Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển gen kháng virus xoăn vàng lá cho giống cà chua DM166

3.1.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp Zeatin và IAA ñến khả 3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Zeatin và IAA ñến sự ra rễ của chồi 3.4 Tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

NGUYỄN HỒNG ÁNH

NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS XOĂN VÀNG LÁ

CHO GIỐNG CÀ CHUA DM166

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược sử dụng và công bố trong các luận văn, luận án và các công trình khoa học nào trước ñây

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn ñược sử dụng trong luận văn ñều

ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc, ñảm bảo trích dẫn theo ñúng quy ñịnh

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam ñoan này !

Tác giả

Nguyễn Hồng Ánh

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Quang Thạch

Bộ môn CNSH- Trường ðH Nông nghiệp Hà Nội và TS ðặng Thị Vân- Bộ môn

CNSH, Viện Nghiên cứu Rau Quả Việt Nam ñã tận tình hướng dẫn em trong quá trình

thực hiện và hoàn thành luận văn

Em xin ñược gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học –Trường ðH Nông Lâm Bắc Giang ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia ñình cùng bạn bè, những người ñã luôn quan tâm ủng hộ và là chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian em làm luận văn này

Xin trân trọng cám ơn!

Bắc Giang, ngày 22 tháng 8 năm 2013

Học viên

Nguyễn Hồng Ánh

MỤC LỤC

1.7 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật 21

1.7.1 Giới thiệu chung về Agrobacterium tumefaciens 21

1.7.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium

1.7.6 Các phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium

3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ

3.1.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ lá mầm 46

3.1.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ thân mầm 47

3.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ lá trưởng

3.1.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp Zeatin và IAA ñến khả

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Zeatin và IAA ñến sự ra rễ của chồi

3.4 Tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào giống cà chua DM166 thông qua vi

3.4.1 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn (OD600nm) ñến tỉ lệ biểu hiện tạm thời

3.4.2 Ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) ñến tỷ lệ biểu hiện tạm

3.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ trong quá trình ñồng nuôi cấy tới hiệu quả

3.4.5 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất ñiều tiết sinh trưởng trong môi trường lây

nhiễm và trong môi trường ñồng nuôi cấy tới hiệu quả chuyển gen 60

IAA : β – Indol acid acetic

NAA : Napthalene acetic acid

PCR : Polymerase Chain Reaction

Ti-plasmid : Tumor-Plasmid

T-DNA : Transfer-DNA

Vir : virulence

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

1.2 Diện tắch, năng suất và sản lượng cà chua của các châu lụctrên thế giới

1.4 Những nước có giá trị nhập khẩu cà chua lớn nhất thế giới năm 2008 7

3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ lá mầm 46

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành

3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ lá trưởng

3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp Zeatin và IAA ựến khả

3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ựộ Zeatin và IAA ựến hiệu quả ra rễ 53

3.6 đánh giá ựặc ựiểm hình thái và mức bội thể của cây tái sinh trước khi ra

3.7 Ảnh hưởng của mật ựộ vi khuẩn tới tần số biểu hiện tạm thời của gen

3.8 Ảnh hưởng của hàm lượng AS (Acetosyringone) ựến sự biểu hiện tạm

3.10 Ảnh hưởng của nhiệt ựộ trong quá trình ựồng nuôi cấy tới hiệu quả

3.11 Ảnh hưởng của nồng ựộ chất ựiều tiết sinh trưởng trong môi trường lây

nhiễm và trong môi trường ựồng nuôi cấy tới hiệu quả chuyển gen 60

3.1 ðồ thị ñánh giá ảnh hưởng của sự phối hợp nồng ñộ IAA và Zeatin tới

khả năng tạo callus ñối với lá mầm, thân mầm và lá trưởng thành 50

3.3 Kết quả ñiện di kiểm tra sự hiện diện promoter 35S của một số mẫu cà

3.4 Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm khuyếch ñại trình tự mục tiêu của một

3.6 Hình ảnh hiển thị kết quả lai Southern mẫu dò cho promoter 35S của một

3.7 Hình ảnh hiển thị kết quả lai Southern mẫu dò cho promoter 35S của một

MỞ ðẦU

1 ðặt vấn ñề

Cà chua là thực phẩm quan trọng trong ñời sống thường ngày của con người ðây là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, dễ trồng, vốn chi phí ban ñầu thấp, có thể

mở rộng sản xuất ở hầu hết các vùng sinh thái khác nhau

Nhu cầu tiêu thụ cà chua ở nước ta rất lớn và nhu cầu ngày càng tăng vì cà chua

là loại rau quả có giá trị dinh dưỡng cao, trong quả cà chua có chứa nhiều loại vitamin như: A, B, C, PP, K… và các chất khoáng như: Ca, Fe, P,S, Na, K, Mg và ñường Mặt khác, cà chua là loại thực phẩm dễ chế biến và sử dụng, có thể dùng ăn tươi, nấu, chế biến thành cà chua khô, cà chua bột, tương cà chua, …Bên cạnh ñó, cà chua còn là mặt hàng xuất khẩu có triển vọng vì sản phẩm cà chua ở nước ta ñược thu hoạch vào thời ñiểm nhiều nước không trồng ñược trong mùa ñông lạnh (Trần Khắc Thi, 2005) [20 ]

Tuy nhiên, năng suất và chất lượng cà chua phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố trong ñó bệnh hại là yếu tố rất quan trọng, ñặc biệt là những bệnh gây ra do nấm, vi khuẩn, virus Chúng gây hại từ giai ñoạn cây con trong vườn ươm, giai ñoạn trồng ngoài sản xuất cho ñến khi thu hoạch (Chu Thị Thơm và cs, 2006) [ 1]

Bệnh hại cà chua làm giảm năng suất khiến người nông dân phải dùng nhiều loại thuốc phòng trừ sâu bệnh với liều lượng cao,làm ô nhiễm môi trường và sản phẩm, gây ngộ ñộc cho người tiêu dùng do tồn dư thuốc hóa học bảo vệ thực vật trong sản phẩm

Bên cạnh ñó, với năng suất trung bình 14 tấn/ha, sản lượng cà chua hàng năm trên cả nước còn rất khiêm tốn ( 100 ngàn tấn) mới chỉ ñảm bảo cho bình quân ñầu người hơn 1kg/năm (Trần Khắc Thi, 2005) [ 20]

Vì vậy, việc tạo ra những giống cà chua có khả năng kháng sâu bệnh, năng suất cao và chất lượng tốt là rất cần thiết

Trước ñây, muốn tạo ra một giống cây trồng mới, người ta ñã phải lai tạo, chọn lọc qua nhiều thế hệ nhưng không phải tất cả ñều tạo ñược giống cây mang ñược các ñặc tính như mong muốn

Ngày nay, công nghệ gen ñã giúp cho việc chuyển gen ưu việt vào cây trồng

ñược nhanh chóng và hiệu quả hơn (Trương Thị Bích Phượng và cs, 2003) [19 ]

Việc nghiên cứu chuyển gen trên cây cà chua ñã ñược nghiên cứu rất sớm trong lịch sử nghiên cứu cây chuyển gen, ñồng thời nhiều nghiên cứu ñã rất thành công, vật liệu cây cà chua tạo ra bằng phương pháp chuyển gen ñã ñược phát triển thành giống thương mại

Tuy nhiên, kết quả các nghiên cứu ñã chỉ ra rằng hiệu quả chuyển gen vào cây cà chua phụ thuộc rất nhiều vào giống (genotyp dependent).ðề tài: Nghiên cứu ứng dụng

kỹ thuật chuyển gen trong tạo giống kháng virus xoăn vàng cà chua cho Việt Nam ñược tiến hành trên một số giống (FM372C, DM166, M88).Trong ñó ñã xây dựng ñược quy trình chuyển gen cho giống FM372C và áp dụng có hiệu quả.Việc nghiên cứu qui trình chuyển gen cho hai giống cà chua còn lại DM166 và M88 là cần thiết

Trên cơ sở quy trình chuyển gen của giống FM372C chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài:“ Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển gen cho giống cà chua DM166.’’

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu nhằm xác ñịnh ñược quy trình chuyển gen phù hợp cho giống DM166

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vài nét về cà chua

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây cà chua

Cà chua có nguồn gốc ở Peru, Bolivia, Ecuado Trước khi tìm thấy ở Châu Mỹ thì cà chua ñược trồng ở Peru và Mehico Những loài cà chua hoang dại gần với loài

cà chua trồng ngày nay vẫn tìm thấy ở dọc theo dãy núi Andes (Peru), ñảo Galapagos (Ecuado) và Bolivia Các nhà vường ñã trồng, thuần dưỡng những giống cà chua quả nhỏ và dạng hoang dại Những giống và loài hoang dại này ñược mang từ nơi xuất xứ ñến Trung Mỹ, rồi ñến Mehico (Tạ Thu Cúc, 2002) [16]

ðến ñầu thế kỷ XVIII, các giống cà chua ñã trở nên phong phú và ña dạng hơn, nhiều vùng ñã trồng cà chua làm thực phẩm Vào thế kỷ XIX (1830) quả cà chua ñã trở thành thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày Cuối thế kỷ XIX, trên

200 dòng, giống cà chua ñược giới thiệu một cách rộng rãi trên thế giới (Tạ Thu Cúc, 2002) [16]

Cà chua thuộc họ cà (Solanaceae), bộ cà (Solanales), phần lớp bạc hà (Lanmiidae), lớp ngọc lan (Magnoliopsida), có tên khoa học là Solanum Lycopersicum (tên gọi cũ là Lycopersicum esculentum L.) Ngoài ra cà chua có nhiều tên gọi khác nhau như Lycopersicum esculentum Mill, L Lyccopersion, S.lycopersicon, L.kort (

