ĐỀ TÀI THỰC HIỆN TIÊU bản HIỂN VI cố ĐỊNH NOÃN sào CHUỘT ĐỒNG

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ  Hệ sinh dục là cơ quan duy trì nòi giống. Ở cơ quan sinh dục trong của động vật hữu nhũ cái gồm: buồng trứng (noãn sào), ống dẫn trứng , tử cung, âm đạo. Trong các cấu trúc này, buồng trứng là tổ chức sản sinh ra giao tử cái, phát triển thành cơ thể sống khi chúng được thụ tinh, đồng thời đây cũng là nơi sản xuất hormon sinh dục. Xuất phát từ những nhu cầu:  Tìm hiểu cấu trúc mô học của buồng trứng nhằm cung cấp kiến thức cơ sở cho môn sinh lý động vật và nguời, ứng dụng trong các biện pháp kế hoạch hoá gia đình.  Thực tế giảng dạy thực tập giải phẫu cần một lượng mẫu hiển vi mới nhằm thay thế nguồn mẫu hiển vi cũ đã bị xuống cấp (do SV Nguyễn Thị Diệu Linh thực hiện năm 1981). Chúng tôi thực hiện đề tài: “Thực hiện tiêu bản hiển vi cố định noãn sào chuột đồng (Rattus.sp)” nhằm:  Xác định thời lượng chính xác để thực hiện tiêu bản hiển vi cố định chuột đồng (Rattus.sp).  Sản xuất ra 100 tiêu bản cố định và 2 mẫu ngâm noãn sào định vị trong cơ thể chuột đồng (Rattus.sp). PHẦN II : LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU  1. KỸ THUẬT: Thực hiện theo phương pháp tiêu bản cắt lát. Mẫu thực hiện theo phương pháp này qua nhiều giai đoạn phức tạp và có thêm một số thao tác phụ nếu như trong mỗi giai đoạn chính chưa đạt được tính chất mong muốn. Tóm lược qui trình như sau: định hình khử nước tẩm parafin đúc khuôn cắt mẫu tải mẫu lên lame nhuộm kép bằng Hematoxyline Eosin khử nước làm trong mẫu và cố định mẫu trong Baume Canada. 1.1. Cố định: Nguyên tắc chung: Mẫu vật phải được cố định ngay sau khi lấy. Không được làm dập nát mẫu. Không được cắt quá dày. Không để một mặt mẫu dính vào lọ đựng. Dung dịch cố định cần thiết phải: + Đúng nồng độ. + Thể tích dung dịch cố định gấp từ 30 60 lần thể tích mẫu. Thời gian cố định thích hợp: nếu mẫu dày tối đa 5mm cố định từ 24 48 giờ. Dung dịch cố định Bouin: chứa acid piric, acid acetic và formol. Nếu không rửa mẫu cố định bằng vòi nước chảy thì thay dung dịch cố định bằng cồn 950 ít nhất 2 lần. 1.2. Khử nước: Quy trình khử nước thông thường chung cho mỗi loại mẫu (thời gian khử nước có thể gia giảm tuỳ theo kích cỡ mẫu, điều kiện của từng phòng thí nghiệm) Cồn II (cồn tuyệt đối sử dụng 2 lần) 4 giờ Cồn I (cồn tuyệt đối sử dụng 1 lần) 4 giờ Cồn tuyệt đối. 6 giờ Cồn tuyệt đối. 6 giờ 1.3. Tẩm parafin: Tẩm dung môi trung gian của parafin (khử cồn) Dung môi trung gian của parafin thường dùng nhất là tôluen và xylen. Ngoài ra còn có nhiều chất có đặc tính khử cồn hoà tan parafin như benzen, étxăng bách hương, butanol, sunfuacacbon ... Những chất sau chỉ dùng hạn chế: ví dụ như étxăng bách hương dùng cho kỹ thuật xét nghiệm ty lạp thể, butanol dùng cho tổ chức hạch. Để khử hết cồn dùng: Xylen (hay xylol) II (đã sử dụng 2 lần) Xylen I (đã sử dụng 1 lần) Xylen nguyên chất. Thời gian khử cồn tối đa là 24 giờ, mẫu ngâm lâu quá sẽ cứng và dễ vỡ. Tẩm parafin (khử xylen): Trước hết cần chọn loại parafin tốt và thích hợp. Parafin chỉ có thể ngấm vào mẫu và loại xylen ra khi nó ở trạng thái lỏng, tẩm parafin chỉ thực hiện đầy đủ khi dung môi trung gian đã bị loại hoàn toàn. Người ta khử dung môi trung gian bằng cách chuyển mẫu lần lượt vào những lọ có parafin ngày càng tinh khiết. Để tiết kiệm hoá chất và thời gian, trên thực tế chỉ cần 3 lần tẩm là đủ. Parafin I (đã sử dụng 2 lần). 6 giờ Parafin II (đã sử dụng 1 lần). 6 giờ Parafin III (nguyên chất). 12 giờ Loại parafin I và II có thể dùng nhiều lần hơn qui định. Loại parafin III phải đảm bảo nguyên chất vì chính nó sẽ dùng đ

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ



Hệ sinh dục là cơ quan duy trì nòi giống Ở cơ quan sinh dục trong của động vật hữu nhũ cái gồm: buồng trứng (noãn sào), ống dẫn trứng , tử cung, âm đạo Trong các cấu trúc này, buồng trứng là tổ chức sản sinh ra giao tử cái, phát triển thành cơ thể sống khi chúng được thụ tinh, đồng thời đây cũng là nơi sản xuất hormon sinh dục

Xuất phát từ những nhu cầu:

+ Tìm hiểu cấu trúc mô học của buồng trứng nhằm cung cấp kiến thức cơ sở cho môn sinh lý động vật và nguời, ứng dụng trong các biện pháp kế hoạch hoá gia đình

+ Thực tế giảng dạy thực tập giải phẫu cần một lượng mẫu hiển vi mới nhằm thay thế nguồn mẫu hiển vi cũ đã bị xuống cấp (do SV Nguyễn Thị Diệu Linh thực hiện năm 1981)

