự đã phân lập

ra loài phụ Bt var tenebrionit diệt bọ cánh cứng hại lá khoai tây vùng Colorado, Hoa Kỳ từ sâu tenebrio molitar Sau đó, công ty Mycogen phát

hiện ra một chủng tương tự Bt var tenebrionit tên là Bt var sandiego và đã tổng hợp được chuỗi gen độc tố của chúng Năm 1985, gen cry của Bt đã được chuyển vào cây trồng để diệt sâu Năm 1987, phát hiện ra Bt diệt giun tròn thực vật Năm 1991, phát hiện ra Bt diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda

Năm 1995, cây chuyển gen thương phẩm đầu tiên đã được đưa và sản xuất

Năm 2003, saikai và cộng sự đã công bố protein tinh thể của Bt diệt tế bào ung thư Năm 2005, Ohba đã phát hiện ra protein của 4 dưới loài Bt phân lập

ở Việt Nam có khả năng chống tế bào ung thư cổ tử cung của người [3]

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis tại Việt Nam

Ở Việt Nam thuốc trừ sâu sinh học Bt được ứng dụng đầu tiên tại Viện

Bảo vệ Thực vật năm 1971 Nguyễn Văn Cảm và cs, đã khảo nghiệm 5 loại

thuốc trừ sâu sinh học Bt nhập nội từ Liên Xô, Trung Quốc đã cho kết quả rất khả quan Tuy nhiên, những nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt đầu tiên

được Nguyễn Công Bình và cs thực hiện lần đầu tiên vào năm 1973 tại Viện Sinh vật, Viện Khoa học (nay là Viện Khoa học và Công nghệ) Có thể chia

lịch sử 30 năm phát triển Bt của thành 3 thời kỳ như sau:

1.1.2.1 Thời kỳ mở đầu nghiên cứu

Nguyễn Công Bình, Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính là những người đầu

tiên mở đường nghiên cứu Bt tại Việt Nam Năm 1973, Viện Sinh vật đã tiến hành sản xuất Bt bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí nghiệm Năm 1973-1976, Bt đã được sản xuất chủ yếu trên môi trường đặc

với giá thể là agar tự chế tạo từ rong câu và các nguyên liệu khác như: bã khô

lạc, bột đậu tương, bột cá, các chủng Bt được sử dụng để sản xuất ở thời kỳ này do Nguyễn Công Bình mang từ Trung Quốc về có loài phụ Bacillus thuringiensis var thuringiensis, B thuringiensis var kurstaki Các chế phẩm

này đã được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã thu được các kết

quả tốt đẹp Năm 1975, chế phẩm Bt đã được sản xuất theo phương pháp lên

men chìm trong nồi lên men tự tạo tại Phòng Sinh học thực nghiệm thuộc phân viện Viện Khoa học đóng tại thành phố Hồ Chí Minh Năm 1982, Viện

Công nghệ thực phẩm cũng sản xuất chế phẩm Bt theo phương pháp lên men

phẩm Bt đã bị giảm sút vì các chế phẩm Bt sản xuất ra có chất lượng không

cao nên tốc độ tiêu thụ giảm Nhìn chung, trong thời kỳ này đã bắt đầu sản

xuất và áp dụng thành công chế phẩm Bt đã khiến cho các nghiên cứu Bt mở

đầu khá thuận lợi và tốt đẹp

1.1.2.2 Thời kỳ sản xuất và ứng dụng (1984-1994)

Các chế phẩm Bt sản xuất theo phương pháp dịch thể được áp dụng rộng

rãi, có hiệu quả phòng trừ rất rõ rệt, hơn nữa giá bán không cao (khoảng 6000

đồng/lít) nên phù hợp với thu nhập của nông dân Việc sản xuất chế phẩm Bt

theo phương pháp lên men hở không cần vô trùng đã được một số đơn vị thuộc các trường đại học đề xuất nhưng đã không thu đươc kết quả tốt

1.1.2.3 Thời kỳ nghiên cứu cơ bản, ứng dụng và phát triển (1994-nay)

Cuối thời kỳ sản xuất và ứng dụng 1984-1993, chế phẩm Bt kém chất lượng không tiêu thụ được Sản xuất và ứng dụng Bt bước vào thời kỳ thoái trào, các nhà

nghiên cứu lại phải quay lại nghiên cứu cơ bản để phục vụ cho xây dựng công nghệ sản xuất và cơ sở ứng dụng Do vậy, khoảng 10 năm trở lại đây, các nhà

khoa học đã chuyển việc nghiêm cứu Bt sang hướng mới là tìm ra các chủng Bt có

phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục hồi lại việc sản xuất thuốc trừ sâu

Bt và ứng dụng công nghệ chuyển gen Bt phục vụ sản xuất

Các chủng Bt phân lâp tại Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài và đa

dạng về gen Năm 1998, có 34 chủng chuẩn mang kháng nguyên tiêm mao H

và đã chế tạo được 34 bộ sinh phẩm (kit) phục vụ cho phân loại Bt bằng

phương pháp huyết thanh Bằng phương pháp PCR với hỗn hợp các cặp mồi

đặc hiệu cho 7 gen thuộc nhóm gen cry typ 1 cho thấy có 102 chủng Bt trong tổng số 115 chủng có chứa 311 gen cry1 (chiếm 88.7%), đáng chú ý là các

Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gen có trong các chủng Bt

phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng và biểu hiện gen

mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E coli từ các chủng Bt aizaiwai phân lập từ các mẫu đất của Hà Nội và Hà Tĩnh, các

protein tái tổ hợp thu được đã cho hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đôi chứng Năm 2000, Võ Thị Thứ và cs đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein

cry4A diệt ấu trùng muỗi Năm 2003, Lê Thị Thu Hiền đã thiết kế thành công vectơ chuyển gen cry1A vào cây bông [1]

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gen kháng côn trùng vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được bắt đầu từ cuối thế kỷ 20 Trong đó, đã có rất nhiều nghiên cứu chuyển gen

cry1A kháng sâu vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium fumefaciens để tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng kháng sâu như:

cây đậu xanh, cây cải bông [4.5,6,9,10] Năm 2003, Phan Đình Pháp và cs

đã chuyển gen cry1B vào cây lúa thông qua phương pháp sử dụng súng bắn

gen, đến năm 2005, gen kháng sâu trên được chuyển vào cây cà tím thông qua

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [11]

