ĐỀ TÀI THỰC HIỆN TIÊU bản cố ĐỊNH DỊCH HOÀN CHUỘT ĐỒNG

PHẦN I : ĐẶT VẤN ĐỀ Sinh sản là một đặc điểm đặc trưng nhất của mọi cơ thể và là bản năng của mọi sinh vật để bảo tồn nòi giống và cũng là đặc điểm đặc trưng của sinh vật khi so sánh với phi sinh vật Ở giới động vật thuộc lớp thú, trong các cấu trúc của hệ sinh dục đực, tinh hoàn là cơ quan sản sinh tinh trùng và chế tiết hormon sinh dục. Để có cơ sở giải phẩu nhằm quan sát hình dạng ngoài và quá trình sản suất tinh trùng của tinh hoàn, việc xác định phương pháp thực hiện tiêu bản hiển vi và mẫu ngâm tinh hoàn là cần thiết. Ngoài ra kết quả nghiên cứu sẽ thay thế cho nguồn mẫu tiêu bản dịch hoàn đã xuống cấp không thể tiếp tục dùng để giảng dạy mô học. PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1. KỸ THUẬT 1.1 Kỹ thuật thực hiện mẫu ngâm: Thực hiện mẫu ngâm là cố định làm bất động những cấu trúc của tổ chức cũng như của tế bào nhưng vẫn tôn trọng tới mức tối đa hình thái của chúng. Nói khác đi, cố định một tổ chức là giết chết những thành phần của tổ chức đó nhưng vẫn bảo quản chúng trong một tình trạng gần với lúc sống nhất Trước hết một loại thuốc cố định tốt phải đạt được những yêu cầu sau đây: Chống được sự nhiễm trùng Ngấm nhanh vào tổ chức, giết nhanh tế bào Bảo toàn hay chỉ làm thay đổi rất ít những cấu trúc cơ bản của tổ chức và tế bào, chống lại sự tự tiêu hủy do men nội bào Một số tác nhân cố định hoá học thông dụng là: cồn, formol, axit axetic, axit pieric, axit chromic, bicromat kali, clorua mercuric, tetroxyl osmium, axit trichloraxetic Hòe,1976 1.2 Kỹ thuật thực hiện tiêu bản hiển vi cố định: Thực hiện theo phương pháp tiêu bản cắt lát. Mẫu vật thực hiện theo phương pháp này qua nhiều giai đoạn phức tạp và có thêm một số thao tác phụ, nếu một trong mỗi giai đoạn chính chưa đạt được mong muốn thì sẽ làm ảnh hưởng đến kết quả về sau. Tóm lược quy trình như sau: định hình khử nước tẩm Parafin – đúc khuôn – cắt mẫu tải mẫu lên lame nhuộm kép bằng HematoxylineEosin khử nước – làm trong mẫu và cố định mẫu trong Baume Canada. 1.2.1 Cố định. Nguyên tắc chung: Mẫu vật phải được cố định ngay sau khi lấy. Không được làm dập nát mẫu. Mẫu vật phải có kích thước vừa phải. Không để một mặt mẫu dính vào lọ đựng. Đủ dung dịch cố định cần thiết. • Đúng nồng độ. • Thể tích dung dịch cố định gấp từ 3060 lần thể tích mẫu. Thời gian cố định thích hợp. Mẫu dày tối đa 5mm thì cố định từ 2448 giờ. Dung dịch cố định là dung dịch Bouin chứa acid picric, acid acetic và formol. Rửa nước cho sạch màu vàng của Bouin dưới vòi nước chảy Hòe, 1976

PHẦN I : ĐẶT VẤN ĐỀ

Sinh sản là một đặc điểm đặc trưng nhất của mọi cơ thể và là bản năng củamọi sinh vật để bảo tồn nòi giống và cũng là đặc điểm đặc trưng của sinh vật khi sosánh với phi sinh vật

Ở giới động vật thuộc lớp thú, trong các cấu trúc của hệ sinh dục đực, tinhhoàn là cơ quan sản sinh tinh trùng và chế tiết hormon sinh dục Để có cơ sở giải phẩunhằm quan sát hình dạng ngoài và quá trình sản suất tinh trùng của tinh hoàn, việc xácđịnh phương pháp thực hiện tiêu bản hiển vi và mẫu ngâm tinh hoàn là cần thiết.Ngoài ra kết quả nghiên cứu sẽ thay thế cho nguồn mẫu tiêu bản dịch hoàn đã xuốngcấp không thể tiếp tục dùng để giảng dạy mô học

PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1 KỸ THUẬT

1.1 Kỹ thuật thực hiện mẫu ngâm:

Thực hiện mẫu ngâm là cố định làm bất động những cấu trúc của tổ chức cũngnhư của tế bào nhưng vẫn tôn trọng tới mức tối đa hình thái của chúng Nói khác đi,

cố định một tổ chức là giết chết những thành phần của tổ chức đó nhưng vẫn bảo quảnchúng trong một tình trạng gần với lúc sống nhất

Trước hết một loại thuốc cố định tốt phải đạt được những yêu cầu sau đây:

- Chống được sự nhiễm trùng

- Ngấm nhanh vào tổ chức, giết nhanh tế bào

- Bảo toàn hay chỉ làm thay đổi rất ít những cấu trúc cơ bản của tổ chức và tếbào, chống lại sự tự tiêu hủy do men nội bào

