Phát hiện đột biến gen COL1A1 trên bệnh nhân tạo xương bất toàn bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN COL1A1 GÂY BỆNH TẠO XƯƠNG BẤT TOÀN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN COL1A1

GÂY BỆNH TẠO XƯƠNG BẤT TOÀN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHãA 2008 - 2012

HÀ NỘI – 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN COL1A1

GÂY BỆNH TẠO XƯƠNG BẤT TOÀN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHãA 2008 - 2012

Giáo viên hướng dẫn: GS.TS TẠ THÀNH VĂN

HÀ NỘI – 2012

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp là một bước ngoặt đánh dấu sự chuyển tiếp từ mộtsinh viên trở thành cử nhân kỹ thuật y học; là quá trình học tập, tích lũy kiếnthức, kỹ năng để áp dụng vào thực tế Trong suốt quá trình đó, tôi đã nhậnđược rất nhiều sự giúp đỡ quý báu

Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơnchân thành tới:

GS.TS Tạ Thành Văn Giám đốc trung tâm nghiên cứu Gen

-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, người thầy đã tạo điều kiện cho tôi thựchiện khóa luận tại trung tâm

TS.BS Trần Vân Khánh - Trưởng bộ môn Bệnh học phân tử - Đại

học Y Hà Nội, Phó giám đốc trung tâm nghiên cứu Gen – Protein người đãtận tình hướng dẫn, chỉ bảo, sửa chữa và góp ý cho tôi hoàn thành khóa luận Ban giám hiệu, phòng quản lý và đào tạo đại học, bộ môn Hóa sinh, Thưviện và các phòng ban trong trường đại học Y Hà Nội

Tập thể Trung tâm nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu,hoàn thành khóa luận

Các Giáo sư, Phó giáo sư, Tiến sĩ trong hội đồng chấm khóa luận tốtnghiệp, các thầy cô đã cho tôi nhiều chỉ dẫn và kinh nghiệm quý để đề tài đitới đích

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tất cả người thân trong gia đình,bạn bè, các anh chị đi trước đã động viên, chia sẻ khó khăn với tôi trong suốtquá trình học tập và nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn!

Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

-*** -LỜI CAM ĐOAN

Kính gửi: Phòng Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội

Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp.

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, tất cả các

số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất

cứ công trình nghiên cứu nào khác

Hà nội, ngày 27 tháng 06 năm 2012

Người viết khóa luận

Nguyễn Thị Huyền Trang

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

COL1A2 Collagen týp I alpha 2

RT-PCR Reverse Transcription PCR (PCR sao mã ngược)

Asn: Asparagine Ile: Isoleucine Thr: Threonine

Gln: Glutamine Met: Methionine Val: Valine

Glu: acid Glutamic Phe: Phenylalanine Stop codon: mã kết thúc

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh xương bất toàn có tên tiếng Anh là Osteogenesis Imperfecta, viếttắt là OI, còn gọi là bệnh xương thủy tinh hay bệnh giòn xương Đây là bệnhphổ biến nhất trong các rối loạn di truyền về xương Tần suất mắc bệnhkhoảng 1/15.000 – 1/25.000 trẻ sinh ra và chủ yếu là di truyền trội trên nhiễmsắc thể thường [5] Đặc điểm điển hình của bệnh là hệ xương không đượchình thành một cách hoàn chỉnh Nguyên nhân chính là do đột biến gen tổnghợp collagen týp I dẫn đến thiếu hụt hoặc bất thường cấu trúc phân tửcollagen týp I, làm xương giòn và dễ gãy khi có va chạm như ho, hắt hơi hoặcngay cả khi không có sang chấn Bệnh không chỉ biểu hiện bất thường ởxương mà còn bất thường ở các tổ chức khác như: da, dây chằng, củng mạcmắt, răng…

Trên lâm sàng, bệnh được chia làm 4 týp khác nhau tùy thuộc vào mức

độ nặng nhẹ Tuy nhiên, giòn xương, gãy nhiều xương, biến dạng xương làtriệu chứng phổ biến của tất cả các týp [5]

Các nhà khoa học đã phát hiện có khoảng trên 90% các trường hợpbệnh tạo xương bất toàn gây nên do đột biến gen COL1A1 (Collagen týp Ialpha 1) và COL1A2 (Collagen týp I alpha 2) Đây là hai gen mã hóa cho sựtổng hợp collagen týp I, một loại protein chiếm ưu thế trong chất cơ bản ngoạibào của hầu hết các mô [33]

Cũng như nhiều bệnh lý di truyền khác, bệnh xương bất toàn là mộtgánh nặng lâu dài với bản thân người bệnh, gia đình và xã hội Việc điều trịđòi hỏi thời gian dài và còn tùy thuộc vào mức độ nặng nhẹ của bệnh Chođến nay bệnh vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu mà chỉ dừng lại ởcác biện pháp điều trị hỗ trợ và điều trị triệu chứng: giảm đau, giảm gãyxương tái phát nhằm giảm tới mức tối đa tỷ lệ tàn tật và suy giảm chức năngkhác Bởi vậy, chẩn đoán xác định bệnh bằng phương pháp phân tích gen tìm