1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus thuringiensis

1.2.1 Đặc điểm hình thái

Theo các tài liệu về phân loại vi khuẩn gây bệnh côn trùng của Sneath

(1986) Wistreich và Lechtman (1988), Syahly (1991) thì vi khuẩn Bt được xếp vào nhóm I, chi Bacillus, họ Bacillaceae, nghành Firmicutes [3]

Bt thuộc chi Bacillus là vi khuẩn đất, hình que, gram dương, hô hấp hiếu

khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, kích thước tế bào từ 3 – 6 µl, có phủ tiêm

mao không dày, chuyển động được Các loài thuộc chi Bacillus có khả năng

hình thành bào tử khi gặp những điều kiện bất lợi của môi trường, bào tử có dạng hình trứng với kích thước từ 1,5 - 2 µl và có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng khi gặp điều kiện thuận lợi Bào tử là dạng sống tiềm ẩn của vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt, bức xạ, hoá chất, áp suất thẩm thấu cao Màng ngoài nằm ở ngoài cùng đó là phần sót lại của tế bào mẹ, chiếm khoảng 2 – 10% khối lượng khô của bào tử Thành phần chủ yếu là lipoprotein, cũng có một lượng nhỏ axit amin, có tính thẩm thấu kém Lớp áo bào tử có cấu tạo bởi

3 – 15 lớp, chủ yếu là protein sừng Áo bào tử có sức đề kháng cao với lizozim, proteinaza, các chất hoạt động bề mặt, có tính thẩm thấu kém đối với các cation Dưới áo bào tử là vỏ bào tử Vỏ bào tử chứa một lượng lớn peptidoglucan đặc biệt, ít liên kết chéo, ngoài ra còn có 7 – 10% (tính theo khối lượng khô của bào tử) chất dipicolinat canxi (DPA- Ca) không chứa axit

teicoic Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ bào tử cao tới 20atm, lượng chứa nước

là 70% Dưới lớp vỏ bào tử là lõi bào tử còn gọi là thể chất nguyên sinh cấu tạo bởi 4 thành phần: thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất và vùng nhân

Đặc biệt trong quá trình hình thành bào tử vi khuẩn Bt có thể sinh ra

những tinh thể mang tính độc đối với côn trùng Tinh thể là một loại protein

có kích thước khoảng 0,6 x 0,02 μm có thể chiếm 25% trọng lượng khô của tế bào và có hình dạng rất đa dạng: hình tháp, hình ovan, hình lập phương hoặc

có hình dạng không xác định … Khi ở trong tế bào sinh dưỡng thì bào tử và tinh thể thường nằm kề nhau, khi tế bào tan thì bào tử và tinh thể cùng thoát

ra ngoài [3,14]

Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fushin và quan sát dưới kính hiển vi ta thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm còn bào tử thì bắt màu hồng nhạt

(hình 1.1) [3,6,7]

Bt có đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hoá rất giống với các nhóm trực khuẩn sinh bào tử B cereus, B mycoides và B anthracis tuy nhiên Bt có khả

năng sinh tinh thể còn loài khác thì không [4]

1.2.2 Đặc điểm sinh hoá

Bt không lên men sinh axit với arabinoza, xiloza và manitol nhưng tạo

axít trong môi trường có glucoza, có khả năng thuỷ phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà, phát triển được trong môi

trường thạch kị khí có chứa 1% lizozim Bt có khả năng sinh trưởng và phát

triển ở nhiệt độ 15 – 450C, nhiệt độ tối ưu là 28 – 300

C, pH = 7 Bt không có

khả năng khử amin của phenilalanin, không sử dụng axít axetic, không khử muối sunfit

1.2.3 Tính chất nuôi cấy

Tính chất nuôi cấy là đặc tính vốn có của vi sinh vật, là một trong những

tiêu chuẩn để định loại vi sinh vật Tính chất nuôi cấy của các dưới loài Bt

Hình 1.1: Hình thái bào tử và tinh thể của một số chủng Bacillus thuringiensis

(A: Kính hiển Vi quang học; B: Kính hiển vi điện tử quét)

khác nhau là khác nhau, đồng thời phụ thuộc vào thành phần môi trường, thời gian và nhiệt độ nuôi cấy

Khuẩn lạc của dưới loài Bt var kurstaki nuôi cấy trên môi trường MPA

ở 300C trong 72 giờ đa số có hình tròn, màu trắng sữa có mép nhăn đường

kính có thể đạt tới 8 – 10mm Trong khi đó khuẩn lạc loài phụ berlinner có

dạng thảm, với các sợi hình phóng xạ, đường kính khoảng 10mm; màu vàng nhạt và trơn ướt, viền nhăn thành hình vải thô mở rộng ra xung quanh nên được gọi là dạng phóng xạ nhăn Nếu nuôi cấy có bổ sung 2% gluco, nuôi ở

sau 42 giờ thành hình vành khăn tròn dày, đường kính 3mm, giữa có một vành tròn tương đối sâu, bề mặt trắng tối, hơi ánh quang, dạng hạt thô khô,

sau 72 giờ đường kính có thể đạt 2cm Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn lạc

trơn nhẵn [3,4]

1.2.4 Phương pháp phân loại Bacillus thuringiensis

Có nhiều phương pháp phân loại Bt khác nhau Khóa phân loại đầu tiên

được thiết lập dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hoá (Heimpel và Angus, 1958) Tuy nhiên phân loại theo phương pháp này không phân biệt

được các chủng Bt một cách rõ ràng bởi vì Bt có các đặc điểm hình thái, sinh

lý sinh hoá rât giống các đại diện trong nhóm trực khuẩn sinh bào tử Bacillus cereus, B thuringiensis, B mycoides, B anthacis Mới đây phát hiện thêm 2

loài là B weihenstephanensis và B pseudomycoides [3,4,14]

Ngoài ra, người ta con phân loại vi khuẩn Bt theo typ huyết thanh kháng

protein tinh thể, typ huyết thanh kháng nguyên – O, theo loại hình enzym lipaza, dựa trên plasmit và phân loại theo nguồn bệnh Nhưng trong cùng một chủng có sự tồn tại của các typ gen ngoại độc tố khác nhau (Sanchis và cộng

sự, 1988) đã ngăn chặn việc sử dụng các đặc điểm này là cơ sở cho khoá phân

loại các chủng B t [3,14].