Một số tác nhân cố định hoá học thông dụng là: cồn, formol, axit axetic, axitpieric, axit chromic, bicromat kali, clorua mercuric, tetroxyl osmium, axittrichloraxetic [Hòe,1976]

1.2 Kỹ thuật thực hiện tiêu bản hiển vi cố định:

Thực hiện theo phương pháp tiêu bản cắt lát Mẫu vật thực hiện theo phương phápnày qua nhiều giai đoạn phức tạp và có thêm một số thao tác phụ, nếu một trong mỗi giaiđoạn chính chưa đạt được mong muốn thì sẽ làm ảnh hưởng đến kết quả về sau Tómlược quy trình như sau: định hình - khử nước - tẩm Parafin – đúc khuôn – cắt mẫu - tảimẫu lên lame - nhuộm kép bằng Hematoxyline-Eosin - khử nước – làm trong mẫu và cốđịnh mẫu trong Baume Canada

1.2.1 Cố định.

Nguyên tắc chung:

- Mẫu vật phải được cố định ngay sau khi lấy

- Không được làm dập nát mẫu

- Mẫu vật phải có kích thước vừa phải

- Không để một mặt mẫu dính vào lọ đựng

Luận văn tốt nghiệp 2

- Đủ dung dịch cố định cần thiết.

• Đúng nồng độ

• Thể tích dung dịch cố định gấp từ 30-60 lần thể tích mẫu

- Thời gian cố định thích hợp Mẫu dày tối đa 5mm thì cố định từ 24-48 giờ

- Dung dịch cố định là dung dịch Bouin chứa acid picric, acid acetic và formol

- Rửa nước cho sạch màu vàng của Bouin dưới vòi nước chảy [Hòe, 1976]

1.2.2 Khử nước

Quy trình khử nước thông thường chung cho mỗi loại mẫu (có thể gia giảm tùy kích

cở, mẫu, điều kiện của từng phòng thí nghiệm)

1.2.3 Tẩm parafin

1.2.3.1 Tẩm dung môi trung gian của parafin (khử cồn)

Dung môi trung gian của Parafin thường dùng nhất là Toluen và xylene Ngoài ra còn

có nhiều chất có 2 đặc tính khử cồn hòa tan Parafin như Benzen, Ét-xăng bách hương,Butanol, sunfuacacbon, Những chất sau chỉ dùng hạn chế: ví dụ như Ét-xăng báchhương dùng cho kỹ thuật xét nghiệm ty lạp thể, butanol dùng cho tổ chức hạch Để khửhết cồn dùng :

a Xylene (hay xylon) II (đã sử dụng 2 lần 4 giờ )

b Xylene I (đã sử dụng 1 lần 4 giờ)

c Xylene nguyên chất 6 giờ

Thời gian khử cồn tối đa là 24 giờ, mẫu ngâm quá lâu sẽ cứng và dễ vỡ [Hòe, 1976]

1.2.3.2 Tẩm parafin (khử xylene)

Trước hết cần chọn loại Parafin tốt và thích hợp Parafin chỉ có thể ngấm vào mẫu vàloại xylene ra khi nó ở trạng thái lỏng, tẩm parafin chỉ thực hiện đầy đủ khi dung môitrung gian đã bị loại hoàn toàn Người ta khử dung môi trung gian bằng cách chuyểnmẫu lần lượt vào những lọ có Parafin ngày càng tinh khiết Để tiêt kiệm hóa chất và thờigian, trên thực tế chỉ cần 3 lần tẩm là đủ

a Parafin I (đã sử dụng 2 lần) 6 giờ

b Parafin II (đã dùng 1 lần) 6 giờ

c Parafin III (nguyên chất) 12 giờ

Loại Parafin I và II có thể dùng nhiều lần hơn quy định

Parafin III phải đảm bảo nguyên chất vì chính nó sẽ dùng để đúc khuôn

Nói chung, thời gian tẩm lâu hay mau là tùy kích thước và tính chất của mẫu: nếunhỏ và lỏng lẽo thì tẩm vài ba giờ, nếu to và cứng thì tẩm từ 24-36 giờ [Hòe, 1976]

1.2.4 Đúc khuôn

Người ta đổ vào khuôn chất Parafin lỏng đã lọc từ trước (Parafin ở lần chuyển thứ

3, nghĩa là Parafin hoàn toàn mới) Nhúng ngay mẫu vào chất Parafin đang lỏng này.Dùng kẹp hay kìm đã hơ nóng để định hướng mẫu theo ý muốn Sau vài phút Parafin sẽđông đặc lại và giữ mẫu ở nguyên vị trí Khi lớp vỏ ngoài Parafin đã đủ cứng, làm ướt cảkhuôn vào trong bát đựng đầy nước lạnh và chú ý đừng làm rạn, vỡ màng mỏng Parafinbên trên Khoảng 20-30 phút sau, Parafin sẽ cứng lại và thuần nhất toàn bộ Cần tránhlàm lạnh ngay khi Parafin còn lỏng, không được cắt mảnh ngay, phải đợi đến 24 giờ sau

