nghiên cứu phát hiện đột biến gen atp7b gây bệnh wilson

Trong khi đó, ở các bệnh nhân người Trung Quốcđột biến p.Arg778Leu lại chiếm tới 34-38% tống số đột biến [9] Từ những ý nghĩa trên đề tài : “Nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B gây b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Tạ Thành Văn, PGS.

TS Nguyễn Thị Hà, những người thầy người cô đã giúp đỡ, động viên em

trong suốt quá trình học tập, tạo mọi thuận lợi cho em trong quá trình thựchiện và hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào Tạo Đại HọcTrường Đại Học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn, giúp đỡ emthực hiện khóa luận này

Em xin cảm ơn Ths Hồ Cẩm Tú cùng các anh chị cán bộ, anh chị Nghiêncứu sinh tại Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em khi thực hiện và hoàn thànhkhóa luận

Xin cảm ơn các bạn đã động viên, ủng hộ tôi trong quá trình học tập.Cuối cùng, con thực sự biết ơn bố mẹ, mọi người thân yêu trong gia đình

đã luôn tạo mọi điều kiện về tinh thần và vật chất để con vượt qua khó khăntrong học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Y khoa Trường Đạihọc Y Hà Nội

Hà Nội, ngày 22 tháng 6 năm 2012

Vũ Văn Thành

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A: Adenine T: Thymine

G: Guanine C: Cytosine

NCBI: National Center for Biotechnology Information

Ala: alanine (A) Gly: glycine (G) Pro: proline (P)Arg: arginine (R ) His: Histidine (H) Ser: serine (S)

Asn: asparagine (N) Ile: isoleucine (I) Stop: mã kết thúcAsp:acid aspartic (D) Leu: leucine (L) Thr: threonine (T)Cys: cysteine (C) Lys: lysine (K) Trp: tryptophan (W)Gln: glutamine (Q) Met: methionine (M) Tyr: tyrorine (Y)Glu: acid glutamic (E) Phe: phenylalanine (F) Val: valine (V)

Bn : Bệnh nhân

Bp : Basepair Kb: Kilobase

ATP7B : ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh Wilson hay bệnh rối loạn chuyển hóa đồng (Cu), bệnh được mô tảđầu tiên bởi Kinnier Wilson vào năm 1912, là một bệnh lý liên quan đến tổnthương gen Wilson là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể ( NST) thường,trong đó, đồng tích tụ ở một số cơ quan trong cơ thể, đặc biệt là gan và nãogây nhiều biến chứng phức tạp Ước tính trên thế giới, tần suất mắc bệnh là1/30.000 và 1/100.000 người [9]

Bệnh Wilson do thiếu hụt enzyme typ P- ATPase được mã hóa bởi gen

ATP7B Gen ATP7B nằm trên cánh dài nhiễm sắc thể 13 (13q14.3) gồm 21

exon, với chiều dài khoảng 80 kb và mã hóa cho chuỗi protein gồm 1465 axitamin Enzym P-type ATPase đóng vai trò vận chuyển đồng qua màng tế bào

Sự thiếu hụt hoặc giảm chức năng protein của ATP7B dẫn đến giảm sự bài tiết

Cu từ gan vào mật, khiến cho Cu tích lũy trong gan và tạo thành chất độc chogan Khi lượng đồng trong gan tăng quá mức, đồng sẽ theo hệ thống tuầnhoàn tới các cơ quan đích như : não, mắt, thận gây ra các tổn thương cho cơquan đích

Chẩn đoán bệnh có thể dựa trên các triệu chứng lâm sàng như dấu hiệu vềgan, não và vòng Kayser-Fleischer Ngoài ra, có thể sử dụng các xét nghiệmnhư đo nồng độ đồng trong nước tiểu 24h, hàm lượng ceruloplasmin huyếtthanh, nồng độ Cu trong gan tăng) [35, 12] Tuy vậy, nếu chỉ dựa các xétnghiệm hóa sinh thì rất khó để chẩn đoán chính xác cũng như khó có thể phânbiệt giữa người bình thường và người mang gen Vì vậy, phân tích DNA làmột bước cần thiết để xác định người mắc bệnh [35]