Cho đến nay, khoá phân loại vi khuẩn Bt theo phương pháp huyết thanh

được de Barjac và Bonnefoi đề nghị vào năm 1962, sau đó được Lauren và Thyery cải tiến năm 1996, được sử dụng phổ biến và là phương pháp đáng tin

cậy được trung tâm quốc tế Bt đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm nghiên cứu Bt trên thế giới từ năm 1982 [2,3]

Nguyên lí: Khi kháng nguyên lông roi kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngưng kết Kết quả của phản ứng là tạo cặn lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường Dưới kính hiển vi đối pha hoặc kính hiển vi quang học có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được Đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết

thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác của Bt [3,14]

Phản ứng ngưng kết

Hình 1.2 Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên lông roi H

1.2.5 Đặc điểm loài phụ Bacillus thuringiensis var kurstaki

Bacillus thuringiensis var kurstaki được phát hiện lần đầu tiên năm

1901, tuy vậy tiềm năng thương mại của nó đã bị lãng quên cho đến mãi năm

1951 Tuy nhiên, trong các thập kỷ gần đây, B thuringiensis var kurstaki đã

trở thành phương tiện chủ yếu để kiểm soát sâu hại cây vân sam tại Canada

Đến năm 1986, việc sử dụng Bt var kurstaki tăng một cách đáng kể, khoảng 74% rừng được phun đối với sâu hại cây vân sam Ở các nước khác, Bt var kurstaki được sử dụng để trừ sâu bướm, bướm đêm, sâu thuốc lá và đặc biệt là

sâu tơ hại bắp cải, sinh sản nhanh, thời gian sống ngắn nhưng mức độ phá hoại cao

Bacillus thuringiensis var kurstaki là một trong số 82 dưới loài của vi khuẩn B thuringiensis và chiếm tỉ lệ cao nhất Theo các tài liệu công bố, thì

trong số 83,5% số chủng kiểm tra ngưng kết với các typ huyết thanh đã có thì

Bacillis thuringiensis var kurstaki ngưng kết với typ H3a,3b,3c chiếm 27,6%,

sau là B thuringiensis var azawai ngưng kết với typ H7 chiếm 15%, B

thuringiensis var morrisoni ngưng kết với typ H8a,8b chiếm 13,8%,…Bacillus thuringiensis var kurstaki sinh tinh thể hình lưỡng tháp, hình lập phương và

hình cầu trong đó hình lưỡng tháp là chủ yếu cà có hoạt tính với côn trùng bộ

cánh vẩy (Lepidoptera), và một số côn trùng bộ hai cánh (Diptera) Các tinh thể có trọng lương phân tử 130 – 140kDa được mã hóa bởi 130 gen cry1 khác nhau từ cry1A – cry1F Dưới đây là bảng phân loại độc tố Cry1 ở Bacillus thuringiensis var kurstaki và côn trùng [3]

Bảng 1 Phân loại độc tố Cry1 ở Bacillus thuringiensis var kurstaki và côn

trùng đích

Độc tố Trọng lƣợng

Plutella xylostella, Ostri nianubilalis Cry1Ab 131 Heliothis vires cens, Mandacasexta, Pieris

brassiace Cry1Ac 133,3 Tricho plusiani, Ostrinia nianubilalis,

Heliothis virescens, Manduca sexta, Pieris brassiace

Spodoptera exigua, Mamestra brassicae

Spodoptera littoralis

Spodoptera exgua

1.2.6 Hệ thống di truyền của vi khuẩn

1.2.6.1 Hệ gen của vi khuẩn Bt

Kích thước hệ gen của vi khuẩn Bt vào khoảng 2,4 – 5,7 triệu bp Thể

nhân (Nuclear body) ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thuỷ, chưa có màng nhân nên không có hình dạng nhất định, và vì vậy được gọi là vùng nhân Khi

nhuộm màu tế bào bằng thuốc nhuộm Feulgen có thể thấy nhân hiện màu tím

Đó là một nhiễm sắc thể duy nhất dạng vòng chứa một sợi ADN xoắn kép

Thể nhân chứa đựng thông tin di truyền của vi khuẩn Bt Hầu hết các chủng

Bt phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài NST, các nhân tố di truyền này

có thể đóng vòng hoặc không đóng vòng

1.2.6.2 Phân loại gen độc tố diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis

Năm 1982, Held và cộng sự đã lần đầu tiên sử dụng chữ viết tắt cry từ

chữ Crytal có nghĩa là tinh thể để biểu diễn gen tổng hợp protein tinh thể diệt

sâu Các chủng Bt sinh tổng hợp 3 dạng độc tố đó là: Độc tố Cry (dạng chủ yếu – tinh thể độc) được mã hóa bởi các gen cry khác nhau và độc tố Cyt (độc

tố phân huỷ tế bào) do gen cyt mã hoá, độc tố này làm tăng khả năng diệt côn trùng của độc tố Cry và độc tố Vip (vegetative insecticidal protein) do gen vip

mã hoá tổng hợp Gen này không xếp vào họ gen cry vì không sinh tinh thể

Các chủng Bt khác nhau có hoạt tính diệt côn trùng khác nhau Nhiều

nghiên cứu đã cho thấy rằng hoạt tính và phổ tác dụng diệt côn trùng được quyết định bởi cấu trúc protein tinh thể[3]

1.2.6.3 Vị trí của các gen mã hoá protein tinh thể diệt côn trùng trong tế bào

Từ những năm đầu thập kỷ 80, nhiều nhà nhiên cứu tập trung vào sự

tồn tại của các gen ICPs (insecticidal crytal protein) ở các loài phụ Bt khác

nhau Một số nghiên cứu về mối tương quan về sự có mặt của plasmid và khả năng hình thành tinh thể diệt côn trùng Các phương pháp xử lý plasmid, tiếp hợp và các thí nghiệm tách dòng đã chứng minh rằng các gen mã hoá protein diệt côn trùng thường nằm trên các plasmid có hệ số copy thấp Tuy nhiên, có những công bố về sự tồn tại của gen mã hoá protein tinh thể diệt sâu trong

nhiễm sắc thể của một số dưới loài như: kustaki HD1 entomocidus, aizawai 7.92, dendrolimus và wuhanensis Carlton và Gonzalez đã tiến hành cuộc điều

tra về sự có mặt của plasmid trong hầu hết các chủng Bt Những nghiên cứu của họ trên 21 loài phụ Bt cho thấy số plasmid dao động từ 2 đến 12 trong các

chủng nghiên cứu Các thí nghiệm lai gen đã cung cấp bằng chứng về sự tồn

tại của các gen tổng hợp nhiều loại độc tố trong một tế bào Bt Ví dụ các plasmid trong Bt var aizawai và kurstaki HD1 có 5 gen mã hóa protein diệt

côn trùng nằm nhiều vị trí khác nhau trong tế bào [4,21]

