Nghiên cứu chọn tạo giống cà chua chín chậm, kháng virus xoăn vàng lá bằng chỉ thị phân tử DNA

Hiện có nhiều nước trên thế giới ñã chọn tạo ñược nhiều giống cà chua chín chậm nhờ sử dụng các dạng ñột biến chín chậm hoặc không chín như dạng ñột biến chín chậm alc alcobaca, ức chế s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
  -

NGUYỄN THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG CÀ CHUA CHÍN CHẬM, KHÁNG VIRUS XOĂN VÀNG LÁ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA

LUẬN VĂN THẠC SỸ

HÀ NỘI - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
  -

NGUYỄN THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG CÀ CHUA CHÍN CHẬM, KHÁNG VIRUS XOĂN VÀNG LÁ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS PHAN HỮU TÔN

HÀ NỘI - 2013

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan tất cả số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận tốt nghiệp này là khách quan, trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học

vị nào

Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện khóa luận tốt nghiệp này ñã ñược cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong khóa luận ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2013

Tác giả

Nguyễn Thị Lan Anh

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi ñã nhận ñược sự quan tâm, giúp ñỡ rất tận tình của các thầy cô, bạn bè cũng như những người thân trong gia ñình

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết sâu sắc tới PGS.TS Phan Hữu Tôn, người

ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ tôi về chuyên môn trong suốt quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Kỹ sư Khúc Ngọc Tuyên và toàn thể cán bộ, nhân viên Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng - Khoa công nghệ sinh học - ðH Nông nghiệp Hà Nội ñã rất nhiệt tình giúp

ñỡ, tạo ñiều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong thời gian thực hiện ñề tài tại bộ môn Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trường ðH Nông nghiệp Hà Nội

ñã trang bị cho tôi những kiến thức cần thiết ñể có thể thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia ñình, anh

em, bạn bè ñã ñộng viên, giúp ñỡ và tạo ñiều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2013

Tác giả

Nguyễn Thị Lan Anh

MỤC LỤC

2.3.3 Lập bản ñồ và phát triển các chỉ thị phân tử liên kết với các gen

2.4.1 Quá trình chín của quả cà chua 16

3.3.1 Phương pháp ñánh giá các ñặc ñiểm nông sinh học, năng suất,

4.1.4 Kết quả ñánh giá về cấu trúc chùm hoa, ñặc ñiểm nở hoa và tỷ lệ

4.1.5 Kết quả ñánh giá về năng suất và các yêu tố cấu thành năng suất 37

4.1.8 Ghép lây nhiễm ñánh giá khả năng kháng TYLCV của các THL

4.3 Chọn lọc cá thể cà chua tốt mang gen Ty3/Ty3 từ một số quần thể

4.3.1 PCR xác ñịnh cá thể mang kiểu gen kháng Ty3/Ty3 từ 4 quần thể

4.3.2 Chọn lọc các cá thể tốt từ các quần thể phân ly F2 dựa vào các

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên ñầy ñủ

AVRDC Trung tâm nghiên cứu phát triển giống rau thế giới

CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequences

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

FAO Food and Agriculture Organization

MAS Marker asissted selection

NSCT Năng suất cá thể

PCR Polymerase Chain Reaction

SCAR Sequenced Characterized Amplified Region

TYLCV Tomato Yellow Leaf Curl Virus

TYLCD Tomato Yellow Leaf Curl Disease

4.9 Ðặc ðiểm của 8 cá thể tốt mang gen kháng virus Ty3 ðồng hợp tử

chọn ðýợc từ 4 quần thể phân ly trong vụ xuân hè 2013 53

DANH MỤC HÌNH

2.5 Tác ðộng của LeMADS-RIN ðến quá trình sinh tổng hợp ethylen 17 2.6 Bản ðồ di truyền và vị trí của gen rin trên NST số 5 20 2.7 Bản ðồ di truyền và vị trí của gen nor trên NST số 10 20 2.8 Thời gian tồn trữ dài của con lai alc × ‘Vaibhav’ so với các dòng bố

3.1 Các ðiểm kháng nhiễm bệnh xoãn vàng lá theo triệu chứng 28

4.3 Hình ảnh một số tổ hợp lai triển vọng kháng virus xoãn vàng lá 45

4.5 Kết quả PCR xác ðịnh các tổ hợp lai thật kháng virus sử dụng cặp mồi

4.6 Kết quả PCR phát hiện các tổ hợp lai chín chậm thông qua sự có mặt

4.7 Ðánh số chọn lọc cá thể từ các quần thể phân ly F2 ở giai ðoạn cây con 50 4.8 Kết quả PCR xác ðịnh cá thể mang gen kháng Ty3 ðồng hợp tử trong

quần thể phân ly F2 của tổ hợp T1 sử dụng cặp mồi P6-25 F2/R5 51

PHẦN 1 MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề

Cà chua (Solanum lycopersicum) là loại rau ăn quả quan trọng ở nước ta Ở

miền Bắc, cà chua chủ yếu ñược trồng từ tháng 9 ñến tháng 3 năm sau và thu hoạch

từ tháng 11 ñến cuối tháng 5 Giá bán cà chua thời gian này thường rất thấp, người sản xuất thu ñược ít lợi nhuận Trong khi ñó, từ tháng 6 - 10 nhu cầu sử dụng cà chua lại rất cao, giá bán có thể tăng gấp 2 - 3 lần so với thời ñiểm chính vụ Vì thế

ñã có một số biện pháp kỹ thuật nhằm rải vụ như trồng sớm hoặc muộn, trồng trong nhà lưới hay dùng giống chịu nóng Tuy nhiên, các giống ñang trồng hiện nay chưa

có giống nào có ñặc tính chín chậm, vì thế vẫn phải thu ñến ñâu bán ngay ñến ñó, thời gian rải vụ không dài Hiện có nhiều nước trên thế giới ñã chọn tạo ñược nhiều giống cà chua chín chậm nhờ sử dụng các dạng ñột biến chín chậm hoặc không chín

như dạng ñột biến chín chậm alc (alcobaca), ức chế sự chín rin (ripening inhibitor), ñột biến không chín nor (non-ripening) và không bao giờ chín Nr (Never-ripening)

(Foolad, 2007; Garg và cộng sự, 2008) Những ñột biến này có tác dụng làm chậm quá trình chín và sự mềm hóa của quả, giúp quả có thể bảo quản ñược lâu trong ñiều kiện bình thường, vận chuyển ñược xa và chống thối tốt (Foolad, 2007; Garg và cộng sự, 2008; McGlasson và cộng sự, 1983) Chọn tạo ñược giống chín chậm sẽ cho phép ta trồng chính vụ khi thời tiết thuận lợi, cho năng suất và chất lượng cao, sau ñó thu hoạch và bảo quản ñược lâu, khi nhu cầu tiêu thụ tăng thì xử lý ethylene làm quả chín rồi bán với giá cao Trồng giống chín chậm còn giúp người trồng chủ ñộng trong thu hái, quả cứng và chống thối tốt cho phép vận chuyển thuận lợi và hạn chế thất thoát sau thu hoạch

Bên cạnh ñó, cà chua bị rất nhiều loại bệnh gây hại, trong ñó xoăn vàng lá do

một số loài virus thuộc chi Begomovirus gây ra ñang là một trong những bệnh gây hại

nghiêm trọng, ñặc biệt ñối với cà chua sớm và trái vụ ở miền Bắc Việt Nam Bệnh có thể gây giảm năng suất 80 - 90% nếu bị nhiễm sớm (Nguyễn Thơ, 1984) Sử dụng giống kháng virus là biện pháp hiệu quả nhất ñể phòng chống bệnh này Hiện ñã xác

ñịnh có 5 gen kháng virus, gồm gen Ty1 (Zamir và cộng sự, 1994) và Ty3 (Ji và Scott,

2006) nằm trên nhiễm sắc thể 6, gen Ty2 nằm trên nhiễm sắc thể 11 (Hanson và cộng

sự, 2006), gen Ty4 nằm trên nhiễm sắc thể 3 (Ji và cộng sự, 2008) và gen Ty5 nằm trên

nhiễm sắc thể 4 (Ilana Anbinder và cộng sự, 2009) đồng thời các gen này hiện cũng

