Các khâu còn lại, từ mảnh bệnh phẩm sau khi pha, được xử lý qua các khâu kỹ thuật vi thể, làm ra các tiêu bản mô bệnh học được thực hiện trong labo mô bệnh học và do các kỹ thuật viên mô
Trang 1ĐẶT VẤN ĐỀ
Một xét nghiệm mô bệnh học được tiến hành theo một chuỗi liên hoàn
từ việc lấy bệnh phẩm, cố định, pha, chuyển đúc, cắt mảnh, dán mảnh, nhuộm
và đọc kết quả Việc lấy bệnh phẩm bằng phẫu thuật, sinh thiết hay bấm qua nội soi…được thực hiện bởi các bác sĩ lâm sàng Việc pha bệnh phẩm thành các mảnh nhỏ và đọc kết quả mô bệnh học do các bác sĩ chuyên khoa giải phẫu bệnh đảm nhiệm Các khâu còn lại, từ mảnh bệnh phẩm sau khi pha, được xử lý qua các khâu kỹ thuật vi thể, làm ra các tiêu bản mô bệnh học được thực hiện trong labo mô bệnh học và do các kỹ thuật viên mô bệnh học thực hiện
Giải phẫu bệnh là khoa học các tổn thương, phân tích bệnh tật về hình thái học cũng như cơ chế [1] Vì vậy, để có một tiêu bản đẹp, đạt yêu cầu cho chẩn đoán luôn là mục tiêu phấn đấu cho mỗi labo mô bệnh học
Trong vài thập niên gần đây, cùng với sự phát triển mạnh về khoa học
và công nghệ, từng khâu trong chuỗi liên hoàn xét nghiệm mô bệnh học đã có những cải tiến mới, thay vì phải thao tác bằng tay thì giờ đây, phần lớn các khâu đã được thực hiện bằng máy Công xuất làm ra các tiêu bản mô bệnh học ngày một tăng, đáp ứng đầy đủ các yêu cầu của các nhà lâm sàng Tuy nhiên, giải phẫu bệnh học nói chung và kỹ thuật mô bệnh học nói riêng, có tính đặc thù Với chuyên ngành này, máy móc dù có tối tân đến đâu cũng không thể thay được yếu tố con người Để có một tiêu bản đẹp, người kỹ thuật viên mô bệnh học, bên cạnh đôi bàn tay điêu luyện luôn phải có những hiểu biết tường tận về hóa chất, hóa-lý tính và đặc điểm mô học cơ bản của các loại mô cũng như phải hiểu rõ và tuân thủ đúng các yêu cầu cơ bản của các khâu kỹ thuật…
Trang 2Trong phạm vi một khóa luận tốt nghiệp cử nhân kỹ thuật y học làm về
kỹ thuật mô bệnh học Chúng tôi lựa chọn đề tài “So sánh kỹ thuật dàn mảnh cắt bằng bàn hơ nhiệt với bể nước nóng trong kỹ thuật làm tiêu bản
mô bệnh học” với hai mục tiêu là:
1 Thực hiện hoàn chỉnh kỹ thuật làm tiêu bản nhuộm thường quy Hematoxylin Eosin (H&E)
2 So sánh kỹ thuật dàn/tãi mảnh cắt bằng bàn hơ nhiệt với bể nước nóng trong quá trình làm tiêu bản mô bệnh học.
Trang 3Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Quá trình làm ra một tiêu bản mô bệnh học [2].
1.1.1 Lấy bệnh phẩm :
Bệnh phẩm làm mô bệnh học được lấy bởi các bác sĩ lâm sàng và chủ yếu gồm các loại: bệnh phẩm phẫu thuật( sau khi cắt bỏ một phần hay toàn bộ một phần cơ quan trong cơ thể); Bệnh phẩm được lấy bằng sinh thiết mổ; Kim sinh thiết, sinh thiết bấm qua nội soi… Hai yêu cầu cơ bản trước tiên của việc
lấy bệnh phẩm là: phải lấy trúng và lấy đủ.