Sau những nghiên cứu về xác định vị trí của các gen độc tố trong tế bào

vi khuẩn, rất nhiều nhóm nghiên cứu đã tách dòng gen ICP của một số dưới

loài Bt Năm 1981, Schnepf và Whitelay công bố đã tách dòng và biểu hiện gen cry từ Bt var kustaki HD1 trong chế phẩm Dipel Họ đã biểu hiện được

gen trong E.coli và chỉ ra rằng chủng này có hoạt lực đối với ấu trùng

Manduca sexta Tiếp theo công bố này, hàng loạt công bố về gen mã hoá cho

tiền độc tố (protoxin), đã được tách và đọc trình tự Các gen này tổng hợp protein diệt côn trùng bộ cánh vảy, hai cánh và cánh cứng Hiện nay có tới hơn 300 gen đã được tách dòng và đăng kí trên ngân hàng dữ liệu gen (Gene Database) [7]

1.2.6.4 Đặc điểm riêng của một số nhóm gen và độc tố của chúng

Nhóm gen cry1: gồm trên 130 gen thuộc các nhóm gen cry1A-cry1L

mã hoá cho các protein có khối lượng 130kDa, tích luỹ thể vùi dạng hình tháp

và thường chỉ có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, điển hình là ấu trùng bướm ngài, côn trùng keo, côn trùng tơ Nhóm gen này được

phân thành các nhóm phụ sau: cry1A, cry1B, cry1C, cry1D, cry1E … Trong

đó gen cry1A được chia làm 3 gen cry khác nhau : cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac

với hơn 80% các axit amin tương đồng

Nhóm gen cry2: Mã hóa tổng hợp protein có trọng lượng phân tử

khoảng 71 kDa, tạo thể vùi hình lập phương trong đó bao gồm cry2A, cry2B

và cry2C, cả ba gen này đều mã hoá tổng hợp protein có trên dưới 633 axit

amin Có độc tính đối với côn trùng bộ cánh vảy (Heliothis virecens và

Lymantri adipans), bộ 2 cánh (Aedes aegypti) Riêng gen cry2B và cry2C

tổng hợp protein chỉ gây độc cho bộ côn trùng cánh vẩy

Nhóm gen cry3: Gồm 16 gen thuộc các nhóm cry3A-cry3C mã hoá cho

các protein có khối lượng khoảng 73kDa tạo tinh thể hình lưỡng tháp, hình

lập phươn, có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ cánh cứng

Nhóm gen cry4: Gồm 8 gen thuộc nhóm cry4A - cry4B mã hoá cho cả

2 loại protein tinh thể có khối lượng 70kDa và 130kDa tạo tinh thể hình cầu và

hình lập phương, có hoạt tính đối với các loài thuộc bộ 2 cánh Độc tính của

protein nhóm 4 tăng mạnh khi chúng tạo phức với protein 27kDa do gen cyt

mã hoá

Nhóm gen cry5: Mã hoá cho protein có khối lượng 81kDa, gây độc

với côn trùng thuộc bộ cánh vảy và cánh cứng [20]

Nhóm gen mã hoá cho độc tố Cyt: Nhóm gen cyt bao gồm 2 lớp cyt1

và cyt2 mã hoá tổng hợp protein 27kDa, là thành phần chính của tinh thể,

protein này có tác dụng tiêu hủy tế bào động vật không xương sống

Nhóm gen cyt thông thường tồn tại ở các chủng Bt chứa nhóm gen cry4

Nhóm gen cyt mã hoá protein có trọng lượng khoảng 27KDa và có trong thể

vùi (chiếm khoảng 40 – 50% tinh thể) Tinh thể độc này thường có tác dụng

yếu với côn trùng thuộc bộ 2 cánh và giun tròn thuộc bộ thân mềm

Nhóm gen mã hoá cho độc tố Vip: Gần đây người ta đã phát hiện ra

một số loại protein tiết ra môi trường nuôi cấy Bt trong pha sinh trưởng, có

một độc lực lớn đối với côn trùng Protein này được gọi là Vip (vegetative

insecticidal protein) do gen vip mã hoá tổng hợp Gen này không xếp vào họ

gen cry vì không sinh tinh thể

1.2.6.5 Đặc điểm về gen cry1Ab, cry1Ac

Gen cry1Ab kích thước gen 3468 bp mã hóa tổng hợp protein tinh thể độc

tố Cry1Ab với trọng lượng phân tử 131kDa, có hoạt tính độc với côn trùng cánh vẩy, và có trong các dưới loài Bacillus thuringiensis var kurstaki, var berliner, var aizawai [40]

Khi phân tích vùng 2 của độc tố Cry1Ac và Cry1Ab, người ta nhận thấy chúng có cấu trúc bậc 1 gần giống nhau Ngoài ra, trong nghiên cứu khả năng

tổ chức các thụ thể trên màng tế bào ruột côn trùng thì vùng 2 của độc tố

Cry1Ac có khả năng liên kết cả 3 loại thụ thể có khối lượng phân tử khác nhau [17]

Hình 1.3 A: Cấu trúc không gian của độc tố cry1Ab B: Cấu trúc không gian của độc tố cry1Ac

* Ngoại độc tố β

Ngoại độc tố β có trọng lượng phân tử thấp 707 – 850 kDa, là độc tố bền nhiệt, tan trong nước Ngoại độc tố β có tác dụng kìm hãm nucleaza và ARN – polymeaza dẫn tới cản trở việc tổng hợp ARNt Ngoại độc tố β có phổ hoạt tính rộng, có hoạt tính với côn trùng thuộc bộ cánh vảy, côn trùng thuộc bộ cánh cứng và côn trùng thuộc bộ hai cánh Qua nghiên cứu Brian Federici và