Cho đến nay, khoảng hơn 500 đột biến đã được tìm thấy trên bệnh nhânmắc bệnh Wilson [44] Tuy nhiên, mỗi quốc gia cũng như mỗi chủng tộcngười khác nhau có các loại đột biến khác nhau Đột biến p.His1069Glu làđột biến thường gặp nhất trong quần thể nguời da trắng chiếm khoảng 37%

đến 63% tổng số đột biến Trong khi đó, ở các bệnh nhân người Trung Quốcđột biến p.Arg778Leu lại chiếm tới 34-38% tống số đột biến [9]

Từ những ý nghĩa trên đề tài : “Nghiên cứu phát hiện đột biến gen

ATP7B gây bệnh Wilson” được thực hiện nhằm mục tiêu:

Phát hiện đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH WILSON

1.1.1 Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh Wilson trên thế giới

Vào năm 1883, một nhà thần kinh học người Đức Dr Carl Westphal cómột báo cáo và đặt tên bệnh này là "pseudosclerosis".Nhà thần kinh họcngười Anh tên là William Gowers(1888) và bác sĩ Adolph Strumpell mô tảbệnh "pseudosclerosis" là bệnh xơ gan[26]

Bệnh mang tên của bác sĩ người Anh Samuel Alexander Kinnier Wilson(1878-1937) một nhà thần kinh học , ông đã lần đầu tiên mô tả những thayđổi bệnh lý trong gan và não vào năm 1912, sau đó Strpell nhận thấy sự tíchlũy sớm của đồng trong não và gan của các bệnh nhân này[36]

Năm 1948, Martins tìm thấy lượng đồng trong nước tiểu của bệnh nhânWilson tăng rất cao so với người bình thường [30]

Cùng năm đó, Cumings cùng nhóm nghiên cứu đã điều trị hiệu quả bệnhWilson lần đầu tiên với việc tiêm British anti- Lewisite ( BAL) vào năm1951[14]

Năm 1952, Scheinberg và Gitlin phát hiện được enzym ferroxidase tronghuyết thanh gắn với đồng, được gọi là ceruloplasmin Hoạt tính của enzymnày giảm trong huyết tương ở các bệnh nhân Wilson [25]

Bắt đầu năm 1956, một số thuốc được đưa vào điều trị Nhà thần kinhhọc người Anh John Walshe đã phát hiện ra penicillamine [41] Vào năm 1982,Walshe cũng giới thiệu trentine và người đầu tiên phát hiện tetrathiomolybdate

sử dụng cho lâm sàng [42] Bác sĩ Schouwin và Hoogemraad sử dụng kẽmacetate trong điều trị lần đầu tiên vào năm 1961,sau đó kẽm acetate đượcBrewer và các đồng nghiệp tại đại học Michigan dùng để điều trị cho bệnhnhân Wilson một cách phổ biến[10]

Cơ sở di truyền của bệnh Wilson và liên kết ATP7B đột biến đã được làmsáng tỏ trong những năm 1980 và 1990 bởi một số nhóm nghiên cứu[38]

Tới năm 1994, Konstaintin petrukhin cùng nhóm nghiên cứu tại đại họcColumbia đã đưa ra bản đồ gen, cấu trúc và chức năng của gen ATP7B[34] Danadevi Kuppala cùng các đồng nghiệp đã phát hiện năm đột biến trêngen ATP7B của các bệnh nhân Mỹ năm 2009, báo cáo cho thấy đột biến trênexon 14 và exon 18 chiếm tới 84% tổng số đột biến và họ cũng chỉ ra rằng độtbiến H1069Q là đột biến phổ biến nhất được tìm thấy[16]

Các nhà nghiên cứu Thái Lan cũng đưa ra một báo cáo về việc phát hiệnđột biến trên gen ATP7B một năm sau đó[37]

Năm 2011, nhóm nghiên cứu Xin- Hua Li, Yui Lu, Qing- Chun Fu đãphát hiện thêm 14 đột biến mới trong các bệnh nhân người Trung Quốc[44]