♦ Lấy trúng
Lấy được bệnh phẩm trúng vùng tổn thương cấn xét nghiệm là vấn đề không đơn giản và không phải bao giờ cũng thực hiện được Ngay cả trong trường hợp tổn thương có thể quan sát bằng mắt thường (vết loét , ung thư ở
cổ dạ con, ở vùng tai, mũi, họng…) hoặc sờ nắn được dễ dàng (những u hạch nông, những u dưới da, ung thư vú nên để xác định vị chí chính xác vùng sinh thiết là một việc khó khăn, phải cân nhắc, và đòi hỏi kinh nghiệm Ngay
cả những trường hợp nhìn thấy được tổn thương thì vẫn nên lấy bệnh phẩm ở nhiều vị trí khác nhau và lặp lại sinh thiết khi kết quả âm tính Tốt nhất là lấy bệnh phẩm qua cắt lọc vùng tổn thương cho hoàn chỉnh ngay một lần, khi bệnh phẩm còn tươi, nếu như tổn thương ấy nhỏ hoặc khó phân biệt với những vùng tổn thương lành mạnh kề bên rồi sẽ cố định
♦ Lấy đủ
Lấy đủ là lấy đủ thành phần, đủ lượng tối thiểu cần cho việc chuẩn đoán Một yêu cầu khác tuy không quyết định nhưng hỗ trợ nhiều cho việc chuẩn đoán là vừa lấy được tổ chức bình thường lẫn tổ chức bệnh trên cùng một sinh thiết, mục đích của việc lấy cả phần lành lẫn phần bệnh là để đối
Trang 4chiếu, so sánh vùng bình thường với bệnh lý, xác định tính chất xâm lấn tổn thương và trong một số trường hợp xác định cơ quan có tổn thương hoặc loại bệnh Đối với một số tổn thương có tính chất chuyển tiếp hoặc có những giai đoạn phát triển khác nhau, phải lấy bệnh phẩm vừa ở vị trí khác nhau vừa ở
những thời điểm khác nhau 2.1.2 Cố định
♦ Khái niệm
Cố định là làm bất động những cấu chúc của mô cũng như của tế bào, nhưng vẫn tôn trọng tới mức tối đa hình thái của chúng hay nói cách khác, cố định một mô là giết chết những thành phần của mô nhưng vẫn bảo quản được chúng trong tình trạng gần như lúc sống nhất
♦ Vài nét cơ bản về cố định
Một loại thuốc cố định tốt phải đạt những yêu cầu cơ bản sau:
- Chống được sự nhiễm trùng.
- Ngấm nhanh vào mô, giết nhanh tế bào.
- Bảo toàn hay chỉ làm thay đổi rất ít những cấu trúc cơ bản của mô và tế bào,
chống lại sự tiêu hủy do men nội bào, nhất là làm cho protein thành axit amin
- Những thành phần của tế bào cần tìm không được hòa tan, không những
chịu được tác động của các khâu kỹ thuật về sau mà còn chuẩn bị tốt cho các khâu kỹ thuật ấy
- Không làm cho mô, tế bào và những thành phần của chúng bị méo mó, biến
dạng, nhất là không sinh ra những hình giả tạo
- Bảo toàn những chức năng hóa học sẵn có hoặc làm bộc lộ những chức phận
hóa học đã bị ngụy trang
- Tôn trọng một số đặc điểm vật lý.
♦ Một số nguyên tắc chung về cố định
- Mọi bệnh phẩm phải được cố định ngay sau khi lấy để tránh các men nội
bào hoạt động làm cho tế bào thoái hóa, tan ra gây ra sự tự tiêu hủy
Trang 5- Không được làm dập nát bệnh phẩm.
Tuyệt đối tránh dùng kẹp có răng để kẹp chặt bệnh phẩm, nhất là khi bệnh phẩm còn tươi Nên cố định bệnh phẩm trước khi pha sau khi đã cố định
sơ bộ
- Bệnh phẩm không được cắt quá dày.
Thường từ 3-5 mm là vừa, không nên cắt dày quá vì phần giữa của bệnh phẩm không được cố định sẽ bị tự tiêu hủy hoặc thối rữa trước khi dung dịch cố định ngấm tới
- Không để một mặt bệnh phẩm dính vào lọ đựng.