Trần Khắc Thi, 2005) [20] Từ lâu ñã có nhiều tác giả nghiên cứu về phân loại cà chua

và lập thành hệ thống phân loại theo quan ñiểm của mình Theo Muller (1940) thì loài

cà chua trồng hiện nay thuộc chi phụ Eulycopersion C.H.Muller Tác giả phân loại chi

phụ này thành 7 loài, loài cà chua trồng hiện nay (Lycoprsion esculentum L.) thuộc chi

phụ thứ nhất ( Tạ Thị Cúc, 2002) [16]

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng

Trong cà chua có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng có lợi cho cơ thể như Carotene, lycopene, vitamin và kali Tất cả những chất này ñều rất có lợi cho sức khoẻ con người ðặc biệt các loại vitamin B, vitamin C và β-carotene giúp chống lại quá trình oxy hoá của cơ thể, giảm thiểu nguy cơ tử vong do bệnh tim mạch và ung thư Hàm lượng vitamin A thiên nhiên trong cà chua cao, trung bình chỉ cần 100g cà chua

chín còn tươi sẽ ñáp ứng ñược 13% nhu cầu hằng ngày về vitamin A, cũng như các vitamin B6, vitamin C Ngoài ra còn có các vitamin B1, B2, PP

Các chất khoáng vi lượng có trong cà chua như: canxi, sắt, kali, photpho, magnesium, lưu huỳnh, nickel, cobalt, iốt, các axít hữu cơ dưới dạng muối citrat và tuỳ theo môi trường trồng, trong cà chua có thể có cả ñồng, molibden Chính nhờ các yếu

tố này, cà chua ñược coi là một thức ăn giàu chất dinh dưỡng, dễ tiêu hoá, tăng cường sức ñề kháng của cơ thể

Bảng 1.1 Thành phần quả cà chua (trong 100g ăn ñược)

Ngoài ra, có thể chiết tách hạt cà chua ñể lấy dầu Quả cà chua vừa có thể dùng

ñể ăn tươi, nấu nướng vừa là nguyên liệu cho chế biến công nghiệp với các loại sản phẩm khác nhau Do ñó, với nhiều nước trên thế giới thì cây cà chua là một cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế rất cao và là mặt hàng xuất khẩu quan trọng

Theo FAO (1999) đài Loan hằng năm xuất khẩu cà chua tươi với tổng trị giá là 952.000 USD và 48.000 USD cà chua chế biến Lượng cà chua trao ựổi trên thị trường thế giới năm 1999 là 36,7 tấn trong ựó cà chua ựược dùng ở dạng ăn tươi chỉ 5-7% Ở

Mỹ (1997) tổng giá trị sản xuất 1ha cà chua cao hơn gấp 4 lần so với lúa nước, 20 lần

so với lúa mì [16] Cà chua là một trong những mặt hàng có giá trị xuất khẩu cao kể cả dạng tươi và dạng chế biến Lượng cà chua trao ựổi trên thị trường quốc tế là 32,7 triệu tấn, trong ựó 10% ở dạng quả tươi

Ở Việt Nam cà chua ựược trồng trên 100 năm nay, diện tắch gieo trồng cà chua hàng năm biến ựộng từ 15 Ờ 17 ngàn ha, sản lượng 280 ngàn tấn Mức tiêu thụ bình quân ựầu người của nước ta là: 3 kg/người/năm [16] Tại khu vực đồng bằng sông Hồng sản xuất cà chua cho thu nhập bình quân 42 - 68,4 triệu ựồng/ha/vụ, lãi thuần ựạt 15-26 triệu ựồng, cao hơn nhiều so với trồng lúa Trồng lúa chỉ giải quyết 230-250 công lao ựộng, trong ựó trồng cà chua giải quyết ựược 1100 - 1200 công lao ựộng Theo đề án phát triển rau Ờ quả và hoa cây cảnh thời kỳ 1999-2010 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn cà chua là mặt hàng chủ yếu ựược quan tâm phát triển Năm 2005 diện tắch trồng cà chua sẽ là 2000ha Với sản lượng 80.000 tấn, cho giá trị xuất khẩu là 10 triệu USD; năm 2010 diện tắch tăng lên 6000ha, tổng sản lượng ựạt 240.000 tấn, cho giá trị xuất khẩu là 100 triệu

1.2 Tình hình sản xuất và nghiên cứu cà chua trên thế giới

1.2.1 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới

Cà chua là loại cây trồng tuy ựược chấp nhận như một loại thực phẩm và có lịch

sử phát triển tương ựối muộn nhưng do nó có khả năng thắch ứng rộng và hiệu quả kinh tế và giá trị sử dụng cao Trên thế giới ựã có nhiều giống mới ựược ra ựời nhằm ựáp ứng ựược nhu cầu ngày càng cao của con người cả về số lượng và chất lượng

Theo FAO (1999), trên thế giới có 158 nước trồng cà chua Diện tắch, sản lượng, năng suất cà chua trên thế giới như sau:

Theo FAO, 2009: Diện tắch: 4.980,42 (1000 ha)

Năng suất: 2030,63 (tạ/ha)

Sản lượng: 141400,63 (1000 tấn)

Bảng 1.2: Diện tích, năng suất và sản lượng cà chua của các châu lục

trên thế giới năm 2011

Tên châu lục Diện tích

(1000 ha)

Năng suất ( tấn/ha)

Sản lượng (1000 tấn)

Nguồn: FAO Database Static 2011[32]

Trong 10 năm từ năm 2001 ñến năm 2010 diện tích cà chua thế giới tăng 1,09 lần từ 3990,3 nhìn ha lên 4338,83 nghìn ha, sản lượng tăng 1,35 lần từ 107977,76 nghìn tấn lên 145751,83 nghìn tấn, trong khi năng xuất không có sự thay ñổi ñáng kể

Theo bảng trên thì năm 2010, châu Á có diện tích trồng cà chua và sản lượng cà chua lớn nhất thế giới Tuy nhiên châu Úc và châu Mỹ có năng suất lớn nhất

Khoảng 150 triệu tấn cà chua ñã ñược sản xuất ra trên Thế giới trong năm 2009 Trung Quốc là nước sản xuất cà chua lớn nhất, chiếm khoảng một phần tư sản lượng toàn cầu, tiếp theo là Hoa Kỳ và Ấn ðộ Các khu vực chế biến tại California chiếm 90% lượng sản xuất ở Mỹ và 35% lượng sản xuất thế giới ðến các năm sau ñó tới nay Trung Quốc vẫn ñứng ñầu trong sản xuất cà chua

Bảng 1.3: Những nước có sản lượng cà chua cao nhất năm 2010

Cà chua là loại rau cho hiệu quả kinh tế cao và là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của nhiều nước ở cả dạng ăn tươi và chế biến

đứng ựầu về tiêu thụ cà chua là nước Mỹ, sau ựó là các nước châu Âu

Lượng cà chua trao ựổi trên thị trường thế giới năm 1999 là 36,7 triệu tấn, trong

ựó cà chua dùng ở dạng ăn tươi chỉ chiếm 5-7% điều ựó cho thấy, cà chua ựược sử dụng chủ yếu ở dạng ựã qua chế biến

Bảng 1.4: Những nước có giá trị nhập khẩu cà chua lớn nhất thế giới năm 2008

STT Tên nước Sản lượng

(tấn)

Giá trị (1000$) $/tấn

Nguồn: FAO Database Static 2009

Cà chua chế biến ựược sản xuất ở nhiều nước trên thế giới nhưng nhiều nhất là

ở Mỹ và Italia Ở Mỹ, năm 2002 sản lượng nhiều nhất ước ựạt 10,1 triệu tấn Trong ựó các sản phẩm cà chua chế biến chủ yếu là cà chua cô ựặc Ở Italia, sản lượng cà chua chế biến ước tắnh ựạt ựược là 4,7 triệu tấn Ở Châu Á, đài Loan là một trong những nước có nền công nghiệp chế biến cà chua sớm nhất Ngay từ 1918, đài Loan ựã phát triển cà chua ựóng hộp Năm 1967, họ mới chỉ có một công ty chế biến cà chua đến năm 1976, họ ựã có tới 50 nhà máy sản xuất cà chua ựóng hộp

1.2.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua trên thế giới

Trong khoảng 200 năm trở lại ựây tình hình chọn tạo cà chua trên thế giới ựã có nhiều tiến bộ Lịch sử nghiên cứu chọn tạo cà chua trên thế giới bắt ựầu ở châu Âu

Người Italia là những người ñầu tiên phát triển các giống cà chua mới, họ chọn các giống có sự khác nhau về tính trạng quả, chủ yếu là màu sắc quả Thế kỷ 20 ñã ñánh dấu những bước tiến to lớn trong công tác chọn tạo giống cà chua Việc cải tiến năng suất, chất lượng luôn là hai mục tiêu hàng ñầu và chung cho tất cả các chương trình chọn tạo giống Trước năm 1925, việc cải tiến giống cà chua ñược thực hiện bằng cách chọn các kiểu gen ngay từ bản thân các giống - từ các ñột biến tự nhiên, lai tự do hoặc tái tổ hợp của các biến thể di truyền ñang tồn tại trong tự nhiên (theo Tigchelaar E.C, 1986) [50]

Lịch sử công tác chọn tạo giống cà chua trên thế giới bắt ñầu ở Châu Âu với những tiến bộ ban ñầu về dòng, giống Năm 1860 những giống cà chua mới ñã ñược giới thiệu ở Mỹ Năm 1863, 23 giống cà chua ñược giới thiệu trong ñó giống Trophy ñược coi là giống có chất lượng tốt nhất Chương trình thử nghiệm của Liberti Hyde Bailey tại trường nông nghiệp Michigan (Mỹ) bắt ñầu từ năm 1886, tác giả ñã tiến hành chọn lọc, phân loại giống cà chua trồng trọt Từ năm 1870 ñến 1893, A.W.Livingston ñã giới thiệu 13 giống cà chua trồng trọt ñược giới thiệu theo phương pháp chọn lọc cá thể Cuối thế kỷ XIX có trên 200 dòng, giống cà chua ñã ñược giới thiệu rộng rãi (Tạ Thị Cúc, Hồ Hữu An, Nghiêm Thị Bích Hà (2000) [19]