1.1.2.Tình hình nghiên cứu bệnh Wilson ở Việt Nam

Lần đầu tiên vào năm 1969, Bùi Quốc Hương và cộng sự đã báo cáo 8 trườnghợp bệnh Wilson tại hội nghị Thần kinh học quốc tế lần thứ IX tại Mỹ [1]

Sau đó vào những năm 2002-2005, Thái Duy Thành và cộng sự đã cócông trình nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 29 trườnghợp bệnh nhân Wilson ở khoa Thần kinh - bệnh viện Bạch Mai [8]

Tiếp theo Quách Nguyễn Thu Thủy và cộng sự công bố nghiên cứu vềđặc điểm lâm sàng bệnh Wilson ở trẻ em tại Bệnh viện Nhi Trung ương giaiđoạn 2001 - 2006 [5]

Vào năm 2010, Nguyễn Thị Mai Hương, Nguyễn Thị PhươngMai, W Yoo cùng nhóm nghiên cứu đã phát hiện 4 loại đột biến điểm trêngen ATP7B bằng phương pháp phân tích đột biến tại bệnh viện nhi trungương[6]

Năm 2011, Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein trường ĐH Y Hà Nộitiến hành nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson[7] Nhìn chung tình hình nghiên cứu bệnh Wilson ở nước ta còn chưa nhiều.Mới chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu về các đặc điểm lâm sàng và cận lâmsàng[2,3,4]

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH WILON

2.1.1 Đặc điểm lâm sàng của bệnh Wilson

Bệnh Wilson có nhiều biểu hiện lâm sàng phức tạp, theo nghĩa rộng,bệnh nhân Wilson có thể mắc các vấn đề liên quan tới thần kinh, gan, hoặc cảhai Trong những năm qua những tiến bộ trong việc chẩn đoán đã cho phépđánh giá hệ thống của các cá nhân bị nghi ngờ mắc bệnh Wilson trước khi pháttriển các triệu chứng thần kinh Bệnh nhân bị xơ gan, biểu hiện thần kinh, và vòngKayser-Fleischer( K-F) được dễ dàng chẩn đoán là mắc bệnh Wilson bởi vì cácbệnh nhân này có biểu hiện lâm sàng giống mô tả[30, 35] Các bệnh nhân bị suygan, người từ 5-40 tuổi có nồng độ ceruloplasmin trong huyết thanh giảm, xuấthiện vòng Kayser-Fleischer được coi là bệnh Wilson cổ điển[35] Đặc điểm lâmsàng của bệnh Wilson được tổng hợp trong bảng sau:

Bảng 1.1 Các đặc điểm lâm sàng của bệnh Wilson[35]

Đặc điểm lâm sàng bệnh Wilson

• Viêm gan tự miễn

• Xơ gan: có bù hoặc mất bù

• Suy gan cấp tính

Thần kinh

• Chảy nước dãi

• Đau nửa đầu đau đầu

về thần kinh( nếu xảy ra) thường xảy ra sau 2-5 năm [9, 25].

Bệnh nhân có biểu hiện xơ gan đặc hiệu như lách to, huyết áp cao và cổchướng Tất cả bệnh nhân trẻ bị viêm gan mạn tính không rõ nguyên nhân , cóhoặc không có xơ gan, cần được sàng lọc cho bệnh Wilson[28,35]

1.1.1.2 Những thay đổi về mắt

Vòng KF rõ ràng nhất tại vùng ngoại biên của giác mạc, vòng KF xuấthiện do sự lắng đọng đồng bên trong giác mạc trong màng Descemet Kiểmtra bằng đèn khe dùng để xác định có hay không vòng KF Vòng KF xuất hiện

ở hầu hết bệnh nhân mắc bệnh Wilson, tuy nhiên nó không hoàn toàn là đặchiệu, bởi vì vòng KF xuất hiện trong một số trường hợp bệnh lý khác nhưgan mãn tính, ứ mật, xơ gan[9]

Hình 1.1 Vòng KF ở vùng ngoại biên giác mạc[24]