1.2.5 Cắt và dán mẫu

1.2.5.1 Bảo quản máy cắt và lưỡi dao

- Máy cắt mảnh luôn luôn được bảo quản tốt và các phụ tùng được kiểm tra chặtchẽ

- Trước khi dùng cần kiểm tra lại vị trí của các trụ của bàn gắn và lưỡi dao, tránh sự

va chạm vào nhau làm sai lệch máy Xem lại dầu tra vào máy, sự trơn tru…

- Sau khi dùng thì tháo lưỡi dao ra, lau sạch bằng một miếng vải mịn có tẩmxylene, vít chặt trong hộp để tránh tai nạn Lau chùi cẩn thận các mảnh vụn nếu không

sẽ làm cho máy bị sét bẩn

1.2.5.2 Cắt mẫu tẩm parafin bằng máy cắt với 3 giai đoạn

- Cắt khối mẫu thành hình tháp, đáy hình thang, để lại khoảng 2-3 mm Parafinquanh mẫu Gọt làm sao cho 2 cạnh trên và dưới song song

- Hơ nóng nhanh khối gỗ và khối mẫu để gắn khối mẫu vào khối gỗ, điều chỉnhmẫu sao cho ngay ngắn

Luận văn tốt nghiệp 4

- Đặt lưỡi dao vào, định hướng khối và dao trên máy cắt cho thích hợp Nhiệt độ tối

ưu là nhiệt độ phòng Độ dày của mẫu cắt :

• 3-5µm đối với mẫu có yêu cầu quan sát tế bào học

• 10-15 µm đối với mẫu có yêu cầu quan sát tổ chức học định khu

Tốc độ của tay quay tùy thuộc vào tính chất của khối và độ dày của khối, nói chung,nên quay chậm với các khối dễ vỡ, đặc biệt là gan và lách Còn đối với khối rắn không

vỡ cần quay nhanh Hứng các mẫu cắt trên một tờ giấy trắng [Hòe, 1976]

1.2.5.3 Tải mảnh cắt lên lame

Trước khi nhuộm cần phải tải mảnh cắt và dán mảnh trên lame Muốn mảnh cắtdính vào nền lame có thể dùng một chất dính Gêlatin hoặc Albumin, trình tự thực hiệnnhư sau:

- Nhỏ vài giọt nước hoặc dung dịch dán còn ấm trên lame (dung dịch phải làm ướtđều kính)

- Đặt lên trên dung dịch một mảnh cắt hay một dãy cắt

- Đặt lame trên bàn nóng khoảng 50oC và theo dõi mảnh cắt tải ra, mảnh cắt phảinổi trên dung dịch Không bao giờ bàn nóng quá 500C thì tổ chức sẽ bị khô

- Nghiêng lame để tháo nước đi một cách thận trọng Làm thế nào cho dung dịchdán trôi đi càng nhiều càng tốt

- Để tiêu bản khô theo tư thế nghiêng (mảnh cắt ở mặt dưới) ít nhất là 12 giờ ởnhiệt độ bình thường hoặc 20-30 phút trong tủ ấm ở nhiệt độ khoảng 45 oC khi đãkhô kiệt, các mảnh cắt dính rất tốt vào lame [Hòe, 1976]

1.2.6 Loại parafin ra khỏi mảnh cắt

Loại parafin ra khỏi mảnh cắt chỉ tiến hành trước khi nhuộm vì không thể bảoquản lâu được tổ chức rất hay vụn vỡ, hút ẩm

- Đối với các tiêu bản đã được nhuộm cả khối:

+ Làm tan parafin bằng xylene

+ Gắn bằng Baume canada

- Đối với các tiêu bản chưa nhuộm và dán bằng albumin:

+ Làm đông đặc albumin bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn

+ Hòa tan parafin bằng xylen từ 1-2 phút

+ Loại xylen bằng cồn tuyệt đối 1 phút.

+ Cho vào cồn 950 : 1 phút

+ Cho vào nước 5 phút

1.2.7 Nhuộm Hematoxyline – Eosin

- Cho tiêu bản vào Hematoxyline từ 5- 45 phút tùy theo loại Hematoxyline

- Rửa tiêu bản trong nước chảy cho đến khi nào tiêu bản màu xanh (từ hồng sangxanh) khoảng 10 phút ở nước chảy pH=8

- Nhúng vào cồn acid vài giây (1ml acid HCl + 99ml cồn 960 )

Cần lắc tiêu bản rồi rửa nước lã cho xanh lại Kiểm tra lại nếu biệt hóa chưa đủ thìnhúng lại cồn acid, nếu màu nhạt sau khi rửa qua nước cất, có thể cho lại Hematoxylin từ10-15 phút Sau đó biệt hóa trở lại

- Ngâm tiêu bản trong Eosin từ 2-4 phút (Eosin Y 1% trong cồn để nhuộm nguyênsinh chất)

- Rửa nước từ 3-4 phút (kiểm tra trên kính hiển vi xem đã đạt yêu cầu chưa)

- Nhúng tiêu bản trong cồn 900 khoảng 10-15 giây, sau đó là cồn tuyệt đối I, II, III(10-30 giây mỗi lần ) để khử nước

- Chuyển sang ngâm mẫu trong xylene cho đến khi trong mẫu

Gắn tiêu bản chú ý: sau khi gắn xong, tiêu bản phải trong suốt Baume Canada thường

dùng trong dung dịch xylen 55% Cần đậy kín lọ [Hòe, 1976]