Nhiều công trình nghiên cứu của trung tâm nghiên cứu và phát triển rau Châu

Á (AVRDC) cho thấy những giống cà chua chọn tạo trong ñiều kiện ôn ñới không thích hợp với ñiều kiện nóng ẩm vì sẽ tạo những quả kém chất lượng như có màu ñỏ nhạt, nứt quả, vị nhạt hoặc chua…(Kuo và cs, 1998) [40]

Theo ý kiến của Anpachev (1978), Iorganov (1971), Phiên Kì Mạnh (1961) (Kiều Thị Thư, 2006), [18] thì xu hướng chọn tạo giống cà chua mới là:

+ Tạo giống chín sớm phục vụ cho sản xuất vụ sớm

+ Tạo giống cho sản lượng cao, giá trị sinh học cao, dùng làm rau tươi và nguyên liệu cho chế biến ñồ hộp

+ Tạo giống chín ñồng loạt thích hợp cho cơ giới hóa

+ Tạo giống chống chịu sâu bệnh

Các nhà chọn tạo giống trên thế giới ñã sử dụng nguồn gen của các loài hoang dại làm nguồn gen chống chịu với các ñiều kiện bất thuận bằng nhiều con ñường khác

nhau như lai tạo, chọn lọc giao tử, hợp tử, ựột biến nhân tạoẦbước ựầu ựã thu ựược những thành công nhất ựịnh

Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau Châu Á từ những ngày ựầu thành lập (1972) ựã bắt ựầu chương trình chọn tạo nhằm tăng cường khả năng thắch ứng của cà chua với vùng ựiều kiện nóng ẩm Và hầu hết các giống AVRDC lai tạo và các giống

ựã ựược cải thiện trong tập ựoàn từ năm 1974 ựến nay ựều có khả năng chịu nhiệt cũng như chống chịu sâu bệnh tốt

Viện nghiên cứu và phát triển nông nghiệp Malaysia (MARDI) ựã phối hợp với AVRDC và trung tâm nghiên cứu nông nghiệp nhiệt ựới (TARC) ở Nhật Bản ựể xúc tiến chương trình cải tiến giống cà chua triển vọng đã chọn ựược 6 dòng có khả năng chịu nhiệt và chống chịu vi khuẩn: MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT6, MT10

Nhiều thử nghiệm về các giống cà chua ựược tiến hành ở AVRDC- TOP, trường ựại học Kasestart, phân viện Kamphaeng Thái Lan chọn tạo nhiều giống ựược ựánh giá là chất lượng tốt kết hợp với tắnh chịu nóng, năng suất cao và chống bệnh cụ thể là các giống cà chua anh ựào CHT104, CHT92, CHT105 có năng suất cao, chống chịu bệnh tốt, màu sắc quả ựẹp, hương vị ngon, quả chắc.Các giống PT225, PT3027, PT4165, PT446, PT4121 cho năng suất cao, chất lượng tốt, chống bệnh và chống nứt quả Nhiều nghiên cứu thử nghiệm giống cà chua quả nhỏ ựã ựược tiến hành ở AVRDC-TOP, Trường đại học Kaset sart, phân viện Kamphaeng, Thái Lan Trong ựó

có nhiều mẫu giống ựược ựánh giá có chất lượng tốt kết hợp với ựặc tắnh chịu nóng, năng suất cao và chống chịu bệnh như: các giống lai cà chua Anh ựào CHT104, CHT92, CHT105Ầ [40]

Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau Châu Á còn phát triển chương trình về các dòng tự phối hữu hạn và vô hạn có khả năng ựậu quả cho phép ở giới hạn nhiệt ựộ cực ựại 32-340C và cực tiểu 22-240C ựã ựưa ựược nhiều giống lai có triển vọng, ựược phát triển ở một số nước nhiệt ựới như CLN 161L, CLN 2001C, CL5915-204DH, CL143Ầ(Morris, 1998) [42]

Chương trình chọn giống cà chua trường đại học Florida ựược bắtựầu từ năm

1925 Một loạt các giống mới năng suất, chất lượng ựược ựưa ra như Tropic, Walter, Florida MH-1, Floraựae, FloramericaẦ(Nature, 1982) Từ năm 1979 ựến 1984 Ai Cập

ñã tiến hành công trình nghiên cứu nhằm tăng năng suất và nâng cao chất lượng cà chua (ñây là một phần của ñề án cấp quốc gia) Các giống ñã ñược ñánh giá trồng ở các ñịa phương hầu hết nhập từ Mỹ như Housney, Pritchard, VFN8, ñều có những ưu ñiểm về năng suất và chất lượng

ðể cải tiến chất lượng cho giống cà chua, các nhà chọn giống ñã sử dụng các loài hoang dại và bán hoang dại làm nguồn vật liệu quý cho lai tạo Ví dụ như loài L.peruvianum có hàm lượng vitamin C rất cao hay loài L pimpinellifolium có hàm lượng ñường, vitamin C, f-caroten cao Các giống cà chua lai của công ty giống lai Ấn ðộ-Mỹ ở Bangalore (Ấn ðộ) như Naveen, Karnatak, Jajani, Vaishali có năng suất cao, chất lượng quả tốt, quả tròn to trung bình, màu sắc ñẹp, rất thích hợp cho cả ăn tươi và chế biến (Met wally R.,1986) [41]

Viện nghiên cứu nông nghiệp Ấn ðộ (IARI) ở Newdeli ñã tiến hành nhiều nghiên cứu về chọn tạo các giống cà chua chịu nhiệt Từ năm 1975, Viện ñã thành công với các giống như Puas Rugy, Sel.120 (Singh J.H and Checma D.S., 1989) [47]

Trong chọn tạo giống cà chua, người ta chú ý nhiều ñến ưu thế lai Ở Nhật Bản

ưu thế lai ñược sử dụng rộng rãi trên cà chua từ năm 1930 Khi lai thử giữa giống Rutgres với 5 giống khác nhau cho thấy ưu thế lai về tổng trọng lượng quả cao hơn bố

mẹ nhưng về số quả trên cây và trọng lượng quả phần lớn là trung gian giữa bố và mẹ (Kiều Thị Thư, 1998) [18]

Gần ñây, nhiều nước trên thế giới ñặc biệt là Mỹ, các nhà khoa học ñã tạo ra những giống cây trồng biến ñổi gen trong ñó có cà chua Những giống cây trồng này ngoài khả năng chống chịu ñược sâu bệnh, tuyến trùng, khô hạn, sương muối mà còn

có khả năng cất giữ bảo quản lâu, chất lượng cao, mang nhiều dược tính, năng suất cao Các nhà nghiên cứu tại ñại học bang Oregon (Mỹ) ñang hoàn thiện một giống cà chua tím, ñây là một sự kết hợp giữa màu sắc và chất dinh dưỡng.Loại cà chua này có nguồn gốc từ dạng dại ở Nam Mỹ Hàng trăm năm trước các nhà khoa học ñã phát hiện cà chua màu tím trong thiên nhiên nhưng loài cây này nhỏ và có ñộc Vào thập niên 1960-1970, các nhà khoa học ñã thu nhặt hạt giống từ cà chua tím và lai với loài hiện ñại ñể cho ra loại quả an toàn với mọi người hơn dạng ban ñầu của nó

Hiện nay với nền khoa học kỹ thuật hiện ñại các nhà khoa học trên thế giới vẫn

ñang tiếp tục những công trình nghiên cứu về chọn tạo giống cà chua ñể ñáp ứng nhu

cầu của con người ñặc biệt là cà chua quả nhỏ phục vụ ăn tươi và chế biến

1.3 Tình hình sản xuất và nghiên cứu cà chua tại Việt Nam

1.3.1 Tình hình sản xuất cà chua tại Việt Nam

Cà chua là cây ñược du nhập vào Việt Nam mới ñược hơn 100 năm nhưng ñã trở thành một loại rau phổ biến và ñược sử dụng ngày càng rộng rãi Cà chua ở nước ta ñược trồng chủ yếu vào vụ ñông với diện tích khoảng 6.800-7.300 ha và thường tập trung ở các tỉnh thuộc ñồng bằng và trung du Bắc Bộ (Hà Nội, Hải Dương, Vĩnh Phúc…), còn ở Miền Nam tập trung ở các tỉnh An Giang, Tiền Giang, Lâm ðồng… [8]

Trong ñiều tra của TS Phạm ðồng Quảng và cs (2006) hiện nay cả nước có khoảng 115 giống cà chua ñược gieo trồng, trong ñó có 10 giống ñược gieo trồng với diện tích lớn 6259 ha, chiếm 55% diện tích cả nước Giống M386 ñược trồng nhiều nhất (khoảng 1432 ha), tiếp theo là các giống cà chua Pháp, VL200, TN002, Red Crown [15]

Ở Việt Nam, giai ñoạn từ 1996-2001, diện tích trồng cà chua tăng trên 10.000

ha (từ 7.509 ha năm 1996 tăng lên 17.834 ha năm 2001) ðến năm 2008 diện tích ñã tăng lên 24.850 ha Năng suất cà chua nước ta trong những năm gần ñây tăng lên ñáng

kể Năm 2008, năng suất cà chua cả nước là 216 tạ/ha bằng 87,10% năng suất thế giới (247,996 tạ/ha) Vì vậy, sản lượng cả nước ñã tăng rõ rệt (từ 118.523 tấn năm 1996 ñến 535.438 tấn năm 2008)

Bảng 1.5: Diện tích, năng suất, sản lượng cà chua của Việt Nam

Năm Diện tích (ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (tấn)

Nguồn: Số liệu của tổng cục thống kê 2008

Cà chua là một loại rau ăn trái ñã và ñang nắm giữ vị trí quan trọng và là tâm ñiểm nghiên cứu của các nhà chọn tạo giống cây trồng trong tương lai Nhờ vậy mà

hàng loạt các giống cà chua mới năng suất cao phẩm chất tốt ñược ra ñời ñể ñáp ứng nhu cầu cho thị trường ðể phục vụ công tác ñó cần sử dụng rất nhiều phương pháp như lai tạo, chọn lọc và sử lý ñột biến, nuôi cấy invitro…