Chúng tôi thực hiện đề tài: “Thực hiện tiêu bản hiển vi cố định noãn sào chuột

PHẦN II : LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU



1 KỸ THUẬT:

Thực hiện theo phương pháp tiêu bản cắt lát Mẫu thực hiện theo phương pháp này qua nhiều giai đoạn phức tạp và có thêm một số thao tác phụ nếu như trong mỗi giai đoạn chính chưa đạt được tính chất mong muốn Tóm lược qui trình như sau: định hình - khử nước - tẩm parafin - đúc khuôn - cắt mẫu - tải mẫu lên lame - nhuộm kép bằng Hematoxyline & Eosin - khử nước - làm trong mẫu và cố định mẫu trong Baume Canada

1.1 Cố định:

Nguyên tắc chung:

- Mẫu vật phải được cố định ngay sau khi lấy

- Không được làm dập nát mẫu

- Không được cắt quá dày

- Không để một mặt mẫu dính vào lọ đựng

- Dung dịch cố định cần thiết phải:

+ Đúng nồng độ

+ Thể tích dung dịch cố định gấp từ 30 - 60 lần thể tích mẫu

- Thời gian cố định thích hợp: nếu mẫu dày tối đa 5mm cố định từ 24 - 48 giờ

- Dung dịch cố định Bouin: chứa acid piric, acid acetic và formol

- Nếu không rửa mẫu cố định bằng vòi nước chảy thì thay dung dịch cố định bằng cồn 950 ít nhất 2 lần

1.2 Khử nước:

Quy trình khử nước thông thường chung cho mỗi loại mẫu (thời gian khử nước có thể gia giảm tuỳ theo kích cỡ mẫu, điều kiện của từng phòng thí nghiệm)

- Cồn II (cồn tuyệt đối sử dụng 2 lần) 4 giờ

- Cồn I (cồn tuyệt đối sử dụng 1 lần) 4 giờ

1.3 Tẩm parafin:

- Tẩm dung môi trung gian của parafin (khử cồn)

Dung môi trung gian của parafin thường dùng nhất là tôluen và xylen Ngoài ra còn

có nhiều chất có đặc tính khử cồn hoà tan parafin như benzen, ét-xăng bách hương, butanol, sunfuacacbon Những chất sau chỉ dùng hạn chế: ví dụ như ét-xăng bách hương dùng cho kỹ thuật xét nghiệm ty lạp thể, butanol dùng cho tổ chức hạch Để khử hết cồn dùng:

- Xylen (hay xylol) II (đã sử dụng 2 lần)

Loại parafin I và II có thể dùng nhiều lần hơn qui định.

Loại parafin III phải đảm bảo nguyên chất vì chính nó sẽ dùng để đúc khuôn

Nói chung, thời gian tẩm lâu hay mau là tuỳ vào kích thước và tính chất của mẫu: nếu mẫu nhỏ và cấu trúc mô lỏng lẻo thì tẩm vài giờ, nếu mẫu to và cứng thì tẩm từ 24 - 36 giờ

1.4 Đúc khuôn:

Người ta đổ vào khuôn chất parafin lỏng đã lọc từ trước (parafin ở lần chuyển thứ 3, nghĩa là parafin hoàn toàn mới) Nhúng ngay mẫu vào chất parafin đang lỏng này Dùng kẹp hay kiềm đã đun nóng để định hướng mẫu theo ý muốn Sau vài phút parafin sẽ đông đặc lại và giữ mẫu ở nguyên vị trí Khi lớp vỏ ngoài parafin đã đủ cứng, nhúng cả khuôn vào trong bát đựng đầy nước lạnh và chú ý đừng làm rạn, vỡ màng mỏng parafin bên trên Khoảng 20 - 30 phút sau, parafin sẽ cứng và thuần nhất toàn bộ Cần tránh làm lạnh ngay khi parafin còn lỏng, không được cắt lát ngay, phải đợi 24 giờ sau khi đúc khuôn

1.5 Cắt và dán mẫu:

- Bảo quản máy cắt và lưỡi dao:

+ Máy cắt lát luôn luôn được bảo quản tốt và các phụ tùng được kiểm tra chặt chẽ + Trước khi dùng cần kiểm tra lại vị trí các trụ của bàn gắn và lưỡi dao tránh sự va chạm vào nhau làm sai lệch máy

+ Xem lại dầu tra vào máy, sự trơ tru của các trục chuyển động

Sau khi dùng thì tháo lưỡi dao ra, lau sạch bằng một miếng vải mịn có tẩm xylene, vít chặt trong hộp để tránh tai nạn, lau chùi cẩn thận các mảnh vụn nếu không sẽ làm cho máy cắt bị rỉ sét và bị bẩn

- Cắt mẫu tẩm parafin bằng máy cắt với 3 giai đoạn:

+ Cắt mẫu thành hình khối, đáy hình thang để một khoảng 2 - 3 mm parafin quanh mẫu, gọt làm sao cho 2 cạnh trên và dưới song song

+ Cố định mẫu trên thớ gỗ cho ngay ngắn

+ Đặt lưỡi dao vào, định hướng khối mẫu và dao trên lát cắt cho thích hợp, nhiệt độ tối ưu trong phòng là 28 - 29oC Độ dày của mẫu cắt:

* 3 – 5 µm đối với nghiên cứu tế bào học

* 10 - 15 µm đối với nghiên cứu tổ chức định khu

Tốc độ của tay quay tuỳ thuộc vào tính chất của khối và độ dày của khối Nói chung nên quay chậm với các khối dễ vỡ, đặc biệt là gan và lách Còn đối với khối rắn không vỡ cần quay nhanh, hứng các mẫu cắt trên một tờ giấy trắng

- Tải mảnh cắt lên lame:

Trước khi nhuộm cần tải mảnh cắt và dán mảnh trên lame, muốn mảnh cắt dính vào nền của lame có thể dùng một chất dính gêlatin hoặc albumin, trình tự thực hiện:

+ Tráng một lớp dung dịch albumin, để se khô

+ Nhỏ vài giọt nước ấm trên lame

+ Đặt lên trên dung dịch một mảnh cắt hay một dãy cắt

+ Đặt lên trên bàn nóng, hoặc đặt mẫu vào trong tủ sấy ở nhiệt độ khoảng 500C khoảng 15 phút, theo dõi mảnh cắt tải ra, mảnh cắt phải nổi trên dung dịch Không bao giờ bàn nóng hoặc tủ sấy quá 500C vì tổ chức sẽ bị khô

+ Nghiêng lame để tháo nước đi một cách thận trọng Làm thế nào cho dung dịch dán trôi đi càng nhiều càng tốt

+ Để tiêu bản khô theo tư thế nghiêng (mảnh cắt ở mặt dưới) ít nhất là 12 giờ ở nhiệt

độ bình thường hoặc là 20 - 30 phút trong tủ ấm ở nhiệt độ 40 - 450C khi đã khô kiệt, các mảnh cắt dính rất tốt vào lame

1.6 Loại parafin ra khỏi mảnh cắt:

Loại parafin ra khỏi mảnh cắt được tiến hành trước khi nhuộm vì không thể bảo quản lâu được tổ chức rất hay vụn vỡ, hút ẩm

- Đối với các tiêu bản được nhuộm cả khối:

+ Làm tan parafin bằng xylen

+ Gắn bằng Baume Canada

- Đối với các tiêu bản chưa nhuộm và dán bằng albumin:

+ Làm đông đặc albumin bằng cách hơ nhanh trên ngọn đèn cồn

+ Hoà tan parafin bằng xylen từ 1 - 2 phút

+ Loại xylen bằng cồn tuyệt đối 1 phút

+ Cho vào cồn 950 - 1 phút

+ Cho vào nước 5 phút

1.7 Nhuộm Hematoxyline - Eosin:

- Cho tiêu bản vào Hematoxyline 5 - 45 phút tuỳ theo loại Hematoxyline và tuỳ loại mẫu

- Rửa tiêu bản trong vòi nước chảy cho đến khi nào tiêu bản màu xanh (từ hồng sang xanh) khoảng 10 phút (nước chảy có pH = 8)

- Nhúng vào cồn acid vài giây (1ml acid HCl + 99ml cồn 960).

- Cần lắc tiêu bản rồi nhúng vào nước lã cho xanh lại, kiểm tra lại nếu biệt hoá chưa

đủ thì nhúng lại cồn acid, nếu màu nhạt sau khi rửa qua nước cất, có thể cho lại Hematoxyline từ 10 - 15 phút, sau đó biệt hoá trở lại

- Ngâm tiêu bản trong Eosin từ 2 - 4 phút (Eosin Y 1% trong cồn 80o) để nhuộm nguyên sinh chất

- Rửa nước từ 3 - 4 phút (kiểm tra trên kính hiển vi xem đã đạt yêu cầu chưa)

- Nhúng tiêu bản trong cồn 900 khoảng 10 - 15 giây sau đó là cồn tuyệt đối I, II, III (10 - 30 giây mỗi lần) để khử nước

- Chuyển sang ngâm mẫu trong xylen cho đến khi nào mẫu trong (khoảng 15 giây)Gắn Baume Canada vào tiêu bản cần chú ý: sau khi gắn xong tiêu bản phải trong suốt Baume Canada thường dùng với dung dịch xylen 55% [Miền, 2005]

2 SINH THÁI HỌC CHUỘT ĐỒNG:

Hình 1: Ảnh chụp chuột đồng

2.2 Sinh thái học chuột đồng:

Chuột đồng sống ở đồng ruộng, thích ở gần các bờ nước, đào hang ở bờ ruộng, bờ

đê và đôi khi ờ giữa ruộng, không gặp ở vùng núi cao, đôi khi còn vào ở trong nhà Mùa đông có thể vào trú ở đống rơm rạ hoặc chạy vào nhà kho, nhà ở

Hang chuột đơn giản Đối với chuột đồng lớn thường chỉ có 1 cửa ra vào đường hầm tương đối thẳng và ngắn đường kính của hang khoảng 7 cm Trong hang có phòng ở (14 x 18 cm) lót bằng lá, rơm rạ Đường hầm dài ngắn tuỳ nơi ở ruộng thì dài hơn 2,38m Hang ở đê có cấu trúc khác hơn, có các lối thoát thông với khe nứt trong đê Đường hầm dài 2,55m [Đào Văn Tiên, 1967] Đối với chuột đồng bé, hang có 2 - 6 cửa, đường kính hang bé (3 - 5 cm) trong hang thường dùng lá cây lót thành tổ Đất do chuột đào ra thường có thành viên bé dễ nhận thấy Hang có một số cửa bí mật, chuột chỉ dùng khi cần chạy thoát

Chuột đồng ăn tạp, trong dạ dày phân tích thấy có bột xám, khoai (40 - 60%) thực vật xanh Trong dạ dày còn chứa một ít thịt, thức ăn ưa thích của chuột đồng nhỏ là cá con, cua, ốc, côn trùng, Vào mùa gặt lượng thịt gặp không đáng kể chiếm 16,6% trong lúc đó vào các tháng 1 - 2 tần số gặp thức ăn thịt tăng lên 100% Điều đó chứng tỏ rằng khi có thức ăn thực vật, chuột chỉ ăn một ít thịt, nhưng khi thực vật khan hiếm chuột ăn thịt đồng loại và các loài động vật khác

Chuột đồng lớn thành thục có cỡ tối thiểu với con đực có chiều dài thân 160mm nặng 180 gr; với con cái là 170mm và nặng 180gr Phân tích số phôi của chuột sưu tầm được thấy số phôi trung bình mỗi lứa từ 3-14 (trung bình 9.1) số phôi không phụ thuộc vào số lứa đẻ, ví dụ lứa thứ nhất số phôi là 3-10 ( 8.2); lứa hai 10-14 (11.2); lứa thứ ba 6-