1.1.1.3 Triệu chứng về thần kinh

Những triệu chứng về thần kinh thường xuất hiện sau dấu hiệu về bệnhgan Một số dấu hiệu nhỏ có thể xuất hiện ở những bệnh nhân nhỏ tuổi baogồm các thay đổi trong hành vi, sự suy giảm về việc học hoặc không có khảnăng hoạt động cho mỗi hình thức đòi hỏi phối hợp tốt cả tay và mắt, trướckhi có các triệu về thần kinh điển hình như run, rối loạn nhận thức, chảy nướcdãi[16, 27]

1.1.1.4 Các dấu hiệu lâm sàng khác

Ngoài những bệnh lý về gan, thần kinh, mắt thì những bệnh nhân Wilsoncòn có thể có những thay đổi bệnh lý về xương : nhuyễn xương, loãng xương,gãy xương tự phát, bệnh còi xương ở người lớn [9,12]

1.2.2 Chẩn đoán bệnh Wilson

Chẩn đoán bệnh Wilson thường kết hợp giữa các triệu chứng lâm sàngđặc hiệu với các xét nghiệm sinh hóa

Aminotransferase: Bệnh nhân mắc bệnh Wilson thường có nồng độ enzym

aminotransferase huyết thanh bất thường ngoại trừ ở 1 số trẻ nhỏ tuổi Trongmột số trường hợp, mức độ tăng hoạt động của enzym aminotransferase cóthể là nhẹ và không phản ánh mức độ nghiêm trọng của bệnh gan[9,33]

Celuroplasmin : Protein được tổng hợp chủ yếu ở gan và là một chất phản

ứng trong giai đoạn cấp tính của bệnh, celuroplasmin là 1 protein mang chủyếu của đồng trong máu( chiếm 90% lượng đồng lưu hành trong người bìnhthường) Nồng độ celuroplasmin huyết thanh thường cao trong các trườnghợp viêm cấp tính hoặc phụ nữ mang thai, hoặc dùng thuốc tránh thai Bệnhnhân Wilson có nồng độ celuroplasmin huyết thanh giảm, tuy nhiên trong 1

số trường hợp bệnh lý khác như mất protein niệu thì nồng độ enzym này cũnggiảm đáng kể[9,39]

Xét nghiệm nước tiểu 24h: Lượng đồng bài tiết qua nước tiểu 24h có thể hữu

ích trong việc chẩn đoán bệnh Wilson và theo dõi điều trị[9]

Các khuyến nghị trong chẩn đoán bệnh Wilson[35]:

• Một nồng độ celuroplasmin rất thấp trong huyết thanh( <50 mg/Lhay 5mg/dL) nên được xem là dấu hiệu mạnh mẽ cho việc chẩnđoán bệnh Wilson

• Nên xét nghiệm nước tiểu 24h trong tất cả các bệnh nhân đangnghi nghờ mắc bệnh Wilson Lượng đồng đào thải ra

>100µg( >1.6µmol) trong các bệnh nhân có triệu chứng, nếu lượngđồng đào thải ra >40µg( >0.6µmol) thì cần phải xác định thêm

• Lượng đồng trong gan khô > 250µg/g là một thông tin quan trọngtrong việc chẩn đoán bệnh Wilson

• Đánh giá thần kinh và hình ảnh X- Quang của não bộ nên đượcxem xét trong tất cả các bệnh nhân thần kinh

• Trong trường hợp khó khăn trong chẩn đoán bằng các dấu hiệu lâmsàng và các chỉ số sinh hóa thì nên thực hiện phân tich toàn bộchuỗi gen đột biến.

1.2.3.Điều trị bệnh Wilson

Dùng thuốc: Hiện nay vẫn chưa có biện pháp can thiệp vào gen đột biến mà

các thuốc dùng để điều trị bệnh Wilson nhằm giúp tăng đào thải đồng ra khỏi

cơ thể hoặc dùng để giảm hấp thu đồng Hay nói cách khác, những thuốc này(penicillamine, trientine, kẽm acetate ) chỉ có tác dụng lập lại trạng thái cânbằng của đồng trong mô[11,42]

Chế độ ăn: Nên tránh ăn các loại thực phẩm như scola, gan, các loại hạt, nấm

và các loại tôm, cua ,sò ,hến [13,35]

Ghép gan: việc ghép gan chỉ có hiệu quả với những bệnh nhân Wilson có biểu

hiện suy gan cấp tính và xơ gan mất bù[9]

1.3.CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH WILSON 1.3.1 Cấu trúc, chức năng của protein ATP7B

Bệnh Wilson là do đột biến gen ATP7B Gen ATP7B mã hóa cho proteinATP7B là một thành viên trong nhóm ATPase P- một nhóm các protein vậnchuyển kim loại vào và ra khỏi tế bào bằng cách sử dụng năng lượng đượclưu trữ trong các phân tử adenosine triphosphate(ATP)[32,34] ATP7B đượctìm thấy chủ yếu ở gan, với số lượng nhỏ trong thận và não Nó đóng một vaitrò trong việc vận chuyển đồng từ gan đến các bộ phận khác của cơ thể Đồng

là một phần quan trọng của một số enzym duy trì chức năng tế bào bìnhthường.ATP7B cũng rất quan trọng cho việc loại bỏ đồng thừa khỏi cơ thể Trong các tế bào gan, ATP7B được tìm thấy trong bộ máy Golgi, sửa đổicác enzyme mới được sản xuất và các protein khác Ở đây, ATP7B là nguồncung cấp đồng cho một protein gọi là ceruloplasmin, vận chuyển đồng đếncác bộ phận khác của cơ thể qua máu Nếu nồng độ đồng trong gan quá cao,

ATP7B sẽ vận chuyển đồng rời khỏi bộ máy Golgi và chuyển tới mật để đàothải[32].

Hình 1.2 Chu trình vận chuyển đồng của protein ATP7B[32].

Protein ATP7B mang đầy đủ các đặc điểm đặc trưng cho một proteinthuộc họ protein P - type APTase với 5 vùng chức năng chính như: VùngMBSs, vùng N, vùng P, vùng A và vùng xuyên màng

Hình 1.3 Cấu trúc của protein ATP7B[23]

Vùng MBSs: Là vị trí bám cho các nguyên tử đồng.Gồm 6 MBSs, mỗi

một MBSs gồm các trình tự MxCxxC, 1 MBSs sẽ gắn với một nguyên tửđồng Việc phân tích cấu trúc riêng biệt của MBSs trong ATP7B đã cho thấymột cấu trúc nếp gấp βαββαβ được bảo tồn Trình tự và cấu trúc của cácMBSs này được bảo tồn cao trong quá tiến hóa, ngay cả trong các proteinkhác như ATOX1 liên kết đồng( Cu-chaperon ATOX1) Các MBSs trongATP7B có các chức năng quan trọng như: chuyển vị đồng, hợp nhất đồngtrong phức hợp enzym, hoạt hóa ATPase, tương tác giữa protein với protein.Tuy nhiên, ATP7B tương đồng trên vi khuẩn và nấm men cho thấy chỉ chứamột hoặc hai MBSs Điều này cho thấy không phải tất cả 6 MBSs đều quantrọng[32]

Vùng xuyên màng: Nằm trên 8 exon: từ exon 6- exon 12 và exon 19,

exon 20 Nhìn chung, typ P- ATPase có những vị trí bám cho các ion trongvùng xuyên màng để tạo điều kiện thuận lợi cho các ion di chuyển qua màng.Trên vị trí xuyên màng số 6 gồm 1 motif CPC được bảo tồn đặc hiệu choprotein vận chuyển kim loại nặng Peptid chứa các motif này được chỉ ra rằng

là có gắn với đồng , điều đó cho thấy vậy motif CPC thực sự tham gia vậnchuyển Cu qua màng tế bào[32]

Vùng N: Là vùng bám ATP, các vị trí liên kết chính xác với ATP trong

vùng N chưa được xác định, nhưng phân tích cấu trúc vùng N của ATP7Bthấy có liên quan đến một số đột biến bao gồm H1069, G1099, G1101, I1102,G1149 và N1150 Đặc biệt, H1069, G1099, G1101 và I1102 đều là những vịtrí đột biến được tìm thấy trên bệnh nhân Wilson Và đột biến H1069Q là độtbiến điển hình gây bệnh Wilson ở quần thể người Châu Âu và Bắc Mỹ Điềunày phù hợp với vị trí liên kết ATP, nghĩa là, đột biến H1069Q đồng nghĩavới việc mất vị trí gắn của ATP vào ATP7B Tuy nhiên, trong vùng N, hơn 40đột biến gây bệnh Wilson đã được tìm thấy, điều này chỉ ra rằng có thể cónhiều vị trí tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp vào quá trình liên kết với ATP.Điều này được khẳng định rõ hơn khi đột biến E1064A gây ra sự thiếu hụthoàn toàn sự liên kết của ATP vào vùng N trên ATP7B[32]