ựã xác ựịnh ựược một số chỉ thị phân tử DNA liên kết chặt với các gen Ty1, Ty2, Ty3

và cả gen chắn chậm rin (Castro và cộng sự, 2007a; Garcia và cộng sự, 2007; Ji và

cộng sự, 2007a; Xiaoli, 2010) ựiều này giúp công tác chọn tạo giống cà chua chắn chậm

và kháng virus xoăn vàng lá bằng chỉ thị phân tử DNA ựược trở nên dễ dàng hơn

Vì những lý do trên, với mục ựắch nghiên cứu chọn tạo giống cà chua chắn

chậm và kháng virus xoăn vàng lá phục vụ cho sản xuất, chúng tôi ựã tiến hành ựề

tài: ỘNghiên cứu chọn tạo giống cà chua chắn chậm, kháng virus xoăn vàng lá

bằng chỉ thị phân tử DNAỢ

1.2 Mục ựắch, yêu cầu

1.2.1 Mục ựắch

- đánh giá, tuyển chọn một số tổ hợp lai (THL) F1 có khả năng chắn chậm

và kháng virus xoăn vàng lá, có năng suất cao, chất lượng tốt ựể ựưa vào sản xuất

- Chọn lọc trong một số quần thể phân ly F2 các cá thể tốt mang gen chắn

chậm rin và gen kháng virus xoăn vàng lá Ty3 ựồng hợp tử bằng chỉ thị DNA ựể

gây tạo dòng, giống cà chua thuần chắn chậm và kháng virus xoăn vàng lá

1.2.2 Yêu cầu

- Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với các gene mục tiêu (rin, Ty3) ựể kiểm

tra các tổ hợp lai nhằm loại bỏ các tổ hợp lai giả

- Ghép lây nhiễm ựánh giá khả năng kháng virus của các THL kháng virus triển vọng và ựánh giá khả năng chắn chậm trong vụ xuân hè 2013

- Tạo ựược quần thể Phân ly F2 từ các THL triển vọng và tiến hành PCR

phát hiện ựược các cá thể mang gen chắn chậm rin và gen kháng virus xoăn vàng lá

Ty3 ựồng hợp tử trong vụ xuân hè 2013

- Theo dõi ựặc ựiểm nông sinh học, năng suất, chất lượng quả của các các

cá thể mang gen rin và Ty3 ựồng hợp tử, từ ựó chọn ra ựược các cá thể mang gen

rin và Ty3 ựồng hợp tử có năng suất cao, chất lượng tốt, dạng quả ựẹp cho tự thụ ựể

gây tạo dòng thuần

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gốc, phân loại

2.1.1 Nguồn gốc

Cà chua có nguồn gốc ở Peru, Bolivia, Equador Trước khi Christopher Columbus phát hiện ra châu Mỹ thì Peru và Mehico ñã trồng cà chua Quá trình thuần hóa và du nhập cà chua ñến các châu lục ñược tóm lược như sau:

- Theo tài liệu của châu Âu thì chắc chắn cà chua ñược người Aztec và Toltec trồng ở Nam Mỹ ðầu tiên người Tây Ban Nha ñem cà chua từ châu Mỹ về châu

Âu, sau ñó ñem ñến vùng ðịa Trung Hải

- Năm 1554, Pietro Andrea Mattioli giới thiệu những giống cà chua từ Mehico có màu vàng và ñỏ nhạt ðây cũng là thời ñiểm chứng minh sự tồn tại của

cà chua trên thế giới Năm 1710, Thomas Jefferson ñã trồng cà chua trong vườn, nhưng không thu ñược kết quả ñáng kể trong việc cải tiến giống ðến thế kỷ XVIII (1750), cà chua mới ñược trồng ở Anh ñể dùng làm thực phẩm

- Những tiến bộ ban ñầu về dòng, giống cà chua hoàn toàn dựa vào châu Âu Năm 1863, 23 giống cà chua ñược giới thiệu, trong ñó giống Trophy ñược coi là giống tốt với giá 5 USD một gói nhỏ có 20 hạt giống

- Từ năm 1870 ñến 1893, A W Livingston ñã giới thiệu 13 giống cà chua trồng trọt ñược chọn lọc theo phương pháp chọn lọc cá thể Cuối thế kỷ XIX, có trên 200 dòng, giống cà chua ñã ñược giới thiệu rộng rãi Quá trình chọn tạo giống

cà chua vẫn ñược tiến hành thường xuyên cho ñến nay

2.1.2 Phân loại

Cây cà chua ñã trải qua quá trình phát triển lịch sử lâu dài vì vậy nó có sự ña dạng tuyệt vời về tính thích ứng, nguồn gen phù hợp với nhiều hệ thống canh tác khác nhau.Cơ sở khoa học ñể phân loại cà chua khác nhau rất nhiều

Các công bố của Peralta và Spooner (2000) phân loại cà chua dựa trên trình tự DNA của các bản sao gen ñơn Gần ñây nhất Spooner và cộng sự (2006) phân loại dựa trên phân tích AFLP, kết quả này phù hợp với phân loại của Child (1990) và

Linnaeus (1753) ðiều này cũng chứng tỏ nguồn gốc của cà chua trồng ngày nay bắt ñầu từ dạng giao phấn, tự bất thụ, quả màu xanh (dẫn theo Jaime Prohens and Fernando Nuez, 2008)

Theo bảng phân loại của Peralta (2006) cà chua thuộc loài Solanum chi

Lycopersicon và từ chi này phân thành 4 nhóm khác nhau:

+ Nhóm thứ nhất: Bao gồm các loài phụ như: S lycopersicum, S Pimpinellifolium,

S Cheesmaniae, S Galapagense

+ Nhóm thứ hai: Nhóm Neolycopersicon có loài phụ S Pennellii

+ Nhóm thứ ba: Nhóm Eriopersicon gồm 5 loài phụ: S habrochaites, S

Huaylasense, S corneliomulleri, S peruvianum, S chilense

+ Nhóm thứ tư: Nhóm Arcanum gồm các loài phụ: S arcanum, S chmielewskii và

S neorickii

2.2 Giá trị và yêu cầu ngoại cảnh của cây cà chua

2.2.1 Giá trị dinh dưỡng và ý nghĩa kinh tế của cây cà chua

2.2.1.1 Giá trị dinh dưỡng

Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, ñược sử dụng rộng rãi trên thế giới hơn 150 năm nay Trong quả cà chua chín chứa nhiều vitamin, chất khoáng và nhiều chất có hoạt tính sinh học khác Theo bảng thành phần thực phẩm Việt Nam (Bộ Y tế, 2007), cà chua chứa nhiều vitamin C (40mg/100g), β-caroten (393 µg/100g), lycopen (3025 µg/100g), vitamin K (7,9 µg/100g) và một lượng ñáng kể các chất khoáng cần thiết như kali, mangan, magie, ñồng, sắt, kẽm và các chất xơ hòa tan Lycopen và β-caroten có tác dụng chống oxy hóa mạnh, vì vậy với chế ñộ ăn tăng cường cà chua góp phần làm chậm quá trình lão hóa và giảm nguy

cơ ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư ñại tràng Cà chua còn chứa nhiều hợp chất hóa thực vật khác và chất xơ giúp cho cơ thể bài xuất cholesterol, giảm cục máu ñông, ñề phòng các tai biến của bệnh tim mạch

2.2.1.2 Giá trị kinh tế

Cà chua là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, ñược sử dụng làm nguyên liệu chế biến thành nhiều loại sản phẩm như: cà chua cô ñặc, nước quả, nước sốt, tương cà chua Theo FAO (Symbols and Abbreviations), năm 2004 trên thế giới có

khoảng 114 nước trồng cà chua với diện tích 4231669 ha, sản lượng 112304298 tấn, năng suất trung bình ñạt 27 tấn/ha Cũng theo FAO (Stat 2007) thì năm 2005 diện tích và sản lượng cà chua trên thế giới là 4,57 triệu ha và 124,4 triệu tấn, năng suất trung bình ñạt 27,2 tấn/ha

Cà chua là một trong những mặt hàng có giá trị xuất khẩu lớn kể cả dạng tươi

và dạng chế biến Lượng cà chua trao ñổi trên thị trường quốc tế là 32,7 triệu tấn, trong ñó 10% ở dạng quả tươi Ở Việt Nam, cà chua ñược trồng trên 100 năm nay, diện tích gieo trồng cà chua hàng năm biến ñộng từ 15 – 17 ngàn ha, sản lượng 280 ngàn tấn Mức tiêu thụ bình quân ñầu người của nước ta là 3 kg/người/năm (Tạ Thu Cúc, 1985) Tại khu vực ðồng bằng sông Hồng, sản xuất cà chua cho thu nhập bình quân 42,0 – 68,4 triệu ñồng/ha/vụ, lãi thuần ñạt 15-26 triệu ñồng, cao hơn nhiều so với trồng lúa ( Trần Tuyết Lan Hương, 2009) Trồng lúa chỉ giải quyết 230 – 250 công lao ñộng, trong ñó trồng cà chua giải quyết ñược 1100 – 1200 công lao ñộng