10 (7.6) Chuột đẻ tối đa 3 lứa với tổng số 27-30 con Tỉ lệ chuột non bắt vào tháng 11 cao; còn tháng 12-1 thì gặp nhiều chuột sắp trưởng thành Điều đó chứng tỏ cường độ

sinh sản của chuột mạnh vào các tháng mùa thu, đầu mùa đông ứng với vụ mùa ở nước ta

và giảm đáng kể vào cuối mùa đông đầu mùa xuân

Đối với chuột đồng bé, chúng sinh sản không mạnh lắm Ở Trung Quốc chuột sinh sản tập trung vào tháng 4-5 Số lượng phôi trung bình 5-6 (2-13) Ở nước ta chuột đẻ tập trung vào lúc lúa làm đòng và giảm ở sau vụ gặt

Chuột hoạt động ban đêm, nhanh nhẹn, leo trèo, đào đất nhanh và bơi lội dễ dàng

Ở nước ta vào mùa lũ lụt (tháng 7-8) chuột ra khỏi hang bị ngập nước, bơi đến những chỗ cao như mô đất cao hay bụi cây để trú ẩn Chuột nhút nhát và đa nghi Trong phòng thí nghiệm chuột luôn tìm cách trốn thoát khi người đến gần

Chuột đồng lớn sống chung với các loài chuột khác ở đồng như chuột lợn (Bandicota indica), chuột nhà (Rattus flavipectus colliculus), chuột đồng nhỏ (R.losea) Chúng thường cạnh tranh nhau đôi khi ăn thịt lẫn nhau

Chuột đồng làm hại đáng kể cho nông nghiệp: cắn đổ mạ và lúa, ăn lá và bông lúa Chuột đào bới và gậm các loại củ làm chết cây (sắn, khoai, ) Chuột đào hang trong đê,

bờ ruộng, bờ đập làm cho thấm lậu nước trong ruộng và đê [Cao Văn Sung - Đặng Huy Huỳnh – Bùi Kính, 1980]

3 CẤU TRÚC MÔ HỌC:

Ở động vật hữu nhũ, con đực và con cái có bộ máy sinh dục riêng

Đối với con cái, bộ máy sinh dục gồm:

- Hai buồng trứng (noãn sào) đảm nhiệm chức năng quan trọng: tạo giao tử cái và tiết hormon sinh dục

- Đường sinh dục cái: hai vòi fallope, tử cung và âm đạo

3.1 Đường sinh dục cái:

Buồng trứng phát triển từ lá phôi giữa, từ mấu sinh dục ở phía bụng của thận sơ cấp.

Bên ngoài buồng trứng là lớp biểu mô ngoài, dưới đó là lớp màng trắng [Nguyễn Xuân Hoạt và Phạm Đức Lộ, 1980]

Hình 2 : Cơ quan sinh dục chuột cái

1 Tuyến thượng thận; 2 Thận; 3 Buồng trứng; 4 Noãn phễu; 5 Tử cung;

6 Ống dẫn tiểu; 7 Bàng quang; 8 Ống thoát tiểu; 9 Lỗ tiểu;

10 Lỗ sinh dục ; 11 Hậu môn [Diệu Linh, 1981]

8

1234

567

91011

Hình 3: Buồng trứng động vật hữu nhũ trong thời kỳ sinh dục

[www.eme.maricopa.edu/vc/BioBookRepRod hmt]

3.2.2 Cấu trúc chi tiết:

Bổ đôi buồng trứng qua rốn, người ta phân biệt được hai phần:

3.2.2.1 Phần vỏ:

Là phần ngoại vi của buồng trứng Từ ngoài vào trong gồm có:

a) Biểu mô buồng trứng (biểu mô vuông đơn) Nằm trên mặt buồng trứng, cấu tạo

bởi một hàng tế bào hình khối vuông nằm sát nhau Những tế bào ấy có ít bào tươngvà một nhân bắt màu mạnh, đôi khi có hình giảm phân Thỉnh thoảng biểu mô ẩn sâu vào trong vùng vỏ tạo nên thừng thượng mô

b) Màng trắng: là một màng liên kết, hình thành một cái vỏ không có ranh giới rõ rệt

ở phía trong Màng này cấu tạo bởi ít tế bào liên kết, nhưng nhiều chất căn bản

c) Lớp đệm vỏ: là lớp tổ chức liên kết khá đặt cấu tạo bởi ít sợi chun và nhiều sợi tạo

keo, nhưng nhiều tế bào hình thoi non nằm sát nhau

Trong lớp đệm vỏ có những khối hình cầu gọi là noãn nang, ở những giai đoạn tiến triển khác nhau Mỗi nang noãn là một cái túi đựng noãn, noãn là một tế bào thuộc dòng sinh dục cái gọi là dòng noãn Thành túi cấu tạo bởi những tế bào biểu mô gọi là tế bào nang (tế bào hạt) có cùng nguồn gốc với tế bào dòng noãn nghĩa là phát sinh từ biểu

mô xoang cơ thể thuộc trung bì trung gian [Phạm Phan Địch 1998]

Những nang noãn:

Kết quả cuối cùng của sự sinh noãn là hình thành các nang sơ cấp

Sự sinh noãn có thể chia thành những giai đoạn khác nhau tương ứng với những pha phát triển của noãn [Diệu Linh, 1987]

Hình 4: Sự biến đổi nang noãn

a Nang nguyên thuỷ; b Nang noãn đặc; c Nang noãn có hốc; d Nang noãn chín ; e

Sự rụng trứng; f Hoàng thể.