đột biến trên bệnh nhân mắc bệnh xương bất toàn là cần thiết cho việc pháthiện sớm, để có những can thiệp, hỗ trợ kịp thời, nâng cao chất lượng cuộcsống cho bệnh nhân, động thời giảm bớt gánh nặng cho gia đình Ngoài ra,một mục tiêu quan trọng nữa của việc phát hiện đột biến đó là xác định ngườilành mang gen bệnh, tạo tiền đề quan trọng giúp chẩn đoán trước sinh đối vớinhững đối tượng có nguy cơ cao sinh con bị bệnh, để đưa ra những lời khuyêncần thiết.

Với những ý nghĩa trên, đề tài “Nghiên cứu phát hiện đột biến gen

COL1A1 gây bệnh tạo xương bất toàn” được thực hiện nhằm mục tiêu:

Phát hiện đột biến gen COL1A1 trên bệnh nhân tạo xương bất toàn bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen.

mô tả khoa học đầu tiên về bệnh OI mới được Olaus Jakob Ekman đưa ra.

Trong thế kỷ 20, những biến đổi lâm sàng đáng kể với mức độ nghiêmtrọng khác nhau của bệnh OI được xác định Looser đã tiến hành phân loạibệnh OI đầu tiên năm 1906, sau đó là Silence đề xuất phân loại OI thành 4 týpnăm 1979 Tuy đã được chỉnh sửa nhiều lần nhưng cách phân loại này vẫnđược áp dụng tới ngày nay [36]

Về mặt dịch tễ, tỷ lệ mắc bệnh OI vào khoảng 6-7/100,000 Tỷ lệ nàykhác nhau ở các týp khác nhau: týp I và týp IV chiếm hơn một nửa trong sốtất cả các trường hợp Với týp II, tỷ lệ mắc là 1-2/100,000 và đều tử vongsớm Týp III có tỷ lệ mắc tương đương týp II, còn týp IV là loại hiếm gặp[36]

Năm 1974, những bất thường trong collagen của xương lần đầu tiênđược nhìn thấy trên kính hiển vi điện tử Ba năm sau, báo cáo của Sykes đãchỉ ra mối quan hệ tương tác giữa hai loại collagen trong sự tiêu biến củapepsin trên da những bệnh nhân OI bằng phương pháp điện di trên gelpolyacrylamide [36]

Đột biến gen mã hóa collagen týp I lần đầu tiên được mô tả bởi Chu vàcộng sự năm 1983 là đột biến xóa đoạn dài khoảng 0.5 kb trong 1 alen củachuỗi procollagen - α1 Phát hiện này đánh dấu sự khởi đầu làm sáng tỏ quátrình sinh tổng hợp collagen và cơ chế bệnh học phân tử của OI [5], [36]

1.1.2 Ở Việt Nam

Do tình hình bệnh tạo xương bất toàn ở Việt Nam vẫn còn rất ít và códuy nhất một trung tâm nghiên cứu về bệnh học phân tử: trung tâm nghiêncứu gen - protein tại Trường Đại học Y Hà Nội - Đống Đa - Hà Nội; còn lạichủ yếu nghiên cứu về mặt lâm sàng (viện nhi Trung ương); nên số lượngnghiên cứu về OI ở Việt Nam chưa nhiều, thông tin còn hạn chế Một vàinghiên cứu được công bố gần đây đều được thực hiện tại trung tâm duy nhấtnày [1], [4]

1.2 Đặc điểm của bệnh OI

1.2.1 Đặc điểm lâm sàng

Năm 1979, Silence đã đề xuất phân loại OI thành 4 týp dựa trên đặcđiểm lâm sàng và đặc điểm di truyền trên những bệnh nhân đã xác định chắcchắn là mắc bệnh OI tại Victoria, Autralia [36]

- Týp I: Là thể nhẹ nhất và hay gặp nhất, đặc trưng bởi mắt có màuxanh ở tất cả các độ tuổi, trẻ bắt đầu gãy xương từ khi tuổi còn nhỏ nhưng tầnsuất gãy xương thấp, không có biến dạng hoặc biến dạng xương ít, giảm thínhlực hoặc điếc Hầu hết tiền sử gia đình bệnh nhân có người điếc, dây chằnglỏng lẻo gây sai khớp Đa số bệnh nhân không có tạo răng bất toàn

- Týp II: Là thể nặng nhất Bệnh nhân thường chết ngay trong tử cung

do gãy nhiều xương hoặc ngay sau khi sinh do rối loạn chức năng hô hấp(thiểu sản phổi, gãy xương sườn) Hiện nay OI týp II được chia làm hai loại là

