tóm tắt luận án nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá chẽm con (lates calcarifer bloch, 1790) đối với vi khuẩn streptococcus iniae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN VĨ HÍCH NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ CHẼM CON Lates calcarifer Bloch 1790 ĐỐI VỚI VI KHUẨN Streptococcus iniae TÓM TẮT LU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

TRẦN VĨ HÍCH

NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ

CHẼM CON (Lates calcarifer Bloch 1790) ĐỐI VỚI

VI KHUẨN Streptococcus iniae

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Nha Trang - 2014

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha Trang

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hữu Dũng

vào hồi … giờ … ngày …… tháng …… năm 2014

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện Quốc gia Thư viện trường Đại học Nha Trang

Vaccine được thừa nhận là giải pháp tốt nhất trong việc phòng

bệnh do S iniae gây ra và hiện tại, một số vaccine phòng bệnh do S

iniae gây ra đã có trên thị trường Thế nhưng thời gian bảo hộ của

vaccine thay đổi tùy thuộc vào thành phần vaccine, phương thức dẫn truyền vaccine…trong khi những thay đổi mạnh mẽ của vi khuẩn này nhằm thích nghi với môi trường đòi hỏi các nghiên cứu nhằm tạo ra các loại vaccine có hiệu lực cao vẫn phải được tiếp tục

Hơn nữa, hiệu quả bảo vệ của vaccine cũng phụ thuộc vào khả năng tiếp nhận vaccine của từng loài cá, tuổi cá… trong lúc có quá ít

thông tin về đáp ứng miễn dịch của cá chẽm chống lại bệnh do S iniae

gây ra và hầu như không có thông tin về sự phát sinh và phát triển của

hệ thống miễn dịch cá chẽm Vì thế cần phải có nhiều nghiên cứu về các vấn đề nêu trên làm cơ sở cho việc xây dựng các biện pháp phòng bệnh sớm cho cá chẽm dựa trên các phương pháp miễn dịch

Từ thực tiễn nêu trên, đề tài: ”Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch

của cá chẽm con (Lates calcarifer Bloch 1790) đối với vi khuẩn

Streptococcus iniae” được thực hiện

Mục tiêu của đề tài:

Cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng các biện pháp phòng bệnh sớm cho cá chẽm bằng phương pháp miễn dịch học

Các nội dung chính của đề tài:

1 Nghiên cứu đặc điểm của các chủng vi khuẩn S iniae phân lập

từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa

2 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi

khuẩn S iniae

3 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S iniae

4 Đánh giá hiệu quả của việc sử dụng vi khuẩn bất hoạt trong

phòng bệnh do S iniae gây ra ở cá chẽm

5 Nghiên cứu sự hình thành và phát triển tuyến ức của cá chẽm

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu này đã bổ sung các hiểu biết về hệ

miễn dịch và đáp ứng miễn dịch của cá chẽm (Lates calcarifer) bao

gồm sự phát triển hoàn thiện của tuyến ức, cơ quan lympho trung ương đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu; đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thể hiện qua hoạt tính của đại thực bào

và lysozyme; và đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu khi bị hoạt hóa

bởi kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus iniae

Ý nghĩa thực tiễn: Các kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở

khoa học cho việc nghiên cứu ứng dụng các biện pháp miễn dịch học nhằm phòng bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá chẽm nuôi tại Việt Nam bao gồm việc sử dụng các chế phẩm kích ứng miễn dịch không đặc hiệu (immunostimulants) và liệu pháp vaccine, góp phần phát triển nghề nuôi cá chẽm tại Việt Nam theo hướng bền vững, an toàn, giảm thiểu rủi ro, giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường do việc sử dụng kháng sinh và hóa chất để phòng trị bệnh cho cá