2 CẤU TRÚC MÔ HỌC

2.1 Cấu tạo đại thể của tinh hoàn

Ở người trưởng thành, mỗi tinh hoàn có kích thước trung bình 4 x 2.5 cm, hìnhtrứng nằm trong bìu Tinh hoàn được bọc trong một vỏ liên kết xơ gọi là màng trắng có

lá tạng của tinh mạc phủ ngoài Ở mặt sau trên của tinh hoàn, màng trắng dày lên thànhkhối xơ gọi là thể Highmore Từ màng trắng có nhiều vách liên kết tiến vào trong, chiatinh hoàn thành nhiều tiểu thuỳ tinh hoàn (150 – 200 tiểu thuỳ) Các tiểu thuỳ có xuhướng qui tụ về phía thể Highmore Trong mỗi tiểu thuỳ có 1 – 5 ống sinh tinh congqueo, uốn lượn trong mô liên kết rất giàu mạch máu, mạch bạch huyết, thần kinh [Kiệt,1994]

Luận văn tốt nghiệp 6

2.2 Cấu tạo vi thể của ống sinh tinh

Trong mỗi tiểu thuỳ tinh hoàn có nhiều ống sinh tinh Thành của ống sinh tinhgồm một lớp vỏ chung và lớp biểu mô tinh Lớp vỏ chung gồm lớp đáy, lớp dạng cơ vàlớp sợi Lớp đáy nằm sát màng đáy, không có cấu tạo tế bào, chỉ có sợi collagen xếp theonhiều hướng khác nhau Lớp dạng cơ nằm ngoài lớp đáy, gồm những tế bào chứa nhiềusiêu sợi actin Lớp dạng cơ giúp ống sinh tinh co dãn được Ngoài lớp dạng cơ có những

10 Niếu tinh quản

11 Niếu quản tiền

Biểu mô sinh tinh là một biểu mô đặc biệt tựa trên màng đáy và hướng vào lòngcủa ống sinh tinh Biểu mô sinh tinh gồm hai loại tế bào chính: tế bào dòng tinh và tế bàosertoli

2.2.1 Tế bào dòng tinh

Những tế bào dòng tinh xếp thành 4 – 8 lớp tế bào từ màng đáy cho đến lòng ốngsinh tinh Những tế bào dòng tinh vừa sinh sản vừa biệt hoá để tạo thành tinh trùng Ởngười đàn ông trưởng thành, tế bào dòng tinh gồm có: tinh nguyên bào, tinh bào I, tinhbào II, tinh tử (tiền tinh trùng), tinh trùng

Quá trình từ tinh nguyên bào đến tinh trùng được gọi là quá trình tạo tinh(spermatogenese) Quá trình này gồm ba giai đoạn:

- Tạo tinh bào (spermatocytogenese): tinh nguyên bào phân chia theo kiểu nguyênphân tạo thành tinh bào I

- Tạo tinh tử, còn gọi là quá trình giảm phân (meiose): tinh bào I tiến hành hai lầnphân chia giảm nhiễm để tạo tinh tử

- Tạo tinh trùng ( spermiogenese): các tinh tử biến đổi và biệt hoá thành tinh trùng

Luận văn tốt nghiệp 8

Hình 3: Ống sinh tinh [Hoa, 2003]

Tinh nguyên bào B Tinh bào I

Tinh tử giai đoạn cuối

Tinh tử giai đoạn sớm

Tinh bào II

Thể cặn Tinh trùng

Hình 4: Sơ đồ phân chia và biệt hóa tế bào dòng tinh [Kiệt, 1994]

* Tinh nguyên bào

Tinh nguyên bào là những tế bào sinh dục nguyên thuỷ, nằm sát màng đáy củaống sinh tinh, kích thước nhỏ khoảng 12 micron, nhân ít nhuộm màu, bào tương có bộGolgi nhỏ, ti thể và nhiều ribosom tự do Tinh nguyên bào gồm hai loại: tinh nguyên bào

A và tinh nguyên bào B

Các tinh nguyên bào nằm ở phần nền của biểu mô sinh tinh gián phân liên tục để tạo nhiều thế hệ tế bào, cung cấp trong quá trình sinh tinh Một số tinh nguyên bào có chu kỳ tế bào rất dài, ít phân chia, chỉ đóng vai trò dự trữ Các tế bào này chỉ phân chia khi có sự thiếu hụt tinh nguyên bào cho quá trình sinh tinh

Ở người, phân loại theo hình dạng, có 3 loại tinh nguyên bào:

Loại A đậm màu: đóng vai trò dự trữ, loại này sẽ gián phân tạo thành loại tinhnguyên bào A nhạt khi có sự thiếu hụt

Loại A nhạt màu: gián phân liên tục để tạo tinh nguyên bào loại B

Loại B: gián phân liên tục để tạo tinh bào I có kích thước lớn hơn tinh nguyênbào, nhân trở nên nhuộm màu đậm hơn do các nhiễm sắc thể co ngắn và dày hơn [Silber, 1999]

Sự gián phân liên tục của các tinh nguyên bào đảm bảo nguồn cung cấp cho quá

trình sinh tinh diễn ra liên tục trong suốt đời sống nam giới Các yếu tố ảnh hưởng lênquá trình này sẽ làm giảm đáng kể số lượng tinh trùng và tác động lâu dài lên quá trìnhsinh tinh.Ở người số lượng tinh trùng được sinh ra phụ thuộc vào