Tuy nhiên so với sự phát triển chung của thế giới thì cả diện tích và năng suất ở nước ta còn rất thấp

1.3.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua ở Việt Nam

Một số nhà nghiên cứu cho rằng cà chua bắt ñầu xuất hiện ở nước ta từ thời kì thực dân Pháp xâm lược và chiếm ñóng ðến nay ñã hơn 100 năm, cây cà chua ngày càng ñược ưu chuộng và sử dụng rộng rãi khắp cả nước Nhu cầu tiêu dùng và ñòi hỏi ngày càng cao của thị trường ñã ñặt ra vấn ñề cấp thiết cần chọn tạo bộ giống thích hợp nhằm phát huy hết tiềm năng của giống trong ñiều kiện sinh thái nước ta

Công tác chọn tạo giống cà chua ở Việt Nam bắt ñầu từ nửa sau thế kỷ 20 và hiện nay ñã ñạt ñược những thành tựu rất ñáng khích lệ Ở nước ta, công tác nghiên cứu chọn tạo giống cà chua ñược thực hiện bởi các Viện, Trường, Trung tâm…Trong

ñó có một số ñơn vị chủ lực như Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội mà ñại diện là Trung tâm nghiên cứu và phát triển giống giống rau chất lượng cao, Viện nghiên cứu rau quả, Viện cây lương thực và cây thực phẩm, Viện di truyền nông nghiệp… sau nhiều năm phát triển sản xuất cà chua ở nước ta và sự phát triển ồ ạt của các giống ngoại nhập, nguy cơ bùng phát dịch bệnh hại ngày càng cao ñặc biệt hiện nay là bệnh virus (TYLC)

Do ñó, vấn ñề chọn tạo giống cà chua có khả năng kháng sâu bệnh nhất là bệnh virus ñang ñược triển khai và ñẩy mạnh Yêu cầu sản xuất luôn ñòi hỏi cần có giống cà chua mới năng suất cao, chất lượng tốt, khả năng thích ứng rộng Vì vậy, sử dụng ưu thế lai như một phương pháp chọn giống có hiệu quả và là hướng ñi tốt nhất, cơ bản nhất Nghiên cứu tạo giống cà chua ưu thế lai ñược triển khai nghiên cứu một cách hệ thống và nhiều hơn cả là Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội Chương trình nghiên cứu của trường ñược chính thức bắt ñầu từ năm 1994 và liên tục tiến hành cho tới nay Các công việc nghiên cứu thường niên ñó là: chọn tạo, phân lập, ñánh giá các dòng; chọn lọc duy trì, phân lập ñánh giá các bố mẹ ở các mùa vụ

Bên cạnh ñó, hàng năm còn thực hiện số lượng lớn các tổ hợp thử ñánh giá khả

năng kết hợp; ñánh giá, sàng lọc các con lai ở các vụ (xuân hè, thu ñông, ñông); ñánh giá, thẩm ñịnh các tổ hợp lai ưu tú ở các mùa vụ, tuyển chọn tổ hợp lai ñể thử nghiệm sinh thái và thử nghiệm sản xuất ở các vùng, các mùa vụ trên các tỉnh miền Bắc nước

- Giai ñoạn 2001-2010: giai ñoạn này các giống cà chua lai tiếp tục nghiên cứu với các mục tiêu khác nhau:

+ Giống HT21 ñược tạo ra theo hướng chất lượng cao ðầu năm 2004, HT21 ñược công nhận khu vực hoá và phát triển sản xuất ñại trà HT21 phục vụ trồng ở vụ ñông sớm và ñông chính, năng suất 50-65 tấn/ha, có hàm lượng ñường cao, ñộ Brix cao (5,18%), chất lượng thịt quả tốt, có hương thơm, khẩu vị ngọt dịu (Nguyễn Hồng Minh, Kiều Thị Thư, 2006) [10,11]

+ Giống HT42 ñược thử nghiệm rộng năm 2004, năm 2005 bắt ñầu cho phát triển sản xuất và mở rộng rất nhanh diện tích sản xuất ñại trà HT42 ñáp ứng ñược mục tiêu cà chua trồng trái vụ và cà chua chất lượng cao (Nguyễn Hồng Minh, 2006) [9]

+ Giống cà chua HT160 có chất lượng tiêu dùng cao, thịt quả dày, chắc mịn, có hương, vận chuyển và cất giữ tốt; trồng ñược ở các vụ: thu ñông, ñông chính, xuân hè sớm

Năm 2004 - 2005 giống ñược thử nghiệm và phát triển sản xuất ñại trà với năng

suất, chất lượng cao (Nguyễn Hồng Minh, 2011) [13] Giai ựoạn này cà chua quả nhỏ

ựã có ựược sự phát triển khởi sắc về diện tắch

Năm 2006, 2007 giống cà chua quả nhỏ HT144 do Trung tâm tạo ra ựã phát triển trên diện tắch sản xuất lớn, phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu HT144 có tiềm năng năng suất từ 40-45 tấn/ha; chống chịu bệnh xoăn lá, chết héo cây; ựặc biệt chịu nóng cao nên có khả năng trồng trái vụ (vụ xuân hè) HT144 là giống cà chua lai quả nhỏ ựầu tiên của Việt Nam cạnh tranh thànhcông với các giống thế giới ựể phát triển sản xuất lớn [12]

Ngoài ra, Trung tâm ựã tạo ra nhiều giống cà chua lai khác phát triển sản xuất ựại trà và sản xuất thử nghiệm như: HT152, HT9, HT46 (nhóm quả lớn), HT135 (nhóm quả nhỏ)

Bên cạnh Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, các Viện như Viện nghiên cứu rau quả, Viện cây lương thực và cây thực phẩm cũng ựã nghiên cứu và ựưa ra nhiều giống cà chua ưu thế lai ựáp ứng ựược yêu cầu cho sản xuất và tiêu dùng Giống cà chua lai số 1 ựược chọn từ tổ hợp lai P x HL1 do đào Xuân Thảng và cộng sự, VCLTCTP lai tạo Giống ựược công nhận là giống quốc gia năm 2000 [3]

Giống cà chua PT18 có năng xuất cao, và thắch hợp với ựiều kiện sinh thái ở các vùng trồng cà chua nguyên liệu miền Bắc Việt Nam do PGS.TS Trần khắc Thi, ThS Dương Kim Thoa và công sự tại Viện nghiên cứu Rau quả nghiên cứu Từ dòng

cà chua CLN 2026 D có nguồn gốc từ Trung tâm rau màu Châu Á (AVRDC), bằng phương pháp chọn lọc cá thể qua nhiều thế hệ ựã chọn ra ựược dòng PT 18 có nhiều triển vọng, năng suất và chất lượng phù hợp cho chế biến Giống ựược Hội ựồng Khoa học Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn công nhận là giống quốc gia tháng 4 năm

2004 (Dương Kim Thoa, Trần Khắc Thi, 2005)[4]

Từ kết quả nghiên cứu ựạt ựược của các ựề tài nghiên cứu cấp Nhà nước và cấp

Bộ trong giai ựoạn 2001 - 2005 và giai ựoạn tiếp theo 2006 - 2010, VNCRQ ựã chọn tạo thành công và giới thiệu cho sản xuất một số giống rau có năng suất cao và chất lượng tốt Trong ựó, một số giống cà chua lai ựang ựược mở rộng diện tắch trồng ở một

số vùng trồng rau tập trung của các tỉnh phắa Bắc: Giống cà chua Lai số 9: theo kết quả chọn tạo giống cà chua ưu thế lai phục vụ chế biến của Dương Kim Thoa, Trần Khắc

Thi cho thấy giống cà chua lai số 9 cĩ biểu hiện ưu thế lai cao, khả năng sinh trưởng phát triển ổn định ở các thời vụ trồng, chống chịu sâu bệnh tốt, Giống được Hội đồng khoa học Bộ Nơng nghiệp và Phát triển Nơng thơn cơng nhận là giống tạm thời để mở rộng sản xuất tháng 12/2005 [5]

Giống cà chua lai HPT10: giống cĩ dạng hình sinh trưởng bán hữu hạn, cây sinh trưởng phát triển tốt cho năng suất cao ở cả hai thời vụ thu đơng và vụ đơng xuân,

cĩ khả năng chống chịu bệnh khá Thời gian sinh trưởng 102-130 ngày, năng suất cao 40-50 tấn/ha vụ thu đơng, 60-65 tấn/ha vụ đơng xuân, quả cĩ chất lượng cao, Brix 5%, thích hợp cho cả ăn tươi và chế biến Giống đã được trồng thử nghiệm tại một số tỉnh như Bắc Ninh, Hải Phịng và một số điểm trồng rau an tồn khu vực Hà Nội [4]

Như vậy, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Giống rau Chất lượng cao – ðHNNHN là cơ sở hàng đầu của nước ta về nghiên cứu tạo ra các bộ giống cà chua lai

cĩ khả năng cạnh tranh với các tập đồn tư bản về bộ giống cà chua và các cơng nghệ phát triển giống Các bộ giống của trung tâm tạo ra ngày càng nhiều và phù hợp với điều kiện thực tế nước ta và cĩ khả năng canh tranh với các giống nhập nội cả về thời gian sinh trưởng, năng suất, sản lượng,chất lượng cũng như khả năng thâm canh, mở rộng diện tích Do nhu cầu về phát triển sản xuất và tiêu dùng cà chua ngày càng cao

và tính chất cạnh tranh với các giống ngoại nhập ngày càng khốc liệt, các nghiên cứu

về tạo giống cà chua lai trong nước cần được đẩy mạnh để tiếp tục đưa ra các giống mới phục vụ sản xuất

