Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau

Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy

yyyyyyyyyyyyyyyyyyyy ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

ĐỊA PHƯƠNG HÀ GIANG - VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN MINH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN

KHÁC NHAU

LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN MINH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN

Trang 3

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này

Tôi xin cảm ơn các kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Sinh học, Khoa Khoa học Sự sống, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành một số thí nghiệm

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên khuyến khích và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó!

Thái Nguyên, ngày 1 tháng 03 năm 2014

Tác giả luận văn

Trang 4

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CÂY LÚA 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây lúa 4

1.1.3 Giá trị kinh tế của cây lúa 5

1.1.4 Đặc điểm hóa sinh hạt gạo 6

1.1.5 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và Việt Nam 6

1.2 HẠN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY LÚA 9

1.2.1 Hạn và ảnh hưởng của hạn tới cây trồng 9

1.2.2 Tình hình nghiên cứu đặc tính chịu hạn của cây lúa1.2.3 Cơ sở sinh lý, hóa sinh và di truyền của tính chịu hạn của cây lúa 11

1.2.4 Cystatin và vai trò của cystatin với tính chịu hạn 18

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 VẬT LIỆU 24

2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 25

2.2.1 Hóa chất 25

2.2.2 Thiết bị 26

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.3.1 Phương pháp sinh lí, hóa sinh 26

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử 33

2.3.3 Phương pháp xác định trình tự nucleotide 39

2.3.4 Phương pháp xử lí trình tự gen 39

2.3.5 Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu 39

Trang 5

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HOÁ SINH HẠT CỦA 9 MẪU LÚA NGHIÊN CỨU 41

3.1.1 Đặc điểm hình thái và khối lượng hạt 41

3.1.2 Hàm lượng protein và lipid 42

3.1.3 Hoạt tính α – amylase 43

3.1.4 Hoạt tính protease 44

3.1.5 Chiều dài rễ của 9 giống lúa nghiên cứu ở giai đoạn cây non 44

3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA 9 GIỐNG LÚA Ở GIAI ĐOẠN CÂY MẠ 46

3.3 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 48

3.3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 48

3.3.2 Kết quả nhân gen Cystatin 49

3.3.3 Kết quả xác định trình tự gen Cystatin 50

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54

1 Kết luận 54

2 Đề nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

Trang 6

ABA Abscisic Acid (Axit abxisic)

CTAB Cetyltrimethyl – amonium bromide

CUC Cup Shaped Cotyledon

P5CS Pyroline – 5 – carboylate synthase

TAE Tris Acetate EDTA

Trang 7

Trang

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới từ năm 2000 – 2012 7

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam từ năm 2000 – 2012 9

Bảng 2.1 Đặc điểm của 09 giống lúa nghiên cứu 24

Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị sử dụng 26

Bảng 2.3 Cặp mồi nhân gen cystatin 35

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng nhân gen cystatin 35

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector 36

Bảng 3.1 Hình thái và khối lượng hạt của 9 giống lúa 41

Bảng 3.2 Hàm lượng protein và lipid của 9 giống lúa 42

Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme α – amylase của 9 giống lúa 43

Bảng 3.4 Hoạt tính protease của 9 giống lúa 44

Bảng 3.5 Chiều dài rễ của 9 giống lúa 45

Bảng 3.6 Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của 9 giống lúa 46

Bảng 3.7 Phổ hấp phụ DNA ở bước sóng 260 nm và 280 nm của 2 giống lúa nghiên cứu 49

Trang 8

Hình 2.1 Hình ảnh hạt của 9 giống lúa nghiên cứu……….25 Hình 2.2 Vector pBT 37Hình 3.1 Đồ thị rada biểu diễn khả năng chịu hạn của 9 giống lúa nghiên cứu 47Hình 3.2 Hình ảnh điện di DNA tổng số của 2 giống lúa nghiên cứu 48Hình 3.3 Hình ảnh điện di kết quả PCR nhân gen Cystatin ở 2 mẫu

luá LH và Sym6 50Hình 3.4 Kết quả điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen cystatin 50Hình 3.5 Trình tự nucleotide của gen cystatin ở hai giống LH và

Sym6 521

Hình 3.6 So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein cystatin ở hai giống lúa nghiên cứu và AF435976……… ….….53

Trang 9

MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Lúa gạo (Ozyza sativa L.) là cây lương thực chiếm 10% diện tích trồng

trọt và là cây lương thực chính nuôi sống hơn nửa dân số thế giới Hiện nay, lúa được xếp vào vị trí thứ hai sau lúa mì về diện tích và sản lượng Lúa gạo

là nguồn cung cấp năng lượng lớn nhất cho con người Trên thế giới, cây lúa được khoảng 250 triệu nông dân trồng ở hơn 100 nước trên thế giới Ở Việt Nam, lúa là cây lương thực quan trọng được trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác

Trong những thập kỉ qua, loài người đang đứng trước nguy cơ bùng nổ

về dân số và theo FAO để đảm bảo mức tiêu dùng ổn định, mức tăng sản lượng hàng năm cần gấp 2 lần so với mức tăng dân số Trước tình hình đó cây lúa đã và đang là đối tượng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học

Trong những năm gần đây, quá trình biến đổi khí hậu trên trái đất diễn

ra khá phức tạp, khó lường theo chiều hướng xấu của môi trường như: Hạn hán, lũ lụt, xói mòn, thoái hoá đất,…Ở Việt Nam, trong những năm qua, do còn có hạn chế về điều kiện tưới tiêu, tập quán canh tác và đặc biệt là việc chọn giống chịu hạn đưa vào sản xuất chưa được chú trọng, thêm vào đó là diễn biến thời tiết phức tạp, hạn hán thường xuyên xảy ra đã gây ảnh hưởng không nhỏ đến năng suất và chất lượng của nhiều loại cây trồng trong đó có cây lúa Cây lúa là loài cây tương đối mẫn cảm với những điều kiện bất lợi của ngoại cảnh và thuộc nhóm cây chịu hạn kém Vì vậy, việc tạo ra các giống lúa có năng suất cao, khả năng chống chịu tốt là yêu cầu thực tiễn đề ra cho các nhà khoa học

Trên thế giới hiện nay, chọn tạo cây trồng theo hướng chống chịu đang

là vấn đề được đặt trọng tâm nghiên cứu, trong đó chọn tạo giống lúa theo hướng chống khô hạn nhận được sự quan tâm của rất nhiều các nhà khoa học

Trang 10

Nghiên cứu về gen liên quan đến tính chịu hạn cho thấy tính chống chịu khô hạn là tính trạng đa gen Các trình tự gen liên quan đến tính chịu hạn ở cây lúa đã được công bố trên ngân hàng gen Quốc tế, trong đó có gen cystatin

Cystatin là chất ức chế có bản chất protein, gen này thường được biểu hiện trong các điều kiện hạn, lạnh, mặn và ở các pha riêng rẽ của quá trình sinh trưởng, phát triển của thực vật Mặc dù các nghiên cứu về gen liên quan đến tính chịu hạn ngày càng được quan tâm nhưng thông tin về các gen này chưa nhiều Vấn đề đặt ra là cần tìm hiểu đặc điểm sinh lý, hoá sinh và sinh học phân tử liên quan đến tính chịu hạn của cây lúa Trên cơ sở đó định hướng cho công tác chọn giống và cải tạo giống phù hợp có khả năng chịu hạn tốt

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn của việc chọn tạo giống lúa theo hướng nâng cao khả năng chịu hạn, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu:

“Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Xác định được mức độ chịu hạn của một số giống lúa ở giai đoạn cây non

- Xác định được mối liên quan giữa hoạt tính của α – amylase, protease,

chiều dài rễ với khả năng chịu hạn của một số giống lúa

- Phân lập và xác định được trình tự gen cystatin ở một số giống lúa có

khả năng chịu hạn khác nhau

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Đánh giá khả năng chịu hạn bằng phương pháp gây hạn nhân tạo ở giai

đoạn 3, 5, 7, 9 ngày gây hạn

- Xác định hoạt tính của α – amylase, protease trong hạt của 09 giống lúa

nghiên cứu

- Xác định chiều dài rễ 5 ngày tuổi ở giai đoạn cây non

- Khuyếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen cystatin ở 1 giống lúa

có khả năng chịu hạn tốt và 1 giống lúa chịu hạn kém

Trang 11

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY LÚA

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Lúa có nguồn gốc nhiệt đới và cận nhiệt đới khu vực Đông Nam châu

Á và châu Phi Lúa là loài thực vật sống một năm, lá mỏng, bản hẹp, hoa nhỏ

tự thụ phấn mọc thành cụm hoa phân nhánh cong hay rủ xuống Cây lúa có

tên khoa học là Ozyza sativa L., có bộ nhiễm sắc thể 2n = 24, là cây thân thảo

sinh sống hàng năm Thời gian sinh trưởng của các giống dài ngắn khác nhau khoảng 60 – 250 ngày

Lúa trồng hiện nay do giống lúa dại Oryza fatua hình thành thông qua

quá trình chọn lọc nhân tạo lâu dài Sự tiến hoá của cây lúa gắn liền với sự phát triển của loài người, đặc biệt là ở châu Á Theo các tài liệu ghi chép, cây lúa được trồng ở Trung Quốc khoảng 2800 – 2700 năm TCN Ở Việt Nam, theo các tài liệu đã được công bố thì cây lúa được trồng phổ biến và nghề trồng lúa đã khá phồn thịnh ở thời kì đồ Đồng (4000 - 3000 năm TCN) [8]

Trên thế giới, cây lúa phân bố khá rộng, từ vĩ tuyến 530B (sông Amua biên giới Trung Quốc – Nga) đến vùng xích đạo và vĩ tuyến 400 N (Achentila), từ vùng thấp 3m dưới mặt nước biển độ cao 2700m [12] Hiện

nay có hai loài lúa đã được thuần hoá là lúa châu Á (Oryza sativa) và lúa châu Phi (Oryza glaberrima)

Lúa châu Phi đã được gieo trồng trong khoảng 3.500 năm, tuy nhiên nó không phát triển xa khỏi khu vực nguồn gốc của nó Việc gieo trồng loài lúa này thậm chí còn suy giảm do các giống châu Á

Hiện nay, lúa châu Á là giống lúa chính được gieo trồng làm cây lương thực trên khắp thế giới Châu Á được xem là quê hương của cây lúa nước vì nơi đây có đủ điều kiện để phát triển giống lúa này, cũng là nơi xuất hiện nền văn minh lúa nước, có thể xem đây là một trong những trung tâm nông nghiệp đầu tiên trên thế giới

Trang 12

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây lúa

Lúa bao gồm các bộ phận: rễ, thân, lá, hoa và hạt

Rễ lúa thuộc loại rễ chùm Rễ còn non có màu trắng sữa, rễ trưởng thành có màu vàng nâu và nâu đậm, rễ đã già có màu đen Khi hạt lúa nảy mầm thì mới chỉ có một rễ là rễ phôi Sau đó, các rễ khác mọc ra từ các đốt thân và khi có một lá thật thì cây lúa đã có thể có 4 – 6 rễ mới, càng về sau số lượng rễ càng nhiều lên

Thân lúa gồm thân giả và thân thật Thân lúa dạng ống tròn, rỗng gồm nhiều đốt Cắt ngang một lóng thân, ngoài cùng là biểu bì, tiếp đến là hạ bì Thân lúa gồm các mô cơ liên kết với nhau tạo lên độ cứng của thân Các mạch dẫn liên kết với nhau tạo thành bó mạch, phần còn lại của thân lúa là các tế bào màng mỏng Thân gồm nhiều mắt và lóng Trước thời kỳ lúa trỗ, thân lúa được bao bọc bởi bẹ lá Số lóng dài từ 3-8 lóng

Lá lúa gồm có phiến lá, cổ lá và bẹ lá Phiến lá dài trung bình là 40cm, đầu nhọn, hai bên mép lá có gai nhỏ Tại cổ lá có hai thìa lá và hai tai

30-lá Bẹ lá phát triển ôm lấy thân Bẹ lá: là phần đáy lá kéo dài cuộn thành hình trụ và bao phần non của thân Phiến lá hẹp, phẳng và dài hơn bẹ lá (trừ lá thứ hai) Lá thìa là vảy nhỏ và trắng hình tam giác Tai lá gồm một cặp hình lưỡi liềm Lá được hình thành từ các mầm lá ở mắt thân Tốc độ ra lá thay đổi theo thời gian sinh trưởng và điều kiện ngoại cảnh

Hoa lúa thuộc dạng điển hình của cây hoà thảo gồm vỏ trấu trong, vỏ trấu ngoài, hai mày trấu, nhị đực có 6 bao phấn, nhụy gồm bầu nhụy và 2 vòi nhụy Khi bông lúa nở hoa, vỏ trấu mở ra, 6 bao phấn vươn ra ngoài tung phấn lên vòi nhuỵ Ở lúa có quá trình thụ tinh kép Hạt lúa về bản chất là một quả, hạt gạo gồm 2 phần là nội nhũ và phôi Nội nhũ là phần dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi phôi Phôi nằm ở phía cuống của hạt thóc Khi nảy nầm, phôi

sẽ phát triển thành mầm và rễ để bắt đầu một chu trình phát triển mới [8]

Trang 13

Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa từ khi gieo hạt đến khi thu hoạch trải qua 3 giai đoạn chính là: giai đoạn tăng trưởng, giai đoạn sinh sản và giai đoạn chín Mỗi giai đoạn giữ một vai trò nhất định trong suốt đời sống của cây lúa và yêu cầu những điều kiện ngoại cảnh và dinh dưỡng khác nhau [8]

* Giai đoạn tăng trưởng

Là thời kì từ khi gieo hạt đến khi có đòng Giai đoạn này chia làm 2 thời

kì chính là: thời kì mạ và thời kì đẻ nhánh Thời kì mạ là thời gian từ khi gieo đến khi đẻ nhánh, với các giống có thời gian sinh trưởng khoảng 100 ngày thì thời kì mạ khoảng 18 – 22 ngày Thời kì đẻ nhánh là thời gian từ khi cây lúa đẻ nhánh đến khi có đòng Thời kì này kéo dài khoảng 20 – 25 ngày [8]

* Giai đoạn sinh sản

Là thời gian từ khi có đòng đến khi lúa trỗ bông, kéo dài khoảng 30 –

35 ngày tùy thuộc vào giống lúa

* Giai đoạn chín

Là thời gian từ khi lúa trỗ bông cho đến khi thu hoạch Thời gian này kéo dài khoảng 30 ngày ở tất cả các giống lúa Ở giai đoạn này, lúa thụ phấn, hình thành hạt và lớn lên

1.1.3 Giá trị kinh tế của cây lúa

Lúa là một trong những cây lương thực quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu Bên cạnh vai trò cung cấp lương thực cho con người, lúa còn là nguyên liệu quan trọng của công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, nông nghiệp, y học, Vitamin trong cám gạo có tác dụng chữa phù nề, tiêu hoá kém Vỏ trấu dùng trong công nghiệp sản xuất vật liệu, phân bón Rơm, rạ làm thức ăn cho gia súc, trồng nấm,…

Ngoài ra lúa còn là nguồn hàng hóa xuất khẩu có giá trị cao Trên thế giới hàng năm lượng lúa xuất nhập khẩu đem lại nguồn lợi nhuận kinh tế lớn

Trang 14

Trong các loại cây lương thực lấy hạt ở Việt Nam thì lúa và ngô là hai loại cây lương thực chính, song so với tổng sản lượng của hai loại cây này thì sản lượng ngô chỉ vào khoảng trên dưới 10%

1.1.4 Đặc điểm hóa sinh hạt gạo

Trong hạt gạo có chứa tinh bột, protein, lipid, vitamin,

Tinh bột trong hạt gạo chiếm khoảng 60% - 70% Đây là nguồn chủ yếu cung cấp calo Tinh bột gạo được cấu tạo bởi amylose và amylopectin Amylose có cấu tạo mạch thẳng và có Amylopectin có cấu tạo mạch ngang Hạt gạo chứa nhiều amylose sẽ cứng cơm hơn hạt gạo chứa ít amylose và nhiều amylopectin Gạo nếp chứa ít amylose (dưới 10%) và nhiều amylopectin (trên 90%) nên cơm rất mềm và dẻo Phần lớn các loại gạo thông thường chứa 20% – 25% amylose nên hạt cơm hơi cứng

Protein trong hạt gạo chiếm khoảng 7%- 10% Các giống lúa nếp có hàm lượng protein cao hơn lúa tẻ

Lipid trong hạt gạo chứa khoảng 1% - 3%, nếu gạo xay chiếm khoảng 2,02% , còn gạo đã xát chỉ chiếm khoảng 0,52%

Trong lúa gạo còn có 1 số vitamin cần thiết nhất như B1, B2, B6, PP Ngoài ra, trong hạt gạo còn có chứa một số loại chất khoáng cần thiết

1.1.5 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và Việt Nam

1.1.5.1 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới

Nhiều nhà khoa học cho rằng, cây lúa trồng có nguồn gốc ở Đông Nam châu Á, trong đó Ấn Độ, Miến Điện và Việt Nam là những nơi xuất hiện nghề

trồng lúa đầu tiên của loài người

Qua bảng 1.1 cho thấy, sản lượng lúa từ năm 2000 – 2012 dao động trong khoảng 598,97 triệu tấn đến 719,7triệu tấn trong vòng 13 năm sản lượng lúa đã tăng 120,73 triệu tấn Diện tích trồng lúa từ năm 2000 – 2012 cũng tăng từ 154,11 triệu ha lên 163,19 triệu ha Năng suất lúa trên thế giới

Trang 15

trong 13 năm tăng từ 38,9 tạ/ha lên 44,1 tạ/ha Như vậy, diện tích, sản lượng

và năng suất lúa trên thế giới liên tục tăng

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới từ năm 2000 – 2012 Năm Diện tích

(triệu ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lượng (triệu/tấn)

1.1.5.2 Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam

Nghề trồng lúa ở Việt Nam có lịch sử lâu đời nhất so với nghề trồng lúa

ở các nước châu Á Theo các tài liệu khảo cổ ở Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam Cây lúa đã có mặt từ 3000 - 2000 năm Trước Công Nguyên Tổ tiên chúng ta đã thuần hóa cây lúa dại thành cây lúa trồng và đã phát triển nghề trồng lúa đạt được những tiến bộ như ngày nay

Trước năm 1945, diện tích trồng lúa ở 2 đồng bằng Bắc Bộ và Nam Bộ

là 1,8 triệu và 2,7 triệu ha với năng suất bình quân 13 tạ / ha và sản lượng

Trang 16

thóc tương ứng 2,4 - 3,0 triệu tấn Trong thời gian này chủ yếu là các giống lúa cũ, ở miền Bắc sử dụng các giống lúa cao cây, ít chịu thâm canh, dễ đổ, năng suất thấp

Từ năm 1963- 1965, ở những vùng chuyên canh lúa do diện tích nhiều, thường có một số diện tích cấy chậm, bị muộn thời vụ Nhờ tiến bộ kỹ thuật

đã đưa vào một số giống lúa xuân thấp cây, ngắn ngày đã đảm bảo được thời

vụ Đã chuyển vụ lúa chiêm thành vụ lúa xuân, chuyển từ xuân sớm thành xuân chính vụ (80-90%) diện tích và thời kỳ 1985-1990 sang xuân sớm (5%-10%) và (70%-80%) là xuân muộn Một số giống lúa xuân đã có năng suất cao hơn hẳn lúa chiêm, có thể cấy được cả hai vụ chiêm xuân và vụ mùa Do thay đổi cơ cấu sản xuất lúa, kết hợp với áp dụng hàng loạt các tiến bộ kỹ thuật mới nên sản xuất lúa ở Việt Nam ngày càng phát triển và đạt được những thành tựu đáng kể

Từ năm 1979 đến 1985, sản lượng lúa cả nước tăng từ 11,8 lên 15,9 triệu tấn, nguyên nhân là do ứng dụng giống mới, tăng diện tích và năng suất Tính riêng 2 năm 1988 và 1989 sản lượng lương thực tăng thêm 2 triệu tấn/năm

Từ khi thực hiện đổi mới (năm 1986) đến nay, Việt Nam đã có những tiến bộ vượt bậc trong sản xuất lúa, đưa nước ta từ chỗ là nước thiếu ăn triền miên đã không những đảm bảo đủ lương thực cho nhu cầu trong nước mà còn xuất khẩu từ 3-4 triệu tấn gạo /năm, đứng hàng thứ 2 trên thế giới về các nước xuất khẩu gạo

Việt Nam được coi là một trong những trung tâm trồng lúa lâu đời nhất châu Á Lúa gạo là thức ăn chính của người Việt Nam Tình hình sản xuất lúa

ở Việt Nam từ năm 2000 – 2012 đã được tổng hợp ở bảng 1.2

Qua bảng 1.2 cho thấy, sản lượng lúa giai đoạn 2000 – 2012 dao động

từ 32,555 triệu tấn đến 43,66 triệu tấn, như vậy đã tăng 11,105 triệu tấn trong vòng 13 năm

Trang 17

Diện tích trồng lúa dao động từ 7,655 nghìn ha đến 7,750 nghìn ha Diện tích trồng lúa của năm 2012 tăng so với năm 2000 là 0,095 nghìn ha Nhìn chung, diện tích trồng lúa ở Việt Nam lúc giảm lúc tăng nhưng sản lượng và năng suất lúa thì tăng liên tục, chứng tỏ các giống cho năng suất cao

Sản lượng (triệu/tấn)

1.2 HẠN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY LÚA

1.2.1 Hạn và ảnh hưởng của hạn tới cây trồng

Nước là thành phần bắt buộc của tế bào sống, có nước thực vật mới hoạt động bình thường được Nhưng hàm lượng nước trong thực vật không giống nhau, thay đổi tùy thuộc loài hay các tổ chức khác nhau của cùng một

Trang 18

loài thực vật Hàm lượng nước còn phụ thuộc vào thời kỳ sinh trưởng của cây

và điều kiện ngoại cảnh mà cây sống Cung cấp nước cho cây là điều kiện không thể thiếu được để đảm bảo thu hoạch tốt Việc thỏa mãn nhu cầu nước cho cây là điều kiện quan trọng nhất đối với sự sống bình thường của cây Ngược lại, hạn là hiện tượng xảy ra khi cây bị thiếu nước

Hạn là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước của thực vật do môi trường gây nên làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của thực vật Hạn cũng

có thể được định nghĩa là sự thiếu lượng nước do mưa hoặc tưới nước trong một thời gian dài tạo ra sự cạn kiệt độ ẩm trong đất và gây nên tổn thương cho thực vật [9] Có ba loại hạn cơ bản: hạn đất, hạn không khí và hạn sinh lý Hạn đất xảy ra khi lượng nước dự trữ cho cây hấp thu trong đất bị cạn kiệt nên cây không hút đủ nước và mất cân bằng nước Hạn không khí xảy ra khi

độ ẩm không khí quá thấp làm cho quá trình thoát hơi nước của cây quá mạnh, cây không hút đủ nước và dẫn đến mất cân bằng nước trong cây Hạn sinh lý xảy ra do trạng thái sinh lý của cây không cho phép cây hút được nước mặc dù trong môi trường không thiếu nước Hạn sinh lý kéo dài cũng tác hại như hạn không khí và hạn đất Nếu hạn đất kết hợp với hạn không khí thì mức

độ tác hại với cây tăng lên gấp nhiều lần

1.2.1.2 Ảnh hưởng của hạn đối với cây trồng

Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với hạn Nếu ở ngoài giới hạn đó có thể gây hại cho sự sinh trưởng và phát triển của cây, giảm năng suất sinh học

Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính là làm tăng nhiệt độ cây và gây mất nước trong cây [9] Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì càng ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, nếu thiếu nước nhẹ

sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cường quá trình già hóa tế bào khi bị khô kiệt

Trang 19

nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thương và chết Hạn làm thay đổi tính chất lý hoá và là tăng độ nhớt của chất nguyên sinh, làm chậm các hoạt động sống, làm giảm mức độ phân tán, khả năng thuỷ hoá và tính đàn hồi của keo nguyên sinh Hạn cũng là thay đổi đặc tính hoá keo từ trạng thái sol rất năng động sang trạng thái coaxecva hoặc gel kém linh động, cản trở các hoạt động sống [9]

Hạn ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất: Làm đảo lộn từ hoạt động tổng hợp là chủ yếu khi đủ nước sang phân giải khi thiếu nước Quá trình phân giải chính là quá trình phân giải protein và axit nucleic, kết quả là giải phóng và tích luỹ NH3 gây ngộ độc cho cây và có thể là chết cây [9]

Hoạt động sinh lý bị kì hãm: Thiếu nước sẽ ức chế hoạt động quang hợp vì khí khổng đóng nên thiếu CO2, lục lạp có thể bị phân huỷ, ức chế sự tổng hợp diệp lục, lá bị héo khô rồi chết làm giảm diện tích quang hợp Sự vận chuyển các sản phẩm quang hợp ra khỏi lá về cơ quan dự trữ bị tắc nghẽn Thiếu nước sẽ làm tăng hô hấp vô hiệu, về sau giảm hô hấp nhanh, hiệu quả sử dụng năng lượng của hô hấp rất thấp vì hô hấp sản sinh ra nhiệt là chính

Đối với thực vật nói chung và cây lúa nói riêng, hạn ảnh hưởng nhất tới hai quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đó là giai đoạn cây non

và giai đoạn ra hoa Hạn là nguyên nhân chính của sự mất mùa và làm giảm năng suất gieo trồng Do đó, nước được xem là yếu tố rất nhạy cảm trong

sự sinh trưởng của tế bào Thiếu nước cũng ảnh hưởng đến quá trình phân hoá hoa và đặc biệt là quá trình thụ tinh Khi gặp hạn, hạt phấn không nảy mầm, ống phấn không sinh trưởng được, sự thụ tinh không xảy ra và hạt bị lép

1.2.2 Cơ sở sinh lý, hóa sinh và di truyền của tính chịu hạn của cây lúa

1.2.2.1 Cơ sở sinh lý của tính chịu hạn của cây lúa

Trong điều kiện thiếu nước cực đoan cây lúa có hai cơ chế chủ yếu để chống chịu hạn, đó là sự thích nghi và phát triển của bộ rễ, đồng thời duy trì

Trang 20

áp suất thẩm thấu của tế bào để hút được nhiều các phân tử nước từ môi trường [9]

Vai trò của bộ rễ: nhiều nghiên cứu cho thấy cây lúa sống trong môi trường thiếu nước có bộ rễ dài, khỏe, mập, có sức đâm sâu hơn để hút được nước ở những tầng đất sâu Rễ lúa có khả năng đâm sâu và lan rộng Rễ lúa có khả năng phân nhánh rất mạnh với sự phát triển đặc biệt của lông hút Vì vậy

cả bộ rễ lúa có tổng số bề dài và bề mặt tiếp xúc với đất rất rộng để hút được nhiều nước hơn khi gặp hạn

Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu: là một đặc tính của tế bào khi

tế bào bị mất nước do hạn, nóng, lạnh…Khi tế bào bị mất nước dần dần, các chất hòa tan sẽ được tích lũy trong tế bào chất (như: đường, acid hữu cơ, amino acid, các ion…), các chất này có tác dụng điều chỉnh áp suất thẩm thấu

Áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu nhận được những phân tử nước ít ỏi còn trong đất Bằng cơ chế như vậy thực vật có thể chịu được sự mất nước trong thời gian ngắn [15]

1.2.2.2 Cơ sở hóa sinh của tính chịu hạn của cây lúa

Chịu hạn ở thực vật thường là kết quả của nhiều cơ chế đáp ứng stress hoạt động đồng thời Một số cơ sở hóa sinh của tính chịu hạn bao gồm: hoạt

độ  - amylase, protease, acid abscisic (ABA), proline…

 - amylase thuộc nhóm hydrolase có trong cơ thể động vật (nước bọt, tụy tạng), thực vật (hạt hòa thảo nảy mầm), nấm mốc, vi khuẩn Ở thực vật, sự tăng hoạt độ của - amylase sẽ làm tăng hàm lượng đường do tinh bột bị thủy phân, nên làm ảnh hưởng tới sự điều hòa áp suất thẩm thấu khi cây gặp hạn

Vì thế, dựa vào sự biến động hàm lượng  - amylase cũng có thể sơ bộ đánh giá khả năng chịu hạn của cây lúa

Protease đóng vai trò rất quan trọng trong cơ thể thực vật, nhất là trong thời kỳ nảy mầm của hạt Nó tham gia vào quá trình phân giải protein dự trữ trong hạt nhằm cung cấp amino acid cho thời kỳ phát triển đầu tiên của cây

Trang 21

Protease cũng tham gia vào phân giải các protein lạ hoặc protein bị biến tính

khi gặp điều kiện cực đoan (hạn, lạnh, nóng…) [7]

Abscisic acid (ABA) là hocmone thực vật liên quan đến sự điều chỉnh sinh lý, sinh trưởng và phát triển, đáp ứng với môi trường của thực vật bậc cao ABA đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình của tế bào thực vật như: sự phát triển của hạt, sự ngủ, sự nảy mầm, sinh trưởng phát triển, đáp ứng với stress của môi trường ABA chủ yếu được tổng hợp ở rễ cây do phản ứng với stress của môi trường Khi cây gặp hạn, ABA có vai trò điều chỉnh sự trao đổi nước trong cây hạn chế sự mất nước và làm cây thích nghi được với điều kiện khô hạn Về cơ chế người ta cho rằng ABA làm biến đổi điện hóa qua màng và do đó điều tiết sự tiết ion K+

[15]

Proline là một amino acid có tác dụng bảo vệ các cấu trúc nội bào và các đại phân tử khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu trong

tế bào, đồng thời là một amino acid ưa nước có khả năng giữ và lấy nước cho

tế bào, ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+ tương tác với protein màng, ngăn chặn sự phá hủy của màng và các phức protein khác Các kết quả nghiên cứu đều cho thấy khi cây trồng gặp hạn thì cây giảm tổng hợp protein và tăng tổng

hợp proline [7]

1.2.2.3 Cơ sở di truyền của tính chịu hạn của cây lúa

Tính chịu hạn ở cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng do nhiều gen quy định, các gen liên quan đến tính chịu hạn đã được phân lập như: HSP, LEA, LTP, P5CS, cystatin…

 HSP (Heat Shock Protein) – Protein sốc nhiệt

HSP có ở hầu hết các loài thực vật và chiếm khoảng 1% protein tổng số của lá HSP xuất hiện trong cả các quá trình sinh trưởng bình thường và các giai đoạn biệt hóa mô của thực vật, chúng được tổng hợp thêm trong điều kiện cực đoan của môi trường Dựa vào khối lượng phân tử, người ta phân loại HSP ở thực vật ra làm 6 nhóm: HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, HSP20, HSP8,5 [19]

Trang 22

Trong tế bào thực vật, HSP tập trung thành các hạt sốc nhiệt HSG (Heat Shock Granules) Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, các hạt HSG gồm các hạt HSP và mRNA Các HSP gắn kết trên các RNA polymerase để ngăn cản

sự phiên mã tổng hợp mRNA trong quá trình bị stress nóng Sau sốc nóng, các hạt này phân tán và liên kết dày đặc với các ribosome hoạt động sinh tổng hợp protein [24]

Gen HSP nhóm 70 đã được phân lập từ DNA tổng số của lúa, công bố trình tự trên Ngân hàng gen Quốc tế với mã số X67711 có chiều dài 4791bp [53]

 LEA (Late embryogenis abudant protein) – protein tích luỹ với số lượng

lớn ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi

Trong tự nhiên, phôi sau khi được hình thành trong giai đoạn chín thường được chuyển sang trạng thái ngủ, lượng nước trong phôi giảm tới mức tối thiểu Protein LEA được tạo ra hàng loạt trong giai đoạn muộn của quá trình hình thành phôi, nó hạn chế sự mất nước do điều kiện ngoại cảnh bất lợi

và đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh quá trình mất nước khi hạt chín Nó là một trong những nhóm protein quan trọng liên quan đến điều kiện mất nước của tế bào Nhóm gen mã hóa loại protein LEA còn đóng vai trò quan trọng trong sự chịu khô của hạt Khi hiện tượng mất nước xảy ra, RNA của chúng xuất hiện trong hạt đang hình thành và dần trở thành một lượng lớn gồm nhiều loại RNA thông tin khác nhau trong hạt chín và bị phân giải hết trong quá trình nảy mầm Ngoài ra LEA không những điều chỉnh quá trình mất nước khi hạt chín, mà còn hạn chế sự mất nước bắt buộc do các điều kiện ngoại cảnh bất lợi gây ra

Mức độ phiên mã của gen LEA được điều khiển bởi ABA và mức độ mất nước của tế bào, áp suất thẩm thấu trong tế bào Nhiều gen LEA đã được nghiên cứu, phân lập, xác định chức năng Một đặc điểm nổi bật của nhóm protein này là: giàu amino acid không ưa nước, không chứa cystein và

Trang 23

tryptophan, có vùng xoắn  và có khả năng chịu nhiệt Chúng thay thế vị trí

nước trong tế bào và thực hiện các chức năng như: cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, hủy protein biến tính và điều chỉnh áp suất thẩm thấu [9], [40], [35]

LEA được chia thành các nhó sau: nhóm 2-D19, nhóm 2-D11 (còn gọi

là đehydrin), nhóm 3-D7, nhóm 4-D113, nhóm 5-D29, nhóm 6-D95

Gen LEA nhóm 3-D7 đã được phân lập từ mRNA của lúa và công bố trên Ngân hàng gen với mã số AF046884 có chiều dài là 603bp, mã hoá cho protein dài 200 amino acid [54]

 LTP (Lipid Transfer Protein) – Protein vận chuyển lipid

Các protein vận chuyển LTP (Lipid Transfer Protein) là protein có liên quan tới đặc tính chịu khô hạn ở thực vật LTP có khả năng tạo phức với một

số acid béo và xúc tác cho quá trình vận chuyển lipid qua màng tế bào, giúp hạn chế sự mất nước Bên cạnh đó, LTP còn liên quan đến quá trình hình thành tầng cutin của tế bào thực vật, làm tăng khả năng chống chịu và hạn chế tác hại của stress môi trường (muối, hạn) LTP được chia thành hai dạng khác nhau về khối lượng phân tử Dạng thứ nhất có khối lượng phân tử khoảng 9 kDa (LTP1) và dạng thứ hai có khối lượng phân tử khoảng 7 kDa (LTP2) Cả LTP1 và LTP2 đều có một vùng bảo thủ gồm 8 amino acid loại cystatin và 4 amino acid loại proline [45] Có thể nói LTP đóng vai trò quan trọng trong sự thích nghi của thực vật trong điều kiện khô hạn

Ở lúa, gen LTP đã được phân lập từ RNA, đọc trình tự và công bố trên Ngân hàng gen với mã số U77295 có chiều dài là 351 bp, mã hoá cho protein

có chiều dài 116 amino acid [55]

 Gen P5CS (gen mã hóa Pyrroline-5-carboxylate synthetase)

Nhóm gen P5CS mã hóa tổng hợp pyrroline-5-carboxylate synthetase P5SC giữ vai trò trung tâm trong quá trình điều hòa sinh tổng hợp proline ở thực vật Các nghiên cứu sử dụng enzyme này nhằm mục đích điều khiển

Trang 24

hàm lượng proline để thích ứng và tăng cường khả năng chống chịu của cây đối với các bất lợi về áp suất thẩm thấu và oxy hóa của môi trường đã được thực hiện ở nhiều loài cây khác nhau Như vậy, sự biểu hiện của gen P5CS mạnh sẽ làm tăng hàm lượng proline, có vai trò tăng áp suất thẩm thấu của tế bào và cây trong điều kiện hạn hán [14]

Ở các loài thực vật tổng hợp mạnh prolin thì cây có tính chống chịu tốt hơn so với các loài thực vật khác trong điều kiện hạn, mặn,…Ví dụ cây lúa được chuyển gen P5CS chống chịu stress tốt hơn hẳn giống đối chứng Gần đây gen P5CS đã được phân lập thàmh công ở cây lúa Kết quả phân lập cho thấy gen P5CS làm cho tính chống chịu của cây lúa được cải thiện rõ rệt

1.2.3 Tình hình nghiên cứu đặc tính chịu hạn của cây lúa

Cây lúa sống trong ruộng nước, là cây cần và ưa nước điển hình nên từ

“lúa nước” bao giờ cũng gắn liền với cây lúa Ở nước ta đại bộ phận ruộng lúa đều tưới ngập nước, tuy nhiên cũng có những giống lúa có khả năng chịu hạn (lúa cạn, lúa nương ) sinh trưởng hoàn toàn phụ thuộc vào nước trời, nhưng năng suất không cao bằng lúa nước Lại có những giống lúa chịu được nước sâu, ở vùng Ðồng Tháp Mười những giống lúa cổ truyền có thể chịu ngập sâu đến 3 mét [9]

Nhu cầu về nước qua các thời kỳ sinh trưởng phát triển của cây lúa cũng khác nhau Thời kỳ nảy mầm: hạt lúa khi bảo quản thường phải giữ độ

ẩm 13%, khi ngâm ủ hạt thóc hút nước đạt 22% thì có thể hoạt động và nảy mầm tốt khi độ ẩm đạt 25-28% Những giống lúa cạn lại được gieo khô khi đất đủ ẩm hoặc trời mưa có nước mới nảy mầm và mọc được Thời kỳ mạ: từ sau gieo đến mạ mũi chông thì chỉ cần giữ ruộng đủ ẩm Trong điều kiện như vậy rễ lúa được cung cấp nhiều oxy để phát triển và nội nhũ cũng phân giải thuận lợi hơn Khi cây mạ được 3-4 lá thì có thể giữ ẩm hoặc để một lớp nước nông cho đến khi nhổ cấy Thời kỳ ruộng cấy: từ sau cấy đến khi lúa chín là thời kỳ cây lúa rất cần nước Nếu ruộng khô hạn thì các quá trình sinh trưởng gặp trở ngại rõ rệt

Trang 25

Cây lúa là loài thực vật được nghiên cứu khá nhiều trên thế giới Trong

số đó phải kể đến một số nghiên cứu sau:

Martinez và đtg (2005) khi phân tích sự phát sinh chủng loại của họ

gen cystatin chịu hạn từ Arabidopsis, lúa và lúa mì đã khẳng định sự có mặt của 12 gen cystatin riêng biệt trong lúa, 7 gen trong Arabidopsis và ít nhất 7

gen trong lúa mì [31]

Ohtsubo (2005) khi tiến hành nghiên cứu Ozyzacystatin, một loại cystatin chống chịu của lúa, đã tìm ra 3 họ cystatin chịu hạn và cho rằng chúng giữ cùng một vai trò sinh lý trong việc điều khiển cysteine proteinase của cây lúa [34]

Wang và đtg (2007) đã so sánh sự biểu hiện gen giống lúa nước và giống lúa cạn trong điều kiện stress khô hạn giữa các giống: lúa cạn IRAT109, Haogelao, Han 297 và giống lúa nước Zhongzuo 93, Yuefu, Nipponbare Sau khi đọc trình tự DNA, tác giả nhận thấy có 64 unique ESTs thể hiện ở mức độ cao giống lúa cạn và 79 ở giống lúa lúa nước Điều đó có thể dự đoán sự thể hiện cao của các gen mục tiêu trong lúa cạn, vì vậy có thể cải tiến được khả năng chống chịu stress do khô hạn trong lúa nước [48]

Yin và đtg (2008) đã sử dụng 4 dạng môi trường nuôi cấy mô sẹo lúa với nồng độ cytokinin và auxin khác nhau để phân giải protein có liên quan đến stress hạn là cysteine endopeptidase và cystatin Kết quả điện di cho thấy,

có 213 điểm protein được biểu hiện một cách đặc trưng trong quá trình phân hoá mô sẹo dưới các điều kiện hormone khác nhau [51]

Ở Việt Nam, tính chống chịu khô hạn ở lúa cũng được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

Bằng phương pháp thổi khô mô sẹo, Đinh Thị Phòng (2001) đã thu được 271 dòng mô và 900 dòng cây xanh có khả năng chịu hạn là nguyên liệu cho chọn lọc [9]

Trang 26

Đỗ Thị Dương (2001) nghiên cứu đặc điểm hoá sinh của 5 giống lúa cạn cho thấy, khả năng chịu hạn có liên quan đến hàm lượng đường tan và protein [4]

Nguyễn Thị Tâm (2003) nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật trên các giống CR303, CS4, M1107, 79 – 1, CN2, DH60 Ở nhiệt độ 420C đã tạo ra được 197 dòng mô có khả năng chịu nóng và 520 dòng cây xanh [7]

Bùi Thị Thu Thuỷ (2006) cũng bằng phương pháp thổi khô mô sẹo đã sàng lọc được 174 dòng mô có khả năng chịu hạn và 397 dòng cây xanh tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật [13]

Ngô Mạnh Dũng (2008) phân tích quan hệ di truyền của 7 giống lúa cạn có khả năng chống chịu là KS, LC93.4, C207, CH5, LC93.1, CH7, C70 bằng kĩ thuật RADP với 6 mồi ngẫu nhiên đã xác định quan hệ di truyền giữa các giống này tạo cơ sở cho việc lai tạo các giống lúa mới có khả năng chịu hạn [3]

1.2.4 Cystatin và vai trò của cystatin với tính chịu hạn

1.2.4.1 Cystatin

Cystatin (CYS) là một dạng protein ức chế hoạt động của cysteine proteinase Trong cơ thể sống, cysteine proteinase thực hiện nhiều chức năng quan trọng như: Trưởng thành protein, làm mới protein để phù hợp với những thay đổi bên ngoài và loại bỏ protein bất thường, protein gấp cuộn [26] Khi thực vật gặp hạn, cysteine proteinase hiện diện như những proteinase tham gia vào quá trình thủy phân protein dự trữ Quá trình này có thể bị cản trở bởi những chất ức chế proteinase được gọi là cystatin [20]

Cystatin được phân bố ở cả thực vật, động vật và vi sinh vật cho thấy đây là nhóm chất đóng vai trò quan trọng với sự tồn tại, sinh trưởng và phát triển của sinh vật [52]

Trang 27

Sự sai khác về kích thước, khối lượng của phân tử protein, về số lượng và

vị trí các liên kết disulphide…là căn cứ để phân loại cystatin thành 4 họ [26] Cystatin họ 1, được biết là họ stefin, không chứa liên kết disulfide hoặc các nhóm carbohydrate, nó có trọng lượng phân tử khoảng 11kDa, gồm 100 gốc amino acid [47]

Cystatin họ 2, là protein có hai liên kết disulfide trong chuỗi ở gần đầu carbon cuối cùng và được glycosyl hóa, có trọng lượng phân tử khoảng 13 -

24 kDa với 115 amino acid [19]

Cystatin họ 3, có tên là Kininogen, bao gồm các Kininogen huyết tương,

nó lớn hơn các thành viên khác của hai họ kia và hầu hết là các phức hợp phân tử cystatin có trọng lượng phân tử cao (60 - 120 kDa) với khoảng 355 gốc amino acid có chứa các liên kết disulfide Các Kininogen giữ vai trò quan trọng trong quá trình đông tụ máu

Người ta đã tìm thấy ở các cystatin họ I và II dạng pentapeptide Val-Val-Ala-Gly và trình tự tương đồng Gln-X-Val-Y-Gly ở các cystatin họ

Gln-II Ngoài ra, trình tự Phe-Ala-Val được định vị gần đầu carboxyl và dipeptide Phe-Try gần đầu amino, là trình tự bảo thủ của cystatin họ II nhưng không tìm thấy ở các cystatin họ I và III Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng vùng pentapeptide và dipeptide này đóng vai trò quan trọng trong việc bám với cysteine proteinase [47]

Ngoài ba họ trên, dựa vào sự khác nhau giữa cystatin phân lập từ động vật và thực vật, người ta còn bổ sung thêm họ phytocystatin [22], gồm hầu hết các chất ức chế cysteine proteinase của thực vật, chúng có tính chất chung với hầu hết các cystatin họ I và II Trong họ phytocystatin thì oryzacystatin từ hạt gạo là chất ức chế nguồn gốc thực vật đầu tiên được nghiên cứu Nó có mối liên hệ về mặt cấu trúc và chức năng với cystatin lòng trắng trứng gà (Barett) Oryzacystatin cũng được xếp vào cystatin nhóm I do sự vắng mặt của liên kết disulfide, chuỗi pentapeptide cũng được tạo thành bởi Gln-Val-Val-Ala-Gly ( gốc thứ 57 - 61) và khối lượng phân tử xấp xỉ 11,5 kDal với 102 gốc amino

Trang 28

acid Trình tự amino acid của oryzacystatin giống 30% với cystatin họ II, nó

có vùng trình tự Phe-Ala-Val (gốc thứ 29 - 31) và Phe - Try (gốc thứ 83 - 84), điều đó chứng tỏ oryzacysstatin cũng có thể xếp vào nhóm cystatin họ II

Các chất ức chế cysteine proteinase có nguồn gốc từ thực vật được chia làm hai nhóm, nhóm 1 gồm chủ yếu là phytocystatin có chứa vùng đơn và nhóm thứ 2 có chứa vùng đa, như multicystatin được phân lập từ củ khoai tây

và cystatin của lá cà chua Cystatin phân lập từ củ khoai tây không chứa vùng bảo thủ Gln-X-Val-Y-Gly [19] Tám chất ức chế bromelain dạng iso được phân lập từ thân dứa cũng thể hiện sự khác biệt so với các cystatin khác vì không chứa vùng bảo thủ Gln-X-Val-Y-Gly nhưng lại có sự tương đồng về mặt cấu trúc với chất ức chế trypsin/chymotrypsin từ hạt đậu tương Từ thực

tế này người ta đã cho rằng, rất có thể các chất ức chế protease có chung nguồn gốc [27]

Nhiều mô hình tương tác giữa cystatin và cysteine proteinase đã được

mô tả Nhìn chung có ba vùng tương tác là: gốc Gly gần đầu amino, vùng bảo thủ trung tâm Gln-Val-Val-Ala-Gly và cấu trúc kẹp tóc bậc 2 gần đầu carboxyl Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, liên kết disulfide không tham gia vào tương tác này [21] Đối với Oryzacystatin, Abe và Arai đã tiến hành nghiên cứu về vùng hoạt động ức chế của nó với papain Kết quả cho thấy, Oryzacystatin bậc một có khả năng ức chế papain, vùng Gln-Val-Val-Ala-Gly

và vùng Pro - Trp là những đồng yếu tố trong tương tác này [18]

Gen cystatin đã được nghiên cứu và phân lập ở: táo [20], lúa [42], đậu tương [29]

Nghiên cứu và phân lập gen cystatin giữa các giống lúa có khả năng chống chịu khác nhau nhằm xác định chỉ thị phân tử trong chọn giống lúa có khả năng chịu hạn tốt và tạo cơ sở cho việc nghiên cứu làm giảm sự tích lũy cystatin giúp thay đổi khả năng chống chịu của cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng

Trang 29

1.2.4.2 Cysteine proteinase

Quá trình phân giải protein ở thực vật diễn ra phức tạp với sự tham gia của nhiều enzyme, bằng nhiều con đường khác nhau trong các thành phần khác nhau của tế bào Trong đó, sự phân giải protein với sự tham gia của enzyme cysteine protease chiếm tới 30% tổng hoạt động phân giải protein Cysteine proteinase là enzyme có vai trò thiết yếu trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật, sự già và chết theo chương trình của tế bào,

sự tích lũy protein dự trữ trong hạt, huy động protein dự trữ và khả năng

chống chịu với những stress của môi trường Chúng tham gia vào sự hoàn

thiện protein, tái tạo protein và loại bỏ protein biến tính nhằm giúp cây thích ứng với những tác động của môi trường bên ngoài

Cysteine proteinase hoạt động bằng cách loại bỏ đoạn amino tận trong chuỗi polypeptide để tạo ra các enzyme hoạt động Vùng amino tận (hay còn gọi là proregion) không những giữ vai trò trong việc ức chế hoạt động của enzyme mà còn giúp protein mới được tổng hợp cuộn xoắn chính xác và bảo

vệ enzyme chống lại tác động bất lợi của ngoại cảnh Ở động vật có xương sống, cysteine proteinase liên quan đến hệ thống phân giải protein của lysosome và giữ vai trò ngoại bào trong một vài quá trình trao đổi chất [33]

Ở động vật không xương sống như giun tròn, cysteine proteinase là enzyme tiêu hóa Ở động vật chân đốt như tôm hùm, chúng không những giữ vai trò

trong tiêu hóa mà còn liên quan đến hệ thần kinh [43] Ở côn trùng, cystein

proteinase tìm thấy trong cả cơ quan tiêu hoá và một số mô khác nữa, chứng

tỏ chúng giữ nhiều vai trò khác nhau [46]

Ở thực vật, cysteine proteinase được tìm thấy chủ yếu trong không bào

và có thể tham gia biến đổi protein dự trữ trong suốt quá trình nảy mầm của hạt, điều đó cung cấp nguồn dinh dưỡng nitơ hỗ trợ cho sự phát triển của cây non Ngoài ra, người ta còn tìm thấy cysteine proteinase trong môi trường ngoại bào của cây sung và cây đu đủ [24]

Trang 30

1.2.4.3 Gen cystatin

Gen cystatin ở thực vật mã hóa protein cystatin ức chế hoạt động của cysteine protease Trong những năm gần đây, cystatin được bàn luận nhiều bởi mối liên quan của nó tới tính chống chịu yếu tố bất lợi của ngoại cảnh như: nóng, lạnh, mặn, hạn…[26], đặc biệt là tính chống chịu hạn Khi gen này hoạt động, sản phẩm tạo thành sẽ tham gia vào việc hạn chế sự phân giải các chất và do đó bảo vệ các từ nhiều phần khác nhau của cây Gen cystatin được phân lập đầu tiên từ mRNA của cây lúa, ký hiệu là OC1 có đoạn mã hóa dài

309 nucleotide, mã hóa phân tử protein dài 102 amino acid [17] Ở cây đậu xanh, gen cystatin được Kang và đtg phân lập, đọc trình tự từ mRNA và công

bố tại ngân hàng gen Quốc tế có mã số D38130 với kích thước 304 nucleotide, đoạn mã hóa gồm 267 nucleotide mã hóa 88 amino acid [49] Cũng thuộc nhóm cây đậu đỗ, gen cystatin ở cây đậu tương có kích thước 5863bp trên đó

có 4 exon và 3 intron được Misaka phân lập năm 2000 [38] Ở cây lạc, Vũ Thị

Thu Thủy cũng đã phân lập được đoạn gen cystatin có chiều dài 461bp với 2 exon và 1 intron; Protein do gen mã hóa có 98 amino acid [14]

Kết quả nghiên cứu ở ngô cho thấy, có 10 gen cystatin của ngô, các gen

ký hiệu là CC gồm có CC1, CC2, CC3, CC4, CC5, CC6, CC7, CC8, CC9, và

CC10 [26] Trong 10 gen cystatin ở ngô, có 9 gen được phân lập từ mRNA,

chỉ có gen CC1 phân lập từ DNA

Trong điều kiện bất lợi (nóng, hạn, lạnh…) sự biểu hiện của gen cystatin tăng cao hơn trong nhiều loại cây trồng, vì thế có thể sử dụng cystatin

để nâng cao khả năng chống chịu của thực vật với môi trường bất lợi [42]

1.2.4.4 Chức năng của cystatin

Dự đoán kết quả về phản ứng của tế bào khi bị thiếu hụt nước, Bray (1993) đã đề cập sản phẩm của các gen tham gia duy trì chức năng tế bào trong suốt giai đoạn mất nước, đó là nhóm chất ức chế hoạt động của protease

[22] Khi gen này hoạt động, sản phẩm tạo thành sẽ tham gia vào bảo vệ các

enzym, hạn chế sự phân giải các chất do đó bảo vệ các cấu trúc trong tế bào

Trang 31

Diop và đtg (2004) đã phân lập trình tự gen VuCl từ mRNA (cDNA)

mã hóa cystatin từ lá cây đậu cô ve (Vigna unguiculata (L.) Walp) Các

protein VuCl tái tổ hợp (rVuCl) được biểu hiện từ cDNA là một chất ức chế

hiệu quả hoạt động của papain Sự biểu hiện của gen VuCl trong tế bào phản

ứng với tác động của các yếu tố bất lợi phi sinh học (hạn hán, ABA ngoại sinh) được phân tích bởi phương pháp Northern blot và Western blot Kết quả cho thấy, trong các mô lá của cây đậu cô ve thuộc hai giống khác nhau về khả năng chịu hạn, các yếu tố bất lợi phi sinh học đã tạo ra sự tích tụ các polypeptide VuCl Sự khác nhau về mật độ tích tụ cystatin tương ứng với mức

độ chịu đựng của cây đậu cô ve [24]

Việc nghiên cứu gen cystatin không những giải quyết mối liên quan của gen với tính chống chịu hạn mà còn liên quan đến khả năng chống vi sinh vật, chống côn trùng gây bệnh đối với cây trồng [21], [30]

Trang 32

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

Sử dụng 9 giống lúa thu thập được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 9 giống lúa nghiên cứu

mẫu

Nơi thu thập mẫu

2 Lúa Thái Bình LTB Phú Lương, Thái Nguyên

3 Khang dân KD Phú Lương, Thái Nguyên

4 Lúa hương LH Võ Nhai, Thái Nguyên

5 Nếp lai 203 NL203 Phú Bình, Thái Nguyên

Trang 33

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và chuyên dụng có nguồn gốc

từ các hãng nổi tiếng trên thế giới, bao gồm:

- Các hóa chất dùng trong phân lập gen nhƣ: Taq - polymease, buffer PCR, SDS, EDTA, Tris, agarose…của hãng Invitrogen

- Vector tách dòng pBT do Viện Công nghệ Sinh học cung cấp

Trang 34

- Cặp mồi cystatin được chúng tôi thiết kế dựa trên sự phân tích trình tự gen cystatin ở giống lúa được công bố tại Ngân hàng gen quốc tế với mã số AF435976 và đặt tại hãng Bioneer

- Các hóa chất thôi gel, tách plasmid do hãng Bioneer cung cấp

- Các loại hóa chất khác: Thạch, tinh bột tan, casein,… của Trung Quốc, Việt Nam sản xuất

2.2.2 Thiết bị

Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị sử dụng

2 Bộ điện di Scie – plas Ltd – UK

3 Máy chụp ảnh gel Gel Logic 1500 – Kodak –USA

5 Nồi hấp khử trùng HV – 110 – Hirayama – Japan

6 Máy đo pH F – 51BW – Horiba – Japan

9 Cân điện tử TE 214S – Startorius Germany

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp sinh lí, hóa sinh

2.3.1.1 Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn

Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của 09 giống lúa ở giai đoạn cây non theo phương pháp của Lê Trần Bình và đtg [1]

Định dạng
Số trang	69
Dung lượng	0,9 MB

Nghiên cứu phân lập gen cystatin ở một số giống lúa có khả năng chịu hạn khác nhau

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Kết quả xác định trình tự gen Cystatin