Tính mới của công trình: Đây là công bố đầu tiên về hệ miễn

dịch của cá chẽm và các đáp ứng miễn dịch của cá chẽm tại Việt Nam Đồng thời, đây cũng là công bố đầu tiên trên thế giới về sự phát triển

hoàn thiện của tuyến ức của cá chẽm (Lates calcarifer) được thực hiện

và Lymbery (2008), Patel và cs (2009), Schipp và cs (2007), Tucker

và cs (1990)…

1.2 BỆNH DO S iniae TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Bệnh do S iniae gây ra ở các loài cá nuôi đang có chiều hướng gia

tăng và gây ra những thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi trồng thủy sản thế giới Tình hình dịch bệnh do vi khuẩn này gây ra ở cá nuôi tại các quốc gia như: Nhật, Úc, Singapore, Mỹ, Israel, Bahrain, Ấn Độ đã được tổng hợp từ các công bố của Berridge và Frelier (1998), Bromage và Owens (2002), Colorni và cs (2002), Eldar và cs (1994), Kaige và cs (1984), Kusuda và cs (1976), Minami và cs (1979), Mukhi và cs (2001), Ohnishi và Jo (1981), Pier và Madin (1976), Sugita (1996)…

Các đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn S iniae, dấu hiệu bệnh lý và phương pháp phòng trị bệnh do S iniae gây ra đã

được tổng hợp từ các nghiên cứu của Bromage và Owens (2002), Colorni và cs (2002), Crosbie và Nowak (2004), Eldar và Ghittino

(1999), Kusuda và cs (1976), Perera và cs (1994), Park và cs (2009), Stoffregen và cs (1996)…

cs (2005), Xie và cs (2006), Patel và cs (2009)…Các công bố đã cho thấy rằng các nghiên cứu về hệ thống miễn dịch ở cá xương xảy ra ở nhiều đối tượng nuôi và vẫn còn nhiều cơ chế đáp ứng vẫn chưa được làm rõ Tuy vậy, nhìn chung, hệ thống miễn dịch của cá xương khá phát triển với sự hiện diện của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với nhiều chức năng tương tự như hệ miễn dịch động vật có xương sống bậc cao Điều này cho phép cá đáp ứng tốt với việc sử dụng vaccine trong phòng bệnh

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 10/2008 đến tháng 8/2012 tại phòng thí nghiệm Bệnh học, Trung tâm nghiên cứu Giống và Dịch bệnh Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang và phòng thí nghiệm khoa Sinh học Trường Đại học Bergen, Nauy

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Cá chẽm Lates calcarifer (Bloch, 1790) kích cỡ dưới 155 gam

Vi khuẩn Streptococcus iniae

2.3 SƠ ĐỒ KHỐI NỘI DUNG NGHIÊN CỨU (hình 2.1)

2.4 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH CÁC NGHIÊN CỨU

2.4.1 Nghiên cứu đặc điểm của các chủng vi khuẩn S iniae phân

lập từ cá chẽm

2.4.1.1 Phân lập vi khuẩn S iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa

Vi khuẩn được phân lập từ não, thận và lách của cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa trên môi trường TSA bổ sung 1,5% NaCl và KF ở 28oC trong 24h Việc định danh các chủng vi khuẩn phân lập được dựa theo

hệ thống định danh vi khuẩn của Bergey kết hợp so sánh trình tự 16S rDNA với ngân hàng gene có sẵn trên NCBI

FKC

2.4.1.2 Xác định độc lực của vi khuẩn phân lập

Ba chủng vi khuẩn VN091211R, CR090722P và NH081107P được lựa chọn để xác định độc lực Thí nghiệm xác định liều gây chết 50% (LD50) của mỗi chủng vi khuẩn được tiến hành với 7 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức bao gồm 20 cá chẽm Trong đó tất cả cá chẽm

ở 6 nghiệm thức thí nghiệm được tiêm 0,2 mL dung dịch huyền phù

vào xoang bụng với mật độ vi khuẩn trong dịch huyền phù tăng dần từ

102 CFU/mL ở nghiệm thức 1 cho đến 107 CFU/mL ở nghiệm thức 6

Ở nghiệm thức đối chứng, cá được tiêm 0,2 mL PSB vào xoang bụng Liều gây chết 50% được xác định dựa vào phân tích tỉ lệ cá chết tích lũy ở các nghiệm thức trên phần mềm probit, SPSS