OI týp II-A và II-B

- Týp III: Là thể tương đối nặng, chỉ đứng sau týp II, trẻ thường sinh ra

đã có gãy xương, biến dạng tiến triển xương dài, xương sọ, cột sống… Gãyxương tái phát nhiều lần gây hậu quả là chi ngắn và biến dạng tăng dần, mặt hìnhtam giác và có bướu trán Củng mạc mắt thường quá trắng hoặc có màu xám, màuxanh, giảm chức năng hô hấp, giảm thính lực và bất thường về răng

- Týp IV: Là thể trung gian giữa týp I và III Gãy xương xuất hiện ởtuổi nhỏ, các biến dạng xương ở mức nhẹ đến trung bình, tần suất gãy xươngthay đổi Củng mạc mắt có thể bình thường hoặc xám; có hoặc không có tạorăng bất toàn; thường giảm thính lực ở tuổi trưởng thành và tiền sử gia đình

có người điếc [5]

Xếp theo thứ tự từ nhẹ đến nặng sẽ là týp I, týp IV, týp III, týp II Một

số nghiên cứu mới đã phân loại thêm týp V, VI, VII, VIII

Bảng 1.1 Đặc điểm lâm sàng của bệnh OI [36]

Týp

Đặc điểm

Di truyền Trội trên

NST thường

Trội trên NST thường

Trội/Lặn trên NST thường

Trội/Lặn trên NST thường

Trội/Lặn trên NST thường

Mức độ nghiêm trọng Nhẹ Tử vong

trước sinh Nghiêm trọng Nhẹ vừa Vừa

xuyên Hiếm gặp

Biến dạng xương Hiếm gặp Rất nặng Nặng Nặng vừa Nhẹ vừa

Tạo răng bất toàn Có thể Chưa rõ Chưa rõ Có Có thể

Biến chứng thần kinh Không Chưa rõ Chưa rõ Có Không

1.2.2 Chẩn đoán

Hiện nay, siêu âm trước sinh là lựa chọn đầu tiên để phát hiện bệnh lýcủa thai nhi trong đó có OI Siêu âm trước sinh có thể chẩn đoán chính xácbệnh OI tới 89% Siêu âm hai chiều là kỹ thuật hình ảnh đáng tin cậy trong

OI týp II và III Việc chẩn đoán có thể được thực hiện sớm nhất ở tuần 17 củathai kỳ với OI týp I và tuần 13 với OI týp II Đối với OI týp III, chiều dài chithường bắt đầu biến đổi sớm nhất ở khoảng tuần 17 đến 18 của thai kỳ OI týpIII hoặc týp IV có thể có hoặc không có gãy xương, biến dạng xương haygiảm khoáng hoá xương; nếu có thì sự biến đổi chỉ nhìn thấy được ở 3 thángcuối thai kì Vì vậy cần siêu âm định kỳ khi có nghi ngờ OI týp III hoặc týp

IV [14]

Chẩn đoán bệnh OI ở người trưởng thành dựa vào: biểu hiện lâm sàng,phim chụp X quang, tiền sử gãy xương và tiền sử gia đình.Với những trườnghợp không có tiền sử gia đình hoặc gãy xương không có kết hợp với nhữngbất thường ngoài xương thì chẩn đoán cần kết hợp thêm xét nghiệm số lượng

và cấu trúc phân tử collagen týp I qua nuôi cấy nguyên bào sợi từ da bệnhnhân và kết hợp phân tích gen [5]

Hình 1.1 Sơ đồ chẩn đoán phân loại bệnh OI [36]

1.2.3 Điều trị

Hiện nay, chưa có phương pháp thay thế cấu trúc collagen bị tổnthương hay kích thích cho cơ thể tăng tổng hợp số lượng collagen, vì vậychứng bất toàn trong tạo sinh xương vẫn được xem là một rối loạn di truyềnkhông thể chữa khỏi được Liệu pháp tác động lên gen và tế bào chỉ có tácdụng hỗ trợ [17]

Các phương pháp chính điều trị OI gồm: Hóa dược trị liệu, vật lý trịliệu (phục hồi chức năng), phẫu thuật chỉnh hình, điều trị răng, điều trị điếc[2], [36]

a. Hóa dược trị liệu

Một trong những hoá dược điều trị OI được coi là hiệu quả nhất hiệnnay đó là thuốc ngăn cản quá trình huỷ xương nhóm bisphosphonate [2]

Bisphosphonate dùng để uống hoặc tiêm tĩnh mạch, được sử dụng rộngrãi cho bệnh nhân OI thể nặng, nhưng tác dụng của nó trên nhóm bệnh nhân