1.4 Thực trạng nhiễm bệnh xoăn vàng lá ở cà chua

Bệnh xoăn vàng lá do vi rút gây ra và gây hại trên nhiều cây trồng khác nhau trong đĩ cĩ nhĩm cây rau bị thiệt hại nghiêm trọng nhất là cà chua và ớt Bệnh cĩ thể xuất hiện ngay từ khi cây cịn nhỏ trong vườn ươm cho đến khi trồng ra ruộng và thu hoạch, phổ biến nhất là cây bắt đầu ra hoa Bệnh xuất hiện càng sớm thì mức độ thiệt hại càng nặng [14] Cây bị bệnh cịi cọc lá màu vàng nhạt trong khi gân lá màu xanh tạo thành vết xanh vàng loang lổ, lá nhỏ lại và nhăn nheo, thơ cứng, ngọn xoăn, cây sinh trưởng kém, thấp nhỏ, phân nhiều nhánh, cành khơng phát triển được ðốt thân hoặc các đốt ngắn lại và hơi uốn cong Cây bị bệnh sớm và nặng cĩ thể chết Nếu bị muộn và nhẹ thì những lá non ra sau mới bị xoăn, cây cĩ thể ra hoa và trái nhưng rụng

nhiều Nếu có trái thì trái nhỏ, méo mó, cứng, chất lượng kém Bệnh xoăn vàng lá cà chua lan truyền qua trung gian là bọ phấn Vi rút lây lan chủ yếu do bọ phấn trích hút

từ cây bệnh rồi truyền sang cây khỏe Vi rút lan truyền rất nhanh, khi bọ phấn bắt ñầu chích hút cây cà chua, vi rút sẽ ñược truyền trong vòng 15-30 phút Mật ñộ bọ phấn càng cao thì cây bị bệnh càng nhiều Bệnh không lan truyền qua hạt giống và ñất Hằng năm, bệnh thường phát sinh mạnh vào tháng 10-11 và gây hại nặng vụ cà chua xuân hè tháng 3-4, ñặc biệt khi trời nắng, ấm và ít mưa [1]

Thực tế sản suất cà chua nước ta cho thấy năng suất của cà chua còn hạn chế không chỉ do khó khăn về giống, kỹ thuật vốn ñầu tư mà còn do sự phát sinh, phát triển của dịch hại trên từng vùng, từng vụ hết sức phức tạp, bao gồm dịch hại do côn trùng, tuyến trùng, nấm, vi khuẩn và vi rút, trong ñó nghiêm trọng nhất là bệnh héo

xanh (do vi khuẩn Ralstonia solanacearum) và bệnh xoăn vàng lá ( do tomato yellow

leaf curl virus - TYLCV thuộc chi Begomovirus, họ Geminiviridae) ðặc biệt trong

những năm gần ñây, bệnh xoăn vàng lá ñã gây ra những thiệt hại nghiêm trọng trên vụ

cà chua thu ñông sớm và cà chua xuân hè Cây cà chua bị bệnh vi rút xoăn ngọn sẽ làm cho hoa và nụ bị rụng nhiều, quả xốp, khô nước phẩm chất kém, năng xuất thấp Bệnh

có thể làm giảm tới trên 90% sản lượng, tỉ lệ cây nhiễm tới 100% (Vũ Văn Hải, Hà Việt Cường, 2007) [22] Theo Lê Thị Liễu (2004), trong vụ ñông xuân 2003-2004 tại khu vực Gia Lâm-Hà Nội có tới 96% số hộ ñiều tra trả lời ruộng cà chua của họ bị nhiễm xoăn vàng lá với 50% ruộng bị bệnh nặng [7]

Xoăn vàng lá ñã và ñang là bệnh vi rút gây thiệt hại kinh tế nặng nhất trong sản xuất cà chua ở Việt Nam Quản lý dịch hại TYLCV chủ yếu dựa trên việc phòng trừ

véc tơ lan truyền vi rút, bọ phấn Bemicia tabaci Tuy nhiên, vì số lượng quá lớn các loài cây ký chủ của bọ phấn B.tabaci (500 loài trong 74 họ cây thực vật khác nhau)

cùng với sự ña dạng của các loài cây ký chủ của TYLCV (34 loài cây trồng), quan hệ giữa bọ phấn và cây ký chủ là hoàn toàn hết sức phức tạp và ña dạng nên sử dụng biện pháp hóa học có hiệu quả rất thấp hoặc không có hiệu quả ñồng thời lại gây ảnh hưởng tới môi trường [1] Do vậy, việc trồng trọt các giống kháng TYLCV ñược coi là biện pháp hữu hiệu nhất có thể khắc phục triệt ñể bệnh xoăn vàng lá

Về nguyên tắc, việc bổ sung tính trạng kháng bệnh vào một giống thương mại có

thể thực hiện thông qua lai truyền thống Tuy nhiên lai truyền thống ựể tạo giống kháng bệnh xoăn vàng lá ựã gặp nhiều trở ngại do hạn chế về nguồn gen, gen kháng TYLCV chỉ xuất hiện ở các loại cà chua dại thêm nữa tắnh trạng kháng TYLCV thông thường ựược quyết ựịnh ựa gen nên việc lai tạo truyền thống gặp rất nhiều khó khăn đặc biệt bệnh xoăn vàng lá ựược coi là bệnh phức, triệu chứng bệnh xoăn vàng lá do

nhiều loại vi rút thuộc chi Begomovirus, họ Geminivirus gây ra [27] Ở Việt Nam hiện

tại ựã phát hiện 4 loài vi rút gây bệnh xoăn vàng lá khác nhau (Vũ Văn Hải, Hà Việt Cường,2007) [22] Việc tìm kiếm một giải pháp hợp lý ựể tạo ựược giống kháng ựa vi rút gây bệnh xoăn vàng lá cà chua là hết sức cần thiết

Bệnh xoăn vàng lá không những gây thiệt hại ở Việt Nam mà nó còn gây thiệt hại nặng hầu hết ở khắp các nước trên thế giới Bệnh hại cà chua do TYLCV gây ra ựược phát hiện ựầu tiên gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sản xuất cà chua tại Israel từ những năm 1930, sau ựó phát hiện bệnh xuất hiện và gây ảnh hưởng tại nước Cộng Hòa Dominica, Cuba, Jamaica vào khoảng ựầu những năm 1990 và nhanh chóng lan rộng tới các nước Trung đông, các nước thuộc Bắc và Trung Phi và đông Nam Á Cho tới nay, TYLCV xuất hiện và gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sản xuất cà chua

của hầu khắp các nước trên thế giới [44] Hiện nay, ựã có tới 40 loài Bengomovirus hại

cà chua ựã ựược phát hiện và công bố trên thế giới [45] Do vậy việc tìm kiếm một giải pháp hợp lý ựể tạo ựược giống kháng ựa vi rút gây bệnh xoăn vàng lá không chỉ là vấn

ựề riêng của Việt Nam

Trên thế giới việc quản lý dịch hại do TYLCV cũng chủ yếu dựa trên việc phòng

trừ véc tơ lan truyền vi rút, bọ phấn Benica tabaci (B tabaci) Trên thế giới ựã có rất

nhiều nghiên cứu ựược ựầu tư ựể tìm ra giải pháp phòng trừ bọ phấn nhưng cho tới nay vẫn phải lựa chọn biện pháp sử dụng thuốc hóa học Tuy nhiên, cũng tương tự như Việt Nam biện pháp hóa học cũng có hiệu quả rất thấp hoặc là không có hiệu quả Do vậy trên thế giới việc trồng trọt các giống kháng TYLCV cũng ựược coi là biện pháp hữu hiệu nhất có thể khắc phục triệt ựể bệnh xoăn vàng lá [45]

1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng RNAi trong tạo giống cây chuyển gen

1.5.1 Trên thế giới

Sự can thiệp RNA (RNAi) ựược xem là một cơ chế quan trọng trong việc kháng

lại vi rút ở thực vật [26] Vì vậy, kỹ thuật chuyển gen dựa trên cơ chế can thiệp RNA

ñã ñược ứng dụng ñể tạo giống cây trồng kháng lại vi rút Nhiều giống cây trồng kháng ñược các loại bệnh vi rút khác nhau ñã ñược tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gen RNAi Trong ñó, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen lặp lại ñảo chiều của vi rút mục tiêu ñược sử dụng ñể chuyển vào cây Cấu trúc này sẽ ñược biểu hiện thành RNA dạng kẹp tóc (hpRNA) trong cây chuyển gen và kích thích cơ chế RNAi hoạt ñộng khi có sự xâm nhập của vi rút vào cây Cho ñến nay ñã có nhiều loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh vi rút ñược công nhận và trồng thương mại như: ñu ñủ chuyển gen kháng

bệnh ñốm vòng (papaya ringspot virus); bí ñao chuyển gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus,

ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus

1.5.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi ñể tạo giống cây trồng kháng bệnh vi rút từ năm 2007-2008 bởi Lê Trần Bình và cộng sự với ñề tài:” Tạo cây trồng chuyển gen kháng bệnh vi rút bằng kỹ thuật ANRi”, kết quả ñã tạo ra vài trăm dòng thuốc lá chuyển gen kháng vi rút khảm dưa chuột (CMV), kháng vi rút khảm thuốc lá (TMV) và kháng cả 2 loại vi rút trên Kiểm tra tính kháng vi rút bằng gây bệnh nhân tạo ở thế hệ To thu ñược có tỉ lệ kháng (số dòng kháng hoàn toàn/số dòng kiểm tra) vi rút CMV là 70,9%, TMV là 74,5% và kháng cả hai loại CMV và TMV là 70,8% Công trình này cũng ñưa ra quy trình tạo cây thuốc lá kháng vi rút thành công ở Việt Nam, từ ñó có thể áp dụng cho chuyển gen vào các cây trồng có giá trị kinh tế (như cà chua, khoai tây, thuốc lá, ớt, ) ñể tạo ra các cây trồng kháng vi rút mong muốn [2] Chu Hoàng Hà và cộng sự từ năm 2007 tới năm 2010 ñã tạo thành công ñu ñủ chuyển gen kháng vi rút gây bệnh ñốm vòng bằng công nghệ RNAi Mới ñây nhất ñề tài “Tạo dòng ñậu tương chuyển gen kháng vi rút gây bệnh bằng kỹ thuật RNA interference (RNAi)” do GS.TS Chu Hoàng Mậu chủ nhiệm ñược thực hiện từ tháng 1 năm 3013 và dự kiến sẽ kết thúc vào tháng 1 năm 2014 [59] ðiều này cho thấy, RNAi ngày càng ñược ứng dụng rộng rãi, nó mở ra tiềm năng ứng dụng vô cùng

to lớn trong việc tạo giống cây trồng chuyển gen kháng vi rút

1.6 Cơ chế ñề kháng vi rút của cây cà chua chuyển gen

Bộ gen hoạt ñộng thông qua việc truyền thông tin tổng hợp protein từ DNA trong nhân tế bào bào ñến bộ máy tổng hợp protein trong tế bào chất Những thông tin này ñược truyền tải bởi RNA thông tin (mRNA) Với cây chuyển gen, chúng ta ñã tạo ra tính kháng tích cực và hiệu quả cho cây trồng chống lại vi rút Có nhiều cách giải thích

về tính kháng của cây chuyển gen, theo Baulcombe (2004) tính kháng của cây chuyển gen gọi là tính kháng có ñược nhờ chính yếu tố gây bệnh [26] Gen ñược chuyển vào cây là những gen có chức năng khác nhau của vi rút: gen mã hóa protein vỏ, gen mã hóa protein vận chuyển… hay gen ñược thiết kế có ñầu là những ñoạn lặp lại ngược chiều Dù bằng cách nào thì mục ñích cuối cũng vẫn là ngăn cản quá trình nhân bản và

di chuyển của vi rút trong cây trồng

Từ những năm 1990 khi công nghệ chuyển gen ñã khá phát triển, người ta thấy

có hiện tượng nếu trong sinh vật có nhiều bản sao ñược chuyển nạp thì lại có hiện tượng không tìm thấy sản phẩm protein, mặc dù các bản sao của gen ñó vẫn phiên mã tạo ra số lượng lớn mRNA Như vậy không phải số lượng bản sao của một gen càng nhiều thì càng cho nhiều sản phẩm protein Các nhà khoa học ñã chỉ ra rằng một gen biến nạp vào hệ gen mới ñã bị kìm hãm biểu hiện bởi một gen nội tại tương ñồng có cùng cấu trúc và chức năng Van der Krol và cộng sự và Napoli và cộng sự 1990 gọi ñây là hiện tượng ñồng ức chế hay là sự bất hoạt gen sau phiên mã [43] Cơ chế gây bất hoạt gen với tên gọi là quá trình can thiệp RNA, ñược kích hoạt khi phân tử RNA tồn tại trong tế bào với cấu trúc sợi ñôi RNA sợi ñôi kích hoạt một cơ chế hóa sinh ñể phân hủy các phân tử mRNA có mã di truyền giống với nó Khi các phân tử mRNA này biến mất, gene tương ứng bị bất hoạt, và không có protein nào do gene ñó mã hóa ñược tạo ra Theo họ cơ chế gây bất hoạt gen này có liên quan ñến một số RNA kép ngắn (dsRNA), cả hai sợi phiên mã và không phiên mã ñều có thể làm bất hoạt DNA gen tương ñồng với nó Cơ chế hoạt ñộng của RNAi gây bất hoạt hoặc giảm hoạt hóa theo ðỗ Năng Vịnh ñược tóm tắt như sau [6]

DsRNAi có chiều dài khoảng vài trăm bp ñược cắt bởi

enzyme Dicer + ATP

Tạo ra các siRNA có từ 21-33 bp)

Phức hợp RISC + ATP sẽ mở xoắn siRNA kép

Tạo ra các siRNA sợi ñơn sẽ bám vào mRNA ñích, tương ñồng

với nó làm mRNA bị phân hủy

RNA dependent RNA polymerase (RdRP)

Nhân siRNA mới Trên thực tế ñã có rất nhiều nghiên cứu ứng dụng công nghệ RNAi trong lĩnh vực chống chịu ở thực vật mà trọng tâm là chống chịu vi rút Ban ñầu công nghệ “ức chế gen” bằng siRNA ñược coi là chỉ có hiệu quả cho tạo giống kháng các bệnh do RNA vi rút - những vi rút thường có pha hình thành RNA trong quá trình nhân bản và thực tế trong một thời gian ngắn có rất nhiều nghiên cứu thành công ñược công bố Nhiều giống cây trồng kháng ñược các loại vi rút khác nhau ñã ñược tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gen RNAi Trong ñó cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen lặp lại ñảo chiều của vi rút mục tiêu ñược sử dụng ñể chuyển vào cây Cấu trúc này sẽ ñược biểu hiện thành RNA sợi ñôi dạng kẹp tóc (hpRNA) trong cây chuyển gen và kích thích cơ chế RNAi hoạt ñộng khi có sự xâm nhập của vi rút vào cây Ngoài ra, người ta thấy rằng khi vùng ñệm của hpRNA ñược lặp lại với một trình tự intron (ihpRNA) thì kết quả im lặng gen ñược tạo ra cao nhất Cây ñậu chuyển gen kháng vi rút BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng lên ñến 93% và thuốc lá chuyển gen có khả năng ñề kháng cao với vi rút CGMMV ñến thế hệ T2 ñã ñược tạo ra với cấu trúc ihpRNA Tuy nhiên với TYLCV mặc dù thuộc DNA vi rút và không nhân bản trực tiếp qua mRNA nhưng mới ñây ñã có các công bố thành công trong việc tạo giống kháng

vi rút thông qua cơ chế “ức chế gen” bằng siRNA Cơ chế “ức chế gen” micro RNA

interference (miRNA) ựã ựược phát hiện và nghiên cứu chủ yếu ở ựộng vật, tuy nhiên sau này ựã ựược chỉ ra rằng miRNA xảy ra cả ở ựộng vật và thực vật Trong những năm gần ựây miRNA ựã bắt ựầu ựược nghiên cứu ựể ứng dụng trong tạo giống kháng

vi rút ở thực vật Việc sử dụng miRNA có thể tăng ựược hiệu quả biểu hiện tắnh kháng

vi rút của cây chuyển gen [25]

1.7 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật 1.7.1 Giới thiệu chung về Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh cây sống trong ựất, có khả

năng xâm nhiễm thực vật, kắch thắch tạo khối u ngay tại các vết thương của cây chủ

Trong tự nhiên, Agrobacterium tumefaciens chủ yếu tấn công cây hai lá mầm, ựặc biệt

là nhóm thực vật có hoa Hoàn toàn khác với mô và tế bào thực vật bình thường, khối

u do Agrobacterium tumefaciens sinh ra phát triển rất mạnh ngay trong ựiều kiện thiếu hormone sinh trưởng (auxin và cytokinin) đó là do Agrobacterium tumefaciens ựã

chuyển một ựoạn T Ờ DNA (Transfer DNA) sang tế bào thực vật và T- DNA ựiều khiển quá trình sinh tổng hợp các chất ựó Ngoài ra, các khối u cũng sinh tổng hợp các opin và các axit amin (amino acid Ờ aa) ựặc biệt là các dẫn xuất của ựường Dạng opin ựược tổng hợp có thể là nopalin, octopin, agrocinopin, mannozapin và agropin phụ

thuộc vào từng chủng Agrobacterium tumefaciens Trong ựó, octopin và nopalin là hai

dạng opin phổ biến Opin ựược vi khuẩn sử dụng thay cho nguồn cacbon và nitơ nhờ hoạt ựộng của gen chuyển hóa opin trên plasmid gây khối u thực vật (Tumor inducing plasmid- Ti-plasmid) [28] Cơ chế phân tử của sự hình thành khối u ựã ựược quan tâm nghiên cứu nhằm tìm ra một phương thức phòng bệnh cho cây Khi phát hiện ra Ti-plasmid và khả năng tự chuyển T- DNA vào genome thực vật, người ta ựã ựặc biệt chú

ý và khai thác khả năng sử dụng chúng như một vector tự nhiên ựể chuyển các gen quan tâm vào thực vật nhằm tạo ra cây trồng mang những tắnh trạng mong muốn

1.7.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid

Ti-plasmid ựược phát hiện ở tất cả các chủng Agrobacterium tumefaciens gây

nhiễm và tồn tại bền vững ở nhiệt ựộ dưới 30oC đây là một phân tử DNA dạng mạch vòng, sợi kép và tồn tại trong tế bào như một ựơn vị sao chép ựộc lập, có kắch thước khoảng 200 kb Phân tắch di truyền cho thấy, Ti-plasmid dạng octopin và dạng nopalin

là hai dạng phổ biến nhất, có 4 vùng tương ñồng, trong ñó vùng T-DNA và vùng gây

ñộc (Virulence Region- vùng Vir), liên quan trực tiếp tới sự hình thành khối u ở thực vật Vùng gây ñộc có chứa các gen mã hóa các protein/enzyme Vir Có 9 loại protein

Vir là A, B, C, G, B1-11, D1-2, E1-2, F, H, J/AcvB [35] Các protein Vir này có vai trò

quan trọng trong việc chuyển T-DNA sang tế bào thực vật Hai vùng còn lại chứa gen

mã hóa cho việc sao chép plasmid và chuyển nạp

Hình 1.1: Bản ñồ Ti-plasmid dạng octopin

Trên Ti-plasmid, chỉ có vùng T- DNA ñược chuyển từ vi khuẩn sang genome của các cây bị bệnh và tồn tại bền vững ở trong ñó Tuy nhiên, vùng này lại không mã hóa những sản phẩm trung gian cho quá trình chuyển T- DNA mà cần có sự trợ giúp

ñặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng Vir và trên nhiễm sắc thể vi khuẩn Vùng Vir dài khoảng 40kb ñảm nhiệm chức năng gây nhiễm Ở Ti-plasmid dạng octopin, vùng Vir chứa tới 24 gen gây ñộc Sản phẩm protein do các gen này mã hóa

