đa dạng di truyền vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng steinernema spp ở một số tỉnh bắc trung bộ

Hoàng Thị Bích*, Nguyễn Thị Phương, Phạm Ngọc Tuyên, Lê Thị Mai Linh, Phan Kế Long 2010, “Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của các chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh g

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG

ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN

TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG STEINERNEMA SPP

Ở MỘT SỐ TỈNH BẮC TRUNG BỘ

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội - 2010

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG

ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN

TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG STEINERNEMA SPP

Ở MỘT SỐ TỈNH BẮC TRUNG BỘ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHAN KẾ LONG

nghiên cứu viên Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, người đã tận tình chỉ bảo, hướng cho tôi những phương pháp luận hết sức căn bản nhưng vô cùng giá trị để tôi có những định hướng cho luận văn của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn Giám đốc Quỹ phát triển khoa học và công

nghệ quốc gia đã tạo mọi điều kiện về công việc, thời gian để cho tôi được tập trung vào khóa học và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn tới các anh, chị, em trong phòng Tuyến trùng học – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã giúp tôi rất nhiều trong quá trình làm luận văn

Tôi cũng xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, phòng Đào tạo và các thầy cô tại Cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nguyên cứu

Cuối cùng, tôi gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến: bố, mẹ, anh và con

gái Hà Chi bé bỏng đã luôn ở bên động viên, khuyến khích để tôi hoàn

thành luận văn này./

Tôi chân thành c ảm ơn sự giúp đỡ quí báu đó!

Hà N ội, ngày 24 tháng 12 năm 2010

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Phương

1 Hoàng Thị Bích*, Nguyễn Thị Phương, Phạm Ngọc Tuyên, Lê Thị Mai

Linh, Phan Kế Long (2010), “Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của các chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng

Steinernema sp TĐ3 phân lập từ Tam Đảo, Vĩnh Phúc, Tạp chí Dược Học (giấy nhận đăng)

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Entomopathogenic nematode - EPN 3

1.1.1 S ơ lược về tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng 3

1.1.2 Tuy ến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema 5

1.1.3 Tuy ến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Heterorhabditis 5

1.2 Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN 6

1.2.1 Gi ống Xenorhabdus 6

1.2.2 Gi ống Photorhabdus 7

1.2.3 S ự đa dạng của giống Xenorhabdus và Photorhabdus 7

1.3 Mối quan hệ giữa tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh 9

1.3.1 Vai trò c ủa tuyến trùng với vi khuẩn 9

1.3.2 Vai trò c ủa vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp nematode-bacterium 10

1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước. 11

1.4.1 Nh ững nghiên cứu trên thế giới 11

1.4.2 Nh ững nghiên cứu tại Việt Nam 14

1.4.3 Ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại trong việc nghiên cứu về vi khu ẩn 17

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu nghiên cứu. 19

2.1.1 Tuy ến trùng 19

2.1.2 Ấu trùng Bướm sáp lớn 20

2.2 Hóa chất và thiết bị 20

2.2.1 Hóa ch ất 20

2.2.2 Môi tr ường phân lập vi khuẩn cộng sinh 21

2.2.3 Trang thi ết bị 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Ph ương pháp xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL 22

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Gây nhiễm ấu trùng BSL 30

3.2 Phân lập vi khuẩn cộng sinh 30

3.3 Quan sát hình ảnh tế bào các chủng vi khuẩn cộng sinh 32

3.4 Đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Steinernema spp từ các tỉnh Bắc Trung Bộ 34

3.4.1 K ết quả khuếch đại gen 16S rDNA 34

3.4.2 K ết quả giải trình tự gen 16S rDNA của 03 chủng VKCS 35

3.5 Phân tích sự đa dạng về di truyền của các chủng vi khuẩn cộng sinh với giống Steinernema 44

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 Kết luận 48

4.2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 59

BTB Bromothymol Blue

DMSO Dimethyl sulfoxide

EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid

EPN Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic

nematode) EtBr Ethidium bromide

IJ Ấu trùng xâm nhiễm (Infective juvenile)

NBTA Môi trường phân lập vi khuẩn (Nutrient agar supplemented with

bromothymol blue and triphenyl tetrazolium chloride) PCR Phản ứng khuyếch đại đoạn DNA (Polymerase Chain Reaction) TBE Dung dịch đệm điện di (Tris/Borate/EDTA)

TTC Triphenyltetrazolium chloride

VKCS Vi khuẩn cộng sinh

VSV Vi sinh vật

VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định

Hình 1.1 Vòng đời của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng 8

Hình 2.1: Hình ảnh tuyến trùng Steinernema spp (IJs) 19

Hình 2.2 Ấu trùng bướm sáp lớn Galleria mellonella 20

Hình 3.1 Ảnh ấu trùng BSL chết do nhiễm tuyến trùng Steinernema spp 30

Hình 3.2 Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn 30TX1 31

Hình 3.3 Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn 45XT 31

Hình 3.4 Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn TK10 32

Hình 3.5 Ảnh tế bào chủng vi khuẩn 30TX1 33

Hình 3.6 Ảnh tế bào chủng vi khuẩn 45XT 33

Hình 3.7 Ảnh tế bào chủng vi khuẩn TK10 34

Hình 3.8: Sản phẩm PCR của gen 16S rDNA của các chủng VKCS 35

Hình 3.9: So sánh trình tự nucleotide ở các loài trong giống Xenorhabdus 42

Hình 3.10: Cây phát sinh chủng loại Maximum Parsimony, số ở các gốc là giá trị % bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu 46

Bảng 1.1: Tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh tương ứng 8

Bảng 2.1: Thành phần hỗn hợp cho phản ứng PCR 25

Bảng 2.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 25

Bảng 2.3: Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định trình tự DNA 27

Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng xác định trình tự DNA 28

Bảng 3.1: Kết quả đối chiếu trình tự đoạn gen 16S-rDNA của vi khuẩn 30TX1 36

Bảng 3.2: Kết quả đối chiếu trình tự đoạn gen 16sDNA của vi khuẩn TK10 37 Bảng 3.3: Kết quả đối chiếu trình tự đoạn gen 16S-rDNA của vi khuẩn 45XT với ngân hàng dữ liệu trình tự quốc tế ( Genbank) bằng chương trình BLAST ta có kết quả thể hiện ở bảng sau: 38