- Số lượng tinh nguyên bào dự trữ (loại A đậm)

- Số lần gián phân từ giai đoạn A đậm đến giai đoạn tinh bào I Con số này

thường cố định tùy loài

- Cường độ phân chia của các tinh nguyên bào cũng như của các giai đoạn sau

của quá trình sinh tinh [ Silber, 1999 ]

** Tinh bào I

Tinh bào I thực hiện phân chia giảm nhiễm lần thứ nhất để cho hai tinh bào II với

23 nhiễm sắc thể Tinh bào II nhanh chóng phân chia giảm nhiễm lần hai để tạo thànhhai

Luận văn tốt nghiệp

1

7 6 5 4

3 2

10

Tinh nguyên bào A nhạtTinh nguyên bào BTinh nguyên bào A đậmGiai đoạn sớm của tinh trùngTinh tử

Tinh bào I

Tế bào Sertoli

Hình 5: Các loại tế bào dòng tinh ở lớp biểu mô tinh [David H Cormack]

tinh tử và được đẩy dần vào lòng ống Tinh tử không phân chia mà tiến hành hàng loạtcác quá trình biến đổi khác nhau để tạo thành tinh trùng Quá trình biệt hoá từ tinh tử trởthành tinh trùng gồm bốn giai đoạn: giai đoạn bộ golgi, giai đoạn tạo mũ, giai đoạn thểcực đầu và giai đoạn chín

- Giai đoạn bộ golgi: tinh tử có kích thước nhỏ hơn các tinh bào (khoảng 7 – 8micron) Trong bào tương có bộ golgi phát triển, ti thể, ribosom tự do, một đôi trung tử

và một ít lưới nội bào không hạt Những hạt nhỏ thể cực đầu tích luỹ trong bộ golgi vàsau đó nhập lại để hình thành một hạt cực đầu duy nhất nằm trong túi cực đầu có màngbọc Trung tử di chuyển về phía đối diện với thể cực đầu đang hình thành

- Giai đoạn tạo mũ: túi cực đầu cùng với hạt cực đầu bên trong phát triển và phủlên nữa trước nhân của tinh tử để tạo thành mũ cực đầu, hay thể cực đầu (acrosom) nhântrở nên kết đặc lại, trung tử phát triển để tạo thành đuôi tinh trùng sau này Ti thể tậptrung quanh đoạn đầu của đuôi hình thành nên lò xo ti thể

- Giai đoạn thể cực đầu: thể cực đầu phát triển tạo thành một cấu tạo nằm trênnhân, phía đầu của tinh trùng Trong thể cực đầu có chứa nhiều enzim thuỷ phân như:Hyaluronidaz, neuraminidaz, phosphataz acid, proteaz có hoạt tính như trypsin Vì vậythể cực đầu đóng vai trò như một lysosom đặc biệt mà enzim của chúng có tác dụng táchrời tế bào của vòng tia tiêu huỷ màng trong suốt bao quanh trứng trong quá trình thụ tinh(phản ứng thể cực đầu) Đuôi hình thành và có cấu tạo điển hình giúp tinh trùng chuyểnđộng về phía trước

Luận văn tốt nghiệp 11

Nhân Tiền tinh trùng

Túi cực đầu

Đầu Cổ Đoạn

giữa Đoạn chính Đoạn cuối

Hình 6: Sơ đồ biệt hoá tinh tử thành tinh trùng và cấu tạo của tinh trùng

[Kiệt, 1994]

- Giai đoạn chín: nhân kéo dài, cô đặc hơn, bào tương dư thừa được tách khỏi tếbào và được thực bào bởi các tế bào Sertoli Tinh trùng được giải phóng vào lòng ốngsinh tinh.

Sự chuyển động của tinh trùng là kết quả của quá trình tương tác giữa các siêuống, ATP và dynein Trong những trường hợp dynein thiếu hụt (hội chứng kartagener)tinh trùng mất khả năng chuyển động, gây ra tình trạng bất thụ hội chứng này thườngkèm với viêm hô hấp mãn, do các lông chuyển của tế bào trụ có lông chuyển biểu mô hôhấp cũng bất động Năng lượng đảm bảo cho sự chuyển động của tinh trùng là nhữngchất carbohydrate các tuyến phụ thuộc đường sinh dục nam chế tiết ra, trong đó chủ yếu

là đường fructose

Theo nhiều tác giả thì trong quá trình phân chia từ tinh nguyên bào đến tinh tử,các tế bào cùng thế hệ luôn luôn còn còn một cầu bào tương nối với nhau Cầu này sẻmất đi khi tinh tử loại bỏ các mảnh bào tương thừa Các cầu bào tương này đóng vai tròquan trọng trong việc trao đổi thông tin từ tế bào này sang tế bào khác, cho phép quátrình phân chia và biệt hoá xảy ra đồng thời với nhau [Kiệt, 1994 ]