ñã kích thích sự tách biệt T- DNA, bao bọc che chở và giúp chúng tiếp cận với genome cây chủ [37]

1.7.3 Cấu trúc và chức năng của các ñoạn T-DNA

Kết quả phân tích trình tự gen trên T- DNA ở các Ti-plasmid khác nhau cho thấy, T- DNA ñược giới hạn bởi một ñoạn trình tự lặp lại gần như hoàn toàn từ khoảng 25bp và gọi là ñoạn biên Chúng là dấu hiệu nhận biết cho qua trình chuyển T-DNA và xâm nhập của T- DNA vào tế bào thực vật Ở ñoạn biên bên phải (Right border- RB)

có yếu tố ñiều khiển cis cần cho quá trình chuyển T- DNA ðoạn bên trái (Left border-

LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyển T- DNA và là dấu hiệu ựể quá trình này kết thúc bình thường

Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T- DNA xâm nhập vào genome thực vật ở dạng một ựoạn liên tục dài 22 kb Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopin, T- DNA là một ựoạn gen liên tục dài 13 kb T- DNA mang rất nhiều gen như: (1) các gen mã hóa những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) các gen gây khối u như

tms1, tms2, tmr mã hóa cho các enzyme liên quan ựến quá trình sinh tổng hợp auxin và

cytokinin [37]

1.7.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens

Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hóa học dẫn dụ vi khuẩn như: acetosyringone, hydroxy- acetosyringoneẦ Dưới tác dụng của các hợp chất này,

Agrobacterium tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T- DNA

vào tế bào thực vật Quá trình này ựược sự trợ giúp ựặc biệt của các gen Vir và RB,

LB Cũng chắnh các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng Vir hoạt

ựộng và tăng cường biểu hiện

Hoạt ựộng của các gen Vir sinh ra sợi ựơn T- DNA làm xuất hiện bản copy sợi

bên dưới của T- DNA Chỉ ựoạn sợi ựơn DNA giữa hai trình tự biên (LB và RB) của T- DNA mới ựược chuyển vào tế bào thực vật, và ựược gắn vào genome của tế bào

đó là yếu tố hoạt ựộng cis của hệ thống vận chuyển T- DNA Protein Vir D1, D2 ựóng

vai trò là chìa khóa trong bước này, chúng nhận ra trình tự biên T-DNA và cắt sợi bên

dưới tại mỗi bên điểm cắt là ựiểm ựầu và kết thúc của sợi tái sinh Sau ựó, protein Vir

D2 vẫn còn gắn kết với ựầu cuối 5Ỗ của sợi T- DNA và tế bào thực vật Nếu gây ựột

biến hay loại bỏ ựoạn RB thì hầu như mất hoàn toàn khả năng chuyển T-DNA, còn nếu ựột biến LB sẽ làm giảm hiệu quả chuyển T- DNA [30] điều ựó chứng tỏ tổng hợp sợi T-DNA là từ ựầu 5Ỗ ựến 3Ỗ, ựược bắt ựầu từ ựoạn RB và kết thúc ở LB

Phương tiện ựể chuyển ựoạn T- DNA vào nhân tế bào thực vật là phức protein

và sợi T-DNA Theo ựa số các nhà khoa học cho rằng phức hợp sợi ựơn T- DNA-Vir

D2 ựược bao bọc bởi protein Vir E2 có trọng lượng 96 kDa Sự phối hợp này giúp

ngăn cản sự tấn công của nuclease, hơn nữa sợi ựơn T- DNA duỗi thẳng làm giảm kắch thước của phức xuống xấp xỉ 2 nm, tạo ựiều kiện thuận lợi cho quá trình di chuyển qua

các kênh dẫn truyền trên màng tế bào Protein Vir E2 chứa ựựng hai tắn hiệu ựịnh vị trong nhân tế bào thực vật và một protein Vir D2 [35] Thực tế cho thấy hai protein

này có vai trò quan trọng trong việc dàn xếp sự hấp thụ phức vào trong nhân tế bào thực vật [57] Nếu loại bỏ tắn hiệu ựịnh vị trong nhân thì một trong các protein này bị giảm, nhưng không ức chế hoàn toàn quá trình chuyển T- DNA và tương tác giữa T- DNA với genome tế bào thực vật, chứng tỏ có một thành viên khác có thể ựảm nhận

một phần tối thiểu vai trò của protein bị thiếu Protein Vir E cần thiết ựối với quá trình bài xuất protein Vir E2 sang tế bào thực vật

Protein Vir D4 cũng là bắt buộc ựối với sự vận chuyển phức ss- T- DNA Chức năng của protein Vir D4 là liên kết với ATP ựộc lập với phức protein cần thiết ựối với

quá trình di truyền T- DNA

Các nghiên cứu công bố ựã miêu tả vai trò của operon Vir B có kắch thước 9,5

kb trong quá trình sản sinh cấu trúc bề mặt của tế bào ựối với sự vận chuyển phức từ vi khuẩn sang tế bào thực vật [33]

Protein Vir B là protein có tắnh kị nước tương tự protein kết hợp trên màng khác Phần lớn protein Vir B ựã ựược phát hiện giống như kênh protein xuyên màng Tuy nhiên, cũng có thể vài protein Vir B khác ựược phân phối lại trong quá trình phát

sinh sinh vật và thực hiện chức năng của kênh kết hợp qua tế bào vận chuyển đáng

chú ý là trong ựó protein Vir B2, Vir B11 là thành phần cơ bản của bộ máy vận chuyển

T- DNA từ tế bào vi khuẩn sang tế bào thực vật Sau khi T- DNA qua màng tế bào chúng ựi thẳng vào nhân và kết hợp với hệ gen thực vật, bắt ựầu hoạt ựộng và sản sinh

ra auxin, cytokinin và opin gây lên sự phát triển thái quá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn ựến sự hình thành khối u

1.7.5 Tương tác giữa T-DNA và genome tế bào thực vật

Trong tế bào thực vật, phức ss- T- DNA ựược ựưa qua màng nhân vào nhân

Hai protein ựóng vai trò quan trọng trong bước này là Vir D2 và Vir E2 Tắn hiệu ựịnh

vị trong nhân của Vir D2 và Vir E2 ựóng vai trò chủ yếu Protein Vir D2 có chức năng

xác ựịnh vị trắ cho T - DNA trong nhân Phức ss- T- DNA là phức nucleoprotein lên

ựến 20 kb chứa một ựầu 5Ỗ gắn với protein Vir D2 Nhưng phức ựược bao bọc bởi số lượng lớn phân tử Vir E2 (xấp xỉ 600/20kb T- DNA) và mỗi phức này có hai tắn hiệu

ñịnh vị trong nhân Hai tín hiệu này của Vir E2 ñóng vai trò quan trọng ñối với việc

nhận liên tục phức T-DNA của nhân, có khả năng kích thích mở lỗ màng nhân Khả năng nhận phức của nhân ñược ñiều khiển bởi protein kết hợp tín hiệu ñịnh vị ñặc trưng trong nhân, protein này ñược tìm thấy trong tế bào chất của tế bào thực vật

Hình 1.2: Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật

và cơ chế chuyển T - DNA

Bước cuối cùng trong quá trình vận chuyển T- DNA là sự tương tác trong genome tế bào thực vật Các phản ứng trong sự tương tác T- DNA không có tính ñiển hình Sự tương tác này tìm thấy bởi sự tái tổ hợp không theo quy luật Theo cách nhìn nhận việc cắt bỏ bớt base, như microhomologies, ñược cần ñến ñối với bước lặp lại

giữa cặp vận chuyển T- DNA với Vir D2 và DNA thực vật Sự tương ñồng này rất

thấp và cung cấp ñặc trưng nhỏ nhất ñối với quá trình tái tổ hợp bởi sự xác ñịnh vị trí

của Vir D2 ñể gắn kết ở trình tự gần kề hay ñầu 3’ của T- DNA tìm thấy một vài sự

tương ñồng nhỏ ñối với DNA thực vật, kết quả ở sự tương tác ñầu tiên giữa sợi T- DNA và DNA thực vật là tạo ra lỗ hổng ở sợi 3’- 5’ của DNA thực vật Sau ñó DNA thực vật ñược cắt ở vị trí ñầu 3’ của lỗ hổng bởi endonuclease và nucleotit của ñầu 5’

bắt cặp với Vir D2 bởi một nucleotit của ñầu 5’ bắt cặp với Vir D2 bởi một nucleotit

trong ñầu sợi (5’-3’) DNA thực vật Phần 3’ nhô ra của T- DNA cũng như DNA thực vật thay thế bị phân hủy bởi endonuclease hay 3’-5’ enxonuclease ðầu 5’ của T-

DNA gắn với Vir D2 còn ñầu 3’ kia cặp ñôi với DNA thực vật kéo dài từ bước ñầu của

quá trình tương tác, nối liền với vết cắt trong sợi DNA dưới của thực vật Sự ñưa vào của sợi T- DNA trong sợi 3’- 5’ của DNA thực vật ñược bổ sung, tình trạng xoắn sinh

ra bởi vết cắt trong sợi ñối ngược ñược sản sinh

Tình trạng này hoạt hóa phản ứng sửa chữa của tế bào thực vật và sợi bổ sung ñược tổng hợp sử dụng ñể chèn dễ dàng sợi T- DNA như là sợi khuôn (Hille J và cs 1983) [36] Vir D2 có vai trò hoạt hóa trong sự hòa hợp chính xác sợi T- DNA vào nhiễm sắc thể thực vật Phóng thích protein Vir D2 có thể cung cấp năng lượng chứa ñựng trong các liên kết phosphodieste, như Tyr 29 với nucleotit ñầu tiên của sợi T-