OI thể nhẹ vẫn chưa được làm rõ [10], [36] Ở một nhóm bệnh nhân OI dùngthuốc sau vài tuần có biểu hiện: giảm đau, khỏe khoắn hơn, tăng trương lực

cơ [2] Công bố mới đây của Bradbury về ảnh hưởng của Risedronate trênngười trưởng thành khẳng định ở bệnh nhân OI dùng thuốc có sự cải thiệnđáng kể mật độ chất khoáng ở cột sống thắt lưng, kèm theo giảm quá trìnhhủy xương [8] Clodronate và etidronate (bisphosphonates thế hệ đầu tiên)gây ra sự tự chết của các hủy cốt bào do ức chế hoạt động của enzyme phụthuộc ATP (Adenosin triphosphat) [28] Tuy nhiên, khi quá trình huỷ xương

bị ức chế mạnh thì nó sẽ gây hiệu ứng ngược làm ngăn cản quá trình sửa chữacác thương tổn; nên việc sử dụng thuốc nhóm bisphosphonate điều trị OI cóthể dẫn đến các tai biến xa [2]

Ngoài ra, việc sử dụng hormone tăng trưởng hỗ trợ điều trị tầm vóc nhỏ

ở bệnh nhân OI týp III và IV cũng đang được tiến hành nghiên cứu [36]

b. Phẫu thuật chỉnh hình

Với các trường hợp giảm khoáng hóa xương, tần số gãy xương caohoặc dị dạng xương, phẫu thuật chỉnh hình được tiến hành nhằm duy trì tư thếgiải phẫu của chi [5]

c. Điều trị răng

Điều trị răng nhằm duy trì răng sữa và răng vĩnh viễn, duy trì chứcnăng cắn và khớp cắn cho bệnh nhân [5] Ở bệnh nhân OI, răng thường bị gãyhoặc mòn Điều này có thể được điều trị bằng đóng nắp răng với polyme cứng

để ngăn ngừa nhiễm trùng răng và biến dạng mặt [36]

d. Điều trị giảm chức năng nghe

Phẫu thuật điều trị điếc do gãy xương tai giữa hoặc do co cứng và sẹo ởxương đe, một số trường hợp điếc xuất hiện muộn do ảnh hưởng thần kinhcảm nhận thì không đáp ứng với phẫu thuật Có thể dùng phương pháp cấy ốctai nhưng hiệu quả còn hạn chế [5]

e. Phục hồi chức năng

Vật lý trị liệu để ngăn ngừa sự co cứng và biến dạng cột sống trên bệnhnhân OI týp III và IV Một số biện pháp: tập thể dục, bơi lội, dinh dưỡng,thực hiện một lối sống lành mạnh (không hút thuốc lá, tránh uống cà phê,rượu, tránh dùng các loại thuốc chống viêm có corticosteroid) [2]

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều thử nghiệm điều trị và bước đầu đã

có kết quả khả quan như: liệu pháp điều trị gen, ghép tủy xương [5]

1.3 Cơ sở phân tử của bệnh OI

1.3.1 Cấu trúc, chức năng của protein Collagen typ I

1.3.1.1 Thành phần, cấu trúc

Phân tử collagen týp I là protein gồm 3 chuỗi polypeptide (2 chuỗi α1

và 1 chuỗi α2); trong đó gen COL1A1 mã hóa cho hai chuỗi procollagen - α1,gen COL1A2 mã hóa cho một chuỗi procollagen - α2 Các chuỗi propeptideliên kết với nhau (2 chuỗi procollagen - α1 và 1 chuỗi procollagen - α2) tạothành chuỗi bậc ba helix Vùng trung tâm của chuỗi xoắn dài 1012 acid amin,trong đó có 338 tripeptide G-X-Y lặp lại liên tục (với G là Glycin, X thường

là Proline, Y thường là Hydroxyproline) [16], [32], [36]

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử collagen bình thường và bất thường [32]

(A): Cấu trúc gen COL1A1 gồm 3 phần chính:

(1) Vùng promoter hay vùng hoạt hóa (màu vàng) chứa trình tự TATA (hộp TATA màu đen) (4) là nơi bám dính của các protein liên kết với hộp TATA, để tạo phức hợp RNA polymerase khởi động quá trình phiên mã (transcription) Hộp TATA cách mã mở đầu của gen khoảng 50 nucleotide.

(2) Vùng chứa 51 exon và các intron của gen COL1A1 (màu xanh lá cây).

(3) Đuôi poly A (poly Adenin) màu hồng, nằm ở vùng 3’-UTR (untranslated region): là chuỗi lặp lại nhiều ribonuceleotide dạng Adenine ở đầu 3’ của mRNA (sau khi phiên mã) Sự polyadenyl hóa được thực hiện nhờ enzyme đặc biệt là poly(A) polymerase

sử dụng Adenine như một cơ chất để gắn và kéo dài chuỗi Adenine vào đầu 3’ Chuỗi poly

A là nơi bám dính đặc hiệu của protein đặc hiệu PABP (poly A binding protein) Protein này hoạt hóa cùng với phức hợp eIF (Eukaryotic initiation factors), cụ thể là eIF-4, để hoàn thiện quá trình phiên mã, kích hoạt sự bám của ribosom, khởi động quá trình dịch mã.