2.2.2 Yêu cầu ngoại cảnh của cây cà chua

2.2.2.1 Nhiệt ñộ

Cà chua ưa thích khí hậu ấm áp, ôn hòa, khả năng thích nghi rộng Cà chua sinh trưởng trong phạm vi nhiệt ñộ từ 15 – 35oC, hầu hết các giống cà chua trồng trọt sinh trưởng không bình thường khi nhiệt ñộ dưới 15oC và trên 35oC Nhiệt ñộ thích hợp nằm trong giới hạn 22 – 24oC, hạt nảy mầm tốt ở nhiệt ñộ 25 – 30oC, tối

ưu là 29oC Cây con sinh trưởng tốt trong ñiều kiện nhiệt ñộ 25 – 26oC, quả ñậu tốt

ở 18 – 20oC và phát triển thuận lợi khi nhiệt ñộ 20 – 22oC Sắc tố hình thành ở nhiệt

ñộ 20oC, trên 35oC sắc tố bị phân giải, quả chín ở nhiệt ñộ 24 – 30oC

2.2.2.2 Ánh sáng

Cà chua là loại cây trồng không phản ứng với ñộ dài ngày, vì vậy nhiều giống

cà chua có thể ra hoa ở ñiều kiện thời gian chiếu sáng dài hoặc ngắn (cây trung tính) Do ñó, nếu nhiệt ñộ thích hợp thì cà chua có thể sinh trưởng, phát triển ở nhiều vùng sinh thái khác nhau trên ñất nước ta Tuy nhiên, ánh sáng ngày dài và hàm lượng Nitrat ảnh hưởng rõ rệt ñến tỷ lệ ñậu quả Nếu chiếu sáng 7 giờ và tăng lượng ñạm thì làm cho số quả ñậu giảm ñi, so với khi chiếu sáng ngày sẽ tăng số quả/ cây Tuy nhiên, trong ñiều kiện ngày ngắn, nếu không bón ñạm thì chỉ cho số

quả ít, nhưng trong ñiều kiện ngày dài mà không bón ñạm thì không ra hoa và không ñậu quả (Tạ Thu Cúc, 1979)

2.2.2.3 Ẩm ñộ

Có ý nghĩa lớn trong sinh trưởng, mỗi thời kỳ có nhu cầu khác nhau về ẩm ñộ (Tạ Thu Cúc, 1979) Theo Barebyi (1971), ở chế ñộ ẩm ñộ 60% vào mùa ẩm thì hàm lượng chất khô, ñường và vitamin C là cao nhất, ẩm ñộ cao thường làm phát triển nhiều dịch bệnh, nhất là bệnh mốc sương và làm giảm thời gian bảo quản quả

2.2.2.4 Các chất ñiều hòa sinh trưởng

- Năng suất tăng khi xử lý hạt bằng β-NOA 25 – 50 ppm, GA3 5 – 20 ppm, ñồng thời làm giảm lượng hạt trong quả

- Ethrel khi phun lên lá sẽ làm quả chín nhanh hơn

- Trong ñiều kiện cây bị bệnh, nếu phun NAA 25 ppm thì sẽ phục hồi ñược sự sinh trưởng bình thường của cà chua (Tạ Thu Cúc, 1979)

- P: hàm lượng P cao xung quanh vùng rễ làm rễ phát triển mạnh và tăng khả năng hút nước và dinh dưỡng P ảnh hưởng ñến số hoa và hoạt ñộng của cytokinin

- K: ảnh hưởng ñến kích thước và chất lượng quả, làm giảm tỷ lệ quả dị dạng K ñóng vai trò quan trọng trong việc hình thành màu sắc, tăng lượng caroten, lycopen và giảm clorophin Thiếu K làm giảm ñộ rắn quả và hàm lượng các chất dinh dưỡng Các nguyên tố vi lượng như Bo, Zn và Mn cũng rất ñược quan tâm Bo ảnh hưởng ñến số hoa, số hoa rụng và trọng lượng quả Thiếu Bo làm giảm sự phát triển của bộ rễ, lá mầm dòn dễ gãy, chồi ñỉnh bị thối, quả bị biến dạng ðất nhiều cát và giàu canxi thì thường thiếu Bo, do ñó cần bón bổ xung yếu tố vi lượng này

Cà chua có thể trồng trên nhiều loại ñất, tuy nhiên, ñất thoát nước có ñộ màu

mỡ cao, cấu trúc ñất tốt, pH 6,0 – 7,0 sẽ cho năng suất cao nhất

2.3 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua kháng virus xoăn vàng lá

2.3.1 Nguyên nhân gây bệnh xoăn vàng lá

Bệnh xoăn vàng lá cà chua lần ñầu tiên ñược xác ñịnh tại Israel vào năm

1930 và hiện nay ñã ñược xác ñịnh do một nhóm các loài begomovirus khác nhau thuộc họ geminivirus gây ra, ñược lan truyền bởi vector bọ phấn trắng (bemisa

tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (Hà Viết Cường, 2008) Mặc dù nhóm

geminivirus này bao gồm các loài riêng biệt, nhưng chúng vẫn ñược gọi chung là

virus xoăn vàng lá cà chua - Tomato yellow leaf curl virus (Vidavski, 2007)

TYLCVD cho ñến nay ñược biết có liên quan tới ít nhất 11 loài và hơn 25

chủng monopartite begomoviruses (Fauquet và cộng sự, 2008) Bệnh virus xoăn lá

cà chua (Tomato leaf curl virus disease - ToLCVD) có những triệu chứng khác rất nhỏ với TYLCVD, nó ñược chú ý sau này do ñược gây ra bởi các loài begomovirus

bộ gen kép (bipartite begomovirus) và bởi sự khác biệt trong chuỗi DNA-A (Pena

và cộng sự, 2010) Các loài begomovirus bộ gen kép (bipartite genome) gồm hai

phân tử DNA sợi vòng ñơn: DNA-A (2,6-2,8 kb) và DNA-B (2,5-2,8 kb) (Gronenborn, 2007), các loài có bộ gen ñơn tương ñương phân tử DNA-A

Ở Việt Nam ñã phát hiện có 6 loài begomovirus gây ra bệnh xoăn vàng ngọn

cà chua là Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV), Tomato yellow leaf curl

Kanchanaburi (TYLCKaV) (Cường và cộng sự, 2008), Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV) (Green và cộng sự, 2001), Tomato leaf curl Hainan virus (ToLCHnV), Tomato leaf curl Hanoi virus (ToLCHanV) (Ha và cộng sự,

2011) và Tomato leaf curl Dan Xa virus (ToLCDXV) (Blawid và cộng sự, 2008)

2.3.2 Nghiên cứu về nguồn gen kháng virus xoăn vàng lá

Loài cà chua trồng (Solanum lycopersicum) cực kỳ mẫn cảm với virus xoăn vàng lá (Tomato yellow leaf curl virus – TYLCV) Tuy nhiên, mức ñộ kháng cao với TYLCV ñã ñược tìm thấy trong các loài cà chua dại S pimpinellifolium, S

peruvianum, S chilense, S habrochaites, và S cheesmaniae Một vài mẫu giống S pimpinellifolium cũng biểu hiện mức ñộ chống chịu tốt với TYLCV (Ji và cộng sự,

2007b; Pena và cộng sự, 2010) Trong các loài cà chua dại biểu hiện tính kháng với

TYLCV, S chilense, S habrochaites, và S peruvianum cung cấp khả năng kháng

tốt và ñã ñược sử dụng rộng rãi trong chương trình tạo giống ñể phát triển các giống

cà chua thương mại kháng TYLCV (Ji và cộng sự, 2007b; Pena và cộng sự, 2010) Một số gen lặn liên quan ñến tính kháng trong các cây có khả năng chống

chịu TYLCV từ mẫu giống PI26935 thuộc loài S peruvianum ñã ñược phát hiện bởi

Pilowsky và Cohen Những nghiên cứu này dẫn ñến sự ra ñời của TY20, một giống kháng vừa phải Tiếp ñó, các dòng giống với khả năng kháng cao như TY172 và

TY197 ñã ñược phát triển tại Trung tâm Volcani ở Israel từ loài S peruvianum (Ji

và cộng sự, 2007b) Tính kháng trong TY172 ñược ñiều khiển bởi một QLT (Quantitative Trait Locus) lớn và bốn QLT nhỏ, QLT lớn ñược ñặt tên là Ty-5, nằm trên nhiễm sắc thể số 4 (I Anbinder và cộng sự, 2009) Các mẫu giống LA372, LA452, LA462, LA1274, LA1333, LA1373, và CMV sel INRA (PI126926 ×

PI128648-6) và LA385 thuộc loài S peruvianum var humifusum ñã ñược phát hiện

là có khả năng kháng cao với TYLCV Các gen từ S peruvianum ñã nhanh chóng

ñược ñưa vào các giống lai thương mại tên tuổi và cung cấp khả năng kháng tốt với TYLCV (Ji và cộng sự, 2007b)