2.4.1.3 Độ nhạy kháng sinh của các chủng S iniae phân lập

Độ nhạy của các chủng vi khuẩn phân lập với các loại kháng sinh được tiến hành theo phương pháp của Bauer (1966)

2.4.1.4 Phương thức xâm nhiễm của vi khuẩn S iniae vào cá chẽm

Ngâm cá chẽm (1,3 ± 0,2g) vào dung dịch nước biển chứa vi

khuẩn S iniae VN091211R (107CFU/mL) trong 1h Sau đó nuôi cá trong nước biển sạch Tiến hành thu mẫu ngẫu nhiên 3 cá thể vào các thời điểm 6, 12, 24, 48 và 72h sau khi cho cá vào bể nuôi Cố định các mẫu gan, thận, lách, não, mắt và ruột cá trong dung dịch Buffered Formalin 10% trong 24 Sử dụng kỹ thuật mô hóa miễn dịch để phát

hiện S iniae trong các tổ chức mô học của cá thí nghiệm

2.4.1.5 Tính tương đồng về kháng nguyên của các chủng phân lập

Tính tương đồng về kháng nguyên của các chủng vi khuẩn phân lập được xác định bằng khả năng ngưng kết của huyết thanh cá chẽm (Plumb and Areechon 1990) sau khi được kích thích miễn dịch bằng

FKC của một chủng vi khuẩn S iniae, với chính chủng vi khuẩn đó và với các chủng S iniae khác

2.4.2 Đáp ứng miễn dịch của các chẽm đối với vi khuẩn S iniae

2.4.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với S iniae và ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng này

Thí nghiệm được tiến hành với 3 nghiệm thức (80 cá/nghiệm thức) Ở nghiệm thức 1 và 2, cá được cho ăn thức ăn viên trong khi ở nghiệm thức 3 cá được cho ăn thức ăn tương tự có bổ sung 5‰ β-

glucan liên tục trong 2 tuần Sau 2 tuần nuôi, toàn bộ cá thí nghiệm ở

nghiệm thức 2 và 3 được tiêm dịch huyền phù vi khuẩn S iniae bất

hoạt (108CFU/mL) vào xoang bụng với lượng 0,3 mL/cá

Các mẫu máu và tiền thận của ba nhóm cá thí nghiệm được thu ngay trước khi tiêm vi khuẩn bất hoạt và mỗi 12h sau khi tiêm, liên tục trong 96h Chỉ số thực bào, hoạt tính thực bào của đại thực bào, hoạt tính lysozyme và khả năng ức chế vi khuẩn của huyết thanh cá chẽm được xác định theo phương pháp của các tác giả Crosbie và Nowak (2004), Shugar (1952)

2.4.2.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S iniae bất hoạt bằng formalin (Formalin Killed Cell - FKC)

i Biến động hàm lượng kháng thể trong huyết thanh cá chẽm sau khi gây miễn dịch bằng FKC

Thí nghiệm nghiên cứu biến động hàm lượng kháng thể đặc hiệu

kháng S iniae ở huyết thanh của cá chẽm được tiến hành với 2 nghiệm thức Nghiệm thức 1 cá được tiêm dịch huyền phù vi khuẩn S

thức 2, mỗi cá được tiêm 0,3 mL PBS vào xoang bụng Hàm lượng

kháng thể đặc hiệu kháng S iniae trong máu cá thí nghiệm kiểm tra

bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp theo phương pháp của Crowther (1995)

ii Thành phần protein kháng nguyên của vi khuẩn S iniae

Thành phần protein kháng nguyên của vi khuẩn S iniae được xác

định bằng kỹ thuật SDS-PAGE (Laemli, 1970) và Western blot (Shoemarker và các cộng sự, 2010)

iii Hiệu quả bảo vệ của FKC đối với bệnh do S iniae gây ra ở cá chẽm

Hiệu quả bảo vệ của FKC đối với bệnh do S iniae gây ra ở cá

chẽm được đánh giá thông qua tính an toàn đối với cá chẽm của hỗn dịch vi khuẩn bất hoạt và hệ số bảo vệ tương đối (RPP)