(B): Collagen týp I bao gồm 2 chuỗi procollagen - α1 và 1 chuỗi procollagen - α2.

Sự bền vững của cấu trúc này phục thuộc vào sự lặp lại của bộ ba axít amin Gly-X-Y Khi

có sự bất thường xảy ra trên gen COL1A1 dẫn tới thêm hoặc mất glycin (vùng màu đỏ) sẽ gây rối loạn cấu trúc phân tử collagen, là nguyên nhân gây bênh OI.

(C): Phân tử collagen týp I [32].

1.3.1.2 Chức năng:

Collagen thuộc họ protein ngoại bào đóng vai trò quan trọng trong sựphát triển và là thành phần cần thiết tham gia cấu trúc mô và các cơ quan, baogồm cả phổi, da, xương, mạch máu Collagen có vai trò làm kết dính, tạo độbền cho những cấu trúc có hình dạng của cơ thể như khung xương, nhãn cầu;

là bộ khung của các cấu trúc Collagen tham gia cấu tạo hầu hết các mô vàcấu trúc bên ngoài của tế bào, đồng thời collagen cũng được tìm thấy bêntrong tế bào Collagen là thành phần chính của gân, sụn, xương, dây chằng vàda; cùng với keratin mềm, collagen tạo nên độ dẻo dai của da, độ bền củathành mạch máu và đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển mô tế bào Sựthoái hóa của collgen sẽ gây ra nếp nhăn dẫn đến tuổi già Collagen cũng tồntại trong giác mạc, thủy tinh thể

Collagen týp I là loại collagen cấu trúc chủ yếu của xương, da và dâychằng; là thành phần chính của ngà răng, chiếm 30% trọng lượng cơ thể.Ngoài ra nó còn được tìm thấy ở giác mạc, củng mạc mắt, màng não… Vìvậy khi có sự khiếm khuyết về cấu trúc, chức năng phân tử collagen týp Itrong OI, bệnh biểu hiện ở nhiều mô và cơ quan [5]

1.3.2 Vị trí, cấu trúc, chức năng của gen COL1A1:

1.3.2.2 Cấu trúc và chức năng

Gen COL1A1 gồm 51 exon với chiều dài 18kb, mã hóa 5kb cho chuỗiprocollagen -α1 (procollagen týp I alpha 1) tham gia cấu trúc phân tử collagentýp I Các exon từ 6 tới 49 mã hóa chuỗi xoắn kép alpha Hầu hết các exonnày có chiều dài khoảng 45 bp, 54 bp hoặc bội số của 45 hoặc 54 bp [31]

Hình 1.4 Cấu trúc của gen COL1A1 [31]

Gen COL1A1 mã hóa chuỗi procollagen - α1 gồm 1464 acid amin [31].Cấu trúc gen chia thành 3 vùng chính: Vùng promoter, vùng chứa exon vàintron, đuôi poly A

Để tổng hợp chuỗi procollagen, đầu tiên gen COL1A1 sẽ thực hiệnphiên mã tổng hợp phân tử mRNA tiền thân Phân tử mRNA này trải qua quátrình cắt các intron và nối chính xác các exon với nhau để tạo ra phân tửmRNA hoàn chỉnh đảm bảo đúng trình tự Phân tử mRNA hoàn chỉnh được

sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp chuỗi procollagen - α1

1.3.3 Các dạng đột biến trên gen COL1A1

Hiện nay có đến 90% các trường hợp mắc bệnh OI là do đột biến gentrội nằm trên gen COL1A1 hoặc COL1A2; còn lại 10% gây nên bởi các độtbiến gen lặn trên một trong các gen hiện nay đã biết (CRTAP, LEPRE1,PPIB, SERPINH1, FKBP10, PLOD2, SP7, SERPINF1) hoặc trên các genchưa đươc phát hiện [36], [39]

Hình 1.5 Tỷ lệ các gen đột biến gây bệnh OI.

(https://oi.gene.le.ac.uk)

Các đột biến trên gen COL1A1 gây bệnh OI gồm: đột biến thay thế, độtbiến lặp, đột biến cắt nối, đột biến mất, đột biến thêm nucleotide Trong đódạng đột biến thay thế là phổ biến nhất, chiếm khoảng 82% các đột biến trêngen COL1A1 (Hình 1.6)

Hình 1.6 Tỉ lệ các đột biến trên gen COL1A1 gây bệnh OI.

( https://oi.gene.le.ac.uk )

Hầu hết các đột biến xảy ra trên exon, chiếm 83% tổng số đột biến trêngen COL1A1 Trong đó đột biến thay thế là phổ biến nhất ở cả hai vị trí độtbiến trên exon và trên intron của gen COL1A1: chiếm 87% các đột biến trênexon, 81% các đột biến trên intron (Hình 1.7).

Trong các đột biến thay thế thì phổ biến nhất là đột biến thay thế glycinbằng một acid amin khác Hiện nay có hơn 700 đột biến thay thế glycin đượcphát hiện trên bệnh nhân OI và tổng hơp lại trên dữ liệu các đột biến genCOL1A1 [5], [15], [36]

Hình 1.7 Tỷ lệ các đột biến gây bệnh OI trên gen COL1A1

( https://oi.gene.le.ac.uk )

Bảng 1.2 Một số đột biến gen COL1A1 ở bệnh tạo xương bất toàn [11].

Cắt nối intron

1.3.4 Đặc điểm bệnh học phân tử của OI:

OI là bệnh di truyền trội trên NST thường

Hình 1.8 Sự di truyền tính trạng bệnh trong bệnh OI

(http://ditruyen.com).

Sự di truyền bệnh OI qua các thế hệ có 3 đặc điểm chính: Nam nữ có tỉ

lệ mắc bệnh ngang nhau và bố mẹ cũng có vai trò ngang nhau trong việctruyền tính trạng cho con cái; sự di truyền không ngắt quãng qua các thế hệ,nếu bố mẹ không mang tính trạng bệnh thì sẽ không truyền bệnh cho con cái;mặc dù sự truyền tính trạng từ bố cho con trai không dùng để đánh giá sự ditruyền trội trên NST thường nhưng sự có mặt của nó trong phả hệ loại trừchắc chắn các kiểu di truyền khác (đặc biệt là di truyền liên kết NST X) Thể

dị hợp tử mang gen bệnh truyền tính trạng này cho gần như một nửa con cáicủa họ

Đột biến gen trội gây bệnh OI týp I, II-A, II-B, III, IV: hiện nay đã cóhơn 1000 biến thể khác nhau trên gen COL1A1 và COL1A2 được phát hiện làgây bệnh OI (https://oi.gene.le.ac.uk) Các loại đột biến cũng như vị trí xuấthiện ảnh hưởng tới kiểu hình người bệnh

OI týp I là phổ biến nhất, đặc trưng bởi sự giảm 50% lượng collagentýp I, thường là kết quả của những đột biến trên một alen của gen COL1A1,đôi khi là do xóa hoàn toàn một alen hoặc thay thế glycine bởi một axit aminnhỏ khác (Cystein, Alanin, Serin) gần mã kết thúc [36]

1.4 Các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen COL1A1

Các đột biến trên gen COL1A1 chủ yếu là đột biến điểm do đó kỹ thuậtPCR và giải trình tự trực tiếp được sử dụng để phát hiện đột biến

Trong trường hợp các đột biến nằm trong vùng mã hoá axít amin(exon) như: đột biến sai nghĩa (missense), đột biến vô nghĩa (nonsense), độtbiến gây lệch khung dịch mã (frameshift) thì chỉ cần PCR mẫu DNA sau đógiải trình tự trực tiếp tìm đột biến

Nếu đột biến cùng intron (không mã hoá axit amin) nhưng ảnh hưởngđến vị trí bám của các hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucloeprotein) thìcần thêm bước khuếch đại sản phẩm cDNA bằng phương pháp RT-PCR đếbiết exon nào bị mất từ mRNA Tuy nhiên mẫu bệnh phẩm phải được lấy ởvùng có sự biểu hiện protein collagen týp I (da, xương)

Như vậy để phát hiện đột biến trên gen COL1A1 cần chú ý tới 3 kỹthuật chính là: PCR, RT-PCR và giải trình tự gen

1.4.1 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR):

PCR là kỹ thuật nhân bản DNA trong ống nghiệm Nguyên tắc củaphản ứng PCR dựa trên đặc điểm của quá trình tự sao chép DNA trong tế bào:cần có DNA ở dạng sợi đơn, cần các đoạn mồi và các loại enzym xúc tác

Kỹ thuật PCR sử dụng Taq polymerase (enzym chịu nhiệt) tổng hợp

một mạch DNA mới từ mạch DNA đơn làm khuôn với nguyên liệu là 4 loạinucleotide Phản ứng đòi hỏi phải có mặt của cặp mồi đặc hiệu (mồi xuôi, mồingược) có trình tự bổ sung với 2 đầu của trình tự DNA khuôn

PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giaiđoạn nhiệt độ khác nhau (Hình 1.9):

- Giai đoạn 1 (Biến tính): DNA khuôn sẽ được biến tính ở nhiệt độcao (cao hơn nhiệt độ Tm) mà tại đó phân tử từ dạng sợi kép thànhsợi đơn (940C - 950C trong vòng từ 30-60s)

- Giai đoạn 2 (Bắt cặp): Nhiệt độ hạ thấp dưới nhiệt độ nóng chảy

Tm (temperature melting) của các mồi (khoảng 400C - 700C tùythuộc mồi được sử dụng) cho phép các mồi bắt cặp với các sợi đơnDNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung Thời gian cho giai đoạn nàykhoảng 30-60s