S chilense là nguồn gen kháng rất quan trọng trong nhiều chương trình tạo

giống trên thế giới Năm 1991, Zakay và cộng sự ñã báo cáo khả năng kháng cao với TYLCV trong các cá thể thuộc mẫu giống LA1969 (Ji và cộng sự, 2007a) Năm

1994, Zamir và cộng sự ñã lập bản ñồ gen Ty-1 trên nhiễm sắc thể số 6 và hai gen

bổ sung trên nhiễm sắc thể số 3 và 7 (Ji và cộng sự, 2007a) Việc ñưa gen kháng TYLCV từ LA1969 vào cà chua trồng ñã ñược tiến hành trong các chương trình tạo giống của nhiều nhóm nghiên cứu, nó cũng ñã ñược ñưa vào cà chua trồng bởi một

số công ty giống tư nhân (Ji và cộng sự, 2007b) Hiện ñã tìm ra ở S chilense các

mẫu giống LA1932, LA1938, LA1959, LA1960, LA1961, LA1963, LA1968, LA1969, LA2747, LA2774, và LA2779 có khả năng kháng ToMoV ở Florida và ñã ñược sử dụng ñể bắt ñầu một chương trình tạo giống kháng bằng phương pháp lai khác loài Tiếp ñó, LA1932, LA2779, và LA1938 ñã ñược chứng minh là nguồn

kháng hữu ắch cho chương trình tạo giống cà chua ở Florida Hiện nay, một số

chương trình nhân giống thương mại ựang sử dụng các gen kháng từ S chilense và

người trồng ựã chấp nhận các giống này trên thị trường (Ji và cộng sự, 2007b) Các ựánh giá tại trung tâm rau thế giới (The World Vegetable Center - AVRDC) cũng cho thấy mẫu giống LA1932 kháng tốt tại tất cả 8 ựịa ựiểm thử nghiệm tại đông Nam Á (Sugawara và cộng sự, 2012), gợi ý rằng LA1932 có thể là một nguồn cung cấp gen kháng TYLCV tốt cho Việt Nam

Năm 1982, Hassan và cộng sự ựã ựánh giá các mẫu giống LA0386, LA1252,

LA1295, LA1352, LA1393, LA1624, và LA1691 thuộc loài S habrochaites và thấy

rằng chúng có khả năng kháng cao với TYLCV, tắnh kháng từ các mẫu giống này là trội (Ji và cộng sự, 2007a) Mẫu giống LA1777 ựã ựược công bố có khả năng kháng TYLCV, các cây kháng từ mẫu giống này ựược chọn ựể lai với các cây kháng từ mẫu giống LA0386 ựể tạo ra một quần thể F1 có khả năng kháng cao, quần thể này

ựược sử dụng ựể lai với S lycopersicum và ựã tạo ra các cây có khả năng miễn dịch

và chịu bệnh, tắnh kháng ựược cho là do một gen trội chắnh và một số gen nhỏ ựiều khiển (Ji và cộng sự, 2007a) Một dòng giống Ih902 ựã ựược sử dụng ựể tạo ra các cây lai, trong ựó FAVI 9 là một nguồn kháng quan trọng cho các chương trình tạo giống ở Guatemala và các nước Trung đông khác (Ji và cộng sự, 2007b)

Tại Ấn độ, S habrochaites f glabratum B6013 ựã ựược chứng minh có hai gen lấn át (epistatic genes) kiểm soát tắnh kháng Tomato leaf curl virus (ToLCV)

Sau ựó, các nhà nghiên cứu ở ựây ựã phát triển dòng giống H24 từ mẫu giống này

"H24" ựã ựược chứng minh mang gen kháng Ty-2 "H24" tạo ra tắnh chịu bệnh rõ

ràng với một số chủng (strains) TYLCV/ToLCV nhưng không phải tất cả Vắ dụ, H24 chống chịu ựược các chủng TYLCV/ToLCV ở đài Loan, miền Bắc Việt Nam, Nam Ấn độ, và Israel nhưng mẫn cảm với các chủng TYLCV phắa bắc Ấn độ, Thái

Lan, và Philippines Ty-2 là nguồn gen kháng ựược sử dụng sớm nhất trong chương

trình tạo giống cà chua ở Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển rau Thế giới (AVRDC) và ựã ựược khai thác rộng rãi bởi một số công ty giống cây trồng Châu Á (Ji và cộng sự, 2007b)

2.3.3 Lập bản ñồ và phát triển các chỉ thị phân tử liên kết với các gen kháng TYLCV

Locus Ty-1 ñã ñược lập bản ñồ ñầu tiên trên nhiễm sắc thể số 6 với các chỉ

thị RFLP TG297 và TG97 sử dụng các quần thể ñược tao ra từ phép lai giữa dòng

mẹ mẫn cảm M82-1-8 S lycopersicum với mẫu giống kháng TYLCV S chilense

LA1969 (Zamir và cộng sự, 1994) Các cây ñồng hợp tử cho các alen từ S.chilense tại TG297 và TG97 là kháng cao và không tạo ra triệu chứng bệnh Các chỉ thị dựa

trên locus TG97 liên kết chặt với gen Ty-1 ñã ñược phát triển tại Hebrew University of Jerusalem, Israel Cùng với Ty-1, vài gen kháng khác ñã ñược lập bản

ñồ trên nhiễm sắc thể số 6 gần vùng Ty-1 Ví dụ như gen Mi-1 có nguồn gốc từ S

peruvianum kháng tuyến trùng nốt sưng rễ, ñịnh vị trong pham vi khoảng 6cM gần

locus Ty-1 ðiều này cho phép sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với gen Mi-1 làm chỉ thị cho gen Ty-1 nếu các alen từ S peruvianum và S chilense khác nhau về

các chỉ thị này Trường hợp các alen từ 2 loài là giống nhau về các chỉ thị này, sử dụng chúng có thể dẫn ñến kết quả sai Chỉ thị CAPS (Cắt tŕnh tự ña hình ñược khuếch ñại - Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) REX-1 liên kết với gen

Mi-1 có thể ñược sử dụng làm chỉ thị phát hiện locus Ty-1 (khoảng 5,5 cM) (Milo, 2001) Tiếp ñó, Chỉ thị CAPS JB-1 liên kết chặt với Ty-1 ñã ñược xác ñịnh, nó cho phép chọn lọc Ty-1 mà không phụ thuộc vào Mi-1 (Castro và cộng sự, 2007b) Chỉ

thị Jb-1 có nguồn gốc từ RFLP CT21, nó tạo ra 3 alen khác nhau nhờ cắt hạn chế

sản phẩm PCR bằng enzyme TaqI Alen 1 có một band xấp xỉ 400bp, alen 2 gồm

một band hơi lớn hơn 400 bp và alen 3 có một band 500bp Alen 2 và 3 là ñồng trội

và trội hơn alen 1 Alen 3 ñã phát hiện ñược các dòng mang gen Ty-1 mà không

phụ thuộc vào sự có mặt của Mi-1 (Castro và cộng sự, 2007)

Hình 2.1 Vị trí gen Ty-2 trên nhiễm

nguồn kháng (Hanson và cộng sự, 2000) Hiện nay, một số chỉ thị dựa trên PCR cho

vùng DNA chuyển vào từ S habrochaites ñã ñược phát triển Chỉ thị CAPS TG105A

cho thấy khả năng khuếch ñại mạnh và cắt hạn chế sản phẩm PCR bằng enzyme

TaqI ñã tạo ra các vạch băng ña hình cho S habrochaites và S lycopersicum Một

chỉ thị dựa trên PCR khác là T0302 cũng ñược phát triển cho locus Ty-2 mà không

phải dùng enzyme giới hạn Phân tích liên kết cho thấy TG105A và T0302 liên kết

chặt với nhau, khoảng cách của các chỉ thị này với gen Ty-2 là xấp xỉ 10 cM (Ji và

cộng sự, 2007b)

Hình 2.3 Bản ðồ gen Ty3 trên nhiễm sắc thể số

6 (Ji và cộng sự, 2007b)

Hình 2.4 Bản ñồ gen Ty-4 trên nhiễm sắc thể số 3 (Ji và cộng sự, 2009)

Năm 2006, Agrama và Scott ñã ñưa ra một bản ñồ QLT cho tính kháng

TYLCV và ToMoV (Tomato Mottle Virus) trong các mẫu giống S chilense

LA2779 và LA1932 sử dụng các chỉ thị RAPD (Ji và cộng sự, 2007a; Pena và cộng

sự, 2010) Nghiên cứu này cho thấy rằng có 3 vùng trên nhiễm sắc thể số 6 góp phần tạo nên tính kháng cả hai virus TYLCV và ToMoV Vùng thứ nhất bao gồm

vùng Ty-1, trong khi hai vùng khác nằm hai bên sườn của các locus sp pruning) và c (potato leaf) Các chỉ thị RAPD liên kết với tính kháng trong các