Dongwu cũng nhận thấy rằng chế phẩm Bt nếu chỉ sử dụng ngoại độc tố β thì

hiệu quả diệt côn trùng chỉ đạt 20% trong khi đó nếu bổ sung độc tố γ thì hiệu quả diệt côn trùng sẽ tăng lên tới 75%

* Ngoại độc tố γ

Ngoại độc tố có γ trọng lượng phân tử thấp, mẫn cảm với nhiệt độ, ánh sáng và không khí, có khả năng tan trong nước Độc tố này thuộc nhóm photpholipase, có tác dụng lên photpholipit và giải phóng ra axit béo, rất mẫn cảm với nhiệt độ, ở nhiệt độ từ 600C trở nên trong vòng từ 10 – 15 phút đã bị

vô hoạt

* Nội độc tố δ

Nội độc tố δ có tác dụng diệt côn trùng mạnh nhất Nó có bản chất là một protein gồm 1180 axit amin, các axit amin chủ yếu là glutamic, asparaginic, chiếm trên 20% tổng số axit amin trong phân tử protein, đây cũng là một nguyên nhân gây ra điểm đẳng điện thấp Lượng xistin nhỏ hơn 20% tổng số axit amin quy định sự không hòa tan của tinh thể, ngoài ra còn có các axit amin: acginic, treonin, lơxin, izolơxin

Ngoài protein tinh thể còn chứa các thành phần khác như: hydratcacbon, tuy nhiên cũng có thể hydratcacbon chỉ là thành phần phụ được pha tạp trong quá trình hình thành bào tử Xét về thành phần hóa học thì nội độc tố chứa chủ yếu các nguyên tố C, H, O, N, S Ngoài ra còn có Ca, Mg, Si, Fe và một lượng nhỏ Ni, Ti, Zn, Al, Cu, Mn Tuy nhiên, nguyên tố P hầu như không có

Nội độc tố δ có đặc điểm không hòa tan trong các dung môi hữu cơ, chỉ tan trong môi trường có pH kiềm, không tan trong nước, rất bền nhiệt Khi

C trong 30 – 40 phút thì tinh thể bị mất tính độc

1.4 Đặc điểm của protein tinh thể độc

1.4.1 Cấu trúc của protein tinh thể Cry

Cấu trúc của protein tinh thể đã được làm sáng tỏ nhờ kỹ thuật nghiên

cứu tinh thể bằng tia X với những nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc Cry3A và Cry1Aa, sau đó được mở rộng cho các độc tố khác Các protein tinh thể có

cấu trúc chung gồm 3 vùng riêng biệt:

Hình 1.4 Mô hình cấu trúc chung của một protein độc tố Cry

bắc cầu xuyên qua lớp kị nước dầy 30 Å của màng kép và tạo nên kênh trên màng Để tạo được lỗ rò xuyên qua màng tế bào, những chuỗi  bên ngoài phải biến đổi đảo ngược để mặt kị nước của nó tiếp xúc lớp màng photpholipid trong khi mặt ưa nước kết hợp với vùng 2 tạo ra một lỗ rò không còn tính đặc hiệu Một số nghiên cứu gần đây phát hiện ra những đoạn oligomer rất quan trọng trong hoạt động của -endotoxin Khi bị mất Glu-129, Arg-131, Asp-136 của chuỗi -4 thì Cry1Aa không còn độc tính với côn trùng, trong khi mất Arg-127 và Asn-138 thì độc tính không hề bị ảnh hưởng Vùng 2 gồm 3 tấm  đối song song quấn quanh một lõi kị nước Nhiều nghiên cứu cho rằng vùng 2 đóng vai trò quan trong trọng việc gắn kết với thụ thể Có một sự tương đồng lớn giữa cấu trúc 3 tấm  này với 3 loại thụ thể glycoprotein ở nhiều loài côn trùng (Amino peptidase N, Cadherin - like

protein và Anionic glycoconjugates) Những kết quả trên gợi ý rằng tất cả các móc (loop) của vùng 2 có thể tham gia gắn vào các thụ thể khác nhau, tương

tự như vị trí liên kết kháng nguyên - kháng thể Khi phân tích vùng 2 của độc

tố Cry1Ac và Cry1Ab, người ta thấy rằng chúng có cấu trúc bậc 1 gần giống nhau nhưng vùng 2 này lại có thể gắn với các thụ thể khác nhau Ngoài ra, trong nghiên cứu khả năng tổ chức các thụ thể trên màng tế bào ruột côn trùng thì vùng 2 của Cry1Ac có khả năng điều khiển cả 3 loại thụ thể có khối lượng phân tử khác nhau (110kDa, 130kDa và 170kDa)

Vùng 3 gồm 2 tấm  xoắn lại, nằm ở đầu C của phân tử độc tố, cấu

trúc của nó có thể bảo vệ độc tố Bt tránh khỏi sự phân giải quá mạnh của

proteaza ruột giữa côn trùng Vùng 3 có thể còn tham gia vào quá trình nhận diện thụ thể và điều khiển kênh ion Chức năng của vùng 3 còn đang được nghiên cứu thêm

Những nghiên cứu gần đây cho biết trình tự axit amin bao từ cuối vùng 2 đến đầu vùng 3 liên quan chặt chẽ đến tính gắn của tinh thể độc vào niêm mạc ruột côn trùng Khi trình tự này biến đổi làm mất đi tính gắn đó côn trùng có hiện tượng kháng thuốc Vì thế vùng 2 và 3 được coi là vùng quyết định đến tính kháng thuốc của côn trùng[3]

1.4.2 Cơ chế tác động của protein tinh thể diệt côn trùng

Các chủng Bt khác nhau có hoạt tính diệt côn trùng khác nhau Khả năng diệt

côn trùng của các loài Bt chỉ thể hiện khi tinh thể độc được côn trùng tiêu hoá

Khi côn trùng ăn phải tinh thể độc và nuốt vào ruột, tinh thể sẽ được hoà

tan và thuỷ phân các tiền độc tố 130kDa và 70kDa thành δ – endotoxin nhờ

pH kiềm cao và hệ enzym proteaza ở trong ruột ấu trùng Độc tố này bám dính lên tế bào thượng bì của ruột tạo nên lỗ thủng để cho ion và nước chảy vào làm cho tế bào căng lên và vỡ ra dẫn đến tế bào bị phân hủy làm cho côn

trùng ngừng ăn, liệt ruột và chết Tuỳ theo loại côn trùng mà có ít nhất 3 cơ chế gây độc đó là:

* Côn trùng sau khi ăn phải tinh thể độc của Bt thì sau 5 – 20 phút ruột sẽ

bị tê liệt, pH trong máu và bạch huyết tăng lên từ 1 – 1,5 đơn vị, pH ruột giữa

hạ xuống do chất kiềm của ruột thấm vào máu, các tế bào biểu mô của ruột phá huỷ dẫn đến cơ thể bị phá huỷ trong sau 1 giờ

* Sau khi côn trùng ăn phải tinh thể độc thì nó ngừng ăn, ruột bị tê liệt

nhưng pH trong máu và bạch huyết không tăng Côn trùng sẽ chết sau 2 – 4 ngày mặc dù không bị tê liệt toàn thân

* Đặc biệt tinh thể độc nhất thiết phải đi kèm với bào tử thì mới gây chết cho côn trùng Côn trùng sẽ chết sau 2 – 4 ngày mà không có hiện

tượng liệt [3,4]

* Độc tố đã được hoạt hoá bám vào các phân tử cảm thụ đặc biệt nằm trên màng vi thể của tế bào thành ruột sâu Sự gắn kết này ở ruột làm thay đổi gradien điện hoá tạo thành các lỗ rò Do đó phá huỷ cân bằng áp suất thẩm thấu của màng tế bào, làm cho tế bào bị phồng lên và bị phân huỷ

dẫn đến sâu chết [17]

Đặc điểm quan trọng nhất trong cơ chế tác động của độc tố lên côn trùng

là sự gắn kết của độc tố với thụ thể và hình thành lỗ rò (kênh ion) Sự gắn kết độc tố với thụ thể của tế bào ruột sâu là quá trình phức tạp Đó là sự gắn kết của độc tố với thụ thể (phân tử cảm thụ) nằm trên màng vi thể của ruột tế bào sâu Quá trình này gồm 2 giai đoạn – giai đoạn gắn kết bền vững và không bền vững Các nhà khoa học đã tìm ra vai trò của vùng I, vùng II, vùng III trong quá trình gắn kết

* Chức năng hình thành kênh ion

Cấu trúc của độc tố bao gồm vùng I với bộ bó 7 chuỗi xoắn alpha Vùng này có chức năng bám vào màng ruột côn trùng và hình thành các lỗ rò (kênh

ion) Hill và cộng sự cho rằng kênh ion giống như lỗ rò đại phân tử, có tính

và K+ có thể đi qua [4]

Như vậy, khả năng gây độc của nội độc tố ọ phụ thuộc vào thành phần tiền độc tố cũng như quan hệ của nội độc tố với những điểm nhận của tế bào thượng bì ruột Tương ứng với mỗi họ protein mang tính độc sẽ có một họ các điểm nhận của các giống sâu mẫn cảm [3]

1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến việc hình thành protein tinh thể độc

Tất cả các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng và phát triển của

Bt đều ảnh hưởng đến quá trình hình thành tinh thể độc

Vi khuẩn Bt sinh trưởng bình thường ở khoảng nhiệt độ 28 – 32, nhiệt

độ tối thích là 300C Nếu nuôi cấy ở nhiệt độ 150C trở xuống thì bào tử không được tạo thành còn tinh thể vẫn được tạo thành pH tối ưu cho sinh trưởng là

Hình 1.5 Cơ chế tác động của protein tinh thể diệt côn trùng

7 pH quá cao (>12) hoặc quá thấp (<3,3) đều làm biến tính tinh thể và sự

phát triển của Bt

Một số nguồn dinh dưỡng có ảnh hưởng tới quá trình hình thành tinh thể độc như nguồn C, N, P Pepton có hiệu quả rõ rệt khi cho vào môi trường với nồng độ 0,3 – 0,5%

Nồng độ oxy có ảnh hưởng quan trọng đối với sự hình thành bào tử và

tinh thể độc ở vi khuẩn Bt Nồng độ oxy đưa vào môi trường phải thích hợp

theo từng giai đoạn, nếu ở giai đoạn đầu của sinh trưởng mà thiếu oxy thì sự tích luỹ sinh khối sẽ giảm mạnh, còn trong giai đoạn bào tử, tinh thể, nếu thừa oxy thì tinh thể hình thành sẽ bị giảm đi, lượng ngoại độc tố tăng lên mạnh mặc dù số lượng bào tử không thay đổi

Quá trình hình thành bào tử đòi hỏi sự tổng hợp một loại proteaza ngoại bào Ở những chủng đột biến do không tổng hợp được enzym này nên cũng sẽ không sinh ra được bào tử và tinh thể Như vậy, sự tạo thành bào tử và tinh thể có liên quan đến sự chuyển hoá phần protein của tế bào sinh dưỡng

Một số axitamin có tác dụng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn cũng như

sự tạo thành tinh thể, như lơxin, izo lơxin Tuy nhiên khi có valin trong môi trường thì tác dụng này mất đi

Những nhân tố ảnh hưởng tới sự trao đổi axit axetic cũng làm ức chế việc tạo thành bào tử và tinh thể

Chất kháng sinh Erytromycin ở nồng độ thấp chưa đủ để ức chế sự sinh

trưởng của Bt nhưng nó lại cản trở sự hình thành bào tử Sự có mặt của chất

kháng sinh này cũng làm thể mang bào tử không bị phân giải và tinh thể sẽ bị giữ lại trong phần còn lại của thành tế bào

1.5 Đại cương về côn trùng thử nghiệm

Sâu là một trong những dịch hại chủ yếu đối với nền sản xuất nông nghiệp Chúng phá hoại tất cả các bộ phận của cây: lá, hoa, quả, thân làm cho cây ngừng sinh trưởng hoặc kém phát triển dẫn tới cây bị chết Nước ta là một nước nhiệt đới gió mùa nên độ ẩm và điều kiện rất thích hợp cho đa số các

loài côn trùng phát triển mạnh mẽ, trong số đó có sâu tơ (Plutella xylostela) Sâu tơ thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera), họ ngài rau (Plutellidae) hay

còn gọi là sâu bay, sâu đu, sâu nhảy dù

Đặc điểm gây hại: Sâu tơ có thể phá hoại tới 39 loài rau khác nhau trong

họ hoa thập tự, đặc biệt gây hại cho cải xanh, cải bắp, su hào, lạc, các cây họ

cà như khoai tây, cà chua Sâu non tuổi 1 khi ăn đục một lỗ nhỏ ở mặt dưới

lá, chui đầu vào ăn nhu mô lá để chừa lại biểu bì Sâu tuổi 2 gặm ăn mặt dưới

lá để lại lớp biểu bì trên lá tạo thành những đốm trong mờ Cuối tuổi 2 trở đi sâu gặm thủng và tạo thành các lỗ thủng Khi số lượng sâu nhiều rau bị hại nghiêm trọng Ví dụ như: Cải bắp bị hại thường không cuốn bắp, su hào bị hại nặng củ không lớn được và nhanh chóng bị hoá gỗ [5,25]

Hình 1.6 A: Sâu tơ (Plutella xylostela) B: Rau cải bắp bị sâu hại

- Đặc điểm hình thái: Trưởng thành sâu dài 6 – 7mm, sải cánh rộng 12 – 15mm, màu xám đen Cánh trước màu nâu xám, trên có nhiều chấm nhỏ màu nâu, từ chỗ chân cánh tới góc sau có một dải màu trắng ở ngài đực và màu vàng ở ngài cái Trứng hình bầu dục màu vàng, xanh nhạt, đường kính 3 – 5mm Sâu non màu xanh nhạt, đẫy sức dài 9 – 10mm, mỗi đốt đều có lông nhỏ Phía trước mép ngoài của phần gốc chân bụng có một ít lông hình tròn, trên đó có 3 lông nhỏ Trên mảnh cứng của lưng ngực trước có những chấm xếp thành hình chữ u Nhộng màu vàng nhạt, dài 5 – 6mm, mắt rất rõ, kén mỏng hình thoi nên sâu tơ còn gọi là sâu kén mỏng [5,25]

- Chu kỳ sinh trưởng: Tuỳ theo nhiệt độ mà sâu tơ có chu kỳ sinh trưởng

ở nhiệt độ 15 – 200C thì một vòng đời của chúng là 40 ngày (Hassanneris, 1958)

1.6 Tổng quan về tách dòng gen

1.6.1 Khái niệm về tách dòng gen

Thực chất của việc tách dòng gen là gắn một gen, một trình tự DNA cần thiết (DNA insert) vào vectơ tách dòng, tạo các vectơ tái tổ hợp và đưa vào tế bào nhận (tế bào chủ), nhằm thu được một số lượng lớn các bản sao của gen hoặc trình tự DNA cần thiết

Tách dòng gen còn được gọi là phân lập gen, có nhiều phương pháp tách dòng gen khác nhau Tách dòng invitro (in vitro gene cloning), tách dòng silico (in silico gene cloning) [1,8,9]…

Để có thể tách dòng gen thì cần phải chọn được vectơ tách dòng thích hợp

1.6.2 Vectơ tách dòng

Vectơ tách dòng (vector cloning) là một trình tự DNA có kích thước nhỏ cho phép cài (gắn) các đoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào, tồn tại trong tế bào chủ trong nhiều thế hệ không gây biến đổi bộ gen của tế bào vật chủ [1,8,9]

Tùy thuộc vào kích thước đoạn DNA muốn tạo dòng và mục đích tạo dòng mà chọn lọc vectơ tách dòng thích hợp Thông thường với các đoạn DNA không quá lớn (dưới 10kb) thì plasmid là vectơ tách dòng được sử dụng nhiều nhất và tế bào tiếp nhận là vi khuẩn Một trong những vectơ tạo dòng nhân tạo thuộc thế hệ mới nhất và được sử dụng phổ biến hiện nay là vectơ pGEM-T Easy Vectơ này mang đầy đủ những đặc điểm của một vectơ tách dòng [24,26]:

Đầu lồi thymidine 3’ cho phép dễ dàng PCR cloning: Các vectơ

pGEM-T Easy được thiết kế với một đầu lồi 3’- thymidine T-nhô ra ở vị trí

gắn tăng hiệu quả của quá trình gắn sản phẩm PCR bằng cách ngăn chặn việc

tự gắn vòng của vectơ và cung cấp một đầu T tương thích với đầu A của sản phẩm PCR đã được tạo ra bởi các enzym tổng hợp

Lựa chọn các thể chuyển nạp xanh / trắng: Vectơ pGEM-T Easy là

vectơ có số lượng bản copy cao, chứa các promoter T7 và RNA polymerase nằm cạnh vùng MCR (multiple cloning region), bên trong có chứa đoạn mã cho α-peptite và enzym β-galactosidase Khi gen mục tiêu được chèn vào vectơ làm bất hoạt enzym β-galactosidase, đây là cơ sở cho việc lựa chọn khuẩn lạc xanh trắng

Có nhiều vị trí cắt cho enzym giới hạn: Vectơ pGEM-T Easy chứa một

số lượng lớn vị trí cắt của các enzym giới hạn trong vùng đa chọn lọc MCR Vùng MCR của vectơ pGEM-T Easy gồm các vị trí nhận biết của enzym

EcoRI, BstZI và NotI, cho phép 3 enzym có thể cắt các đoạn chèn vào một

cách độc lập

Gắn nhanh chóng: vectơ pGEM-T Easy được cung cấp với đệm 2x

rapid ligation buffer Phản ứng gắn thường được ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng (tốt nhất là để qua đêm)

Các trình tự và vị trí nhân dòng của vectơ PGEM-T Easy

Vectơ pGEM-T Easy có thể được làm thẳng ở vị trí base thứ 60 bằng

enzym EcoRV và thêm một base T vào đầu 3’ Vị trí cắt của EcoRV sẽ được

khôi phục lại bằng phản ứng gắn của vectơ và đoạn cài

Hình 1.8 Trình tự và cấu trúc vectơ pGEM-T Easy

Bảng 1.2 Thành phần chính của plasmid pGEM – T Easy

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

Vi khuẩn Bt, các chủng vi khuẩn E.coli thu nhận được từ Phòng Di

truyền Vi sinh vật

Kit huyết thanh miễn dịch chuẩn thu nhận từ Phòng Di truyền Vi sinh vật

Các cặp mồi được sử dụng để khuếch đại gen cry1Ab, cry1Ac theo trình

tự của Asano và cs năm 2003

Vectơ tách dòng pGEM-T Easy (hãng Invitrogen) do phòng Di truyền Vi sinh vật cung cấp