- Giai đoạn 3 (Kéo dài): Nhiệt độ tăng lên 720C là nhiệt độ thích hợpnhất cho enzyme Taq polymerase hoạt động tổng hợp sợi DNA mớibằng cách kéo dài sợi mồi từ 4 loại nucleotid (dATP, dCTP, dGTP,dCTP)

Hình 1.9 Các giai đoạn trong phản ứng PCR (http://www.molecularstation.com)

Sau mỗi chu kỳ, các đoạn DNA được tổng hợp sẽ được dùng làmkhuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo Một phản ứngPCR thông thường từ 30-40 chu kỳ và cứ sau một chu kỳ thì số lượng DNAlại tăng gấp đôi Vậy sau n chu kỳ số lượng DNA thu được là 2n bản copy.Sản phẩm cuối cùng của phản ứng PCR là các đoạn DNA dạng sợi kép vớichiều dài đặc hiệu đúng bằng khoảng cách giữa 2 đoạn mồi

1.4.2 RT-PCR :

RT-PCR là viết tắt của Reverse transcription Polymerase ChainReactions (chuỗi phản ứng polymerase phiên mã ngược) được sử dụng đểphát hiện đột biến gen ở mức mRNA

Khác với kỹ thuật PCR nhân một đoạn DNA mong muốn dựa trênkhuôn là DNA, RT-PCR sử dụng khuôn là RNA Do đó bước đầu phải có có

sự phiên mã ngược nhờ enzym phiên mã ngược (reverse transcriptaseenzyme) chuyển RNA thành cDNA Ngoài enzym quá trình phiên mã ngượccòn đòi hỏi mồi thích hợp để tổng hợp toàn bộ RNA thành cDNA, do đó tadùng mồi ngẫu nhiên (random hexamer primers) mà không dùng mồi đặchiệu Sau đó, quá trình PCR được sử dụng để khuếch đại lượng cDNA tạothành với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen cần khuếch đại

Thực chất RT-PCR là sự kết hợp hai quá trình: phiên mã ngược (RT)

(enzym Tth từ vi khuẩn Thermus thermophilus là một enzym DNA

polymerase bền nhiệt và có hoạt tính RT khi có mặt Mn2+) Loại thứ hai làenzym tái tổ hợp của AMV-RT và MMLV-RT có hoạt tính RNase H yếuhoặc không còn, có độ bền nhiệt cao hơn (60oC)

Quá trình PCR khuếch đại sản phẩm cDNA thu được từ quá trình phiên

mã ngược

1.4.3 Điện di trên gel

Điện di trên gel là phương pháp điện di sử dụng gel agarose hoặcpolyacrylamide với các nồng độ khác nhau để phân tách các phân tử có kíchthước, trọng lượng khác nhau

Mục đích:

- Kiểm tra kích thước phân tử DNA/RNA

- Ước lượng nồng độ DNA/RNA trong sản phẩm PCR

- Đánh giá chất lượng sản phẩm DNA/RNA: độ tinh sạch, độ nguyênvẹn

Nguyên tắc: Trong dung dịch các phân tử DNA tích điện âm (-) vì vậy

khi có mặt của dòng điện DNA sẽ di chuyển về phía cực dương (+) Sự phântách xảy ra trên bản gel là do sự khác biệt về kích thước và hình dạng phân tử.Phân tử lớn hơn do ma sát, va chạm với các thành phần trong gel lớn hơn cácphân tử kích thước nhỏ hơn nên sẽ chạy chậm hơn

Gel: Thông thường DNA sẽ được chạy điện di trên gel Agarose (thíchhợp cho các phân tử lớn, dễ xử lý và dễ đúc) Nồng độ gel được sử dụng tùythuộc vào kích thước phân tử DNA

Buffer (đệm): Dung dịch đệm sử dụng phổ biến ở Việt Nam là đệmTBE (Tris-Borate EDTA) có khả năng đệm cao hơn TAE nhưng nó có mộtnhược điểm rất lớn là: các ion trong dung dịch đệm có thể phản ứng vớiagrose hoăc glycerol (trong mẫu) gây ảnh hưởng tới kết quả điện di

Trước khi mẫu được nạp lên gel nó được trộn với loading buffer (chứaBromphenole blue giúp ta dễ kiểm tra xem mẫu đã chạy đến đâu trong điệntrường; đồng thời chứa cả chất làm tăng độ tập trung DNA)

Sau khi chạy điện di, DNA/RNA trên gel được nhuộm với Ethidiumbromide hoặc GelRed (những chất phát huỳnh quang khi chiếu UV)

1.4.4 Giải trình tự gen (DNA sequencing):

Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép gồm 2 mạch đơn được cấu tạo từ 4loại nucletid khác nhau đó là: A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T(thymine) Các nucleotid này liên kết với nhau theo một thứ tự xác định Giảitrình tự gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 nucleotid này trên phân