Bảng 3.4 Kết quả thành phần nucleotide trình tự một phần gen 16S rDNA các chủng vi khuẩn nghiên cứu 44

Bảng 3.5: Ma trận khoảng cách di truyền giữa các trình tự nghiên cứu theo mô hình Jukes-Cantor với phân phối đồng đều 44

MỞ ĐẦU

Hiện nay, Các quốc gia đang có xu hướng sử dụng các sản phẩm sinh học thay thế cho các chất hóa học để phòng trừ sâu hại Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic Nematodes – EPN) có khả năng gây bệnh trên côn trùng là nhờ có sự cộng sinh chặt chẽ và đặc hiệu với các vi khuẩn cộng sinh (Xenorhabdus ở Steinernema và

Photorhabdus ở Heterorhabditis) Sau khi thâm nhập vào vật chủ, các vi

khuẩn này sản sinh rất nhanh và tạo ra độc tố giết chết vật chủ, thêm vào đó các vi khuẩn này cũng tiết ra một số chất chống lại các tác nhân cạnh tranh khác trong môi trường như vi khuẩn, nấm (Akhurst and Dunphy, 1993)

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, các hoạt chất sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng/loài vi khuẩn này có khả năng kháng sinh, kháng nấm, ngăn chặn sự tăng sinh của tế bào ung thư chính vì vậy

các chủng/loài vi khuẩn Xenorhabdus /Photorhabdus là nguồn hợp chất tự

nhiên quan trọng để nghiên cứu các loại thuốc mới cho con người (Chen

et al., 1994)

Do mỗi chủng/loài vi khuẩn Xenorhabdus /Photorhabdus tạo ra các

hoạt chất khác nhau chính vì vậy việc tìm ra các chủng/loài mới của loại vi khuẩn này là rất cần thiết Ở Việt Nam, cho đến nay đã phân lập được hơn 60 chủng EPN từ các vùng sinh thái khác nhau Đây là cơ sở để chúng ta dự đoán

về sự đa dạng của VKCS với tuyến trùng Mặc dù, đã có nhiều nghiên cứu về tuyến trùng rất có giá trị và có ý nghĩa khoa học trong xác định hình thái, đa dạng loài nhưng vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về VKCS với tuyến trùng, việc phân loại, định tên và tìm hiểu mối quan hệ giữa vi khuẩn với tuyến trùng hiện là vấn đề rất cần được nghiên cứu

Để khai thác nguồn tài nguyên vi khuẩn tiềm năng này, chúng ta cần phải

có các nghiên cứu đánh giá về chúng Với mục đích tìm kiếm thêm các VKCS với tuyến trùng góp phần làm phong phú và đa dạng hơn cơ sở dữ liệu vi khuẩn của Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:

“Đa dạng di truyền vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Steinernema spp

ở một số tỉnh Bắc Trung Bộ”

với mục tiêu cụ thể như sau:

1/ Phân lập VKCS với một số chủng tuyến trùng giống Steinernema thu được

ở các tỉnh Bắc Trung Bộ

2/ Phân tích đa dạng di truyền của các chủng VKCS này trên cơ sở phân tích thông tin di truyền trên đoạn gen 16S và nghiên cứu mối quan hệ họ hàng của chúng

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.2 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Entomopathogenic nematode – EPN

1.1.1 Sơ lược về tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng

Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematode -

EPN) giống Steinernema thuộc họ Steinernematidae và Heterorhabditis thuộc

họ Heterorhabditidae trong ngành giun tròn là những loài giun tròn có ích, ký sinh ở những loài côn trùng có hại, làm suy yếu hoặc giết chết những côn trùng vật chủ này, nhưng lại rất an toàn đối với người, động vật và thực vật

Cơ chế gây bệnh của EPN là nhờ vào VKCS mà ấu trùng của chúng mang theo trong ruột (Akhurst, 1983; Poinar, 1990) Trong vòng đời phát triển của EPN trải qua các giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm (IJ), con trưởng thành đực và cái Một chu kỳ xâm nhập vào côn trùng vật chủ và phát triển của tuyến trùng EPN trong xác chết côn trùng vật chủ bắt đầu từ pha IJs (tồn tại ở trong đất) đến pha ký sinh phát triển bên trong cơ thể côn trùng vật chủ

và sau khi kết thúc pha ký sinh chúng lại quay trở về pha IJs bên ngoài côn trùng vật chủ Khi tìm được vật chủ thích hợp, IJs xâm nhập vào cơ thể côn trùng qua các lỗ tự nhiên như miệng, hậu môn hoặc lỗ thở hoặc một số dạng IJs được trang bị mấu kitin dạng sừng có thể đục thủng thành cơ thể côn trùng tại nơi xung yếu là ranh giới giữa các đốt cơ thể để xâm nhập Sau khi vào cơ thể vật chủ IJs nhanh chóng xâm nhập vào xoang máu Tại đây VKCS sẽ được giải phóng ra khỏi cơ thể tuyến trùng qua miệng (Heterorhabditis spp.)

hoặc hậu môn (Steinernema spp.) để vào xoang máu của côn trùng Nhờ môi

trường thích hợp là huyết tương vật chủ VKCS nhân nhanh số lượng và tạo ra độc tố gây chết vật chủ trong vòng 24-48h Màu sắc của côn trùng vật chủ cũng

là điểm đặc trưng khác biết giữa 2 giống tuyến trùng: đối với các loài

Heterorhabditis thì khi côn trùng vật chủ chết sẽ có màu đỏ gạch, da xác chết

khô và dai, còn đối với các loài Steinernema khi côn trùng chết sẽ có màu nâu,

xác chết côn trùng không có mùi thối (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) Các tuyến trùng sau đó sẽ trải qua các thế hệ khác nhau, và cuối cùng khi nguồn thức ăn

đã hết, thế hệ cuối cùng sẽ chui ra khỏi xác và phát tán ra môi trường bên ngoài và trở thành IJs để tiếp tục một chu kỳ phát triển mới với một côn trùng vật chủ mới

Hình 1.1 Vòng đời của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng

1.1.2 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema

Tuyến trùng Steinernema sinh sản theo kiểu phân tính nhờ giao phối

giữa đực và cái, trứng con cái được thụ tinh bởi tinh trùng của con đực Ở giai đoạn đầu, con cái đẻ trứng vào cơ thể côn trùng và trứng nở thành ấu trùng thế

hệ 1 Các ấu trùng của thế hệ 1 không phát tán ra ngoài mà ở lại bên trong xác chết cơ thể vật chủ để sử dụng dinh dưỡng bằng chính các mô của côn trùng vật chủ và phát triển nhanh chóng đạt đến giai đoạn trưởng thành thế hệ 2 Trong trường hợp xác chết vật chủ vẫn còn nguồn thức ăn, thế hệ 2 tiếp tục giao phối và tiếp tục phát triển qua thế hệ 3, thậm chí cả thế hệ 4 bên trong cơ thể vật chủ Cuối cùng khi nguồn dinh dưỡng đã hết, thế hệ cuối cùng trong xác chết côn trùng dừng lại ở pha ấu trùng tuổi 2 Các ấu trùng này bắt đầu chui ra khỏi xác chết côn trùng và phát tán ra môi trường bên ngoài và trở thành IJs (tuổi 3) và từ đây chúng tiếp tục một chu kỳ phát triển mới với côn trùng vật chủ mới

1.1.3 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Heterorhabditis

Không giống với các loài Steineinema, ở các loài tuyến trùng

Heterorhabditis, IJs khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng phát triển thành con cái lưỡng tính (hermaphroditis) Con cái này có khả năng sản sinh ra tinh trùng cùng với trứng và tự thụ tinh để sinh sản Từ thế hệ 2 trở về sau, IJs mới phát triển thành con trưởng thành phân tính đực cái và sinh sản bằng hình thức giao phối Giai đoạn đầu của con cái cả lưỡng tính và phân tính, chúng

đẻ trứng (oviparous) nhưng ở giai đoạn sau khi con cái về già chúng đẻ trứng thai (oviviparous); lúc này ấu trùng nở ra bên trong cơ thể con mẹ và sử dụng

cơ thể mẹ làm nguồn thức ăn để phát triển thành ấu trùng tuổi 2, biến con cái thành bọc chứa ấu trùng tuổi 2 Khi phá vỡ thành cơ thể con mẹ chui ra ngoài trở thành ấu trùng xâm nhiễm (tuổi 3) nhưng chúng vẫn giữ lại cái vỏ cutin của ấu trùng tuổi 2 (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

1.2 VKCS với tuyến trùng EPN

Mỗi ấu trùng xâm nhiễm của tuyến trùng EPN (infective juveniles –IJs) mang trong ruột của chúng một loài vi khuẩn cộng sinh chuyên hóa Đa số các loài vi khuẩn này đều gây bệnh cho côn trùng khi xâm nhập vào máu Các

nghiên cứu trong 20 năm qua cho thấy Xenorhabdus cộng sinh với

Steinernema , còn Photorhabdus cộng sinh với Heterorhabditis (Adam, 2006)

Dựa trên cơ sở phân tích mối quan hệ họ hàng và tiến hóa của nhiều đại diện vi khuẩn Rahn, (1937), Thomas and Poinar (1979) đã xây dựng hệ thống phân loại vi khuẩn trong đó vị trí phân loại của các giống vi khuẩn trên được

Các loài vi khuẩn thuộc giống Xenorhabdus không sinh bào tử, hình que

kích thước 0.3-2 x 2-10 µm, gram âm, kị khí không bắt buộc có cả kiểu hô hấp và lên men Chúng sinh trưởng ở nhiệt độ tối ưu là 280C; một số chủng phát triển ở 400C Lên men đường glucose sinh acid (không sinh khí) và một

số đường khác ít lên men Phản ứng catalase âm tính và không khử nitrate thành nitrite Sự chuyển pha xuất hiện ở các mức độ khác nhau trong môi

trường nuôi cấy (Boemare and Akhurst, 1988) Pha I sản sinh nguyên sinh

chất trong giai đoạn nuôi cấy (Boemare et al., 1983), di động bằng lông rung

và có thể tập trung lại trong môi trường thạch 0.6-1.2% (Givaudan et al.,

1995) Pha II không bắt màu (Akhurst, 1980), sản sinh kháng sinh (Akhurst, 1982), protein và một số đặc tính khác của pha Một số chủng di động ở pha

II, nhưng thường pha I mới di động Đa số các chủng có deoxyribonuclease

và protease dương tính

1.2.2 Giống Photorhabdus

Các loài vi khuẩn giống Photorhabdus hình que, kích thước (0.5-2 x

1-10 µm), Gram âm, không sinh bào tử và di động bằng lông rung Kị khí không bắt buộc, có cả hô hấp và lên men Nhiệt độ tối ưu là 280C; một số chủng phát triển ở 37-380C Tất cả các chủng đều có phản ứng catalase dương tính, nhưng không khử nitrate Âm tính với nhiều đặc điểm của họ Enterobacteriaceae Thủy phân gelatin, hầu hết các chủng gây tan huyết cừu

và ngựa, một số sản sinh gây tan huyết hình khuyên trên môi trường máu cừu

ở 250C Lên men Glucose sinh axit, nhưng không sinh khí Cũng lên men đường Fructose, D-mannose, maltose, ribose, và N-acetylglucosamine sinh axit Lên men glycerol yếu

1.2.3 Sự đa dạng của giống Xenorhabdus và Photorhabdus

Xenorhabdus và Photorhabdus là 2 giống vi sinh vật sống cộng sinh với 2 giống giun tròn ký sinh côn trùng lần lượt là: Steinernema và

Heterorhabditis (Forst et al., 1997) Đa số các loài thuộc 2 giống vi khuẩn này gây bệnh cho côn trùng khi xâm nhập vào máu Ngoài ra còn có các loài vi

khuẩn không phải cộng sinh như P asymbiotica được xác định là gây bệnh cho người (Farmer et al., 1989) và một nhóm khác chưa xác định đến loài gây nhiễm bệnh cần liệu pháp điều trị kháng sinh (Peel et al., 1999)

Mỗi loài tuyến trùng thường chỉ cộng sinh với một loài vi khuẩn mặc

dù một loài vi khuẩn có thể cộng sinh với vài loài tuyến trùng Hiện nay các

nhà khoa học đã phân lập và mô tả được 18 loài vi khuẩn Xenorhabdus và 7 loài Photorhabdus (Bảng 1.1)

Elawad et al., 1998

2 S affine X bovienii Akhurst & Boemare, 1990

3 S apuliae X kozodoii Tailliez et al., 2006

4 S arenarium X kozodoii Tailliez et al., 2006

5 S bicornutum X budapestensis Tailliez et al., 2006

6 S carpocapsae X nematophila Akhurst & Boemare, 1990

7 S ceratophorum X budapestensis Tailliez et al., 2006

8 S cubanum X poinarii Tailliez et al., 2006

9 S diaprepesi X doucetiae Fischer-Le Saux et al., 1998

10 S feltiae X bovienii Akhurst & Boemare, 1990

11 S glaseri X bovienii Akhurst & Boemare, 1990

12 S hermaphroditum X griffiniae Tailliez et al., 2006

13 S intermedium X bovienii Poinar, 1990

14 S karii X hominickii Tailliez et al., 2006

15 S kraussei X bovienii Akhurst & Boemare, 1990

16 S kushidai X japonica Nishimura et al., 1994

17 S longicaudum X ehlershii Tailliez et al., 2006

18 S monticolum X hominickii Fischer-Le Saux et al., 1998

19 S puertiricense X romanii Tailliez et al., 2006

20 S rarum X szentirmaii Tailliez et al., 2006

21 S riobravis X cabanillasii Tailliez et al., 2006

22 S scapterisci X innexi Fischer-Le Saux et al., 1998

23 S scarabaei X koppenhoeferi Tailliez et al., 2006

24 S siamkayai X stockiae Tailliez et al., 2006

25 S thermophilum X indica Somvanshi et al., 2006

26 S weiseri X bovienii Tailliez et al., 2006

27 Heterorhabditis

bacteriophora

Photorhabdus luminescens

Poinar, 1990

28 H megidis P luminescens Poinar et al., 1987

Từ bảng 1.1 cho thấy X bovienii có quan hệ cộng sinh với 4 loài

Steinernema , trong khi X poinarii với 2 loài, còn 3 loài vi khuẩn Xenorhabdus khác chỉ có quan hệ cộng sinh với duy nhất 1 loài Steinernema Điều đó cho thấy

tính chuyên hóa của tổ hợp tuyến trùng - vi khuẩn nhưng cũng có tính đa dạng khá cao

1.3 Mối quan hệ giữa tuyến trùng và VKCS

1.3.1 Vai trò của tuyến trùng với vi khuẩn

Quan hệ cộng sinh là một mối quan hệ sinh thái cực kỳ phổ biến trong các quần xã sinh vật trên đất liền, ao hồ và dưới đại dương Nó đóng vai trò quan trọng trong việc hợp thành các dạng sống chính trên Trái đất và tạo ra sự

đa dạng sinh học vô cùng phong phú này

Tổ hợp tuyến trùng – VKCS tương tác với nhau, mỗi bên đều thực hiện những nhiệm vụ, chức năng riêng để sinh tồn và phát triển nhưng lại giúp bên kia để tồn tại, tổ hợp này không thể tách rời và tồn tại độc lập trong môi

trường tự nhiên được

- Tuy ến trùng làm vector vận chuyển VKCS:

Khi xâm nhập vào vật chủ côn trùng các IJs đóng vai trò như vector vận chuyển VKCS vào bên trong vật chủ côn trùng, sau đó tuyến trùng di chuyển thẳng vào xoang máu côn trùng và giải phóng VKCS

- Tuy ến trùng bảo vệ VKCS:

+ Bảo vệ VKCS ở môi trường ngoài côn trùng vật chủ, bằng cách để VKCS trong bọc chứa nằm trong ruột chúng do VKCS không thể tự tồn tại ở ngoài môi trường (đất, nước)

+ Bảo vệ VKCS ở trong cơ thể côn trùng: khi VKCS được giải phóng

từ cơ thể tuyến trùng vào xoang máu của côn trùng, thì theo phản ứng tự nhiên, côn trùng thường tiết ra một số chất kháng thể (dạng protein) để hạn chế hoặc loại bỏ VKCS, trong khi đó nhờ tuyến trùng cũng có khả năng tiết ra một số chất làm trung hòa là làm mất tác dụng kháng thể của các chất này Nhờ vậy, tuyến trùng bảo vệ cho VKCS phát triển bình thường trong cơ thể côn trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

1.3.2 Vai trò của VKCS trong tổ hợp nematode-bacterium

- VKCS s ản sinh độc tố giết chết côn trùng bị nhiễm:

Độc tố do VKCS tiết ra một số protein độc có khả năng nhiễm cho xoang máu côn trùng vật chủ và làm cho côn trùng vật chủ chết một cách nhanh chóng trong vòng 24 – 48h Như vậy, thời gian chết côn trùng vật chủ khác nhau tùy loại tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn và cũng phụ thuộc vào loại côn trùng vật chủ nhưng thường không chậm hơn 48h

- VKCS cung cấp nguồn thức ăn cho tuyến trùng:

Khi mới bắt đầu xâm nhập vào cơ thể côn trùng, tuyến trùng đã sử dụng VKCS vừa được giải phóng từ cơ thể chúng và sinh sôi trong xoang máu côn trùng như nguồn dinh dưỡng của chúng Nhờ đó, các IJs cũng nhanh chóng phát triển sang tuổi 4 và đạt đến trưởng thành Từ thế hệ thứ hai tuyến trùng chuyển sang dinh dưỡng bằng mô côn trùng đã được vi khuẩn hoạt hóa (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

- VKCS ho ạt hóa xác chết côn trùng:

Nhờ các enzyme do vi khuẩn sinh ra, các mô cơ thể côn trùng vật chủ được hoạt hóa thành nguồn thức ăn thích hợp đối với tuyến trùng Nhờ đó, từ thế hệ 2 tuyến trùng sử dụng chính xác chết côn trùng đã được hoạt hóa như

nguồn thức ăn để tiếp tục phát triển, sinh sôi nảy nở các thế hệ tiếp theo Thông thường trong cơ thể côn trùng vật chủ, tuyến trùng có thể phát triển 2 đến 4 thế hệ, phụ thuộc vào sinh khối côn trùng vật chủ làm nguồn thức ăn cho chúng

- VKCS ng ăn cản các vi khuẩn khác xâm nhập vào xác chết côn trùng:

VKCS có khả năng sinh ra các hoạt chất kháng sinh để ngăn cản tác nhân sinh học khác như nấm hoặc vi khuẩn xâm nhập và phát triển trên xác chết côn trùng Điều này có ý nghĩa là chúng có khả năng bảo vệ nguồn thức

ăn nguyên vẹn dành cho tuyến trùng cộng sinh với chúng

Như vậy, có thể nói đây là một trong những mô hình cộng sinh hoàn hảo giữa hai loài sinh vật trong tự nhiên Mô hình cộng sinh này vừa chuyên hóa cao đến mức sự tồn tại của loài này bắt buộc phải có sự hiện diện và cộng sinh của loài kia và ngược lại

1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước

1.4.1 Những nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới đã có rất nhiều các các công trình nghiên cứu về EPN, VKCS và các sản phẩm trao đổi chất của chúng Jennifer và Harry (1988) đã nghiên cứu mô tả những đặc điểm sinh học, sinh thái học chung của các loài

tuyến trùng thuộc 2 giống Steinernema và Heterorhabditis

Boemare (1998) đã mô tả các đặc điểm hình thái, sinh học của 51 loài tuyến

trùng Steinernema và 18 loài tuyến trùng Heterorhabditis và đặc điểm sinh học,

hoạt tính của các VKCS với 2 chủng tuyến trùng nói trên

Boemare et al (1993) sử dụng phương pháp lai chéo DNA để nghiên cứu mối quan hệ của các chủng Xenorhabdus đã phân lập từ những loài EPN

khác nhau (Steinernematidae và Heterorhabditidae) và từ nhiều vùng địa lý

khác nhau Các loài Xenorhabdus được tập hợp vào các nhóm họ hàng DNA như là X nematophilus, X bovienii, X poinarii, và X beddingii Dữ liệu DNA của loài X luminescens khác biệt đáng kể so với tất cả các chủng

Xenorhabdus khác Căn cứ vào những dữ liệu này cùng với những đặc điểm

về kiểu hình tác giả đã đổi tên giống của loài này sang một giống mới

Photorhabdus luminescens

Bằng phương pháp PCR, Brunel et al (1997) đã khuyếch đại gen 16S- rDNA của 13 chủng vi khuẩn của Xenorhabdus cộng sinh với các chủng tuyến trùng Steinernema và 14 chủng của Photorhabdus phân lập từ tuyến trùng thuộc giống Heterorhabditis, các tuyến trùng này được thu tại các vùng

khác nhau và đã xây dựng được cây phát sinh chủng loại của 2 giống

Xenorhabdus và Photorhabdus

Cũng trong năm 1997, Szállás et al (1997) đã phân tích trình tự của gen 16S rRNA của 40 chủng VKCS được phân lập từ Heterorhabditis spp và

7 VKCS của Steinernema spp được phân lập từ những vùng địa lý khác nhau,

và trình tự của một vài chủng tham khảo trong họ Enterobacteriaceae Kết quả

giải trình tự cho thấy chiều dài gen của chủng Xenorhabdus khoảng 1339

nucleotide, còn của các chủng vi khuẩn còn lại nằm trong khoảng 1428 đến

1452 nucleotide Phân tích phát sinh chủng loại cho thấy các loài thuộc chủng

Xenorhabdus , Photorhabdus và các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae phân ra thành 3 nhánh khác nhau, trong đó Photorhabdus

được phân chia thành 5 nhánh phụ

Fischer et al (1998) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của 117 chủng VKCS với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Xenorhabdus và

Photorhabdus bằng sự phân tích RFLP của sản phẩm PCR gen 16S-rDNA Tác giả đã xác định được 30 kiểu gen 16S riêng biệt và nhóm chúng vào các

giống Xenorhabdus và Photorhabdus Cả 2 giống đều đa dạng về kiểu gen và

có liên quan tới sự phân bố của tuyến trùng vật chủ

Fisscher et al (1999) đã dựa trên những đặc tính về hình thái, sinh lý, hóa sinh để sắp xếp một số chủng vi khuẩn Photorhabdus vào 3 nhóm: nhóm

I (nhiệt độ sinh trưởng tối đa từ 35-39C) gồm những VKCS với tuyến trùng

H bacteriophora và H indica Nhóm II (nhiệt độ sinh trưởng tối đa 33-350C)

gồm những chủng VKCS với H megidis, H zealandica Nhóm III (nhiệt độ

sinh trưởng tối đa là những VKCS với tuyến trùng ký sinh ở người Dựa trên phân tích cây phát sinh chủng loại xây dựng từ trình tự gen 16S-rDNA các tác

giả đã đề xuất phân 3 loài mới: P luminescens subsp luminescens subsp nov., P luminescens subsp akhurstii subsp nov., P luminescens subsp

laumondii subsp nov., tách ra từ loài Photorhabdus luminescens, và 2 loài P

temperata sp nov., P temperata subsp., temperata subsp nov tách ra từ loài

Photorhabdus temperata

Babic et al.,(2000) đã nghiên cứu mối quan hệ giữa VKCS với tuyến

trùng H indica với vi khuẩn Ochrrobactrum spp Các VKCS tự nhiên P

luminescens subsp akhurstii được phân lập từ tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng H indica và 14 chủng vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng được thu từ

3 đảo khác nhau ở vùng Caribbean, được mô tả bằng những kiểm tra kiểu hình thường phân tích trình tự và đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn của PCR gen 16S-rDNA Các vi khuẩn phân lập được nhóm vào 3 kiểu genome, mỗi nhóm tương ứng với một đảo Các đặc điểm kiểu hình và phân tích 16S-

rDNA chỉ ra rằng VKCS Photorhabdus có quan hệ gần gũi với Ochrobactrum

anthropi

Liu et al (2001) đã so sánh trình tự của 2 chủng VKCS với tuyến trùng

H marelatus và S oregonense thu được từ bờ biển Bắc Mỹ Trình tự 16S của

loài Xenorhabdus sp cộng sinh với S oregonense gần giống với loài X

bovienii (cộng sinh với S feltiae) Loài Photorhabdus sp cộng sinh với H

marelatus rất khác biệt với các loài Photorhabdus đã biết mặc dù nó có quan

hệ gần gũi với nhóm P temperata

Lakatos (2008) đã mô tả VKCS phân lập từ tuyến trùng ký sinh gây

bệnh côn trùng ở Hungari, một số loài vi khuẩn đã phân lập từ H downesi

và H megidis cho thấy rằng chỉ có sự giống nhau về trình tự gen rDNA của tất cả các loài và phân loài Photorhabdus đã mô tả Dựa trên

16S-trình tự gen 16S-rDNA, mối quan hệ phát sinh chủng loại của những chủng là không chắc chắn, vì giá trị bootstrap thấp Tác giả đã sử dụng

các trình tự gen gysB cho phân tích cây phát sinh chủng loại, và đã chứng minh vi khuẩn phân lập từ H downesi là loài mới Photorhabdus

temperata subsp cinerea subsp nov

1.4.2 Những nghiên cứu tại Việt Nam

Cho đến nay ở Việt Nam đã phân lập được khoảng hơn 60 chủng từ các vùng sinh thái khác nhau, một số loài đã được nghiên cứu về khả năng diệt sâu hại để ứng dụng trong thực tiễn phòng trừ sinh học Từ năm 1999, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã bắt đầu sản xuất chế phẩm sinh học tuyến trùng Cho tới nay, đã sản xuất được 7 chế phẩm sinh học tuyến trùng và kết quả thử nghiệm cho thấy những chế phẩm này có thể diệt được gần 30 loài sâu hại khác nhau (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

Phan Kế Long (2001) đã nghiên cứu và mô tả 2 loài tuyến trùng mới thuộc giống Steinernema (Rhabditida): Steinernema loci sp n và S thanhi sp

n được phân lập từ các mẫu đất bãi biển ở 2 tỉnh Thanh hóa và Hà Tĩnh Sự kết hợp các nghiên cứu về hình thái học và dữ liệu phân tích rDNA-RFLP cho

thấy sự khác biệt của 2 loài này với các loài Steinernema khác Các đặc điểm

hình thái ấu trùng cảm nhiễm tuổi 3 của Steinernema loci sp n gồm: chiều

dài cơ thể từ 896 - 1072 µm, khoảng cách từ đầu đến lỗ bài tiết từ 71 - 86 µm, chiều dài đuôi từ 66 - 83 µm, 9 đường bên riêng biệt Các đặc điểm hình thái

ấu trùng cảm nhiễm của Steinernema thanhi sp n gồm: chiều dài cơ thể

720-960 µm, khoảng cách từ đầu đến lỗ bài tiết 68-84 µm, chiều dài đuôi 52-72

µm, 9 đường bên Phân tích RFLP cho thấy Steinernema thanhi sp n có thể

phân biệt từ loài S arenarium bởi 9 enzym giới hạn, từ loài S glaseri bởi 11 enzym, và 4 enzym từ loài S loci sp n

Bằng việc mô tả các đặc trưng về sinh thái và phân tích RFLP vùng

trình tự ITS r-DNA, Phan et al (2001) đã mô tả một loài tuyến trùng

Steinernema mới được thu thập tại tỉnh Thanh Hóa, S sangi sp n Loài mới này có một đặc điểm tương đồng với loài S kraussei là ấu trùng cảm nhiễm

cùng có 8 đường bên, nhưng chiều dài cơ thể lại ngắn hơn (753 vs 951 µm), khoảng cách từ đầu đến lỗ bài tiết ngắn hơn (51 vs 63 µm), chiều dài gai giao cấu dài hơn (63 vs 49 µm) Việc phân tích RFLP cũng cho thấy sự khác biệt giữa 2 loài này bởi 9 enzym giới hạn

Phan Kế Long và cộng sự (2003) đã nghiên cứu sự phân bố của các

chủng tuyến trùng thu được Xác xuất bắt gặp tuyến trùng trong các mẫu đất thu được là không cao (44 mẫu có 1 chủng EPN trong tổng số 910 mẫu đất)

Trong đó giống Heterorhabditis bắt gặp ít hơn so với giống Steinernema (12

và 32 loài) Heterorhabditis indica là loài phổ biến nhất ở Việt Nam Trong số

32 loài của Steinernema ở Việt Nam thì có 4 loài mới cho khoa học (S tami,

S sangi, S thanhi và S loci) Cũng trong năm 2003 Phan Kế Long và cộng

sự đã dựa trên những đặc điểm sinh học và phân tích RFLP trên vùng trình tự ITS để công bố loài mới Heterorhabditis baujardi sp n Loài mới này có quan hệ gần gũi với H indica phân bố rộng rãi ở các nước nhiệt đới

Phan Kế Long (2004) đã sử dụng phương pháp Maximum parsimony

để xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên các kết quả nghiên cứu về hình

thái và giải mã vùng ITS-rDNA của 29 loài thuộc chủng Steinernema thu

được tại Việt Nam Các loài này được chia thành 5 nhóm chính: nhóm

“intermedium-affine”, “carpocapsae-tami-scapterisci”,

“feltiae-kraussei-oregonensae”, “bicornutum-ceretophorum-riobrave” và nhóm

“glaseri-arenarium-longicaudum-karii” có quan hệ với hình thái của IJs

Phan Kế Long (2006) sử dụng các đặc điểm hình thái và trình tự ITS của các loài tuyến trùng thuộc giống Steinernema để mô tả 4 loài mới Chiều dài của ấu trùng cảm nhiễm của 4 loài mới (Steinernema cumgarense sp n., S

eapokense sp n., S backanense sp n., S sasonense sp n.) có chiều dài IJs

600 µm Ấu trùng cảm nhiễm có các đường bên với 4 gờ trung tâm và 2 gờ ở mép, chúng không có các phần phụ giống sừng trên ở cuối đầu, những loài

này thuộc nhóm ‘carpocapsae-scaterisci-tami’ Chiều dài của ấu trùng cảm nhiễm của loài S cumgarense sp n giống S eapokense sp n và S

siamkayai , nhưng khác với các loài S sasonense sp n., S carpocapsae, S

scapterisci và S tami Những loài này có thể phân biệt với những loài gần gũi

S eapokense bởi giá trị D% và phần hyaline của đuôi ấu trùng cảm nhiễm Các phân tích về cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự của gene ITS-rDNA cho thấy các loài trên là loài mới

Dự án: “Genomic approaches to metabolite exploitation from Xenorhabdus /

Anh do chương trình EC-FP7 tài trợ với mục đích nghiên cứu các hợp chất tự

nhiên từ chất tiết của vi khuẩn Xenorhabdus /Photorhabdus cộng sinh với

tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema và Heterorhabditis phục

vụ trong y dược Ở Việt Nam, dự án tập trung phân lập, phân loại tuyến trùng cùng với VKCS và tách chiết các hoạt chất sinh học Phan Kế Long và cộng

sự (2009) đã phân lập được hợp chất Diketopiperazin từ sản phẩm trao đổi

chất thứ cấp của vi khuẩn Xenorhabdus sp cộng sinh với tuyến trùng

Steinernema robustispiculum TN 21

Tuy nhiên, những nghiên cứu về VKCS và hoạt chất của chúng ở Việt Nam còn rất ít Nhóm nghiên cứu của Trịnh Hồng Thái và cộng sự đã nghiên

cứu về proteinase do vi khuẩn Xenorhabdus sp XS4 và Xenorhabdus sp

CA Kết quả cho thấy các vi khuẩn này đã tiết ra môi trường nuôi cấy các proteinase, hoạt độ proteinase mạnh nhất ở pH 8 (Trịnh Hồng Thái, 2002) Chính vì vậy, nghiên cứu về VKCS với tuyến trùng và hoạt chất sinh học của chúng có thể sẽ là hướng nghiên cứu mới có ý nghĩa khoa học và thực tiễn trong y học

1.4.3 Ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại trong việc nghiên cứu về

vi khuẩn

Hệ thống phương pháp nghiên cứu về vi khuẩn ngày càng được hoàn thiện, từ những nghiên cứu ban đầu về hình thái khuẩn lạc cho tới ứng dụng các kỹ thuật hiện đại Việc nghiên cứu về hình thái khuẩn lạc tuy rất đơn giản song cũng ngày càng bộc lộ nhiều hạn chế trong việc phân tích kết quả nghiên cứu do: Kết quả về hình thái khuẩn lạc dễ bị lẫn lộn không ổn định do phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy, thử hoạt tính sinh hóa phức tạp, để ổn định phải yêu cầu điều kiện thí nghiệm rất nghiêm ngặt Các thí nghiệm tiến hành tiêu tốn nhiều thời gian trong khi đó kết quả đem lại khó đối chiếu do không đồng nhất về điều kiện thí nghiệm và các thông tin thu được khó số hóa Đánh giá

sự đa dạng và mối quan hệ phát sinh ít đem lại kết quả cao

Ngày nay, nhờ vào sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử DNA (PCR-RFLP và Sequencing), giải mã thông tin DNA… các kết quả thu được luôn nhanh, nhạy, chính xác, ổn định, dễ đối chiếu so sánh hơn nữa còn bộc lộ

được mối quan hệ và sự đa dạng về di truyền Áp dụng các kỹ thuật sinh học hiện đại còn đưa lại kết quả ứng dụng nhờ biểu hiện gen của vi khuẩn trên cơ

thể nhiều vật chủ khác nhau như Ecoli, Pichia pastoris…

Trong nghiên cứu định loại về vi khuẩn và xác định quan hệ di truyền thì trình tự 16S- rDNA được đánh giá là tiêu chuẩn vàng với những ưu điểm:

- Đây là trình tự mã hóa cho ribosome có cấu trúc di truyền ổn định trong cả giới vi khuẩn

- Trình tự này mang thông tin di truyền để có thể phân biệt quan hệ giữa các loài khác nhau thậm chí là cả các phân loài, chủng…vv

- Việc phân lập, giải trình tự của trình tự này hoàn toàn dễ dàng và thuận lợi do nó mang những vùng bảo thủ thuận lợi cho việc thiết kế mồi

- Cơ sở dữ liệu của trình tự 16S- rDNA trên Genbank rất phong phú và

có nhiều thuận lợi cho các nhà khoa học có thể so sánh đối chiếu và đánh giá kết quả

Chính vì vậy mà việc ứng dụng kỹ thuật sinh học hiện đại đặc biệt là kỹ thuật giải trình tự 16S- rDNA đã đưa đến một kết quả nhanh chóng, dễ dàng

và có độ tin cậy cao, đáp ứng được mục tiêu và yêu cầu mà đề tài hướng tới

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Tuyến trùng

- Sử dụng chủng tuyến trùng thu được ở một số tỉnh Bắc Trung Bộ (Thạch Khê - Hà Tĩnh, Thường Xuân - Thanh Hóa, Xuân Trường, Thọ Xuân - Thanh Hóa) đang được lưu giữ tại phòng Tuyến trùng học - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

- Ký hiệu mẫu:

TT Tên vi khuẩn Ký hiệu VK Địa điểm thu mẫu

1 Steinernema sangi 30TX1 Thường Xuân, Thanh Hóa

2 Steinernema loci TK10 Thạch Khê, Thạch Hà, Hà Tĩnh

3 Steinernema sp 45XT Xuân Trường, Thọ Xuân, Thanh Hóa

Hình 2.1: Hình ảnh tuyến trùng Steinernema spp (IJs)

2.1.2 Ấu trùng Bướm sáp lớn

Ấu trùng Bướm sáp lớn (Galleria mellonella) được nhân nuôi tại phòng thí nghiệm Tuyến trùng học - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Hình 2.2 Ấu trùng bướm sáp lớn Galleria mellonella

Bướm sáp lớn Galleria mellonella (BSL) là loài côn trùng thuộc bộ

cánh vẩy Lepidoptera, được sử dụng làm vật liệu chính trong các nghiên cứu

về tuyến trùng ký sinh gây bệnh ở côn trùng (EPN) Ấu trùng tuổi trước nhộng của bướm sáp lớn được sử dụng như là vật chủ trong các nghiên cứu về sinh học các loài EPN, làm mồi bẫy thu thập EN, EPN trong đất và nhất là môi trường lý tưởng cho nhân nuôi in vivo EPN

2.2 Hóa chất và thiết bị

2.2.1 Hóa chất

- Bộ sinh phẩm MinElute của hãng QIAgen để tinh sạch sản phẩm PCR

- Dung dịch đệm điện di TBE (Tris/Borate/EDTA) 1X được pha loãng từ dung dịch gốc TBE 5X có thành phần như sau:

Tris base: 53g EDTA 0,5M pH 8,0: 15ml

Acid boric: 27,5g Nước khử ion vừa đủ 1lit

- Gel agarose 1%: Cân 0,4g bột agarose hoà trong 40 ml dung dịch đệm TBE 1X, đun trong lò vi sóng khoảng 2-3 phút cho bột agarose tan hết Khi gel hạ nhiệt độ xuống khoảng 50ºC, đổ vào khay điện di đã đặt sẵn lược điện

di có độ dày răng lược thích hợp Để gel đông và ổn định hoàn toàn trong khoảng 1 giờ

- Dung dịch Ethidium Bromide nồng độ 0,05 µg/ml (EtBr): Pha 1 gam EtBr trong 100 ml nước cất Dung dịch EtBr gốc được giữ trong lọ màu ở nhiệt độ phòng

- Đệm tra mẫu (Loading Dye) có thành phần như sau:

2.2.2 Môi trường phân lập VKCS

Sử dụng môi trường NBTA (Nutrient agar supplemented with bromothymol blue and triphenyl tetrazolium chloride) dùng để nhân nuôi vi khuẩn có thành phần như sau: Pep ton 5gram; Beef Extract 3 gram; Agar

15 gram; Bromothymon Blue (BTB) 0.025 gram; Triphenyltetrazolium

Chloride (TTC) 0.04 gram; Nước cất 1 lít

Hoà lẫn hỗn hợp này trong nước, ngoại trừ TTC và khử trùng ở 1200C, 1 atm trong 15 phút Chỉ trước khi rót ra đĩa (agar < 500C), thêm TTC Nếu TTC vô trùng, cân cẩn thận từng tí một trong 1 cốc sạch khuẩn và rót nó vào môi trường đã hấp Xoáy nước để trộn đều Nếu TTC khô, thêm vài ml nước

cất và cho đi qua 1 siêu phin lọc trước khi cho vào môi trường đã nguội TTC

sẽ hỏng khi thêm vào môi trường quá nóng

2.2.3 Trang thiết bị

- Bộ điện di DNA (Advance Tech, Nhật Bản)

- Cân phân tích 10-4g (Mettler Toledo)

- Lò vi sóng

- Máy ly tâm (Microcentrifuge-Sorvall, Mỹ)

- Máy khuấy trộn Vortex (RotoLab, OSI)

- Máy soi chụp ảnh gel (Bio-Rad, Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh (Sorvall Biofuge Fresco)

- Máy xác định trình tự DNA tự động (ABI 3100 Avant Genetic Analyzer)

- Lọ thủy tinh, đĩa thủy tinh lõm, bình thủy tinh

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL

Ấu trùng cảm nhiễm của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng sau khi đã được tẩy trùng bề mặt bằng streptomycin 5000 đơn vị/ml (2-3 giờ) sẽ được chuyển vào đĩa Petri Φ 9mm (500 ấu trùng trong 1 ml nước cất) cùng với giấy thấm

Whatman # 1 Cho 5 ấu trùng bướm sáp lớn, Galleria mellonella vào đĩa, bọc lại

bằng Parafilm để ngăn ngừa sự bốc hơi nước và bảo quản trong chỗ tối ở 25°C

2.3.2 Phương pháp phân lập VKCS

Sau khi Galleria mellonella chết (24-48 giờ), tẩy trùng bề mặt xác của

Galleria bằng cách dìm vào cồn 96° trong vòng từ 1-2 phút, dùng 2 kẹp nhỏ, khẽ xé rách lớp vỏ rồi dùng que cấy đã tiệt trùng lấy một chút dịch cơ thể

Galleria cấy lên đĩa môi trường NBTA Bọc kín đĩa bằng parafilm và để trong

tủ ấm ở 300C, 24-48 giờ

2.3.3 Phương pháp quan sát hình thái tế bào VKCS

Nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên phiến kính, dùng que cấy lấy vô trùng một khuẩn lạc VKCS và hoà trộn đều Đặt lamen lên và quan sát hình dáng tế bào VKCS dưới kính hiển vi quang học

2.3.4 Phương pháp định loại VKCS dựa trên trình tự 16S rDNA

2.3.4.1 Tách chi ết DNA tổng số

Để tách DNA tổng số của VKCS, chúng tôi đã sử dụng DNeasy Blood and Tissue Kit của hãng QIAgen Các bước tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất và được tóm tắt dưới đây:

Bước 1: Mẫu được chuyển vào ống eppendorf 1,5ml ly tâm loại dịch thu

tế bào vi khuẩn

Bước 2: Thêm 180µl dung dịch ATL, trộn đều, thêm 20µl dung dịch Proteinase K, trộn bằng Vortex, ủ ở 55ºC cho tan hết mẫu

Bước 3: Trộn bằng Vortex khoảng 15 giây

Bước 4: Thêm 200µl ethanol (96 – 100%), trộn nhanh bằngVortex

Bước 5: Chuyển toàn bộ dịch mẫu sang cột DNeasy Mini Spin (gọi tắt là cột) đặt trong ống thu dịch ly tâm (collection tube), ly tâm 8000 vòng /phút trong 1 phút

Bước 6: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác, thêm 500 µl buffer AW1, ly tâm 8000 vòng /phút trong 1 phút

Bước 7: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác, thêm 500 µl buffer AW2, ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút Bỏ dịch trong ống thu dịch ly tâm và ly tâm tiếp 14000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 8: Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml đã ghi kí hiệu mẫu, thêm 200

µl buffer AE, để ở nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 8000 vòng /phút trong 1 phút Bước 9: Bỏ cột, bảo quản DNA tổng số thu được trong ống eppendorf 1,5 ml ở -200 C

2.3.4.2 Nhân đoạn DNA đích bằng kỹ thuật PCR

Đoạn gen 16S-rDNA được nhân bản (PCR) bằng các mồi theo mô tả của

Brunel et al., 1997:

Mồi xuôi PXF: 5'-TCC TAC GGG AGG CAG CAG TG-3'

Mồi ngược PXR: 5'-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'

Chuẩn bị hỗn hợp cho PCR với thành phần như sau:

Căn cứ thông số kỹ thuật của mồi do nhà sản xuất cung cấp, chúng tôi

đã thiết lập được chu trình nhiệt cho phản ứng như sau:

Bảng 2.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Các giai đoạn PCR Nhiệt độ ( o C) Thời gian (giây) Số chu kì

35