Cá chẽm (135 - 155g) được chia thành 2 nhóm: nhóm 1, cá được gây miễn dịch bằng cách tiêm FKC vào xoang bụng với liều lượng 0,3 mL/con và ở nhóm đối chứng, cá được tiêm PBS (0,3 mL/con) Cá tiêm FKC và cá đối chứng được nuôi dưỡng riêng biệt trong 2 bể composite dung tích 2 m3 với cùng điều kiện bể nuôi (25 - 30‰, 28°C

 2°C) và chế độ chăm sóc như nhau Sau 4 tuần tất cả cá thí nghiệm được tiêm nhắc lại giống như lần tiêm đầu tiên

Việc công cường độc để xác định hiệu quả bảo vệ của vi khuẩn bất hoạt được tiến hành ở ngày thứ 60 sau khi gây miễn dịch cho cá Thí nghiệm được tiến hành với 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm

Tỉ lệ chết tích lũy ở cá tiêm FKC

RPP = 1 - - x 100 (%)

Tỉ lệ cá chết tích lũy ở cá tiêm nước muối sinh lý

2.4.5 Sự hình thành và phát triển tuyến ức của cá chẽm

Cá chẽm mới nở được thu mẫu từ các bể ương nuôi cá bột theo định kỳ 12h một lần cho đến khi cá đạt 40 ngày tuổi Sử dụng phương pháp mô học để quan sát sự hình thành và phát triển của tuyến ức tương ứng với tuổi cá

2.4.6 Phương pháp phân tích số liệu

Các số liệu thu thập từ các thí nghiệm được xử lý thống kê dựa trên phần mềm SPSS 19.0 và microsoft excel 2003

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN

Streptococcus iniae PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM

3.1.1 Phân lập vi khuẩn S iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa

3.1.1.1 Tình hình dịch bệnh do S iniae gây ra ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa

Kết quả phân tích 104 đàn cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa đã khẳng

định sự có mặt của vi khuẩn S iniae ở cá chẽm tại các vùng nuôi cá

trọng điểm của Khánh Hòa

Ngoài 2 đàn cá chẽm nuôi ở Cam Ranh, tỉ lệ cá chết hàng ngày

trong giai đoạn mắc nhiễm S iniae biến động trong khoảng 0,1–0,3%

lượng cá nuôi (bảng 3.1) Biểu hiện bệnh lý của những cá chẽm nuôi

mắc nhiễm S iniae thường gặp là hiện tượng xuất huyết dưới da ở

vùng miệng, nắp mang, hậu môn hoặc ở thân cá, mắt cá mờ đục hoặc

lồi ra bên ngoài (hình 3.1a, 3.1b) Một số cá mắc nhiễm S iniae còn

biểu hiện dấu hiệu sưng thận hoặc xuất huyết ở gan (hình 3.1c, 3.1d)

3.1.1.2 Đặc điểm phân loại của các chủng vi khuẩn phân lập

Các chủng vi khuẩn phân lập được đều là liên cầu khuẩn Gram dương, dung huyết anpha hoặc beta, đường kính của khuẩn lạc, sau 24

- 48 giờ nuôi cấy trên môi trường BA, nhỏ hơn 1mm (hình 3.2)

Kết quả xác định các đặc điểm sinh hóa của những chủng vi khuẩn này bằng API 20STREP cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn

phân lập được đều là S iniae Cả 8 chủng đều có độ tương đồng di truyền 99-100% với trình tự của các chủng S iniae đã được công bố

trên NCBI với độ dài của đoạn gen được so sánh từ 405 – 478 bp

Bảng 3.2 Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm nuôi tại

Khánh Hòa so với chủng chuẩn tham chiếu S iniae ATCC 29178 (1: VN091211R; 2:

CR091016P; 3: NH081107P; 4: NH081011P; 5: VN091208R; 6: CR091122P; 7: NT090612C

và 8: CR090722P)

Sinh Catalase - - -

-Sinh Oxidase - - -

-Voges Proskauer - - -

-Haemolysis (5% sheep RBC) α/β α/β β β α/β α/β β β β Phát triển trên/trong môi trường Brain Heart Infusion Agar + + + + + + + + + Tryptic Soy Agar + + + + + + + + + Tryptic Soy Broth + + + + + + + + + Blood agar + + + + + + + + + Phát triển ở 10oC - - -

-27oC + + + + + + + + + 35oC + + + + + + + + + NaCl 6.5% - - -

-Hippurate (HIP) - - -

-Esculin (ESC) + + + + + + + + + Pyrrolidonyl acrylamidase + + + + + + + + + α-Galactosidase (α-GAL) - - -

-β-Glucuronidase (β-GUR) - - -

-β-Galactosidase (β-GAL) - - -

-Alkalin Phosphatase (PAL) - - -

-Leucine Aminopeptidase (LAP + + + + + + + + + L-arginie (ADH) - - + + - - + + +

D-ribose (RIB) + + + + + + + + + L-arabinose (ARA) - - -

-D-manitol (MAN) + + + + + + + + + D-sorbitol (SOR) - - -

-D-lactose (Tortoli et al., ) - - -

-D-trehalose (Sarabhai et al.,) + + - - - + +

Inulin (Shapiro et al., ) - - -

-D-raffinose (Ton-That et al.,) - - -

-Starch (2) (AMD) + + - - + + - - +

Glycogen (GLYG) - - -

3.1.2 Độc lực của vi khuẩn S iniae phân lập từ cá bệnh

Cá thí nghiệm bắt đầu chết từ 2-3 ngày sau khi tiêm S iniae vào

xoang bụng Số lượng cá chết tăng mạnh vào ngày thứ 5 sau đó giảm dần, đến ngày thứ 10 thì dừng hẳn Dấu hiệu bệnh lý của cá thí

nghiệm thể hiện tương tự như cá nhiễm S iniae ở ngoài tự nhiên Kết quả phân lập vi khuẩn từ cá thí nghiệm đã thu được vi khuẩn S iniae

thuần khiết ở não, gan và thận cá Không có bất kì hiện tượng chết nào xảy ra ở các nghiệm thức đối chứng (hình 3.3)

0 20 40 60 80 100 120

a

0 10 30 50 60 80 100

Hình 3.3 Tỉ lệ chết tích lũy ở các nhóm cá chẽm thí nghiệm sau khi tiêm S iniae vào xoang

bụng với các nồng độ khác nhau (a: chủng VN091211R; b: chủng NH081107P và c: chủng CR090722P)

Liều gây chết 50% (LD50) khi tiêm vi khuẩn VN091211R, CR090722P và NH081107P vào xoang bụng của cá chẽm kích thước

16 ± 2 gđược xác định lần lượt là 104,8, 105,8 và 105,6 CFU (hình 3.4)

3.1.3 Xác định độ nhạy của S iniae với các loại kháng sinh

Các chủng S iniae phân lập được nhạy cảm với norfloxacine,

ciproffloxacin, sulphamethoxazol/trimethoprim, ampicillin, erythromycin, doxycycline và amoxicyclin Tuy nhiên chúng cũng có khả năng kháng lại oxytetracycline, gentamycin, cephalexin và streptomycin (bảng 3.3)

3.1.4 Con đường cảm nhiễm của vi khuẩn S iniae vào cá chẽm

Kết quả gây nhiễm vi khuẩn S iniae cho cá chẽm bằng phương

pháp ngâm cho thấy mang cá là nơi xuất hiện vi khuẩn lần đầu tiên (bảng 3.4)