Phải đổ dung dịch cố định vào lọ đựng rồi mới cho bệnh phẩm vào, nếu một mặt bệnh phẩm dính vào thành lọ mà không được cố định sẽ dẫn đến bị thoái hóa, hoại tử
- Chú ý với những trường hợp cố định đặc biệt
Glycogen thì cố định bằng dung dịch Gendre
Mỡ cố định bằng dung dịch formol 10% cắt lạnh và nhuộm Soudan.Không có loại dung dịch cố định đa năng Vì vậy khi tiến hành nghiên cứu cần tìm hiểu cố định bằng dung dịch nào
Trang 61.1.3 Gửi Xét nghiệm
Là công việc của các khoa lâm sàng bao gồm gửi bệnh phẩm đã được
cố định và phiếu xét nghiệm với những yêu cầu cơ bản sau :
♦ Bệnh phẩm phải được bảo quản nguyên vẹn trong tình trạng cố định
tốt
- Lọ đựng phải sạch, thậm chí cần vô trùng để tránh những tác động ngoại lai làm ảnh hưởng tới bệnh phẩm (nấm mọc, vi khuẩn từ dụng cụ làm hỏng bệnh phẩm )
- Chất liệu lọ đựng bệnh phẩm như thủy tinh chất dẻo
Mỗi lọ chỉ đựng một bệnh phẩm sinh thiết của một bệnh nhân
♦ Cung cấp những thông tin cơ bản
- Ngoài những thông tin như ký hiệu, tên, tuổi, giới của bệnh nhân phiếu gửi xét nghiệm phải ghi rõ nơi lấy bệnh phẩm, loại thuốc cố định được sử dụng
- Nhất thiết phải có sổ lưu để tiện tra cứu, đối chiếu khi cần thiết
1.1.4 Vùi bệnh phẩm
♦ Mục đích của vùi bệnh phẩm
Sự cố định chỉ mới giết chết tế bào và giữ cho những thành phần của nó được bất động ở tình trạng tĩnh Để biết được thực chất của mối liên quan giữa tế bào và mô cũng như cơ cấu của tế bào ít bị biến dạng người ta phải có một chất làm nền cho bệnh phẩm giống như một cái khuôn giữ vững cho bệnh
Trang 7phẩm bằng cách thâm nhập được vào trong tế bào và giữ cho các thành phần của tế bào hoặc của mô không bị thay đổi khi cắt mảng Đó là sự vùi.
♦ Nguyên lý
Chất dùng để vùi hay dùng nhất là paraffin vì có những tính chất như
Có mật đó thích hợp và dễ ngấm nhất là cho phép cắt mảng mà ít làm thay đổi hình thái và tính chất của mô hoặc tế bào Loại paraffin thích hợp nhất cho vùi bệnh phẩm là loại có nhiệt độ nóng chảy 56-58°C
♦ Vùi paraffin
- Khử nước
Vì paraffin không tan trong nước nên không ngấm vào mô hoặc tế bào được do đó bệnh phẩm phải được khử nước bằng cồn etylic có nồng độ từ thấp đến cao : 80°C, 95°C, 100°C
- Tẩm dung môi trung gian của paraffin ( khử cồn)
Do paraffin cũng không tan trong cồn nên phải khử cồn bằng một dung môi trung gian có đồng thời có 2 tính năng: Vừa hòa tan cồn hòa tan paraffin Dung dịch trung gian sẽ loại cồn có trong bệnh phẩm, làm tan mỡ và làm trong bệnh phẩm Dung môi trung gian hay dùng nhất là toluen hoặc xylen
- Tẩm paraffin ( khử dung môi trung gian )
Tẩm paraffin chỉ thực hiện được tốt khi dung môi trung gian đã được loại bỏ hoàn toàn bằng cách chuyển bệnh phẩm vào những cốc có paraffin nóng chảy với độ tinh khiết tăng dần
- Đúc bloc hay vùi thực sự
Muốn đúc bloc phải làm cho paraffin ở xung quanh cũng như ở bên trong bệnh phẩm đặc lại một cách thuần nhất, dùng những khuôn bằng kim loại, những khuôn này được láng qua một chút glycerin Đổ vào khuôn chất paraffin đã lọc từ trước, nhúng ngay bệnh phẩm vào chất paraffin còn đang lỏng này Dùng kẹp đã hơ nóng để định hướng bệnh phẩm theo ý muốn
Trang 8Chừng 10 giây, chất paraffin lỏng tiếp xúc với khuôn đã tạo nên một màng mỏng và khi ấy bệnh phẩm đã được định hướng Khi lớp vỏ ngoài paraffin đã
đủ chắc (nhưng bloc vẫn còn ấm) nhúng cả khuôn vào bát đựng đầy nước lạnh và chú ý không làm dạn, vỡ màng mỏng ở paraffin bên trên Khoảng 20 đến 30 phút sau, paraffin sẽ chắc và thuần nhất toàn bộ Khuôn sẽ tách ra gần như tự nhiên sau khi nguội hoàn toàn nếu như nó được rửa sạch và bôi glycerin trước
♦ Quy trình chuyển tay
• Áp dụng cho bệnh phẩm có chiều dày < 2mm
Trang 9♦ Quy trình chuyển máy
• Áp dụng cho mô thông thường
Trang 10- Đặt lưỡi dao vào và định hướng khối và dao trên máy cắt mỏng cho thích hợp Bắt đầu cắt với độ dày 3 đến 5 µm đối với tế bào học.