Sâu tơ (côn trùng thử nghiệm) do phòng Viện Bảo vệ Thực vật cung cấp

Enzym: enzym giới hạn EcoRI, T4-DNA ligase, Taq- polymese của

hãng Invitrogen, Fermentas

2.2 Hóa chất và thiết bị

2.2.1 Hóa chất:

men, pepton, NaCl…

ion…

2.2.2 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu thuộc phòng di truyền vi sinh vật, phòng máy chung về công nghệ gen Viện công nghệ sinh học, gồm có:

Tên thiết bị Hãng sản xuất

Máy chạy PCR

Bộ điện di ADN

Máy chụp ảnh gen

Máy li tâm

Kính hiển vi đối pha

Máy khuấy trộn Vortex

3 Môi trường MPB nuôi cấy Bt để thử huyết thanh:

Cao thịt: 3 – 5g NaCl: 5g

Pepton: 10g H2O: 1l

pH: 7 – 7,2

 Các dung dịch dùng trong tách chiết DNA plasmid

EDTA pH = 8.0: 10mM Glucose: 50mM

Tris bazơ 121g Axit acetic 5M: 28.6 ml EDTA 0.5M pH=8.0: 50ml

Nước khử ion đủ 500ml

Tris HCl 1M pH= 8.0: 1ml EDTA 0.5M pH=8.0: 2ml Glycerol: 2ml

Bromphenol blue 1%: 2ml

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xác định nồng độ bào tử

Các chủng Bt phân lập được sử lý ở 650C trong 30 phút hoặc 700

C trong 15 phút để loại bỏ tế bào sinh dưỡng Sau đó tiến hành pha loãng với nồng độ giảm dần từ 10-1

đến 10-11, ở các nồng độ từ 10-9

đến 10-11 cấy vào

C sau 24 giờ đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa có nồng độ pha loãng nhỏ nhất Từ

đó số lượng bào tử được tính theo công thức:

X = n.a.10

X: số lượng bào tử trong 1ml dịch nuôi cấy

n: số khuẩn lạc trung bình tạo thành trong 100 μl dịch pha loãng a: nồng độ pha loãng

2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

Thử hoạt tính trên sâu theo phương pháp nhúng đĩa lá của Thiery và Frachon

- Loại sâu thử: Sâu tơ, dùng sâu tuổi 2 đầu tuổi 3, không cho sâu ăn trước 3 giờ

- Mẫu để thử: Lá cải xanh, lá bắp cải, lá đậu tương hoặc thức ăn nhân tạo Tuỳ theo từng loại sâu mà ta chọn lá thử cho phù hợp; Ở đây ta chọn lá cải xanh Chọn lá là những lá sạch, không phun thuốc sâu, không sâu bệnh, rửa sạch tráng qua bằng nước cất, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng Sau đó, cắt lá với diện tích đều nhau cho vào đĩa Petri đã khử trùng

và 107 tế bào/1ml

Nhúng lá thử vào dịch Bt phân lập đã pha loãng, để 10 phút lấy ra để khô ở

nhiệt độ phòng Sau đó lấy lá cho vào các đĩa Petri (có ghi nồng độ thử) và mỗi nồng độ thử 10 con sâu

Nuôi ở nơi thoáng mát và theo dõi tỷ lệ sâu chết sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ Song song với mẫu thử ngiệm ta tiến hành mẫu đối chứng: lá rửa sạch để khô tự nhiên, cho lá khô vào đĩa Petri và thả 10 con sâu trên một đĩa, theo dõi

tỷ lệ chết tương tự như mẫu thí nghiệm [42]

Tỉ lệ sâu chết được tính theo công thức Abbott:

A = (C – T)/C 100

A: % sâu chết

C: Số sâu sống ở mẫu đối chứng

T: Số sâu sống ở mẫu thí nghiệm

2.3.3 Kỹ thuật định typ huyết thanh

Các chủng Bt được cấy vào ống craige (ống thủy tinh nhỏ, được cắm

C trong 24-48 giờ khi đó, những tế bào có khả năng chuyển động sẽ di chuyển

lên phía trên bề mặt môi trường giữa ống craige và ống nghiệm Vi khuẩn phát triển ở bề mặt này sẽ được cấy vào ống nghiệm có chứa 2ml môi trường

LB, lắc ở 70-75 vòng/ phút trong 12 giờ

Phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh tương ứng được quan sát trên kính hiển vi: lấy 2µl dịch nuôi nhỏ trên phiến kính lõm để kiểm tra khả năng chuyển động của vi khuẩn, sau đó nhỏ tiếp 2 huyết thanh chuẩn (đã pha

loãng) và quan sát dưới kính hiển vi[3]

2.3.4 Phương pháp tách DNA plasmid

- Lấy khuẩn lạc vi khuẩn cấy vào 2 ml môi trường LB, lắc qua đêm 200 vòng/phút ở 370

C

- Hút 1,5 ml dịch nuôi đem ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút

- Loại dịch nổi thu cặn và bổ xung 150 μl dung dịch Sol I, vortex làm tan tủa

- Bổ xung 150 μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ và để đá 5 phút

- Bổ xung 150 μl dung dịch Sol III, đảo nhẹ và để đá 5 phút

- Li tâm 12000 vòng/phút, thu dịch nổi, bổ xung 1 μl cồn tuyệt đối, ủ -200C ít nhất trong 2 giờ

- Li tâm 12000 vòng/phút, thu cặn và để khô

- Bổ xung 30 – 40 μl RNAse, ủ trong 1 giờ ở 370C

- Bổ xung 500 μl nước khử ion Đẩy lên tới 1,5 μl bằng Choloroform : isoamyl alcohol (24:1)

- Li tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi (khoảng 400 μl)

- Bổ xung 1/10 NaOAC hoặc KOAC, đẩy lên 1,5 μl bằng cồn tuyệt đối, ủ - 200

C

- Li tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu tủa, rửa bằng cồn 70% (300 μl)

- Li tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn và để khô

- Bổ xung 40 μl nước khử ion làm tan tủa

- Bảo quản -200C

2.3.5 Phương pháp PCR để khuếch đại gen cry1Ab, cry1Ac

Thành phần phản ứng PCR cho một chủng một cặp mồi với tổng thể tích 20 μl:

-Primer F1: mồi xuôi gen cry1Ab

-Primer F2: mồi xuôi gen cry1Ac