[www.mum.org/ovary.hmt]

* Noãn nguyên bào (nguyên thuỷ):

Đó là những nang noãn nhỏ nhất, xếp thành nhiều hàng ở vùng ngoại biên của buồng trứng, ngay dưới màng trắng Mỗi nang noãn gồm có từ trong ra ngoài:

- Một noãn bào I nằm chính giữa nang

- Chung quanh noãn có một vài hàng tế bào nang dẹt gọi là tế bào hạt

- Ngoài cùng là một màng đáy, bọc toàn bộ nang noãn gọi là vỏ nang [Phạm Phan Địch 1998]

Hình 5: Nang noãn nguyên thuỷ

[www.ansi.okstate.edu/…/study/Note/Female/]

Nhân

Nhân noãn

Trong noãn sào, các noãn nguyên bào đã có thể phân biệt với các tế bào khác nhờ kích thước lớn, có sự phân phối nguyên sinh chất khá đặc sắc [Nguyễn Xuân Hoạt - Phạm Đức Lộ,1980]

Noãn nguyên bào chỉ phát triển và tồn tại trong buồng trứng ở giai đoạn phôi thai noãn nguyên bào có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội Qua nhiều lần gián phân nguyên nhiễm, cuối cùng chúng sinh ra những noãn bào cấp I

Sau khi con cái non sinh ra, các noãn nguyên bào lớn lên (trừ: chó, thỏ, chuột lang,…) trong buồng trứng ở các nang noãn [Diệu Linh 1981]

Quá trình tiến triển của nang noãn nguyên thuỷ thành nang noãn chín trải qua nhiều giai đoạn

* Nang noãn sơ cấp (noãn nang cấp I):

Là giai đoạn phát triển tiếp theo của nang noãn nguyên thuỷ Có kích thước lớn noãn nguyên thuỷ Gồm một noãn bào I và một hàng tế bào nang vuông Các tế bào nang phát triển nhờ quá trình gián phân [Trương Đình Kiệt 2002]

Trong bào tương của noãn bào I có những biến đổi đáng chú ý: Bộ golgi phát triển mạnh và phân bố rộng khắp bào tương Các ống thuộc hệ thống lưới nội bào có hạt dài ra

và có nhiều hạt ribôxôm bám vào mặt ngoài thành ống Những ribôxôm tự do phong phú

và phân bố khắp bào tương

Chung quanh nó xuất hiện 1 màng gọi là màng trong suốt ngăn cách noãn với những tế bào nang Màng này được tạo ra trong suốt quá trình tiến triển của nang noãn nguyên thủy Lúc mới đầu, xen giữa noãn bào I và tế bào nang có một khoảng trống hẹp, trong đó có những vi nhung mao của noãn và những phần lồi hình ngón tay của tế bào nang tiến vào Rồi trong khoảng trống này xuất hiện một chất vô hình ngày càng nhiều làm cho nó rộng ra Chất này dần dần đặc lại, vùi các vi nhung mao của noãn bào I và các phần lồi hình ngón tay của bào trứng, tế bào nang và tạo ra một cái màng gọi là màng trong suốt, có tính chiết quang cao cấu tạo bởi glucoprotein ngăn cách noãn bào I và tế bào nang

Ở nang noãn chuột đã tiến triển, ở màng trong suốt có glucoprotein chiếm gần toàn bộ khối lượng của màng và đóng vai trò quan trọng trong sự kết dính tinh trùngvà có tính đặc hiệu cho loài, một hiện tượng rất quan trọng trong quá trình thụ tinh.[Bộ môn mô học

và phôi thai học - ĐHYDHN 2002]

Hình 6: Nang noãn cấp I

[www.ansi.okstate.edu/…/study/Note/Female/]

* Nang noãn đặc (noãn nang thứ cấp - noãn nang cấp II):

Lớn hơn nang noãn sơ cấp, noãn đã lớn Từ trong ra ngoài nang noãn đặc cấu tạo gồm:

+ Noãn bào I: Nằm ở trung tâm vẫn đang tiếp tục lớn và tiếp tục ngừng quá trình phân bào

+ Màng trong suốt bao quanh noãn bào I rõ rệt và đang dày lên Lớp hạt, được gọi như vậy vì gồm nhiều hàng tế bào đa diện nằm sát nhau, lấm tấm những nhân trông giống hình hạt, tạo thành một biểu mô tầng do sự tăng sinh của tế bào nang Những tế bào nang

tạo thành lớp này còn gọi là tế bào hạt.

+ Màng đáy

Vỏ liên kết mỏng, được tạo ra từ mô kẽ vây quanh nang noãn Giới hạn bên ngoài của vỏ này lúc mới đầu rất khó phân biệt với mô kẽ [Bộ môn mô học và phôi thai học - ĐHYDHN 2002]

Hình 7: Nang noãn đặc

[www.ansi.okstate.edu/…/study/Note/Female/]

* Nang noãn có hốc (nang noãn có xoang):

Khi nang noãn thứ phát đã lớn (ở người có thể đạt đường kính 200 micromet) và trong nang noãn lớp hạt đã có 6-10 hàng tế bào nang vây quanh noãn bào I Ở một số nơi trong lớp này, một chất dịch lỏng, sáng màu, tập trung ngày càng nhiều trong các khoảng gian bào, làm cho các khoảng này ngày càng rộng ra thành các hốc có kích thước to nhỏ khác nhau và hình thành chất dịch ấy Những hốc này gọi là hốc nang noãn và lúc này nang noãn thứ phát gọi là nang noãn có hốc, chất dịch chứa trong hốc nang noãn gọi là dịch nang noãn hay nước nang noãn, là một dịch thấm từ huyết tương nhưng có thành phần cấu tạo khác huyết tương vì chứa nhiều hyaluronat, nhiều yếu tố phát triển, sterid và các hormon hướng sinh dục với nồng độ cao hơn ở huyết tương

Trong nang noãn có hốc, noãn bào I vẫn tiếp tục lớn lên và tiếp tục ngừng phân bào Màng trong suốt tiếp tục dày lên và lớp vỏ liên kết bọc ngoài nang noãn ngày càng rõ rệt [Bộ môn mô học và phôi thai học - ĐHYDHN 2002]

Hình 8: Nang noãn có hốc

1 Lớp hạt; 2 Hốc nang trứng; 3 Gò noãn; 4 Noãn.

[Phạm Phan Địch 1998]

* Nang noãn có hốc điển hình:

Dịch nang noãn chứa trong các hốc ngày càng nhiều các hốc ngày càng lớn , thông với nhau , rồi hợp với nhau thành những hốc lớn hơn, cuối cùng thành một hốc duy nhất rất lớn Lúc bấy giờ nang noãn thứ phát gọi là nang noãn có hốc điển hình hay nang noãn

có hốc duy nhất

Ở những nơi có hốc xuất hiện hợp lại với nhau, thông với nhau, lớp hạt mất tính chất của lớp biểu mô tầng Các tế bào nang tách xa nhau ra, biến đổi hình dạng, có thể trở thành tế bào hình sao, có các nhánh liên lạc với nhau Hốc duy nhất chứa dịch nang noãn tiếp tục lớn [Bộ môn mô học và phôi thai học - ĐHYDHN 2002]

Hình 9: Nang noãn có hốc điển hình.

1 Tế bào nang; 2 Noãn bào; 3 Vỏ nang; 4 Hốc nang.

[www.ansi.okstate.edu/…/female/sldo16.hmt]

123

1 3 2

4

4

* Nang noãn chín (nang De-graff):

Đó là nang noãn rất lớn

Vào khoảng giữa chu kỳ kinh nguyệt trong cả hai buồng trứng thường chỉ có một (đôi khi 2-3) nang noãn chín lồi lên mặt buồng trứng Chung quanh nang noãn tổ chức lớp đệm vỏ tạo ra hai lớp vỏ Ở mặt ngoài buồng trứng cả hai lớp vỏ rất mỏng, nói chung chỉ 2-3 hàng tế bào nang Ở gò noãn, chung quanh noãn có màng trong suốt bao bọc, những

tế bào nang cao lên thành một hàng tế bào trụ, tạo ra hình ảnh tia mặt trời gọi là vòng tia (vòng phóng xạ) [Bộ môn mô học và phôi thai học - ĐHYDHN 2002]

Khi rụng trứng, noãn bào II được tạo ra và bắt đầu tiến hành ngay lần phân bào thứ hai của quá trình giảm phân

Trước khi rụng trứng một chút, các tua của loa vòi trứng chuyển động mạnh quét lên khắp mặt buồng trứng Bởi vậy, khi được phóng thích khỏi buồng trứng, noãn bào II (được bọc lần lượt từ trong ra ngoài bởi màng trong suốt và vòng tia), được loa vòi trứng hứng lấy, lọt vào trong vòi trứng, được vận chuyển trong vòi trứng, về phía tử cung Trong lòng vòi trứng, noãn bào II tiếp tục lần phân bào II của giảm phân

Như vậy, phần lớn các kỳ của lần phân bào II xảy ra bên ngoài buồng trứng

Tế bào nang

Hốc nang Noãn bào

Trong noãn chín, bào tương chứa nhiều nhất chất dinh dưỡng cần thiết để noãn sử dụng sau khi thụ tinh, trong các giai đoạn đầu của quá trình phát triển cá thể Bên cạnh đó mọi hoạt động tổng hợp và chuyển hóa hầu như ngừng lại Noãn chín ở trạng thái tiềm sinh.

Sự vỡ các nang trứng để gây ra hiện tượng rụng trứng không phải chỉ do áp lực của dịch nang noãn và thành hốc nang noãn đã tăng tới mức tối đa mà còn do cấu tạo hình thái và hoá học của nang noãn chín, sự sắp xếp thành phần cấu tạo nang noãn

[Bộ môn mô học và phôi thai học - ĐHYDHN 2002]

Hình 11: Nang noãn chín (A) và sự rụng trứng (B)

1 Biểu mô buồng trứng; 2 Mô kẽ; 3 Vỏ xơ; 4.Tế bào vỏ ở lớp vỏ

trong; 5 Mạch máu ở lớp vỏ trong; 6 Lớp hạt; 7 Vết trong suốt;

8 Hốc nang noãn; 9 Vòng tia.

[Bộ môn mô học và phôi thai học - ĐHYDHN 2002]

* Sự phát triển của nang noãn vỡ đã mất noãn và sự hình thành, phát triển của

hoàng thể.

Sự phát triển của nang noãn vỡ đã mất noãn và sự tạo thành hoàng thể.

Sau khi rụng trứng, dịch nang noãn đã thoát ra ngoài, nang noãn vỡ, mất noãn, trở thành nhăn nheo và được gọi là nang noãn nhăn Màng đáy ngăn cách lớp vỏ và lớp hạt,

bị rách Một số mao mạch máu nằm ở lớp vỏ trong bị vở Máu thoát mạch, tạo thành một cục máu đông nằm ở trung tâm nang noãn vỡ Những tế bào nang của lớp hạt và những tế bào vỏ nằm ở lớp vỏ trong của nang noãn trương to, tích luỹ nhiều giọt mỡ trong bào tương và có màu vàng nhạt Những tế bào này gọi là tế bào hoàng thể Chúng tăng sinh tạo thành một khối tế bào vây quanh cục máu đông, làm cho nang noãn vở biến thành một cấu trúc màu vàng ( khi nhìn trên tiết đồ buồng trứng còn tươi, chưa nhuộm) gọi là hoàng thể, được bọc ngoài bởi một vỏ xơ vốn là vỏ liên kết của nang noãn vở Rồi những mạch máu từ lớp vỏ xơ tiến vào khối tế bào tăng sinh, xẻ khối tế bào ấy thành những dây

tế bào biểu mô có quan hệ mật thiết với chúng Trong khi đó cục máu đông ở vùng trung tâm của hoàng thể biến thành một khối xơ [Bộ môn mô học và phôi thai học - ĐHYDHN 2002]

Cấu tạo và mô sinh lý học hoàng thể.

- Cấu tạo: theo kiểu được tạo ra như vừa mô tả trên, hoàng thể là một tuyến nội tiết kiểu lưới nằm trong buồng trứng và được bọc ngoài bởi một vỏ xơ, ngăn cách nhu mô tuyến với mô kẽ của vùng vỏ buồng trứng

Trong nhu mô tuyến của hoàng thể đang phát triển, có thể phân biệt hai loại tế bào hoàng thể: tế bào hạt hoàng thể và tế bào vỏ hoàng thể

+ Tế bào hạt hoàng thể: nằm ở vùng trung tâm hoàng thể, những tế bào hạt hoàng thể là những tế bào đa diện lớn, phát sinh từ những tế bào nang (tế bào hạt) thuộc lớp hạt của nang noãn tiến triển Kích thước của chúng thay đổi tuỳ theo giai đoạn phát triển của hoàng thể Mặt tế bào có những vi nhung mao dài và có những chỗ lõm vào bào tương Nhân có một hạt nhân lớn nhưng những hạt dị nhiễm sắc nhỏ nên nhân đậm màu Ti thể

có tính đa hình, hình que, hình cầu, lớn Ở hoàng thể thai nghén, ti thể hình que chiếm ưu thế Chất nền ti thể chứa những hạt có hình dáng không đều và lớn hơn những hạt thấy ở chất nền ti thể của các loại tế bào khác

Hình 12: Sự hình thành hoàng thể và cấu tạo vi thể của hoàng thể

A Sự tạo ra hoàng thể; B Cấu tạo vi thể của hoàng thể

1 Biểu mô buồng trứng; 2 tế bào kẽ; 3 Vỏ xơ của nang noãn đã vở mất noãn;

4 Mạch máu từ vỏ xơ tiến vào khối tế bào tăng sinh;

5 Tế bào vỏ hoàng thể; 6 Tế bào hạt hoàng thể.

[Bộ môn mô học và phôi thai học - ĐHYDHN 2002]

Tế bào vỏ hoàng thể: nằm ở vùng ngoại vi của hoàng thể, những tế bào vỏ hoàng thể cũng có hình đa diện, nhưng nhỏ hơn và bắt màu đậm hơn tế bào hạt hoàng thể, nhưng khác với những tế bào này bởi trên mặt chúng không có những vi nhung mao dài Những hạt dị nhiễm sắc trong nhân lớn hơn, rõ rệt hơn nên bắt màu đậm hơn Ti thể có tính đa hình, hình que, hình cầu Ở hoàng thể thai nghén, ti thể hình que chiếm ưu thế Chất nền ti thể có hình dạng không đều và lớn hơn những hạt thấy ở chất nền ti thể của các loại tế bào khác

Đặc điểm cấu tạo nổi bậc của tế bào hạt hoàng thể là sự phong phú cấu tạo lưới nội bào không hạt cấu tạo bởi những ống nối với nhau thành một lưới rất khít Lưới nội

bào có hạt thưa thớt Bộ Golgi phong phú và được phân bố nhiều vùng trong bào tương Nhiều giọt mỡ nằm riêng rẽ hoặc tập hợp thành đám và có quan hệ mật thiết với những đám lưới nội bào không hạt tụ đặc Những hạt tụ đặc có hình dáng không đều được coi là những lysosome với số lượng thay đổi và tăng trong quá trình phát triển của hoàng thể Trong những tế bào hạt hoàng thể tạo thành hoàng thể thai nghén, có những hạt đặc khác, không phải là lysosome và đươc coi là nơi tích lũy relaxin, một hormon thuộc loại polypeptid

+ Tế bào vỏ hoàng thể: nằm ở vùng ngoại vi của hoàng thể, những tế bào vỏ hoàng thể cũng có hình đa dạng, nhưng nhỏ hơn và bắt màu đậm hơn tế bào hạt hoàng thể, nhưng khác với những tế bào này bởi trên mặt chúng không có những vi mao dài Những hạt dị nhiễm sắc trong nhân lớn hơn, rõ rệt hơn nên bắt màu đậm hơn Ti thể có hình dạng cố định hơn Không có ti thể hình cầu Chất nền ti thể không có những hạt đa hình

Bộ Golgi kép phong phú nhưng lớn hơn Lưới nội bào không hạt chiếm phần lớn bào tương

- Mô sinh lý học hai loại tế bào hoàng thể mô tả trên có nguồn gốc khác nhau, có siêu cấu trúc không giống nhau và có tính đáp ứng khác nhau với tác động của hormon hoàng thể hóa LH Chúng tiết ra những hormon khác nhau tuy các hormon đều thuộc loại steroid Những tế bào vỏ hoàng thể không phải đều thấy ở hoàng thể mọi động vật có vú [Bộ môn mô học và phôi thai học - ĐHYDHN, 2002]

* Các nang noãn thoái triển:

Tuyệt đại đa số các nang noãn được tạo ra trong buồng trứng từ đời sống trong bụng mẹ bị thoái triển Sự thoái triển xảy ra mạnh nhất khi nó ra đời, lúc dậy thì và lúc mãn kinh Những nang noãn thoái triển có thể là nang noãn chưa tiến triển (nang noãn tiến triển hoặc nang noãn đã tiến triển tới một giai đoan nào đó và cũng có thể là những nang noãn chín hoặc nang noãn vỡ đã phóng thích noãn nhưng không tạo ra hoàng thể).Những nang noãn thoái triển có cấu tạo khác nhau tuỳ theo giai đoạn tiến triển mà chúng đã trãi qua Có nhiều dạng nang noãn thoái triển

+ Nang noãn thoái hoá:

Đó là những nang noãn mà sự thoái triển xảy ra rất sớm, khi nang noãn chưa tiến triển, nghĩa là ở giai đoan nang noãn nguyên thuỷ, hay khi nang noãn mới bắt đầu tiến triển (nang noãn nguyên phát) Những nang noãn này mau chóng biến đi hoàn toàn, không để lại vết tích gì

+ Nang noãn xuất huyết:

Sự thoái triển bắt đầu xảy ra ở giai đoạn nang noãn có hốc Hốc nang noãn chứa máu đã đông Các tế bào nang ở thành hốc và noãn đều bị thoái hoá Vết tích của nang noãn thoái hoá gọi là thể đen (corpora nigra)

+ Nang noãn tạo tuyến vỏ:

Người ta phân biệt:

- Nang noãn thiếu phát triển Sự thoái triển xảy ra ở nang noãn có hốc có kích thước vừa phải Trong nang noãn này noãn và lớp hạt bị thoái hoá, chỉ còn sót lại lớp vỏ liên kết.

- Nang noãn túi Sự thoái triển xảy ra ở nang noãn có hốc rất lớn hay chưa lớn lắm Lớp hạt thoái hoá nhưng lớp nang chưa biến đi mau chóng Lớp vỏ trong dày lên, tạo thành một màng có lổ thủng Vết tích của nang noãn túi là một thể xơ trong suốt cấu tạo bởi một lớp mô liên kết bị phù

+ Nang noãn nhăn:

Sự thoái triển bắt đầu xảy ra ở nang noãn đã vỡ, đã phóng thích noãn, nhưng không phát triển thành hoàng thể Hốc nang noãn biến mất do thành hốc trở nên nhăn nhúm Lớp hạt và lớp vỏ vẫn còn Nhưng lớp này có thể tăng sinh làm cho nang noãn trương to (nang noãn nhăn phì đại) Vết tích của nang noãn nhăn phì đại là một màng rất nhăn nheo [Bộ môn mô học và phôi thai học - ĐHYDHN 2002]

3.2.2.2 Phần tuỷ:

Phần trung tâm của buồng trứng gọi là phần tuỷ, là một tổ chức liên kết thưa: nhiều sợi cơ trơn và dây thần kinh vận động, cảm giác, vận mạch, nhiều hạch bạch huyết mà hầu hết là những khe bạch huyết, và nhiều mạch máu

Ở đây những động mạch chạy ngoằn ngoèo như lò xo và bắt nguồn từ những động mạch buồng trứng và đông mạch tử cung

Những động mạch cùng những tĩnh mạch tạo thành một tổ chức cương Khi giãn

ra, chúng có thể làm cho buồng trứng trương lên khá nhiều

Ở vùng rốn buồng trứng, những di tích phôi thai gọi là rete ovarii xuất hiện dưới hình thức những dãy tế bào hay một vài nang nước nhỏ Chúng tương đương với những retetestis của tinh hoàn Thành của những nang ấy là biểu mô vuông.[Phạm Phan Địch 1998]

PHẦN III: PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN



1 PHƯƠNG TIỆN VÀ HOÁ CHẤT:

1.1 Địa điểm - thời gian thực hiện đề tài:

- Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm sinh lý động vật, Bộ môn Sinh, Khoa

Sư phạm Trường Đại học Cần Thơ

- Thời gian thực hiện đề tài : từ tháng 10 năm 2005 đến tháng 5 năm 2006

1.2 Phương tiện và hoá chất:

1.2.1 Phương tiện và mẫu vật:

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

2.1 Thực hiện mẫu ngâm đại thể:

Thao tác thực hiện có thể đơn giản hơn so với giải phẩu nghiên cứu tổng thể nội quan

Có thể tóm lược như sau:

- Sau khi bị gây mê bằng ete, đặt chuột nằm ngửa, kéo 4 chân và ghim xuống tấm cao su đặt trên mâm mổ

- Sau đó tiến hành cắt da, theo các đường trong hình 13a

Hình 13a :Cắt da.

- Căng da ghim xuống tấm cao su

- Tiếp theo cắt cơ bụng và cơ hoành theo sơ đồ hình 13b

Hình 13b: Cắt thịt

[Nguyễn Mỹ Tín - Nguyễn Thanh Tùng 2005]

- Gỡ hệ tiêu hóa trình bày sang bên phải Gỡ bỏ phần mở dính trong khoang bụng

để thấy rõ hệ sinh dục và hệ bài tiết

- Cố định mẫu trên tấm nhựa có đục lỗ

- Đặt mẫu vào trong hộp dựng dung dịch formol dehyd 15% (trước khi trữ mẫu vĩnh viễn nên thay dung dich formol 10% 2 đến 3 lần)

2.2 Thực hiện mẫu hiển vi:

Nghiên cứu cấu trúc noãn sào chuột thông qua việc thực hiện tiêu bản hiển vi cố định gồm những bước có tính chất nguyên tắc : lấy mẫu, cố định, khử nước, tẩm parafin, đúc khuôn, cắt lát, nhuộm mẫu, khử nước, làm trong và gắn mẫu Tất cả các bước trên cần phải được tiến hành theo đúng trình tự, thao tác kỹ thuật và thời gian xử lý phải thật hợp lý Nếu không tuân thủ sẽ đưa đến kết quả xấu

Vật liệu và phương tiện chính là cơ sở cho việc nghiên cứu mô học Ngoài ra nó còn phụ thuộc vào tài liệu tham khảo, cơ sở vật chất trong phòng thí nghiệm

2.2.1 Lấy mẫu:

Thao tác mổ giai đoạn định hình chuột: cắt da, cắt thịt tương tự phương pháp giải phẫu động vật có vú kích thước nhỏ nhưng không cần quan tâm đến các nội quan khác chỉ tách lấy buồng trứng Vì buồng trứng chuột nhỏ, mềm được treo bởi màng treo buồng trứng ở trên và liên kết với vòi Fallope ở dưới và được bọc bởi lớp mỡ dày Vì vậy thao tác lấy phải cẩn thận tránh làm dập và bị phạm vào buồng trứng Nên sử dụng kéo mũi nhọn Sau khi tách bỏ hệ tiêu hoá, hệ bài tiết để lộ hệ sinh dục từ đó tìm vị trí buồng trứng

Hình 14: Ảnh chụp giải phẫu chuột đồng

A Chuột chưa mang thai; B Chuột mang thai

Cố định trong dung dịch Bouin đựng trong lọ thuỷ tinh (giai đoạn này được thử nghiệm qua các thời gian: 18 giờ - 12 giờ - 8 giờ - 4 giờ) Trong quá trình cố định nên thường xuyên lắc đều mẫu để trộn đều dung dịch cường nhủ, không để mặt mẫu luôn tiếp xúc với đáy lọ không được tiếp xúc tốt với dung dịch cố định mẫu cố định đồng bộ

A

12