Vùng P: Có chức năng phosphor hóa Việc phân tích mô hình thực

nghiệm phân tử cho thấy rằng ATP gắn vào vùng N của protein ATP7B tạo

ra thay đổi về mặt hình thái làm cho vị trí gắn ATP trong vùng N gần vớivùng P hơn Điều này có thể thúc đẩy việc gắn ATP và phosphoryl hóa củavùng P Việc gắn ATP trong vùng P của ATP7B xảy ra trong vùng lân cậncủa axit amin aspartic vị trí 1027 Vị trí này là một phần của motif bảo tồn

cao DKTG(D: axit aspartic, K: Lysin, T: Threonin, G: Glycine) ở typ

P-ATPase Và là vị trí phosphor hóa bằng γ-phosphate của ATP[32]

Vùng A: Có chức năng khử phosphoryl hóa Sự khử phospho của axit

aspartic được thực hiện nhờ phản ứng trung gian của enzyme phosphatase nộibào, trong đó vùng A đóng 1 vai trò then chốt[32]

1.3.2 Vị trí, cấu trúc của gen ATP7B

1.1.1.5 Vị trí, kích thước của gen ATP7B

Gen ATP7B nằm ở vị trí 13q14.3 trên cánh dài NST 13[21]

Vị trí phân tử trên NST 13 là: Từ vị trí 52.505.804 bp đến 52.585.629bp[22]

Gen có kích thước vào khoảng 80 kb[44]

Hình 1.4 Vị trí của gen ATP7B[22]

1.1.1.6 Cấu trúc của gen ATP7B

Cấu trúc của gen ATP7B như sau:

Vùng khởi động: Điều khiển hoạt động của gen để sản xuất ra các protein

đặc hiệu

Exon: Gen ATP7B có 21 exon, đây chính là vùng gen mã hóa để phiên

mã thành mRNA, chứa đựng thông tin di truyền để tổng hợp nên proteinATP7B

Intron: Đây là vùng không mã hóa của gen, nằm xen kẽ giữa những exon,

vùng intron đóng vai trò quan trọng trong quá trình hoàn thiện mRNA

Hình 1.5 Cấu trúc của gen ATP7B[15].

1.3.2 Liên hệ giữa đột biến gen ATP7B và chức năng của protein

Theo các báo cáo nghiên cứu thì hiện nay có khoảng hơn 500 đột biến

được tìm trên bệnh nhân mắc bệnh Wilson, bao gồm các đột biến thay thế,mất đoạn, thêm hoặc bớt nucleotid gây lệch khung dịch mã protein [44].Trong đó, đột biến dạng thay thế nucleotit chiếm khoảng 79.5% các dạng độtbiến gây bệnh( Hình 1.6) Ảnh hưởng của các đột biến có thể làm giảm thậmchí làm mất hoàn toàn khả năng sinh tổng hợp protein của gen ATP7B[32]( Bảng 2)

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của đột biến tới chức năng và điều hòa của

ATP7B[9]