Hiện này phương pháp của Sanger được sử dụng phổ biến cả ở ViệtNam lẫn thế giới; phương pháp hoá học ít được ứng dụng do độc tính của hoáchất

Phương pháp của Sanger sử dụng ddNTP (dideoxyribonucleosidetriphosphate) là các đồng phân của dNTP (deoxyribonucleoside triphosphate),còn được gọi là “terminator” Cấu trúc ddNTP tương tự dNTP chỉ có mộtđiểm khác biệt duy nhất là ddNTP không có gốc OH ở đầu 3’ (vị trí carbon 3của deoxyribose), là vị trí để các dNTP tiếp theo gắn vào Do đó, phản ứngtổng hợp DNA sẽ được dừng lại tại ngay vị trí mà ddNTP được gắn ngẫunhiên vào thay cho dNTP

Hình 1.10 Hình ảnh minh họa kỹ thuật giải trình tự theo phương pháp Sanger [13].

Giải trình tự một DNA có thể chia làm 2 bước lớn: PCR giải trình tự vàđọc trình tự trên máy tự động

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự:

Sản phẩm PCR giải trình tự sẽ được điện di và đọc kết quả trên máy

Bước 2: Đọc trình tự trên máy tự động.

Để thực hiện đọc trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sảnsinh trong ống phản ứng giải trình phải được đánh dấu huỳnh quang để cácvạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sánglaser Bốn loại ddNTP thường được đánh dấu bằng bốn màu huỳnh quangkhác nhau

Cấu tạo của một máy điện di gồm 2 phần: phần chạy điện di trên gelpolyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di

Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi

có một vạch điện di đi qua chùm tia sáng laser thì vạch điện di sẽ phát sánglên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thànhmột đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ Từ biểu đồ của các đỉnh cường độsáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùngphân tích thành trình tự của đoạn DNA [3]

Hình 1.11 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR giải trình tự

Trong quá trình điện di: sợi có kích thước ngắn sẽ di chuyển nhanh hơnsợi có kích thước dài

Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương.

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân:

- Tiêu chuẩn lâm sàng gồm 4 tiêu chuẩn:

+ Loãng xương, gãy xương tự phát và/hoặc tái phát

+ Củng mạc mắt màu xanh

+ Tạo răng bất toàn

+ Giảm thính lực

Chẩn đoán OI khi có ít nhất 2 trong 4 tiêu chuẩn trên

- Tiêu chuẩn Xquang:

Tất cả bệnh nhân đều có biểu hiện gẫy xương, biến dạng xương trênphim Xquang, các biểu hiện khác nhau tùy thuộc vào từng týp

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp phân tích bệnh chứng

Thiết kế nghiên cứu:

Bước 1: Thu mẫu

Bước 2: Tách chiết DNA từ máu ngoại vi gồm 2 bước:

- Tách chiết DNA

- Đo mật độ quang (OD) xác định độ tinh sạch và nồng độ

Bước 3: Thực hiện phản ứng PCR gồm 2 bước:

- Thực hiện phản ứng PCR để nhân đoạn gen đặc hiệu với OI

- Chạy điện di kiểm tra sản phẩm

Bước 4: Giải trình tự sản phẩm PCR gồm 3 bước:

- Thực hiện phản ứng PCR giải trình tự

- Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự

- Giải trình tự trực tiếp trên máy ABI-3100

2.3 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

- Máy rung lắc nhiệt: Thermomixer 5437 và Thermomixer comfort cho ống1,5ml và Mixmate cho ống 2ml.

- Máy điện di: Mupid (Nhật Bản)

- Máy soi gel và chụp ảnh tự động: EC3 Imaging system

- Máy đọc huỳnh quang

- Máy đo OD: Nanodrop 1000

- Máy PCR: Eppendorf

- Máy giải trình tự gen tự động: ABI-3100

2.3.2 Hóa chất

- Hóa chất tách chiết DNA:

+ Dung dịch Lysis buffer gồm: Succarose 0.3M, Trisbase-HCl (pH7.5)0.01M, MgCl2 0.05M, Trixton X-100 1% và nước cất

+ Dung dịch K gồm: NaCl 0.075M, EDTA (Ethylendiamin TetraaceticAcid) 0.024M (pH 8.0)

+ Dung dịch SDS (Sodium dodecyl sulfate) 10%

+ Proteinase K (10mg/ml)

+ Dung dịch Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 :1)

+ Dung dịch Chloroform : Isoamyl (24 : 1)

+ Ethanol 100%, ethanol 70% bảo quản lạnh

+ Sodium acetate CH3COONa 3M (pH=5.2)

+ Dung dịch hòa tan DNA: đệm TE (Tris - EDTA)

- Hóa chất cho PCR:

+ Thành phần của PCR Master Mix gồm:

+ 10 X Buffer

+ GOLTAQ chứa: dNTPs, Taq polymerase, MgCl2

+ Primers: mồi xuôi, mồi ngược