** Tế bào Sertoli

Là những tế bào lớn, hình tháp kéo dài, có đáy tựa trên màng đáy và cực ngọnhướng vào lòng ống sinh tinh Các tế bào Sertoli không phân chia và chỉ gồm 1 loại tếbào Tế bào Sertoli nằm giữa các tế bào sinh tinh và trải dài từ màng đáy vào đến lòngống sinh tinh [Mortimer, 1994] Tế bào Sertoli có những nhánh bào tương bên ôm lấycác tế bào dòng tinh Trong bào tương có nhiều lưới nội bào không hạt, một ít lưới nộibào hạt, bộ golgi phát triển Ở vùng đáy tế bào có những thể liên kết giữa hai tế bàoSertoli gần nhau Các tế bào Sertoli còn liên kết với nhau bởi liên kết khe

Sự liên kết giữa các tế bào Sertoli chia biểu mô sinh tinh thành 2 phần: phần nền

và phần ống Phần nền gồm các tinh nguyên bào và tinh bào non Phần ống bao gồm cáctinh bào và tinh tử Sự phân cách này tạo điều kiện cho các tinh nguyên bào gián phân vàbiệt hóa

Các tinh bào non từ phần nền, được sinh ra từ lần gián phân cuối cùng của các tinhnguyên bào, phải vượt qua phức hợp liên kết giữa các tế bào Sertoli để đi vào phần ống

Luận văn tốt nghiệp 12

Tinh trùng Tinh trùng Nguyên phân Màng nền Nguyên bào sợi

** Chức năng của tế bào Sertoli

Các tế bào Sertoli và phức hợp liên kết giữa chúng tạo nên hàng rào máu-tinhhoàn Hàng rào máu - tinh hoàn đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tinh Cácchức năng của phần này bao gồm:

- Nâng đỡ các tế bào sinh tinh

- Vận chuyển chất chuyển hoá, và chất dinh dưỡng từ ngoài vào cung cấp cho các

tế bào sinh tinh

- Kiểm soát và hạn chế sự di chuyển của một số phân tử ngoại bào đi vào biểu môsinh tinh

- Thực bào các tế bào sinh tinh bị chết, thoái hóa và các tế bào chất bị thải hồitrong quá trình biệt hóa của tinh tử

- Tiết ABP, giúp cho sự vận chuyển của nội tiết tố, một loại protein kết với nộitiết tố nam Protein này giúp vận chuyển chủ động testosteron từ bên ngoài vào bên trongống sinh tinh và tạo nồng độ testosteron rất cao bên trong biểu mô sinh tinh

- Tiết các chất điều hoà quá trình gián phân và giảm phân của các tế bào sinh tinh,điều hoà hoạt động chế tiết của tế bào Leydig và chế tiết gonadotropins của tuyến yên

- Điều hoà sự di chuyển của các tế bào sinh tinh trong lớp biểu mô sinh tinh và sựphóng thích tinh trùng vào lòng ống sinh tinh

- Tế bào Sertoli tạo thành hàng rào máu – tinh hoàn: các tế bào sinh tinh sau giảmphân, chỉ xuất hiện trong tinh hoàn sau khi dậy thì, có thể có những kháng nguyên đặchiệu “lạ” đối với hệ miễn dịch của cơ thể Nếu hàng rào máu-tinh hoàn bị phá vỡ do chấnthương hay do phẫu thuật, tinh trùng sẽ tiếp xúc với máu, có thể kích hoạt tạo kháng thểkháng tinh trùng trong máu, có thể dẫn đến vô sinh [Mortimer, 1994] Hàng rào máu –tinh hoàn ngăn không cho các immunoglobulin lọt vào bên trong ống sinh tinh, chốngtương tác giữa tế bào dòng tinh đang phát triển với hệ miễn dịch, phòng ngừa phản ứng

tự miễn Điều đó có thể giải thích tại sao ở người suy yếu khả năng thụ thai lại có hiệugiá kháng thể tinh trùng cao trong huyết thanh [Kiệt, 1994 ]

- Chế tiết chất dịch lỏng để tạo thuận lợi cho sự di chuyển của tinh trùng về phíacác ống dẫn tinh, chế tiết protein liên kết với androgen, chế tiết loại peptit gọi là inhibinlàm ức chế tổng hợp và giải phóng FSH trong thuỳ trước tuyến yên Ngoài ra, tế bàoSertoli còn có thể làm biến đổi testosterone thành estradiol

** Mô kẽ tinh hoàn

Mô kẽ là mô liên kết nằm xung quanh các ống sinh tinh, rất giàu mạch máu, mạchbạch huyết, thần kinh Trong mô kẽ có thể quan sát thấy nguyên bào sợi, masto bào, tếbào kẽ, hay còn gọi là tế bào Leydig Tế bào Leydig là những tế bào hình cầu, đa diện,

có kích thước khá lớn (15-20 micron) Trong bào tương tế bào Leydig có nhiều hạt lipitnhỏ, những hạt protein dưới dạng tinh thể Reinke Tế bào Leydig tổng hợp và chế tiếthormone sinh dục nam testosteron có tác dụng duy trì quá trình tạo tinh và phát triển các đặc điểm nam tính phụ Cholesteron có thể được tích luỹ trong các hạt lipit hoặc đượctổng hợp mới từ acetate Nhờ có các enzim trong ti thể, cholesteron sẽ biến thànhpregnenolon, rồi qua một số phản ứng để trở thành progesterone, cuối cùng trở thànhtestosterone

Luận văn tốt nghiệp 14

U tế bào kẽ có thể gây phát dục sớm ở nam [Kiệt, 1994]

PHẦN III PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN

1 PHƯƠNG TIỆN VÀ HOÁ CHẤT:

1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài:

Đề tài được thực hiện trong phòng thí nghiệm sinh lý động vật - Bộ môn Khoa Sư phạm - Đại học Cần Thơ.