Ảnh hưởng của đột biến tới chức năng

và điều hòa của ATP7BĐột

biến Sự hoạt động xúc tác ATPase Tương tác Protein-ProteinG85V

Giảm thủy phân ATP

Giảm tương tác với ATOX1Tăng tương tác với ATOX1Tăng tương tác với ATOX1

Trong chu trình vận chuyển đồng, ảnh hưởng của đồng tới việc hìnhthành trung gian acylphosphat đã được chứng minh, điều này cho thấy 6MBSs có vai trò điều tiết sự hình thành trung gian acylphosphat Tuy nhiên,đột biến của vùng MBSs này chỉ ảnh hưởng nhẹ đến tốc độ và mức độphosphoryl hóa Các đột biến tập trung chủ yếu ở vùng N và vùng xuyênmàng Có rất nhiều đột biến xảy ra ở vùng N, trong số chúng đột biếnH1069Q là đột biến điển hình nhất[18,31] Khi đột biến này xảy ra đồngnghĩa với việc mất đi vị trí gắn của ATP vào ATP7B Theo một nghiên cứucủa Kuppala cho thấy đột biến H1069Q là phổ biến nhất trong các bệnh nhânWilson người Mỹ( chiếm tới 40.3 % tổng số đột biến) [16], theo một báo cáckhác, đột biến này chiếm tới 37-63% tổng số đột biến ở người da trắng[9].Đây là đột biến dạng thay thế Histidin bằng Glutamin Bằng việc sử dụng kỹthuật giải trình tự gen ATP7B, các nhóm nghiên cứu của Tanzi, Caca, Ferenci

đã phát hiện ra dạng đột biến H1069Q (exon 14) phổ biến nhất trên bệnh nhân

Wilson ở các nước Trung, Bắc và Đông Âu Khoảng 50-80% bệnh nhânWilson ở các nước này có ít nhất một alen mang đột biến H1069Q Một sốcác đột biến khác như 2299insC, G710S (exon 8); 3400 delC (exon 15) vàR969Q (exon 13) chiếm tỷ lệ khoảng 10% [39] Nghiên cứu của Loudianos vàcộng sự cho thấy đột biến mất 15 bp (-441/-427 del) nằm trong vùng promotergen ATP7B là dạng đột biến đặc trưng cho nhóm bệnh nhân Wilson ở quốcđảo Sardinia thuộc vùng Địa Trung Hải [29] Bằng việc sử dụng kỹ thuật PCRkết hợp với dHPLC trước khi giải trình tự gen, Curtist và cộng sự năm 1999

đã cho thấy các đột biến ở exon 8, 14 và 18 chiếm đến 60% tỷ lệ các alen độtbiến ở bệnh nhân Wilson nước Anh [15]

Hình 1.6 Biểu đồ tỉ lệ giữa các đột biến

Tuy nhiên, đột biến này ít gặp hơn ở người châu á, thay vào đó đột biếnR778L dạng Arginine chuyển thành Leucin (CGG → CTG) lại phổ biến hơn.Xin-Hua Li cùng nhóm nghiên cứu của mình đã tiến hành trên 68 bệnh nhânTrung Quốc đã cho kết quả là hai đột biến phổ biến nhất là :

p.Arg778Leu(31.9%) và p.Pro992Leu(11.2%)[44] Theo một báo cáo

từ Ấn Độ cũng đã xác nhận có cả đột biến H1069Q và R778L[9]

1.3.3 Đặc điểm di truyền của bệnh Wilson

Bệnh Wilson do thiếu enzym P-type ATPase là bệnh di truyền gen lặnnằm trên nhiễm sắc thể thường nên tuân theo qui luật di truyền Menden.Nếu gọi A là allen bình thường và a là allen bệnh thì AA là người bìnhthường, Aa là người bình thường mang gen bệnh (dị hợp tử) và aa là ngườibệnh Các con của người bệnh với một người bình thường (aa×AA) có kiểuhình bình thường nhưng là người ở thể dị hợp tử mang gen bệnh (Aa)

Bảng 1.3 Kiểu gen bố mẹ và tỉ lệ bị bệnh di truyền lặn

nhiễm sắc thể thường ở thế hệ con

Kiểu gen của bố mẹ Tỉ lệ con bị bệnh và kiểu gen

(AA – đồng hợp tử lành, Aa – lành mang gen, aa – đồng hợp tử bệnh)

Bệnh nhân Wilson có thể mang một gen bệnh của người bố hoặcmột gen bệnh của người mẹ hoặc cả hai gen bệnh của người bố và người

mẹ Bố, mẹ của bệnh nhân có thể mang gen đồng hợp lặn hoặc gen dị hợp.Các anh chị em của bệnh nhân có thể mang gen bệnh hoặc không Nhữngngười mang gen bệnh đều có khả năng di truyền cho con cháu Có mộtđiểm khác biệt so với nhiều bệnh di truyền khác là người mang gen dị hợpcũng biểu hiện bệnh và thường kèm theo dạng đột biến khác[17,40]

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN ATP7B GÂY BỆNH WILSON

1.4.1 Phản ứng PCR

Nguyên tắc của PCR dựa vào đặc điểm của quá trình sao chép DNA

Enzym Taq polymerase (DNA ployme chịu nhiệt) dùng các đoạn DNA mạch

đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi DNA mới bổ trợ và cần phải có các mồioligonucleotid để khởi đầu quá trình tổng hợp

Các bước cơ bản của phản ứng PCR được mô tả bởi hình 1.6 Mỗi chu

kỳ phản ứng gồm 3 giai đoạn khác biệt nhau và được điều hòa bởi nhiệt độ:+ Giai đoạn 1: Phân tử DNA được xử lý ở nhiệt độ cao để tách DNAkhuôn dạng kép thành hai sợi đơn, thường là 94 – 95oC

+ Giai đoạn 2: Nhiệt độ hạ thấp dưới nhiệt độ nóng chảy Tm của các mồi,cho phép các mồi liên kết bắt cặp với các sợi đơn DNA khuôn theo nguyêntắc tạo cặp bổ sung Trong quá trình gắn mồi, enzym DNA polymerase bềnvới nhiệt sẽ được hoạt hóa và bắt đầu giai đoạn kéo mồi Thường nhiệt độkhoảng 40 -700C, tùy thuộc vào kích thước và Tm của các mồi.

+ Giai đoạn 3: Tổng hợp bởi Taq polymerase (synthesis): Taq sử dụng 4

nucleotid (dATP, dCTP, dGTP, dCTP) viết tắt là dNTP 4 loại dNTP để kéodài sợi mồi, tổng hợp sợi DNA mới

Ba giai đoạn tạo thành 1 chu kỳ trong phản ứng PCR Khi các chu kỳđược lặp lại, các đoạn DNA vừa được tổng hợp ở các chu kỳ trước trở thànhkhuôn cho chu kỳ sau Số lượng phân tử DNA tạo ra tăng gấp đôi sau mỗi chu

kỳ Số chu kỳ lặp lại trong mỗi phản ứng PCR thường từ 30→40 chu kỳ vàmỗi chu kỳ thường kéo dài khoảng 2 phút Đoạn khuôn có thể là DNA mạchkép, mạch đơn hoặc ARN Mồi oligonucleotid thường có kích thước 6 - 30nucleotid

1.4.2 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing)

DNA là cơ sở hóa học của gen Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của haimạch đơn được cấu tạo từ 4 loại nucletid khác nhau nhờ các base của chúng, đólà: A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine) Các nucleotid này nốikết liên tiếp với nhau theo một thứ tự xác định Giải trình tự gen tức là phát hiệnđược thứ tự sắp xếp của 4 nucleotid này trên phân tử DNA

Để thực hiện giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sảnsinh trong ống phản ứng giải trình phải được đánh dấu huỳnh quang để cácvạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sánglaser Bốn loại ddNTP thường được đánh dấu bằng các chất huỳnh quangkhác nhau Cấu tạo của một máy tự động gồm hai phần chính yếu, đó là: phầnđiện di với gel polyacrylamid và phần phát hiện các vạch điện di Phần điện dipoluacrylamid có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel Phần

phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm ti laser điqua trước nó Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di,mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia sáng laser thì vạch điện di sẽphát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưulại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ Tù biểu đồ của các đỉnhcường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu đểcuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA

Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự gen trên GeneBank(National Center for Biotechnology Information – NCBI)

Kỹ thuật giải trình tự của DNA đích đã được ứng dụng trong nhiềunghiên cứu để xác định các đột biến mất nucleotid, thay thế nucleotid, thênnucleotid trên gen Do phần lớn các đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson làđột biến điểm như trên đã trình bày nên cho đến nay phương pháp giải trình tựgen ATP7B vẫn được coi là một tiêu chuẩn vàng để phát hiện các đột biếncủa gen gây bệnh