(self-vùng này ñã ñược xác ñịnh bằng cách sử dụng các dòng giống kháng có nguồn gốc

từ các mẫu giống LA2779 và LA1932 Sau ñó, Ji và cộng sự (2007b) ñã lập một

bản ñồ chi tiết cho tính kháng begomovirus và nhận ra một vùng DNA lớn ñược chuyển vào từ S chilense kéo dài từ chỉ thị C2_A2g39690 ñến T0834 trong các

dòng giống tiên tiến có nguồn gốc từ LA2779 kháng cả hai virus TYLCV và

ToMoV Một locus kháng begomovirus ñã ñược lập bản ñồ ở khoảng giữa chỉ thị

cLEG31-P16 và 1079 trên vai của nhiễm sắc thể số 6, và ñược xác ñịnh là Ty3 Phía trên locus Ty3, vùng DNA lớn ñược chuyển vào này cũng nối với vùng Ty-1 gần gen Mi, gợi ý rằng các alen tại cả hai locus Ty-1 và Ty3 có khả năng cùng tồn

tại và nối với nhau Trái lại, các dòng giống tiên tiến có nguồn gốc từ LA1932 có một vùng DNA ñược chuyển vào ngắn hơn, từ cLEG31-P16 ñến C2_A5g41480,

vùng này cũng mang một locus kháng begomovirus mà có lẽ thuộc alen tại locus

Ty3 Ji và Scott (2006) ñã xác ñịnh rằng các locus Ty3 ñịnh vị trong một khu vực

bao gồm locus FER (25 cM, BAC clone 56B23, AY678298) Các trình tự cho các

gen G8 của BAC clone 56B23 là khác nhau ñối với các dòng có nguồn gốc từ S

chilense LA2779 và LA1932 (Maxwell và cộng sự, 2007) ðể phân biệt hai

introgression này, một từ LA2779 ñược chỉ ñịnh là Ty3 và một từ LA1932 ñược chỉ ñịnh là Ty3a Một chỉ thị SCAR (trình tự ñặc trưng vùng khuếch ñại - Sequenced

Characterized Amplified Region) ñồng trội FLUW25 ñã ñược báo cáo (Ji và cộng

sự, 2007b) phát hiện ñược các alen Ty3 và Ty3 (có nguồn gốc từ S lycopersicum), nhưng không phát hiện ñược alen Ty3a (Ji và cộng sự, 2007a) ðể khắc phục vấn

ñề này, nhóm tác giả trên ñã phát triển chỉ thị ñồng trội P6-25 (SCAR chỉ thị) phát

hiện ñược các alen Ty3, Ty3, Ty3a (Ji và cộng sự, 2007a) Khi sử dụng cặp mồi

P6-25F2/R5 này ñể sàng lọc một vài giống lai từ các công ty giống thương mại, các tác giả ñã nhận ñược mảnh PCR 660 bp từ 3 giống thương mại, các mảnh này ñược

giải trình tự và cho thấy 100% tương ñồng với ñoạn từ S chilense LA1969

Introgression mới ñược phát hiện có nguồn gốc từ S.chilense LA1969 này ñược gọi

là Ty3b (Ji và cộng sự, 2007a)

Ji và cộng sự, (2008) ñã phát hiện một introgression S chilense 14 cM trên

nhánh dài của nhiễm sắc thể số 3 trong một số dòng giống kháng có nguồn gốc từ

LA1932 Sau ñó, một locus kháng begomovirus mới là Ty-4 ñã ñược lập bản ñồ với

các chỉ thị vào khoảng 2,3 cM giữa C2_A4g17300và C2_A5g60160 trong vùng

chuyển vị nhiễm sắc (Ji và cộng sự, 2009) Phân tích quần thể phân ly về locus Ty3

và Ty-4 ñã chứng minh rằng Ty3 giải thích 59,6% sự thay ñổi kiểu hình kháng, trong khi Ty-4 chỉ giải thích cho 15,7%, ñiều này gợi ý rằng Ty-4 tạo ra một hiệu lực kháng TYLCV nhỏ hơn Các dòng tái tổ hợp mang cả Ty3 và Ty-4 có mức

kháng cao hơn với TYLCV (Ji và cộng sự, 2009)

Anbinder và cộng sự (2009) ựã lập bản ựồ một QLT lớn và bốn QLT phụ nhỏ góp phần tạo nên tắnh kháng TYLCV trong dòng giống TY172 có nguồn gốc

từ S peruvianum QLT lớn ựược ựặt tên là Ty-5, ựược lập bản ựồ trên nhiễm sắc

thể số 4 trong vùng lân cận của chỉ thị SINAC1 và chịu trách nhiệm 39,7 - 46,6% biến dị kiểu hình Các QLT nhỏ, bắt nguồn từ các cha mẹ kháng hoặc mẫn cảm, ựược lập bản ựồ trên nhiễm sắc thể số 1, 7, 9 và 11, và chịu trách nhiệm 12% biến

dị trong mức nghiêm trọng triệu chứng, bổ sung cho gen Ty-5 (I Anbinder và cộng

sự, 2009)

đã có nhiều cố gắng trong việc nhận diện và lập bản ựồ các gen qui ựịnh

tắnh kháng TYLCV trong S pimpinellifolium và S cheesmaniae nhưng không tạo

ra ựược các bản ựồ tốt cũng như không tìm ra ựược các chỉ thị liên kết chặt phù hợp cho MAS (Pena và cộng sự, 2010)

2.3.4 đánh giá các nguồn gen kháng ở các vùng ựịa lý

Một trong những vấn ựề lớn khi lai tạo giống cà chua kháng begomovirus là khả năng kháng của các alen khác nhau trong các khu vực có mặt các begomovirus

khác nhau Vấn ựề này ựã ựược ựiều tra với một số dòng ở nhiều ựịa ựiểm thử nghiệm

Dòng giống TY52 (mang gen Ty-1) với tắnh kháng có nguồn gốc từ S chilense LA1969, ựược phát triển ở Israel, kháng vừa phải với TYLCV Khi ựánh giá ở Guatemala, nơi có các Begomovirus genome kép với áp lực virus rất cao thì dòng này

lại mẫn cảm Khi ựánh giá trong tám ựịa ựiểm ở đông Nam Á và tại Florida, Mỹ, TY52 mẫn cảm ở bảy ựịa ựiểm, kháng vừa ở một ựịa ựiểm (Ji và cộng sự, 2007a) đối

với dòng H24 mang gen Ty-2 ToLCV từ S habrochaites f glabratum, các thử nghiệm

cho thấy nó kháng ựược tại năm ựịa ựiểm và mẫn cảm hoặc kháng nhẹ ở bốn ựịa ựiểm khác (Ji và cộng sự, 2007a)

Trong số chắn nguồn gen ựược thử nghiệm tại AVRDC, chỉ có S chilense

LA1932 kháng ựược tại tất cả tám ựịa ựiểm ở đông Nam Á (Sugawara và cộng sự, 2012) LA1932 cũng kháng ựược tại các ựịa ựiểm khảo sát ở Florida, Mỹ (Ji và

cộng sự, 2007a) Mẫu giống này mang cả 3 gen kháng: Ty-1, Ty3 và Ty-4 Trong ựó,

Ty3 quyết ựịnh khoảng 60% biến dị kiểu hình kháng, ựiều này chứng tỏ Ty3 là gen

chịu trách nhiệm chính ñối với tính kháng TYLCV (Ji và cộng sự, 2007a)

Các ñánh giá nguồn gen ở Bangalore, Ấn ðộ và Rehovot, Israel nơi có các

begomovirus tương ứng là ToLCV và TYLCV cho thấy dòng giống Ih 902 với

tính kháng có nguồn gốc từ S habrochaites kháng ñược ở cả hai ñịa ñiểm Trong khi ñó, S pimpinellifolium LA121 kháng vừa phải ở Ấn ðộ nhưng mẫn cảm ở Israel Các dòng giống có nguồn gốc từ Ih902 và Fla595 (mang gen Ty3) với tính kháng bắt nguồn từ S chilense LA2779 cũng ñược ñánh giá là kháng ở Guatemala, nơi phát tán của ít nhất 7 loài begomovirus khác nhau (Ji và cộng sự,

2007a) Những dòng giống kháng cao với TYLCV từ trung tâm Volcani, Israel,

như TY172 và TY197 có gen kháng bắt nguồn từ S peruvianum, cũng kháng cao

ở Guatemala (Ji và cộng sự, 2007a)

2.3.5 Cơ chế tạo tính kháng TYLCV

Nỗ lực ñầu tiên ñể hiểu ñược cơ chế kháng TYLCV ở cấp ñộ phân tử là sử dụng tính kháng TYLCV có nguồn gốc từ S chilense chứa locus Ty-1 (Michelson và cộng sự,

1994), với hai dòng ñẳng gen (dòng TY50 và TY52) cà chua chỉ khác nhau ở sự có mặt

hay vắng mặt của ñoạn nhiễm sắc thể S chilense liên quan ñến tính kháng với TYLCV, ñược phát triển bởi RFLP Các cây của dòng TY50, không có alen Ty-1 từ S chilense, mẫn cảm và biểu hiện triệu chứng bệnh sau khi lây nhiễm TYLCV qua bọ phấn trong

ñiều kiện ñồng ruộng Ngược lại, ở các cây của dòng TY52, do sự hiện diện của alen

Ty-1 từ S chilense, có khả năng kháng TYLCV nhưng vẫn có triệu chứng sau khi lây

nhiễm qua trung gian bọ phấn trong ñiều kiện ñồng ruộng Ảnh hưởng của gen Ty-1 ñến sự tích tụ và di chuyển của TYLCV ñược nghiên cứu bằng cách so sánh sự tích tụ

DNA của virus trong d¨ng TY50 và TY52 DNA virus tích lũy trong các dòng kháng 52

ñã ñược tìm thấy là chịu ảnh hưởng của số lượng bọ phấn lây nhiễm Khi lây nhiễm với

số lượng bọ phấn thấp (ba bọ phấn cho mỗi cây), DNA virus hầu như không ñược phát hiện trong dòng 52 Khi số lượng bọ phấn lây nhiễm cao (50 – 70 bọ phấn cho mỗi cây), DNA virus tồn tại trong cả hai dòng kháng và mẫn cảm Tuy nhiên, sự tích lũy DNA virus trong dòng kháng chậm hơn trong dòng mẫn cảm Các tác giả kết luận rằng

gen Ty-1 có liên quan ñến sự ức chế triệu chứng bệnh thông qua hai cơ chế: giảm sự

tích tụ DNA virus trong mô ở các cây lây nhiễm với lượng bọ phấn thấp và hạn chế

virus di chuyển ñường dài ở các cây lây nhiễm với lượng bọ phấn cao (Michelson và cộng sự, 1994)

Gần ñây, các nghiên cứu ñã ñược thực hiện ñể làm sáng tỏ cơ chế kháng ở

dòng TY172 (có nguồn gốc từ S peruvianum) trong ñiều kiện lây nhiễm cao (Segev

và cộng sự, 2004) Cơ chế kháng ñã ñược giải thích bằng tiêm virus trên mô lá của giống cà chua TY172 và giống mẫn cảm, sau ñó so sánh lượng ssDNA và dsDNA virus sinh ra tại vị trí tiêm theo thời gian Số lượng DNA virus có mặt ở các vị trí lây nhiễm ñược ñánh giá theo thời gian, DNA virus ñã ñược tìm thấy tại nhiều thời ñiểm, số lượng ssDNA virus trong các giống kháng bệnh thấp hơn ở các giống mẫn cảm Tuy nhiên, những thay ñổi về số lượng ssDNA virus ñược phát hiện theo thời gian không song hành với những thay ñổi về số lượng dsDNA virus phát hiện trong các mô tương ứng dsDNA virus tích lũy trong cả ký chủ kháng và mẫn cảm tại tất

cả các thời ñiểm kiểm tra Hơn nữa, số lượng dsDNA virus phát hiện thấp hơn nhiều so với số lượng ssDNA virus trong cả ký chủ kháng và mẫn cảm, ñiều này là phù hợp với vai trò của dsDNA virus như một dạng trung gian của ssDNA trong sao

chép ở begomovirus dsDNA rất cần thiết khi begomovirus xâm nhập vào các tế bào

thực vật, ssDNA virus ñóng vai trò như khuôn ñể tổng hợp dạng trung gian dsDNA Trong giai ñoạn thứ hai của chu kỳ sao chép, dsDNA vừa ñược tổng hợp lại vừa là khuôn ñể tổng hợp ssDNA virus mới, thông qua cơ chế vòng lăn (Gutierrez, 1999; Hanley-Bowdoin và cộng sự, 1999)

2.4 Nghiên cứu chọn tạo giống cà chua chín chậm

2.4.1 Quá trình chín của quả cà chua

Quá trình chín của quả là một quá trình phức tạp liên quan ñến cơ chế phối hợp của rất nhiều con ñường trao ñổi chất, có ảnh hưởng ñến màu sắc, khẩu vị, hương vị và kết cấu của quả Nhiều ñặc tính trong số các ñặc tính này giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng và giá trị mỹ quan, do ñó thúc ñẩy tiêu dùng cũng như thúc ñẩy

sự phát tán hạt giống trong tự nhiên (SA và HJ, 2006 ; Y và cộng sự, 2004 )

Trong quá trình chín, cà chua phải trải qua 6 giai ñoạn Ở giai ñoạn 1USDA, chất keo bao quanh hạt ñược hình thành, quả chưa hiện màu, nếu ñem thúc chín thì quả có màu sắc ñặc trưng của giống ðến giai ñoạn 2USDA, ñỉnh quả xuất hiện

màu vàng hoặc màu hồng với khoảng 10% diện tích bề mặt Tiếp ñến giai ñoạn 3USDA, lúc này khoảng 10 – 30% diện tích bề mặt quả có màu vàng hoặc ñỏ Ở giai ñoạn 4USDA, khoảng 30 – 60% diện tích bề mặt quả có màu hồng nhạt hoặc vàng Giai ñoạn 5USDA, khoảng 60 – 90% diện tích bề mặt quả có màu vàng hoặc

ñỏ Cuối cùng là giai ñoạn 6USDA, ở quả cà chua lúc này trên 90% diện tích bề mặt

có màu ñỏ hoặc màu sắc ñặc trưng của giống (USDA, 1991)

2.4.2 Ethylene và vai trò trong quá trình chín của quả

Ethylene là một phytohormone quan trọng ñiều khiển một loạt các quá trình sinh lý trong cây, bao gồm quá trình già hóa, hiện tượng rụng hoa và quá trình chín của quả (FB và cộng sự, 1992); (LelievreJM và cộng sự, 1997) Ethylene ñược tổng hợp trong tất cả các tế bào và các mô nhưng nhiều nhất là các mô già, ñặc biệt là trong quả ñang chín và ñược vận chuyển bằng phương thức khuyếch tán Khi quả bắt ñầu chín, sự tổng hợp ethylene trong quả tăng lên rất nhanh, ñạt cực ñại lúc quả chín hoàn toàn sau ñó giảm ñi nhanh chóng Sự có mặt của ethylene làm biến ñổi tính thấm của màng dẫn ñến sự giải phóng các enzyme gây nên những biến ñổi sinh hóa có liên quan ñến quá trình chín (các enzyme biến ñổi hô hấp, biến ñổi ñộ chua,

ñộ cứng quả, ) ñồng thời kích thích hình thành các enzyme mới trong quá trình hô hấp bột phát và gây nên những biến ñổi sinh hóa gắn liền với sự chín

Hình 2.5 Tác ñộng của LeMADS-RIN ñến quá trình sinh tổng hợp ethylen

(Zhou và cộng sự, 2012)

Ethylene có cấu trúc ñơn giản, ñược tạo thành từ nhiều loại tiền chất khác nhau như linoleic acid, propanal, β – alanine và methionine Lieberman và

Mapson cho rằng methionine là tiền chất của ethylene và ethylene bắt nguồn từ C3 và C4 methionine Ethylene ñược tổng hợp từ methionine thông qua 3 phản ứng quan trọng: [1] chuyển ñổi methionine tạo thành S-adenosyl-L-methionine xúc tác bởi enzyme SAM synthetase, [2] sự hình thành 1 - aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) từ SAM thông qua hoạt ñộng của ACC synthase (ACS),

và [3] sự phân giải ACC ñược xúc tác bởi ACC oxidase (ACO) và giải phóng ethylene (SF và NE, 1984)

Theo Zhou và cộng sự (2012), LeMADS-RIN có thể ảnh hưởng ñến việc tạo

thành ACC synthase và ACC oxidase do ñó nó ñiều tiết quá trình sinh tổng hợp ethylene ACC synthase và ACC oxidase ñược mã hóa bởi một họ gene trong cà

chua (TI và A, 1994), trong ñó LeACS2, LeACS4 và LeACO1 cần thiết cho toàn bộ

quá trình chín của quả cà chua (Barry và cộng sự, 2000) Cũng theo Bary và cộng

sự (2000), sự duy trì quá trình sản xuất ethylene khi quả chín ñược cảm ứng phụ

thuộc vào hoạt ñộng của LeACS2 mà gen LeMADS-RIN lại kiểm soát sự ñiều hòa phiên mã của nó (Ito và cộng sự, 2008) Bên cạnh ñó, LeMADS-RIN còn tác ñộng trực tiếp ñến LeSPL-CNR và LeHB1 ñể ñiều khiển quá trình chín của quả LeMADS-

RIN tác ñộng tích cực (+) ñến sự phiên mã của LeSPL-CNR, mà gen này có thể trực

tiếp hoặc gián tiếp tham gia kiểm soát sinh tổng hợp ethylene Trong khi ñó,

LeMADS-RIN lại ảnh hưởng tiêu cực (Wilkinson và cộng sự) ñến sự biểu hiện mức

ñộ phiên mã của LeHB1 LeHB1 về sau sẽ trực tiếp ñiều chỉnh biểu hiện của gen

LeACO và ảnh hưởng ñến việc tạo thành ethylene trong quá trình chín của quả (hình

2,5) (Zhou và cộng sự, 2012)

Ethylene ñược cảm ứng bởi các thụ thể và tín hiệu của nó ñược vận chuyển

ñể kích hoạt các phản ứng sinh học cụ thể (Wang và cộng sự, 2002) Các nghiên cứu cho thấy cà chua có 5 loại receptor: LeETR1, LeETR2 (Lashbrook và cộng sự, 1998), NR (LeETR3) (Wilkinson và cộng sự, 1995); (Payton và cộng sự, 1996), LeETR4 (Tieman et al, 2000) và LeETR5 (Tieman và cộng sự, 1999) Trong ñó,

NR và LeETR4 ñiều khiển suốt quá trình chín của quả (Tieman và cộng sự, 2000)

Sự biểu hiện của các receptor này phụ thuộc vào từng giai ñoạn sinh trưởng, phát triển của quả và sự tác ñộng từ môi trường bên ngoài

2.4.3 Các dạng ñột biến chín chậm ở cà chua

2.4.3.1 ðột biến ức chế sự chín rin (ripening inhibitor)

Ở thực vật, mỗi loài ñều có chứa các gen mã hóa cho các yếu tố sao mã, ñiều khiển quá trình ra hoa và chín của quả ñược gọi là MADS-box transcription factor

Theo nghiên cứu của Vrebalov (2002) ñã phát hiện ra rằng gen rin là một gen nằm trong hộp gen này Cũng theo nghiên cứu này gen rin ñược ñịnh vị trên NST số 5

thông qua nhân dòng bằng YAC ñể tạo mẫu dò là ñoạn ADN tên là Yrin9L (365kb)

(hình 2,6) Sự biểu hiện của rin là do tác ñộng của 2 locus kiểm soát sự chín và ñiều

khiển sự phát triển của ñài hoa Nhóm nghiên cứu ñã chỉ ra rằng C34 và C43 ñều là thành viên của gia ñình MADS-box và ñược gọi là tên tương ứng LeMADS-RIN và

LeMADS-MC Trong ñó, LeMADS-RIN quyết ñịnh ñến khả năng hô hấp bột phát

và tăng sinh tổng hợp ethylene, tác ñộng ñến quá trình chín của quả, còn

LeMADS-MC có ảnh hưởng ñến sự hữu hạn của chùm hoa và sự phát triển của lá ñài

Dựa vào trình tự cDNA của gen RIN và MC ñã xác ñịnh ñược gen RIN gồm

9 exon và 8 intron Dạng ñột biến rin xuất hiện do ñột biến mất ñoạn, làm mất một vùng DNA khoảng 2,6 kb bắt ñầu tại một ñiểm ở intron thứ 8 của gen RIN và kết thúc ở vùng intron ñầu tiên của gen MC (James và cộng sự, 2004) Ở những quả cà chua mang ñột biến rin và mc xuất hiện các tính trạng ñặc trưng ðột biến rin là

nguyên nhân gây ức chế quá trình sinh tổng hợp ethylene làm ức chế quá trình chín

của quả, còn ñột biến mc gây ra sự vô hạn của chùm hoa và tăng kích thước của lá

ñài (Vrebalov và cộng sự, 2002)

Năm 1993, Picton và cộng sự ñã nhân dòng các cDNA liên kết với dạng ñột biến rin và phát hiện ñược một loạt các ERT: ERT1, ERT10, và ERT15 là các

cDNA có phản ứng sinh mARN trong quá trình chín của dạng ñột biến này Khi xử

lý dạng ñột biến rin với ethylene thì 1 phần các gen này ñược sao mã, chứng tỏ

dạng ñột biến này vẫn có khả năng phản ứng với ethylene ngoại sinh (Lincoln và Fischer, 1988; Knapp và cộng sự, 1989) Theo Zdravkovic và cộng sự ( 2004.), sau

khi xử lý ñột biến rin với 0,1 % ethylene thì quả không mang gen rin (+/+) chín ñồng ñều, quá trình chín nhanh hơn, trong khi ở con lai F1 (rin/+), quá chín diễn ra

từ từ Màu sắc các quả ñồng hợp tử (rin/rin) không có sự thay ñổi, nhưng quá trình

quả chín nhanh hơn so với ñối chứng Như vậy, ñột biến rin có khả năng ñáp ứng

với ethylene ngoại sinh

Giống cà chua chín chậm F1 ñầu tiên trên thế giới là giống “Juliette” (Nguyen, 1994) và “Red Centre” (Nguyen, 1991) ñã cho thấy thành công của việc

sử dụng ñột biến rin trong sự làm chậm quá trình chín và cải thiện tính tồn trữ của

cà chua Năm 2011, tác giả Marković ñã sử dụng ñột biến rin ñể tạo ra các giống lai

F1 mới: Nada, Sampion, SEF, Sidra và Rebus Các giống lai F1 này ñều có thời gian tồn trữ (18 30 ngày) dài hơn so với các giống F1 thương mại không chứa gene

rin như Balkan và Marco (5 -8 ngày) Quả của giống F1 chứa rin có thời gian tồn

trữ dài, ñộ cứng cao, màu sắc và hương vị tương ñối tốt, khối lượng trung bình quả khoảng 190 - 220g, kháng bệnh tốt (Markovic và cộng sự, 2011)

2.4.3.2 Dạng ñột biến nor (non-ripening)

Dạng ñột biến nor biểu hiện tương tự như dạng ñột biến rin và gen Nor cũng

mã hóa yếu tố giả ñịnh phiên mã nhưng với chức năng không ñặc trưng Gen Nor

nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 10, gần chỉ thị TG395 và CT16, có yếu tố

phiên mã là NAC Gen Nor khi bị ñột biến mất 2 bp sẽ trở thành dạng ñột biến nor (hình 2,7) (J và cộng sự, 2004) Dạng ñột biến này làm cho quả chín rất chậm, khi

chín quả cà chua không có sắc tố màu, không bị mềm và tăng khả năng chống nứt quả (Garg và cộng sự, 2008; Cantu và cộng sự, 2009)

Hình 2.6 Bản ñồ di truyền và vị trí

của gen rin trên NST số 5

Hình 2.7 Bản ñồ di truyền và vị trí của gen nor trên NST số 10

Rodriguez và cộng sự (2010) ñã sử dụng ñột biến nor ñể tạo ra con lai F1

nor × ‘Ce’ Con lai F1 có thời gian tồn trữ là 64,1 ngày, dài hơn nhiều so với

dòng bố bình thường là “Ce” không mang gen nor (chỉ ñạt 23,9 ngày), thậm chí còn dài hơn dòng mẹ mang gen nor ñồng hợp tử (ñạt 52,1 ngày) Như vậy, dạng

ñột biến này có hiệu quả làm chậm quá trình chín và kéo dài thời gian bảo quản quả rất tốt ở dạng di hợp tử

2.4.3.3 Dạng ñột biến Nr (Never ripe)

ðột biến Nr ñược phát hiện từ rất sớm (Rick và cộng sự, 1956) ðây là một

dạng ñột biến bán trội xảy ra tại một trong các receptor cảm ứng với ethylene

(Lanahan và cộng sự, 1994; Wilkinson và cộng sự, 1995) Dạng ñột biến Nr ñược

sử dụng trong nhiều nghiên cứu về vai trò của ethylene trong các giai ñoạn phát triển khác nhau (Aloni và cộng sự, 1998; Hansen và Grossmann, 2000), nghiên cứu biểu hiện của gene (Nakatsuka và cộng sự, 1998; Rose và cộng sự, 1997) và khả

năng kháng stress (Ciardi và cộng sự, 2000) Khi gen Nr ở cà chua bình thường bị

ñột biến trên DNA thay C bằng T làm thay ñổi acid amin proline bằng acid amin

leucine tại vị trí 441 trong vùng cảm ứng của receptor ETR1 sẽ dẫn ñến sự xuất hiện

cà chua mang ñột biến Nr (Morris, 1998)

Hình 2.8 Thời gian tồn trữ dài của con lai alc × ‘Vaibhav’ so với các dòng bố mẹ

ở 25 o C (Yogendra và Ramanjini, 2013)

ðột biến Nr ức chế quá trình chín của quả liên quan ñến tính bất thụ cảm ethylene tại các vị trí thụ thể tiếp nhận Kiểu hình ñột biến Nr và kiểu dại ñược

phân biệt nhờ sự phát triển của cánh hoa Thông thường, hiện tượng rụng cánh hoa sẽ xảy ra sau 4 – 5 ngày hoa nở và quả phát triển, nếu không có sự thụ tinh

thì cuống hoa sẽ rụng 5 – 8 ngày sau ñó Nhưng ở dạng ñột biến Nr, khi hoa

không ñược thụ tinh thì cánh hoa vẫn có thể tồn tại và phát triển cùng với cây (Lanahan và cộng sự, 1994)

2.4.3.4 Dạng ñột biến chín chậm alc (alcobaca)

Quả mang ñột biến alc có ñộ cứng cao và bảo quản ñược trong thời gian khá

dài Kopeliovitch và cộng sự (1981) nhận thấy màu sắc quả chín hoàn toàn có sự khác nhau khi thu hái ở các giai ñoạn sinh trưởng khác nhau Quả cà chua ñột biến

alc và quả cà chua bình thường không có sự khác biệt lớn về ñộ cứng quả ban ñầu,

mà tốc ñộ mềm và chín của quả ở dạng ñột biến chậm hơn rất nhiều so với ñối

chứng (Mutschler, 1984b) ðột biến alc tác ñộng ñến quá trình tổng hợp sắc tố theo

hướng giảm sự tạo thành tổng thể các sắc tố và giảm tỷ lệ lycopene/β-carotene Ngoài ra, nó cũng gây giảm hàm lượng và hoạt tính của enzyme polygalacturonase

trong quả mang gen alc ñồng hợp tử (Mutschler, 1984a; Mutschler và cộng sự,

1988) Theo nghiên cứu của Yogendra và Gowda (2013), thời gian tồn trữ của quả

mang ñột biến alc ñồng hợp tử là 45 ngày dài hơn so với các dạng ñột biến ñồng hợp tử khác như rin (38 ngày) và nor (38,5 ngày)

Yogendra và Gowda (2013) cũng tiến hành tạo giống lai F1 giữa alc và giống Ấn ðộ ‘Vaibhav’ Kết quả nghiên cứu cho thấy giống lai F1(alc × ‘Vaibhav’)

có thời gian tồn trữ quả trung bình là 40,5 ngày trong khi giống ‘Vaibhav’ chỉ tồn trữ ñược 18,5 ngày (hình 2.8)

Bên cạnh các dạng ñột biến gây nên tính chín chậm rin, nor, alc và Nr ñã

ñược khai thác và sử dụng trong công tác chọn tạo giống cà chua chín chậm, vẫn

còn một số dạng ñột biến khác như Cnr, Gr và Nr-2 mới ñược phát hiện Hiện nay, dạng ñột biến rin ñược sử dụng phổ biến nhất ở nhiều nước ñể tạo ra các giống cà

chua có thời gian tồn trữ dài và ñộ cứng quả và năng suất cao, màu sắc và chất lượng quả ñẹp

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

– 28 tổ hợp cà chua lai chứa gen chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá ñược cung cấp từ trường ðại học University of California Davis.(bảng 3.1), trong

ñó:

+ 20 tổ hợp cà chua lai kháng virus xoăn vàng lá với gen kháng Ty3 từ

dòng bố 192 (kiểu gen Ty3/Ty3)

+ 8 tổ hợp cà chua lai chín chậm với gen chín chậm rin từ dòng bố 176

(kiểu gen rin/rin)

– Các quần thể F2 của các tổ hợp lai F1 triển vọng

– ðối chứng là giống cà chua F1 Savior (công ty Syngenta)

3.1.2 địa ựiểm và thời gian nghiên cứu

Ờ Các nghiên cứu ựược thực hiện tại phòng nghiên cứu bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ Sinh học Ứng dụng và Trung tâm bảo tồn và Phát triển nguồn gen Cây trồng, Trường đại học nông nghiệp Hà Nội

Ờ Thời gian thực hiện: từ tháng 9/2012 ựến 6/2013

3.2 Nội dung nghiên cứu

Ờ đánh giá một số ựặc ựiểm nông sinh học chắnh, năng suất, chất lượng quả của các tổ hợp lai trong vụ ựông 2012 ựể chọn ra các tổ hợp lai triển vọng

Ờ Ghép lây nhiễm ựánh giá khả năng kháng virus xoăn vàng lá của các tổ hợp triển vọng trong vụ xuân hè 2013

Ờ Kiểm tra di truyền kiểu gen chắn chậm và kháng virus xoăn vàng lá ở các con lai F1 bằng chỉ thị DNA

Ờ Sử dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc các cá thể tốt mang gen kháng

virus xoăn vàng lá Ty3 ở một số quần thể F2 triển vọng trong vụ xuân hè 2013

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp ựánh giá các ựặc ựiểm nông sinh học, năng suất, chất lượng quả

a/ Bố trắ thắ nghiệm

- Thắ nghiệm ựược bố trắ theo kiểu khảo sát tuần tự không nhắc lại, mỗi THL trồng 25 cây

- Khoảng cách, mật ựộ: hàng x cây = 70 x 50 cm, mật ựộ khoảng 2,67 vạn cây/ha

- Thời vụ: Các thắ nghiệm ựược bố trắ trong vụ thu ựông từ tháng 9/2012 ựến tháng 1/2013

- Kỹ thuật trồng, chăm sóc:

Giai ựoạn vườn ươm: hạt giống ựược gieo trên giá thể gồm trấu hun và ựất

bột theo tỷ lệ 1:1 Hạt ựược gieo trong khay bầu, tưới phun mù ựủ ẩm, ựặt trong nhà

có mái che Hằng ngày chăm sóc, tưới nước và giữ ẩm cho cây Khi cây con ựược 5-6 lá (sau khi gieo hạt 30 ngày) thì trồng

Giai ựoạn trồng ở ruộng sản xuất:

+ Lượng phân bón cho 1 ha: 90kg N, 95kg P O 110kg K O Bón lót toàn bộ

phân lân, 1/3 phân ựạm và 1/3 kali Lượng ựạm và kali còn lại chia ựều bón thúc vào 3 lần xới vun

+ Tưới nước: sau khi trồng cần tưới nước giữ ẩm cho ựất ựạt 75% ựộ ẩm ựồng ruộng

+ Vun xới, làm cỏ: vun xới lần 1 sau trồng 30 ngày, lần 2 khi sau trồng 60 ngày, lần 3 sau trồng 80 ngày Thường xuyên nhổ bỏ cỏ dại

+ Làm giàn khi cây cao 30 - 40 cm theo hình chữ A

+ Tỉa cành: tỉa bỏ cành phụ, chỉ ựể lại 2 thân chắnh/cây

+ Phòng trừ sâu bệnh hại: theo dõi và phòng trừ bệnh xoăn vàng lá, mốc sương, héo xanh vi khuẩn bằng thuốc Daconil, Zinep; phòng trừ sâu cắt lá, sâu xám, sâu vẽ bùa, sâu xanh, sâu ựục quả bằng thuốc Sherpa

+ Thu hoạch khi quả bắt ựầu chuyển màu (bắt ựầu chắn), số lần thu căn cứ vào ựặc ựiểm chắn của giống

b/ đánh giá một số ựặc ựiểm nông sinh học và năng suất, chất lượng quả:

theo TCN 219-2006 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Các chỉ tiêu theo dõi gồm:

- Thời gian từ trồng ựến ra hoa: ựược tắnh khi có 50% số cây trên ô ra hoa ựầu

- Thời gian từ trồng ựến thu quả ựợt 1: khi khoảng 50% số cây có quả chắn

- Thời gian từ trồng ựến kết thúc thu hoạch: tắnh ựến ngày thu hết quả thương phẩm

- Số ựốt từ gốc ựến chùm hoa thứ nhất

- Chiều cao từ gốc ựến chùm hoa thứ nhất

- Chiều cao cây: ựược tắnh từ gốc tới ựỉnh ngọn thân chắnh

- Dạng hình sinh trưởng: gồm dạng hữu hạn, bán hữu hạn và vô hạn

- Màu sắc lá: xanh nhạt, xanh và Xđ, quan sát mặt trên của phiến lá vào giai ựoạn thu chùm quả thứ 2 - 3

- Hình dạng lá: quan sát vào thời kì thu hoạch lứa quả thứ 2 Ờ 3, gồm 6 dạng ựược mô tả trong hình 4.1

- đặc ựiểm nở hoa: tập trung hoặc rải rác

- Kiểu chùm hoa: kiểu ựơn giản (chỉ có 1 trục chắnh, hoa mọc so le trên trục