DNA, qui ñịnh ñầu 5’ của sợi T- DNA không còn Ngoài ra, quá trình chuyển T- DNA

còn có sự tương tác với các protein do gen trên nhiễm sắc thể của Agrobacterium

tumefaciens qui ñịnh và protein trong tế bào thực vật

1.7.6 Các phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

1.7.6.1 Hệ thống chuyển gen in vitro

Một số trợ giúp kỹ thuật trong quá trình biến nạp ñã cải thiện hiệu quả của hệ

thống chuyển gen in vitro nhờ A.tumefaciens bao gồm:

Xử lý sóng siêu âm

Xử lý một thực vật với A.tumefaciens trong ñiều kiện sóng siêu âm tạo ra các tổn thương nhỏ, ñồng nhất ở mô thực vật, cho phép A.tumefaciens dễ dàng xâm nhập

vào tế bào thực vật Bằng phương pháp này ñã cải thiện rõ rệt hiệu quả chuyển gen,

biểu hiện Gus tạm thời ñã tăng từ 100 lên 1400 lần ở các tế bào ñậu tương, ñậu ñũa,

cây vân sam trắng, lúa mỳ và ngô [51]

Ly tâm tế bào

Phương pháp chuyển gen thông qua A.tumefaciens kết hợp với ly tâm ñã ñược

áp dụng thành công khi biến nạp vào huyền phù tế bào phôi hóa nhận ñược từ hoa

chuối ñực nuôi cấy in vitro của hai giống chuối thương mại Cavendish và Lady Finger

Tần số chuyển gen ñã ñược cải thiện ñáng kể bằng các áp dụng chế ñộ ly tâm tế bào

thực vật trong quá trình nuôi cấy cộng sinh với vi khuẩn (Khanna H và cs, 2004) [39]

thị gus, gfp, hpt… vào ñậu tương thông qua nốt lá mầm bị tổn thương [21,38]

1.7.6.2 Hệ thống chuyển gen in vivo

Phương pháp này dựa trên cơ sở của việc chuyển gen vào nguyên cây (in

planta) và rất phổ biến ñối với loài A.thaliana, một trong những loài cây mô hình ñối

với các nghiên cứu về di truyền học Phương pháp chuyển gen này tốn ít thời gian, bỏ qua công ñoạn nuôi cấy mô và tái sinh sau biến nạp, vì thế loại bỏ ñược các biến dị soma và số lượng cây chuyển gen thu ñược lớn hơn Kỹ thuật này ñã ñược mô tả ở các

cây trồng khác nhau như ñậu tương, Arabidopsis, hoa hướng dương, cây lạc, và cả ở

cây ngô

Phương pháp ngâm cụm hoa

Một số nghiên cứu chuyển gen ñã ñược tiến hành ở cây Arabidopsis bằng cách ngâm các thể giao tử cái của hoa non, cụm hoa trong dịch vi khuẩn A.tumefaciens

Phương pháp này cũng ñã ñược áp dụng với các cây một lá mầm Chumakov và cộng

sự (2006)[29] ñã chuyển ñược gen nptII vào dòng ngô AT-3 bằng cách xử lý râu ngô của các cây ngô ñang sinh trưởng trên ñồng ruộng với dịch vi khuẩn A.tumefaciens

chủng GV3101 (pTd33) Phân tích PCR cho thấy khoảng 6,8% các cây con nảy mầm

từ hạt nhận ñược từ các cây ngô sau khi lây nhiễm bằng cách này mang gen nptII

Phương pháp thấm lọc chân không

Phương pháp chuyển gen thấm lọc chân không cũng tương tự như phương pháp ngâm cụm hoa Phương pháp này ñã ñược áp dụng ở một số cây trồng, ñặc biệt là cây

một lá mầm Trong môi trường chân không, tế bào thực vật tiếp xúc với A.tumefaciens tốt hơn Người ta nhận ñược các cây Megicago truncatula (cây mô hình thuộc họ ñậu)

chuyển gen bền vững bằng phương pháp chuyển gen này (Trieu A T và cs, 2000)[52]

1.8 Hệ thống vector biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 1.8.1 Vector nhị thể

Ti-plasmid của A.tumefaciens ñã ñược nghiên cứu cải biến như cắt bỏ các gen

không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng tạo dòng ña năng, tạo hai hệ thống vector chuyển gen hiệu quả như vector nhị thể (binary vector) và vector liên hợp (co intergrate vector) Nhờ vậy, cây trồng ñược biến nạp Ti-plasmid cải biến vừa mang gen quan tâm, vừa có khả năng tái sinh và phát triển bình thường

Nghiên cứu gần ñây của Olhoft và cộng sự (2003)[38] ñã thành công trong việc chuyển gen vào nốt lá mầm giống ñậu tương “Bert” và các giống ñậu tương khác sử dụng hệ thống vector mới: vector liên hợp hai nguồn Quy trình chuyển gen này có thể

áp dụng ñể chuyển gen vào các giống ñậu tương khác nhau, thậm trí cả các giống ñậu tương chọn lọc

Trên cơ sở phát hiện hai vùng Vir không cần nằm trên cùng một plasmid với

vùng T – DNA mà vẫn ñiều khiển ñược sự chuyển và xâm nhập của T – DNA vào hệ gen thực vật, người ta ñã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vector nhị thể, trong ñó vùng T – DNA và vùng Vir nằm trên hai plasmid khác nhau nhưng trong cùng một

chủng Agrobacterium tumefaciens

Có hai loại vector ñược sử dụng trong hệ thống vector nhị thể:

(a) Vector chuyển gen là Ti-plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và có phổ vật chủ rộng với ñoạn T – DNA ñược cắt bỏ hết các gen không cần thiết ở giữa hai trình tự biên trái và biên phải, gắn thêm một số thành phần tạo ra cấu trúc mới: i) các ñơn vị sao

chép ñể DNA plasmid có thể vừa tự nhân trong cả E.coli và Agrobacterium; ii) các gen

chọn lọc, gen chỉ thị; iii) vùng có chứa nhiều ñiểm cắt của enzyme giới hạn (vùng tạo dòng ña năng nằm ở giữa hai trình tự biên trái và biên phải ñể chèn gen mong muốn)

(b) Vector bổ trợ: nằm trong Agrobacterium tumefaciens, với toàn bộ vùng Vir

ñược gữ lại nhưng loại bỏ hoàn toàn vung T- DNA và RB, LB Plasmid này ñược cải tiến loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, nhưng vẫn duy trì khả năng xâm nhập vào tế bào thực vật

Hai cấu trúc này cũng ñược ñưa vào Agrobacterium tumefaciens, khi các gen

trên vector bổ trợ hoạt ñộng thì các sản phẩm của nó sẽ tác ñộng tới ñoạn T- DNA trên

vector chuyển gen dẫn ñến sự chuyển ñoạn T- DNA sang tế bào thực vật Quá trình

biến nạp ở vector nhị thể diễn ra như sau: (i) Plasmid nhỏ ñược nhân lên trong E.coli, sau ñó ñược chuyển trực tiếp hoặc qua quá trình tiếp hợp vào tế bào Agrobacterium

tumefaciens ñể chuyển T- DNA vào genome thực vật; (ii) chọn lọc tế bào thực vật

trong những ñiều kiện thích hợp

Thực tế cho thấy, plasmid với hai ñơn vị sao chép có thể không bền vững trong E.coli khi cả hai vùng này cùng hoạt ñộng Tuy nhiên, vector nhị thể có một số ưu ñiểm như: (i) không xảy ra quá trình tái tổ hợp giữa các plasmid; (ii) kích thước của

vector khá nhỏ Nhờ vậy, hiệu quả quá trình chuyển gen từ E.coli sang Agrobacterium

tumefaciens ñã tăng lên

1.8.2 Hệ vector liên hợp

Vector liên hợp ñược xây dựng dựa trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tương

ñồng nằm trên plasmid vi khuẩn (như vector của E.coli) với cùng T- DNA trên plasmid của Agrobacterium tumefaciens Trong ñó, người ta giữ lại vùng Vir, loại bỏ

vùng mã hóa chức năng gây khối u và thay thế bằng những ñoạn DNA mới trong plasmid

Ti-Có 3 loại vector tham gia vào hệ thống vector liên hợp:

(a) Ti-plasmid: các gen gây khối u ñã bị thay bởi gen kháng kháng sinh hoặc một ñoạn trình tự của vector pBR322 (hệ thống vector pGV)

(b) Vector trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thước nhỏ và ñược bổ

trợ chức năng không ưu việt của Ti-plasmid Chúng ñược nhân lên trong E.coli và chuyển sang Agrobacterium tumefaciens nhờ quá trình tiếp hợp Do không thể sao chép trong Agrobacterium tumefaciens nên chúng mang những ñoạn tương ñồng với

T- DNA

(c) Vector trợ giúp: tồn tại trong E.coli, có kích thước nhỏ, chứa các gen di ñộng (mob) và gen chuyển (tra) giúp cho quá trình tiếp hợp và chuyển vào

Agrobacterium tumefaciens

Hình 1.3 Sơ ñồ cấu trúc vector liên hợp

1.9 Các phương pháp kiểm tra sự hiện diện của gen ngoại lai trong cây chuyển gen

1.9.1 Kiểm tra sự hiện diện của gen ngoại lai

1.9.1.1 Polymerase Chanin reaction (PCR)

Kỹ thật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp – Polymerase Chanin reaction) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các ñoạn DNA với tốc ñộ nhanh, chính xác cao ñược thực hiện trong máy chu trình nhiệt (máy PCR)

Phương pháp này ñược tiếp tục hoàn thiện thông qua việc phát hiện và sản xuất

ñược enzyme DNA polymerase chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus và một số vi

khuẩn ưa nhiệt khác.Kỹ thuật PCR ñược coi là phương pháp nền quan trọng có nhiều ứng dụng trong công nghệ di truyền Muốn tiến hành phản ứng PCR, cần phải có các thành phần sau [46]:

Axit deoxyribonucleic khuôn (DNA template): Có thể là DNA mạch kép hay

mạch ñơn hoặc RNA ñược tách chiết từ các ñối tượng nghiên cứu DNA phải có ñộ nguyên vẹn cao