Sinh-Đề tài được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 10/2005đến tháng 05/ 2006

1.2 Phương tiện và hoá chất:

Để thực hiện được tiêu bản hiển vi cố định tinh hoàn chuột đồng trải qua nhiềukhâu phức tạp, cần các phương tiện và hoá chất nhất định như sau:

1.2.1 Phương tiện:

33 Giấy vệ sinh 5 cuồn

5 lít15g3g3g30g250ml0,5 lít500g100ml50g

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

2.1 Thực hiện mẫu đại thể (mẫu ngâm):

Thao tác thực hiện mẫu đại thể dịch hoàn chuột đồng khá đơn giản, gồm các bướcsau:

- Chuột sống sau khi bị dìm chết trong nước, tiến hành mổ ngay Thao tác mổđược thực hiện ở mặt bụng của chuột

Thực hiện mẫu ngâm dịch hoàn chuột đồng bằng cách giải phẩu chuột, sau đó gởcác đường ống dẫn tinh nối từ tinh hoàn ra dương hành của chuột Sau khi giải phẫu,trình bày nội quan, ngâm vào dung dịch formol 10%, sau đó đổi dung dịch khi thấy dungdịch không còn trong (khoảng 2 tháng)

Hình 8: Sơ đồ các đường mổ trong giải phẩu chuột

- Quan sát hình dạng ngoài, vị trí, của dịch hoàn chuột khi mổ

2.2 Thực hiện mẫu hiển vi:

Quá trình nghiên cứu cấu trúc dịch hoàn chuột đồng thông qua phương pháp thựchiện tiêu bản gồm những bước có tính chất nguyên tắc: lấy mẫu, cố định, khử nước, tẩmparafin lỏng, đúc khuôn, cắt mẫu, nhuộm mẫu, khử nước, làm trong và dán mẫu cố địnhLuận văn tốt nghiệp 18

trong Baume Canada Tất cả phải được thực hiện đúng trình tự, thao tác kỹ thuật và thờigian xử lý thích hợp Nếu một trong các khâu không được thực hiện một cách kỹ lưỡngthì mẫu lame về sau sẽ không đạt được yêu cầu.

Hình 9: Tinh hoàn chuột tại vị trí

Hình 9: Tinh hoàn chuột tại vị trí 2.2.2 Cố định:

Cố định trong dung dịch Bouin (công thức pha xem ở phần phụ lục) trong 24 giờ.Trong lúc cố định nên có những động tác lắc hoặc khuấy nhẹ để trộn đều dung dịch cũng

Tinh

hoàn

như thay đổi vị trí của mẫu nhằm tránh hiện tượng một mặt mẫu luôn nằm tiếp xúc vớiđáy lọ sẽ không được tiếp xúc tốt với dung dịch cố định (về sau mặt này của mẫu sẽ bắtmàu không đều so với những vùng khác).

Thể tích dung dịch cố định phải gấp 30-60 lần thể tích mẫu khi đó thì dung địch

cố định sẽ dễ dàng thấm sâu vào cấu trúc mô, mô cố định sẽ tốt hơn, đồng thời dịch mô

từ mẫu thoát ra không làm loãng dung dịch cố định

2.2.3 Khử nước:

Vớt mẫu trong dung dịch cố định ra rửa dưới vòi nước chảy khoảng 2-3 giờ đểgiảm bớt màu vàng của dung dịch Bouin: dùng một chai nước khoáng bị đục thủng đáy,cho nước vào đầy chai sau đó cho tinh hoàn đã cố định vào, tiếp tục cho nước chảykhoảng 2 – 3 giờ

Tiếp theo cho rửa trong lọ nước cất (5 phút x 2 lần) rồi lần lượt chuyển qua các lọcồn với độ cồn tăng dần 500, 700, 900, 9905 nhằm khử hết nước có trong mẫu mà khônglàm phá huỷ đột ngột các cấu trúc mô Cụ thể được thực hiện như sau:

- Chuyển mẫu từ n-Butanol sang lọ Xylene : 3 giờ/ lần x 2 lần

- Chuyển mẫu vào xylene:parafin lỏng với tỷ lệ (1:1) để trong tủ sấy ở nhiệt độ

600C trong khoảng 12 giờ

- Chuyển mẫu qua parafin nguyên chất lỏng trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C trong 36giờ Trộn mẫu thường xuyên để mẫu ngấm đều parafin

Hình 10: Khuôn giấy đúc mẫu.