♦Tãi mảnh cắt và dán
- Nhỏ vài giọt nước hoặc dung dịch dán lên phiến kính (dung dịch phải làm ướt đều kính)
- Đặt lên trên dung dịch một mảnh cắt hay một dải cắt
- Đặt phiến kính lên bàn nóng khoảng 50°C và theo dõi mảnh cắt tãi ra, mảnh cắt phải nổi trên dung dịch
- Nghiêng phiến kính để thoát nước đi một cách thận trọng
- Để khô tiêu bản theo tư thế nghiêng (mảnh cắt ở mặt dưới) ít nhất là 12 giờ
ở nhiệt độ bình thường hoặc 20 đến 30 phút trong tủ ấm ở nhiệt độ khoảng 45°C, khi đã khô kiệt các mảng cắt dính rất tốt vào phiến kính
♦ Tiêu chuẩn của một mảnh cắt đạt yêu cầu
- Mảnh cắt phải mỏng đều
- Không sước hoặc rách
- Mảnh cắt có kích thước to gần bằng bệnh phẩm thật
- Không được hơ dãn quá, còn nguyên khuôn paraffin
- Mảnh cắt phải đặt giữa lam kính
1.1.6 Nhuộm Hematoxylin- Eosin (H&E)[3]
- Tiêu bản tẩy paraffin 3 lần xylen, mỗi lần 2 phút
- Loại xylen bằng cồn 100°, cồn 95°, 80°, mỗi lần 2 phút
- Rửa nước chảy 5 phút
- Nhuộm nhân trong dung dịch hematoxylin nhanh từ 2 đến 5 phút
- Biệt hóa trong cồn acid 1% (1ml HCl nguyên chất trong 100ml cồn 70°) trong
vài giây
Trang 11- Rửa nước chảy ít nhất 5 phút (kiểm tra dưới kính hiển vi xem nhân đã được chưa, nếu nhạt nhuộm thêm, nếu sẫm quá thì biệt hóa trong cồn acid và rửa nước chảy ít nhất 5 phút).
- Làm xanh bằng các dung dịch lithicacbonnat trong 1 phút
- Rửa nước chảy 5 phút
- Nhuộm bào tương bằng Eosin từ 1 đến 3 phút
- Rửa qua nước
- Tẩy bằng cồn tuyệt đối
Tùy theo hãng sản xuất, bàn hơ thường có hai loại kích thước: l × w × h = 150
× 250 × 65(mm) và 180 × 250 × 65 mm Đây là một thiết bị kinh điển và được
sử dụng rộng khắp trong các labo mô học và mô bệnh học Hiện đang lưu hành với nhiều kiểu dáng và mẫu mã khác nhau
Bề mặt bàn hơ là một tấm kim loại phẳng, dày khoảng 50-100mm, thường làm bằng hợp kim nhôm hoặc gang trắng Bề mặt được miết bóng với độ phẳng từ 5-8/14 Bên dưới là một dây trở sinh nhiệt có công xuất từ 150-300Walt, được cách điện và áp sát mặt dưới của bàn hơ Ở ngay sát mặt dưới
và ở điểm xa của bàn hơ được lắp một cảm biến nhiệt(sensor) có biên độ điều chỉnh từ 30-100°C với sai số 1%
Mảnh cắt paraffin được đặt lên vị trí quy định của lam kính sau đó được đặt lên mặt bàn hơ và trước đó luôn sử dụng một dung dịch Albumin phủ lên lam
Trang 12kính chứa mảnh cắt paraffin Cùng lúc đó, kỹ thuật viên dùng hai que tãi để kết hợp với sự tự dãn do nhiệt của mảnh cắt paraffin, tãi phẳng mảnh cắt trên lam kính.
Nhiệt độ bể nước tương ứng với nhiệt độ nóng chảy của paraffin, kết hợp với sức căng bề mặt của nước nóng đã có độ phẳng gần như tuyệt đối sẽ giúp cho mảnh cắt paraffin tự dãn phẳng mà không cần que tãi, không cần dung dịch Albumin và cùng một lúc có thể dàn nhiều mảnh cắt Thiết bị này xem ra rất thích hợp với việc cắt mảnh bằng máy (tự động) và cắt tiêu bản để nhuộm hóa mô miễn dịch
Sự ra đời của bể nước nóng là một cải tiến đáng kể trong việc dàn mảnh cắt làm tiêu bản mô bệnh học Tuy nhiên, nó sẽ hoàn hảo hơn và có được các
kỳ vọng của nhà sản xuất khi bệnh phẩm phải được vùi trong paraplast không phải là paraffin pha sáp ong như hiện nay Loại đầu có nhiều ưu việt hơn loại
Trang 13sau về tính đồng nhất, dễ cắt mỏng, khả năng hòa tan trong dung môi, điểm nóng chảy tới hạn không như paraffin thường , nhưng giá đắt hơn nhiều.
1.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới kỹ thuật làm tiêu bản mô bệnh học
- Điều chỉnh và cho dầu vào máy cắt mỏng chưa tốt
- Một trong các bộ phận của máy cắt mỏng bị rung
- Đặt độ nghiêng của lưỡi dao chưa đúng
- Lưỡi dao chưa đủ sắc
- Tốc độ quay quá nhanh hoặc quá chậm
- Khối cắt định hướng sai, hai bề mặt trên và dưới không song song
-Nhiệt độ xung quanh cao quá hoặc paraffin mềm quá
- Vùi tồi trong một paraffin quá nguội
- Chất lượng paraffin xấu
- Thời gian tãi mảnh cắt không đủ nhanh
- Nhiệt độ bàn tãi hoặc bể tãi quá cao
- Hóa chất phẩm nhuộm kém chất lượng
- Bệnh phẩm có những phần tổ chức quá rắn (cặn máu, xương vv )
- Khử nước tồi hoặc bệnh phẩm khử nước quá nhanh
- Chất lượng các dung dịch hóa chất trong quá trình nhuộm không đảm bảo
- Lam kính chưa sạch
- Thời gian chuyển và nhuộm không đúng quy trình
- Kỹ thuật người làm chưa đúng
Trang 14Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Chúng tôi lấy ba loại mẫu bệnh phẩm đại diện cho ba loại mô: Hạch, ruột và thận Mỗi loại mô lấy 10 mảnh kích thước 3×100×100mm Các mảnh đều được cố định Formol 10%, chuyển bằng máy LTD 100 cùng với các bệnh
phẩm khác của bộ môn, đúc paraffin và làm thành 30 Bloc của ba loại mô
(mỗi loại mô 10 bloc tương tự nhau)
Tiêu chuẩn loại trừ: Các mảnh cắt đều được cố định và chuyển, đúc thành
các bloc, cùng một lần với các mảnh cắt khác, được labo bộ môn giải phẫu bệnh làm hằng ngày và do các kỹ thuật viên lành nghề cắt, nhuộm, làm tiêu bản mô bệnh học Các tiêu bản này đủ tiêu chuẩn để chẩn đoán Đây chính là tiêu chuẩn loại trừ, khẳng định các bloc trên đã đạt tiêu chuẩn về cố định, chuyển và đúc paraffin
2.2 Phương pháp nghiên cứu: mô tả cắt ngang
2.2.1 Tiến hành kỹ thuật
Học viên tiến hành kỹ thuật cắt, tãi, dán mảnh và nhuộm 30 bloc
Việc cắt mảnh được thực hiện bằng Microtom quay tay, bằng dao cắt sử dụng một lần, cùng một seri
Mỗi bloc cắt và lấy 6 tiêu bản Việc tãi mảnh cắt được tiến hành song song, cứ 1 mảnh được tãi bằng bàn hơ nhiệt, mảnh cắt kế tiếp được tãi bằng
bể nước nóng Như vậy, mỗi một bloc có 3 mảnh cắt được tãi bằng bàn hơ nhiệt và 3 mảnh khác bằng bể nước nóng, xen kẽ nhau
Các bloc được đánh số thứ tự, mảnh cắt tãi bằng bàn hơ nhiệt được ký hiệu bằng chữ K sau số thứ tự bloc Mảnh cắt được tãi bằng bể nước nóng