- Chuẩn bị sẵn sàng các hủ đựng sáp nguyên chất ở thể lỏng (khoảng 600C trong

tủ sấy) Đèn cồn, kim mũi giáo và kẹp gấp mẫu

- Đúc khuôn: đặt khuôn vào nơi bằng phẳng, rót parafin lỏng nguyên chất vàokhuôn, rót cho đầy khuôn Nhanh chóng dùng kẹp gắp mẫu từ trong parafin tẩm ra vàđặt vào lớp parafin vừa rót Dùng kim mũi giáo đã hơ nóng trên lửa đèn cồn làm chảyparafin xung quanh mẫu để chỉnh cho mẫu ở đúng vị trí trong khuôn, Sau khi đã rótparafin vào mà thấy parafin còn đục và có bọt khí thì dùng kim mũi giáo hơ nóng choparafin trong và hết bọt Sau đó để khuôn đúc yên tại vị trí trong 24 giờ ở nhiệt độphòng Trữ trong tủ lạnh 150C

2.2.6 Cắt mẫu:

- Chuẩn bị:

* Vật liệu: + Máy cắt mẫu

+ Dao cắt mẫu+ Dao thái lan+ Kim mũi giáo+ Kẹp

+ Giấy+ Đèn cồn + Khối gỗ

* Lấy khuôn parafin có chứa mẫu ra, tháo khuôn giấy ra rồi gọt mẫu đúc Parafinthành khối hình thang cân

* Hơ nóng khối gỗ trên ngọn đèn cồn, đồng thời hơ nhanh khối mẫu hình thangcân rồi dán lên khối gỗ

Parafin

Hình 11: Dạng khối mẫu đã gọt và gắn vào khối gỗ

- Tiến hành:

* Thận trọng từng động tác một, tránh gió, thở mạnh sẽ làm bay đi những mảnhcắt hoặc mảnh cắt sẽ bị dơ Máy cắt để gần nguồn lạnh Tốt nhất là nên cắt vào lúc sángsớm hoặc cắt vào buổi tối

Hình 12: Bố trí máy cắt mẫu.

* Gắn mẫu sao cho ngay ngắn, thẳng góc với lưỡi dao cắt

* Gắn dao vào bàn để dao, khoá chặt cần cố định dao

* Điều chỉnh cho lưỡi dao nghiêng một góc khoảng 150, khóa chặt cần điều chỉnh

độ nghiêng của dao

* Vặn ốc điều chỉnh độ dày lát cắt ở 8µm

* Di chuyển lưỡi dao tiến lại gần vị trí khối mẫu

* Mở khoá tay quay và bắt đầu quay với vận tốc vừa phải để lưỡi dao bắt đầu cắtkhối mẫu Ban đầu cắt với độ dày 20µm Khi cắt đến mẫu thì điều chỉnh độ dày còn

8µm Khi đó các lát cắt sẽ dính nhau thành băng, hứng băng mẫu trên một tờ giấy sạchLuận văn tốt nghiệp 22

màu trắng và bảo quản trong hộp giấy ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh (tránh nguồnnóng vì nguồn nóng sẽ làm nóng chảy Parafin, làm cả băng mẫu dính vào tờ giấy trắng,mẫu sẽ hư, không thể tải từng lát cắt lên lame)

ta nên đặt lame đứng dựa vào thành của khay mổ để nước trút sạch xuống dưới và không

để lại những vệt trên lame

* Khi lame đã được sấy khô xong thì đem ra để nguội, dùng 1 lamelle kéo dànmột lớp mỏng dung dịch Albumin Glycerin (công thức pha ở phần phụ lục) lên lame.Sau đó đặt lame trong tủ sấy ở nhiệt độ 600 đến khi Albumin khô (khoảng 24 giờ)

* Khi lame đã khô lại, nhỏ một giọt nước ấm lên lame Chọn lát cắt tốt trong dãybăng mẫu, cứ cách 3 mẫu thì chọn một mẫu, dùng kim mũi giáo hoặc lưỡi lame cắt rờimẫu ra khỏi băng và dùng kim mũi giáo có dính một ít nước để lấy lát cắt lên, sau đóchuyển lát cắt lên giọt nước ấm Khi chuyển cần nhẹ nhàng, tải xuống từ từ đề tránh bọtkhí

* Cho lame đã tải xong mẫu để dưới đèn tròn 75w, khoảng 45-500C cho đến khigiọt nước ở lame khô đi, mẫu căng ra và được dán vào lớp Albumin trên lame

Mẫu chọn Mẫu chọn Mẫu chọn Mẫu chọn

Hình 14: Chọn các lát cắt trên băng mẫu và tải lát cắt lên lame

2.2.8 Nhuộm mẫu:

Áp dụng phương pháp nhuộm kép 2 màu tương phản là Hematoxyline và Eosin Y(Theo Handbook of Basic Microtechnique), các mẫu đã dán xong cần được nhuộm ngaytrong vòng 24 giờ để tránh bụi và những hư hại do va chạm hay các tác nhân khác

Giai đoạn nhuộm gồm nhiều khâu phức tạp Trong đó, cần có nhiều dụng cụ vàhoá chất cần thiết

- Chuẩn bị:

+ 5 lọ xylen

Luận văn tốt nghiệp 24

+ Mẫu sau khi được tải lên lame nên được xem ngay dưới kính hiển vi, nếu mẫu

có lỗi về kỹ thuật thì ta nên tải mẫu khác ngay

+ Mẫu tốt đã dính lên bề mặt lame có Albumin được hơ nhanh qua ngọn lửa đèncồn cho chảy Parafin ra rồi cho vào lọ xylen I (khoảng 5-7 phút), nâng lame lên xuốngcho sạch Parafin Sau đó chuyển sang lọ Xylen II, cũng với thao tác tương tự rồi chuyểnsang lọ xylen III

+ Tiếp tục chuyển sang các lọ cồn có nồng độ giảm dần: