chọn lựa điều kiện nuôi cấy và thu nhận enzyme chitosanase từ vi khuẩn bacillus licheniformis

Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực giao bậc 2, ba yếu tố phương án cấu trúc có tâm...24Bảng 4.1: Hiệu số đường kính vòng phân giải của enzyme chitosanase từ mẫ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- 

 -BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

Chọn lựa điều kiện nuôi cấy và thu nhận enzyme chitosanase

từ vi khuẩn Bacillus licheniformis

Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Ngô Xuân Mạnh

Khoa Công nghệ thực phẩm Trường ĐHNN HN

Sinh viên thực hiện : Ngô Thị Mai

“Khóa luận đệ trình Khoa CNSH, Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội là một phần yêu

cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học".

HÀ NỘI - 2010

đề tài và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.

Em xin chân thành cảm ơn sự nhiệt tình chỉ bảo, dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi củacác thầy cô khoa Công nghệ thực phẩm, Khoa công nghệ sinh học trong suốt quá trình tiếnhành đề tài

Em xin gửi lởi cảm ơn chân thành đến các anh chị khoá trên cũng như toàn thểbạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập cũng như hoàn thànhkhoá luận này

Cuối cùng, con xin được cảm ơn bố mẹ và gia đình đã luôn quan tâm, lo lắng vàtạo điều kiện cho con trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệpnày

Mặc dù đã hết sức cố gắng, nhưng khoá luận của em không tránh khỏi nhữngthiếu sót và hạn chế Vì vậy, em kính mong nhận được sự góp ý, chỉ bảo của thầy

cô để giúp em có thể phát huy kiến thức một cách hiệu quả sau khi ra trường

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2010 Sinh viên

Ngô Thị Mai

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Mục lục ii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Danh mục đồ thị và sơ đồ viii

Phần I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Chitosan và chitosan oligosaccharide 3

2.1.1 Cấu trúc và thành phần cấu tạo của chitosan và chitosan oligosaccharide 3

2.1.2 Tính chất vật lí và tính chất hoá học của chitosan 5

2.1.3 Ứng dụng của chitosan và chitosan oligosaccharide 5

2.2 Enzyme chitosanase 8

2.2.1 Khái niệm về enzyme chitosanase 8

2.2.2 Nguồn nguyên liệu để thu nhận enzyme chitosanase 9

2.2.3 Đặc điểm và cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 9

2.3 Giới thiệu về vi khuẩn ưa nhiệt 12

2.3.1 Vi khuẩn 12

2.3.2 Khái niệm vi khuẩn ưa nhiệt 12

2.3.3 Cơ chế chịu nhiệt ở vi sinh vật 13

2.3.4 Nhận diện vi khuẩn 13

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ vi sinh vật 14

2.4.1 Thành phần môi trường 14

2.4.2 Điều kiện lên men 15

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme chitosanase 15

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15

2.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 17

Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.l Đối tượng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu 18

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

3.1.2 Địa điểm 18

3.1.3 Vật liệu nghiên cứu 18

3.2 Phương pháp nghiên cứu 19

3.2.1 Bảo quản và giữ giống 19

3.2.2 Thử khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase của vi khuẩn Bacillus licheniformis 19

3.2.3 Nuôi cấy mẫu giống có hoạt tính 19

3.2.4 Xác định đường kính vòng phân giải của enzyme thô (phương pháp đục lỗ thạch) 19

3.2.5 Chuẩn bị cơ chất chitosan 20

3.2.6 Xác định hoạt tính enzyme chitosanase bằng phương pháp acid dinitrosalicylic 20

3.2.7 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của mẫu giống vi khuẩn được tuyển chọn 22

3.2.8 Xác định đường cong sinh trưởng của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis 22

Tiến hành nuôi mẫu giống vi khuẩn đã lựa chọn trong môi trường hoạt hoá, ở 480C, lắc 200 rpm Cứ sau 2h lấy dịch nuôi cấy đem đo độ hấp thụ quang học (Absorbance) ở bước sóng 620nm (A620) 22

3.2.9 Chọn lựa điều kiện nuôi cấy cho vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme chitosanase hoạt tính cao 23

3.2.10 Phương pháp xác định hàm lượng protein 24

3.2.11 Thu nhận enzyme thô 25

3.2 12 Phương pháp thống kê và xử lí kết quả 26

Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase của mẫu giống vi khuẩn Bacillus

licheniformis 27

4.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis.30 4.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 30

4.2.2 Đặc điểm hình thái tế bào 31

4.3 Chọn lựa thời gian tiếp giống và điều kiện nuôi cấy tối ưu để sinh tổng hợp enzyme chitosanase của vi khuẩn Bacillus licheniformis 31

4.3.1 Thời gian tiếp giống 31

4.4 Thu nhận enzyme chitosanase 38

4.4.1 Nuôi cấy và thu nhận enzyme 38

4.4.2 Cô đặc dịch enzyme thô 38

4.4.3 Tinh sạch sơ bộ enzyme chitosanase 39

4.4.4 Đề xuất sơ đồ quy trình thu nhận enzyme chitosanase tử chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis 43

Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Đề nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase 9Bảng 2.2: Kiểu phân cắt của các loại chitosanase 10Bảng 3.1 Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực giao bậc 2,

ba yếu tố (phương án cấu trúc có tâm) 24Bảng 4.1: Hiệu số đường kính vòng phân giải của enzyme chitosanase từ mẫu giống vi

khuẩn Bacillus licheniformis và các giống vi khuẩn khác 28

Bảng 4.2: Hoạt tính chitosanase của các mẫu được nghiên cứu 29

Bảng 4.3: Sự phát triển của vi khuẩn Bacillus licheniformis theo thời gian 32

Bảng 4.4 Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực giao bậc 2,

ba yếu tố (phương án cấu trúc có tâm) 35Bảng 4.5: Hệ số của phương trình hồi quy 35Bảng 4.6 Hoạt tính của enzyme chitosanase trước và sau khi cô đặc 39Bảng 4.7: Hoạt tính chitosanase, nồng độ protein và hoạt tính riêng của các phân xuất tủa bằng cồn 40Bảng 4.8: Hoạt tính chitosanase và nồng độ protein của các phân xuất tủa bằng muối amoni sunphate 41

Bảng 4.9: Hoạt tính enzyme chitosanase từ chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis tủa

bằng muối amoni sunphate trên phân xuất 50- 70% 42

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Cấu trúc hoá học của chitin 3

Hình 2.2: Cấu trúc hoá học của chitosan 3

Hình 2.3: Cấu trúc hoá học của chitosan oligosaccharide 4

Hình 2.4: Chitosan 5

Hình 2.5: Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 11

Hình 4.1: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis 27

Hình 4.2: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống Bacillus licheniformis 28

Hình 4.3, 4.4: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của mẫu giống vi khuẩn

Bacillus licheniformis 30

Hình 4.5: Đặc điểm hình thái tế bào của chủng vi khuẩn 31

Bacillus licheniformis 31

DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ SƠ ĐỒ

Đồ thị 4.1: Hoạt tính chitosanase của 4 mẫu được nghiên cứu 29

Đồ thị 4.2: Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus licheniformis theo thời

gian 33

Đồ Thị 4.3 Mối quan hệ của X1 (nhiệt độ,0C), X2 (pH) và Y (hoạt tính enzyme, U/ml) 36

Đồ thị 4.4 Mối quan hệ của X1 (nhiệt độ, 0C), X3 (nồng độ cơ chất chitosan, %)

và Y (hoạt tính enzyme, U/ml) 37

Sơ đồ 4.1: Quy trình thu nhận enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus

licheniformis 45

TÓM TẮT ĐỀ TÀI

Thực hiện đề tài này chúng tôi tiến hành đánh giá sơ bộ hoạt tính của chủng vi

khuẩn Bacillus licheniformis và so sánh khả năng sinh enzyme chitosanase của vi

khuẩn này với một số giống vi khuẩn khác, như chủng DC1, 4DC và HC5 Tiếp theochúng tôi sẽ tiến hành kiểm tra và lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu đến khả năngsinh tổng hợp enzyme chitosanase có hoạt tính cao Sau đó chúng tôi tiếp tục thu nhậnenzyme chitosanase kỹ thuật bằng hai phương pháp: kết tủa phân đoạn bằng EtOH(cồn) và tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 và đề xuất quy trình thu nhận enzymechitosanase kỹ thuật

Để xác định sơ bộ khả năng sinh hoạt tính chitosanase của chủng vi khuẩn

Bacillus licheniformis chúng tôi sử dụng phương pháp cấy chấm điểm và phương pháp

đục lỗ thạch Chúng tôi sử dụng phương pháp acid dinitrosalicylic để xác định hoạttính enzyme chitosanase và phương pháp Bradford để xác định hàm lượng protein.trong quá trình nuôi cấy, hoạt tính của enzyme chitosanase thu được không chỉ bị ảnhhưởng bởi từng yếu tố riêng lẻ mà nó còn bị ảnh hưởng bởi sự tương tác giữa các yếu

tố với nhau Do vậy chúng tôi tiến hành qui hoạch thực nghiệm nhằm lựa chọn điều

kiện nuôi cấy tối ưu để sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus

licheniformis Chúng tôi thiết kế thí nghiệm bằng cách lập ma trận qui hoạch thực

nghiệm, sử dụng phương pháp trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm và xử lí kết quả bằngphần mềm NEMRODW

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thu được, đặc điểm hình thái khuẩn lạc vàhình thái tế bào của giống vi khuẩn này Tìm được điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất

cho mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis là 480C, nồng độ cơ chất chitosan0.2%, pH =8 Trong quá trình tiến hành thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật, chúngtôi đã xác định được phân xuất tủa cồn là 40-60% và tủa amoni sunphate là 50-70% là

các phân xuất thích hợp để làm sạch enzyme chitosanase từ mẫu giống Bacillus

licheniformis Tuy nhiên trong hai phương pháp đó thì phương pháp tủa phân đoạn

bằng muối amoni sunphate là phương pháp cho kết quả tốt nhất

Phần I MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Chitosan là polymer hữu cơ được thu nhận bằng cách deacetyl hoá chitin.Chitin có trong động vật thuỷ sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ Hàm lượng chitinchiếm tỉ lệ khá cao, từ 14-35% so với khối lượng chất khô Hiện nay chitin, chitosan

và các dẫn xuất của chúng đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhưtrong nông nghiệp, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, mỹphẩm, xử lý nước thải và bảo vệ môi trường…do đó việc nghiên cứu sản xuất chitin,chitosan và các dẫn xuất của chúng đang là vấn đề được quan tâm nghiên cứu

Chitosan – oligosaccharide (COS) là sản phẩm thuỷ phân của chitosan Chúng

là những chất có hoạt tính sinh học cao như chúng có tác dụng điều hoà huyết áp, làmtăng khả năng hấp thụ canxi, thúc đẩy quá trình bài tiết uric, chống ung thư, trị đượcbệnh viêm loét dạ dày, chuột rút và có khả năng làm tăng sức đề kháng của cây trồng

COS được ứng dụng giống chitosan nhưng do đặc tính dễ hoà tan trong nước

mà COS được ứng dụng nhiều trong y học và dược phẩm : COS giúp kích thích tiêuhoá thức ăn, tăng tính thèm ăn ở vật nuôi, tăng cường sức đề kháng, tăng khả năngmiễn dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư…COS có thể được sản xuất bằngphương pháp hoá học ( thuỷ phân chitin, chitosan bằng acid HCl đậm đặc ) hoặc bằngphương pháp sinh học (dùng các enzyme như papain, hemicenlulase, cellulase để thuỷphân chitin, chitosan ) Tuy nhiên việc thuỷ phân chitin, chitosan bằng acid đậm đặc cónhiều nhược điểm như chi phí tốn kém, hiệu suất thấp, gây ô nhiễm môi trường, haomòn máy móc thiết bị và sản phẩm có hoạt tính không cao Do đó, việc nghiên cứu sảnxuất COS bằng phương pháp sinh học là một hướng đi có nhiều triển vọng vì điều kiệnphản ứng nhẹ nhàng, ít gây ô nhiễm môi trường và sản phẩm có chất lượng tốt

Enzyme chitosanase là một enzyme thuỷ phân liên kết nội phân tử cơ chấtchitosan Enzyme chitosanase được ứng dụng chủ yếu để sản xuất ra COS

Enzyme chitosanase có thể thu nhận được từ nhiều nguồn khác nhau như vikhuẩn, nấm, hay một số thực vật…nhưng enzyme chitosanase thu nhận từ chủng vikhuẩn là có hoạt tính cao hơn cả Các chủng vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp

chitosanase lại thường có sẵn trong tự nhiên tại những nơi có xác các loại giáp xác( tôm, cua…) phân huỷ Do đó, nếu tận dụng đươc nguồn vi sinh vật tự nhiên này thì

có thể tạo ra một phương pháp sản xuất COS rất hiệu quả Hơn nữa, các vi sinh vật nàycòn có khả năng sinh sản, phát triển với một tốc độ cực kỳ lớn, do đó cho phép thuđược một lượng enzyme lớn trong một thời gian ngắn một cách dễ dàng Mặt khác,môi trường nuôi cấy lại dễ kiếm, rẻ tiền

Cho đến thời điểm này ở Việt Nam, những nghiên cứu về chitosanase và cácloài vi sinh vật sản sinh ra nó còn rất hạn chế hoặc là hiệu suất thu hồi enzyme từ vikhuẩn còn chưa cao.Với mong muốn góp phần khắc phục các hạn chế còn tồn tại trên,được sự cho phép của khoa Công nghệ sinh học, đồng thời được sự cho phép của khoaCông nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông gghiệp Hà Nội, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài:“Chọn lựa điều kiện nuôi cấy và thu nhận enzyme chitosanase từ

vi khuẩn Bacillus licheniformis”

1.2 Mục tiêu

- Xác định hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn Bacillus

licheniformis.

- Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis

để thu nhận enzyme chitosan có hoạt tính cao

- Lựa chọn được điều kiện thu nhận và tinh chế enzyme chitosanase thô để thunhận enzyme kỹ thuật :

+ Kết tủa phân đoạn bằng EtOH

+ Kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4

+ Đề xuất quy trình thu nhận chitosanase kỹ thuật

Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Chitosan và chitosan oligosaccharide

2.1.1 Cấu trúc và thành phần cấu tạo của chitosan và chitosan

oligosaccharide

Chitosan là một polysaccharide cao phân tử, mạch thẳng, bao gồm các mắt xíchβ-D-glucosamine liên kết với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glycoside, do vậy chitosan có thểgọi là poly β-(1-4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose hoặc là poly β-(1-4)-D- glucosamine (VũCông Phong, 2007)

Chitosan là dẫn xuất của chitin (Hình 2.1), là một dạng chitin đã bị deacetyl hoátrong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (-NHCOCH3) ở vị trí C(2) Chitosan được xem làpolymer tự nhiên quan trọng nhất nhờ những đặc tính quý báu của nó bao gồm cả tínhnăng công nghệ và tính năng sinh lý học (Hình2.2)

Chitin: Poly (1, 4-2-acetamino-2-deoxy-β-D-glucosamine)

Hình 2.1: Cấu trúc hoá học của chitin

Chitosan: Poly (1, 4-2-amino-2-deoxy-ß-D-glucosamine)

Hình 2.2: Cấu trúc hoá học của chitosan

Hiện nay, chitosan được sản xuất từ vỏ tôm bằng cả 2 phương pháp hoá học vàsinh học Trong phương pháp sinh học, việc deacetyl hoá chitin còn có thể được xúctác bởi các enzyme khác nhau bao gồm protease, một số lipase và chitosanase.Enzyme protease thường được sử dụng là papain, bromelain, và các enzyme có nguồngốc động vật, thực vật, vi sinh vật (Miller, 1959).

Tuy nhiên, chitin và chitosan lại có khối lượng phân tử lớn, chuỗi phân tử dài,không hoà tan được trong nước nên đã làm hạn chế đi rất nhiều giá trị sử dụng củachúng Vì vậy, người ta tiến hành thuỷ phân chitosan bằng phương pháp enzyme hoặcphương pháp hoá học Phương pháp hoá học sử dụng acid thủy phân cho năng suất rấtthấp lại tốn kém nên phương pháp chủ yếu được sử dụng là phương pháp sử dụngenzyme chitosanase Enzyme chitosanase phân cắt liên kết β-1,4-glycoside của chitosantạo ra COS (Hình 2.3) Do đó, về cấu tạo của COS là một chuỗi phân tử được cấu tạobởi một số đơn vị D-glucosamine (GlcN) (thường là từ 2 đến 10 đơn vị GlcN) Chiềudài chuỗi phân tử và mức độ DDA được coi là 2 yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạttính sinh học của COS COS dài hơn hexamer có khả năng ức chế vi sinh vật, chống ung thư,tăng cường miễn dịch… tốt hơn so với các COS ngắn hơn Sự tăng mức độ deacetyl làm tănghoạt tính sinh học của COS Bởi vậy, kiểm soát chặt chẽ chiều dài chuỗi phân tử và DDA làđiều kiện tiên quyết để sản xuất COS có giá trị cao

Hình 2.3: Cấu trúc hoá học của chitosan oligosaccharide

(Tuk-Rai và Jung, 2002)

2.1.2 Tính chất vật lí và tính chất hoá học của chitosan

2.1.2.1 Tính chất vật lí

Chitosan là một chất rắn, xốp, nhẹ, vô định hình Có màu trắng hay vàng nhạt,không mùi vị, không tan trong nước, dung dịch kiềm và acid đậm đặc nhưng tan trongacid loãng (pH 6) như HCl, acid acetic …tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màngtốt, nhiệt độ nóng chảy 309-3110C, khối lượng phân tử trung bình 10.000-500.000daltontùy loại Với chitosan, DDA là một chỉ tiêu quan trọng nhất ảnh hưởng đến tất cả cácđặc tính hoá lí của nó như khối lượng phân tử, độ nhớt, độ hoà tan…

Hình 2.4: chitosan

2.1.2.2 Tính chất hoá học của chitosan

- Trong phân tử chitin, chitosan có chứa các nhóm chức -OH, nhóm –NH2 trongcác mắt xích D-glucosamine, có nghĩa chúng vừa là ancol vừa là amine Phản ứng hoáhọc có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N-, hoặc dẫnxuất thế O-, N- (Zhou và cộng sự, 2007)

- Mặt khác chitosan là những polimer mà các monomer được nối với nhau bởicác liên kết β-(1-4)-glycoside, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hoá học như:acid, base, tác nhân oxy hóa và các enzyme thuỷ phân

- Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên tử Oxy

và Nitơ của nhóm chức còn cặp electron chưa sử dụng, do đó chúng có khả năng tạophức, phối trí với hầu hết các kim loại nặng và các kim loại chuyển tiếp như: Hg2+, Cd2+,

Zn2+, Cu2+, Ni2+, Co2+ Tuỳ nhóm chức trên mạch polimer mà thành phần và cấu trúc củaphức khác nhau Ví dụ: phức Ni(II) với chitosan có cấu trúc tứ diện với số phối trí bằng 4(Vũ Công Phong, 2007)

2.1.3 Ứng dụng của chitosan và chitosan oligosaccharide

Chitosan và đặc biệt là chitosan oligosaccharide (COS) ngày càng thu hút được

sự quan tâm rộng rãi bởi những tiềm năng của chúng trong nhiều lĩnh vực: Côngnghiệp, nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, công nghệ sinh học, y học và dược phẩm,

xử lý nước thải và bảo vệ môi trường…

Trong công nghiệp thực phẩm :

- Bảo quản rau quả, trái cây, phụ gia thực phẩm

- Sử dụng chitosan, COS để bảo quản một số loại quả tươi (cam, bưởi, dưa chuột,dâu tây, hồ tiêu, cà chua ) Màng mỏng chitosan trên bề mặt quả có tác dụng ức chế hôhấp, giữ lại khí cacbonic, giảm thiểu lượng ethylene, diệt được một số loại nấm và kìmhãm quá trình biến màu của quả trong khi bảo quản, vận chuyển đi tiêu thụ

- Chitosan tạo ra bột Chitofood thay thế hàn the độc hại nhưng đảm bảo sảnphẩm vẫn dai, ngon Phụ gia này được dùng trong chế biến, bảo quản các sản phẩm từnhóm thịt (giò, chả, thịt hộp, nem), bột (bún, bánh phở, bánh kem), bánh (bánh ít, phuthê), thực phẩm tươi sống, thịt nguội, đồ uống, nước giải khát, sản phẩm sữa

- Bao bì từ chitosan, COS có tính năng đặc biệt, có thể bọc các loài thực phẩmtươi sống giàu đạm, dễ hư hỏng như cá, thịt, làm vỏ nhồi xúc xích có tác dụng kéo dàithời gian sử dụng sản phẩm mà không độc hại, an toàn cho người, không làm mất màu,mùi vị của sản phẩm được bảo quản (Bough, 1976)

 Trong nông nghiệp :

- Được sử dụng để bao bọc các hạt giống nhằm ngăn ngừa sự tấn công củanấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăngcường khả năng nảy mầm của hạt

- Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một sốchỉ tiêu sinh lý-sinh hoá của mạ lúa ở nhiệt độ thấp, kết quả cho thấy chitosan vi lượnglàm tăng hàm lượng diệp lục tổng số và hàm lượng nitơ, đồng thời các enzyme nhưamylase, catalase, peroxidase cũng tăng lên và chitosan còn góp phần cải tạo đất khôcằn, bạc màu, giữ ẩm cho cây trồng

 Trong công nghệ sinh học:

Chitosan được sử dụng để cố định enzyme, tách protein, tái tạo tế bào, cố định

tế bào và sử dụng trong phép sắc kí…

 Trong y học :

- Chitosan, COS được ứng dụng để cầm máu, băng bó vết thương, điều chỉnhhàm lượng cholesterol trong máu, bỏng da, điều chỉnh sự phân giải của thuốc…(Park và cộng sự, 2006)

- Từ vật liệu chitosan, các nhà khoa học Phòng Polymer dược phẩm (Viện Hóahọc - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã nghiên cứu, chế tạo thành côngnhiều sản phẩm hiệu quả cao với giá thành hợp lý như: Thuốc kem Polysamin có tác

dụng kháng khuẩn, kháng nấm, đặc biệt là chủng nấm Candila albicans, không gây dị

ứng và tác dụng phụ, có khả năng cầm máu, chống xưng u, kích thích tái tạo biểu mô

và tế bào da để làm mau liền các vết thương, vết bỏng, chóng lên da non và giảm bớtđau đớn cho người bệnh kích thích lên da non, chống sẹo lồi và điều hòa sắc tố da

- Không chỉ dừng lại ở đó, vật liệu chitosan còn được chế tạo thành thực phẩm

bổ dưỡng, có tác dụng hạ huyết áp, giảm cholesterol và lipid máu, chống béo phì, vì nóloại bỏ một cách hoàn toàn cholesterol và lipoprotein mật độ thấp từ mạch máu Bởivậy việc bổ sung vật liệu chitosan mà cụ thể là COS vào cơ thể của các bệnh nhân béophì thì có kết quả tốt COS là cation dương vì vậy nó có thể liên kết với các ion Cl cótrong mạch máu rồi thải ra ngoài làm giảm huyết áp Vật liệu chitosan còn phòngchống u và ung thư, đặc biệt là tăng cường miễn dịch cho cơ thể, có thể dùng cho cácbệnh nhân bị nhiễm HIV/AIDS bị suy giảm hệ miễn dịch Với khả năng thúc đẩy hoạtđộng của các peptide-insulin chitosan kích thích việc tiết ra insulin tuyến tụy nênchitosan đã dùng để điều trị bệnh tiểu đường (Kim và Rajapakse, 2005)

 Trong xử lý nước thải:

Những nghiên cứu gần đây cho thấy chitosan có thể sử dụng là tác nhân đông tụhiệu quả cho các hợp chất hữu cơ, nó đóng vai trò như một chiếc kìm liên kết các độc

tố kim loại nặng Chitosan được dùng như một chất mang để tách và làm giàu các kimloại nặng trong môi trường nước Mức độ hấp thu của chitosan với các kim loại nặngthủy ngân, cadimi (Hg, Cd) đạt bão hòa sau 90 phút khuấy Hg hấp thụ chitosan caonhất đạt 90%, Cd đạt 41% Khả năng hấp thụ của chitosan đối với các ion trên đạt cựcđại và ổn định ở pH 4-6 Ngoài ra, nó còn có khả năng hấp thụ các chất nhuộm cónồng độ nhỏ của các phenol khác nhau trong công nghệ xử lí rác thải

Trong ứng dụng đặc biệt này, chitosan tỏ ra có hiệu quả hơn các hợp chất caophân tử khác được tổng hợp nhân tạo, than hoạt tính Hơn nữa, nhóm amino (-NH2)trong chitosan là nhóm hoạt động nhất và nó có thể đóng vai trò là tác nhân hấp phụhiệu quả

 Trong lĩnh vực thẩm mĩ:

Trong ngành mỹ phẩm, chitosan, COS được dùng để sản xuất kem chống khô da,kem chống nắng, kem dưỡng mặt và toàn thân nhờ nó có nhóm –NH4 có thể dễ dàng cốđịnh trên biểu bì của da và liên kết với các tế bào sừng hoá của da

Ngoài ra, chitosan còn được dùng để cố định tế bào Saccharomyces

cerevisiae để lên men, được bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy, làm giấy

rửa ảnh, thay hồ tinh bột để hồ vải giúp sợi bền mịn, bóng đẹp, cố định hình in, kếthợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm

Nhờ những ưu điểm trên cho chúng ta thấy sự cần thiết phải phát triển côngnghiệp chế biến chitosan, COS

2.2 Enzyme chitosanase

2.2.1 Khái niệm về enzyme chitosanase

Chitosanase có tên gọi đầy đủ, theo danh pháp quốc tế là: chitosan

N-acetylglucosaminohydrolase

Chitosanase (EC 3.2.1.132) là enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân chitosanbằng cách cắt đứt các liên kết β-1,4-glycoside trừ liên kết giữa các N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc – GlcNAc) và giải phóng ra các chitosan oligosaccharide(COS)

Chitosan + H2O

Hoạt tính chitosanase của chế phẩm enzyme đặc trưng cho khả năng xúc tác phângiải chitosan thành các COS có phân tử thấp hơn Hoạt tính chitosanase được biểu thịbằng số đơn vị hoạt tính trong 1ml (hay 1g) chế phẩm (Choi và cộng sự, 2003)

2.2.2 Nguồn nguyên liệu để thu nhận enzyme chitosanase

Enzyme chitosanase được tìm thấy từ ở các loài sinh vật khác nhau, bao gồm: Vikhuẩn, xạ khuẩn, nấm, côn trùng và một số loài thực vật Tuy nhiên, hiện nay nguồn cungcấp enzyme chitosanase chủ yếu là vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm Nguồn vi khuẩn, xạ khuẩn

Chitosanase

Các chitosan oligosaccharide chứa N-acetyl-D-glucosamine

glucosamineggggggg;gglucosamine

và nấm này chủ yếu được phân lập từ đất, nơi có xác của các loài giáp xác (tôm, cua…)phân huỷ (Brzezinski và Neugebauer, 2003).

2.2.3 Đặc điểm và cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase

2.2.3.1 Khối lượng phân tử

Chitosanase cũng giống như đại bộ phận enzyme khác đều có bản chất làprotein chitosanase hầu hết là enzyme ngoại bào, có cấu tạo đơn phân tử Chúng cókhối lượng phân tử khoảng từ 30 – 50kDa Kích thước phân tử protein của enzymechitosanase sản sinh từ các nguồn khác nhau thì khác nhau Người ta đã tiến hành thínghiệm và tính toán khối lượng phân tử của protein chitosanase thu được từ một sốloài vi sinh vật khác nhau Kết quả như Bảng 2.1

Bảng 2.1: Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase

(Choi và cộng sư, 2003; Miller, 1959; Pelletier và Sygusch, 1992; Tanabe và Morinaga, 2003; Yabuki và cộng sự, 1999; Zhu và cộng sự, 2007)

2.2.3.2 Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase

Theo Fukamizo và Brezinski (1997) đã xác định được các sản phẩm dị vòng thuđược từ quá trình thuỷ phân chitosan đều là dạng α, điều đó cho thấy rằng chitosanase làmột enzyme chuyển hoá

Chitosanase có khả năng nhận dạng liên kết đặc trưng trong chuỗi chitosan đểphân cắt Vị trí phân cắt đó là liên kết β-(1-4)-glycoside giữa các phân tử D-Glucosaminehoặc giữa D-Glucosamine và N-Acetyl-D-Glucosamine

Tuy nhiên không phải bất kỳ enzyme chitosanase nào cũng tấn công vào vị trí 4)-glycoside giữa hai D-Glucosamine, còn một số chitosanase lại có khả năng tấn công vàoliên kết này giữa hai phân tử D-Glucosamine và giữa D-Glucosamine với phần N-Acetyl-

β-(1-D-Glucosamine còn lại Bảng 2.2 thể hiện vị trí liên kết bị tấn công bởi một số chitosanase

Bảng 2.2: Kiểu phân cắt của các loại chitosanase

Cơ chế chuyển hoá này được duy trì liên tục trên thực tế là nhờ 2 đầu xúc tác cókhoảng cách 13,8Å, cao hơn những enzyme chuyển hoá khác gần 10Å

Cơ chế xúc tác của chitosanase được thể hiện trong Hình 2.5

Hình 2.5: Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase

Sản phẩm phản ứng của enzyme chitosanase được nghiên cứu bằng cách sửdụng dung dịch chitosan và một vài COS làm cơ chất Phương pháp sắc kí lớp mỏng(TLC) (thin-layer chromatography) cho thấy rằng enzyme chitosanase đã giải phóng raCOS từ chitosan, phần lớn là các COS dài hơn (GlcN)2 bằng cách phân cắt nội phân

tử Enzyme này không thể thuỷ phân được (GlcN)2 hoặc (GlcN)3 Còn (GlcN)4 và(GlcN)5 thì bền với hoạt tính xúc tác của enzyme này Tuy nhiên, chitosanoligosaccharide (GlcN)6 và (GlcN)7 được thuỷ phân hoàn toàn sau 15h ủ (GlcN)6 chủyếu được phân cắt thành (GlcN)3 + (GlcN)3 và (GlcN)2 + (GlcN)4 nhưng (GlcN)2 +(GlcN)4 thì ít hơn nhiều, [Rồi sau đó, (GlcN)4 → (GlcN)2 + (GlcN)2] Nó cũng chothấy rằng (GlcN)7 được phân cắt thành (GlcN)3 + (GlcN)4 Kết quả này chỉ ra rằng đểphản ứng xảy ra nhanh, cơ chất chitosan nên có chiều dài chuỗi phân tử bằng hoặc dàihơn (GlcN)6, sự phân cắt liên kết glycoside xảy ra tốt nhất tại trung tâm của mối liênkết hexameric và sinh ra (GlcN)3 là sản phẩm chủ yếu Thực tế, enzyme chitosanasethể hiện hoạt tính đối với chitosan cao hơn so với các oligosaccharide mạch ngắn hơn(Choi và cộng sự, 2003)

2.3 Giới thiệu về vi khuẩn ưa nhiệt

2.3.1 Vi khuẩn

2.3.1.1 Khái niệm

Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào có nhân nguyên thuỷ

2.3.1.2 Hình thái và kích thước

Vi khuẩn có nhiều hình thái, kích thước và cách sắp xếp khác nhau Đường kínhcủa phần lớn vi khuẩn thay đổi trong khoảng 0.2-2µm, chiều dài cơ thể khoảng 2.0-8.0µm Hình thái vi khuẩn rất đa dạng : hình cầu, hình que, hình dấu phẩy, hình xoắn,hình có cuống…

+Xoắn khuẩn (Spiilum): Tế bào từng xoắn lại

Ngoài ra còn gặp vi khuẩn hình sao, hình khối vuông, hình khối tam giác

-Dựa vào phản ứng với chất hoá học vi khuẩn được chia thành 2 loại:

+Vi khuẩn Gram (+)

+Vi khuẩn Gram (-)

2.3.2 Khái niệm vi khuẩn ưa nhiệt

Nhiệt độ phát triển là một trong những đặc điểm sinh lý quan trọng của vi sinhvật Người ta chia nhiệt độ phát triển của vi sinh vật theo các chỉ tiêu: Nhiệt độ tối đa(t0 max), nhiệt độ tối thiểu (t0 min), nhiệt độ tối thích (t0opt)

Dựa vào nhiệt độ phát triển, theo Nguyễn Lân Dũng và Phạm Thị Trân Châu(1978), thì vi sinh vật được chia làm các nhóm sau:

-Vi sinh vật ưa lạnh: Bao gồm các vi sinh vật có khả năng chịu nhiệt độ lạnh từ

Tuy nhiên, sự phân chia các nhóm vi sinh vật trên cơ sở nhiệt độ phát triển củachúng chỉ là tương đối Một số vi sinh vật ưa ấm sau quá trình thích nghi có thể trởthành vi sinh vật chịu nhiệt

2.3.3 Cơ chế chịu nhiệt ở vi sinh vật

Cơ chế chịu nhiệt của vi sinh vật đến nay vẫn còn được các nhà khoa học trênthế giới tiếp tục nghiên cứu Đặc biệt ngày nay với kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại,người ta thấy rằng cơ chế chịu nhiệt ở vi sinh vật là tập hợp của nhiều yếu tố liên quanđến cấu trúc của màng tế bào, thành phần và cấu trúc protein, enzyme, tính di truyềncủa màng tế bào vi sinh vật

Đa số các vi sinh vật chịu nhiệt có thành tế bào dày, có độ bền cơ học cao hơncác loại vi sinh vật khác

Thành phần protein và lipid của màng tế bào cũng có vai trò quyết định đến tínhchịu nhiệt của vi sinh vật Ribosom là nhà máy tổng hợp protein của tế bào, bản chấtprotein của ribosom và khả năng chịu nhiệt của nó do các gen chịu nhiệt trong bộ gencủa vi sinh vật điều khiển Nhiệt độ biến tính protein của ribosom càng cao thì khảnăng chịu nhiệt của vi sinh vật càng cao (Lê Gia Huy và cộng sự, 1997)

2.3.4.3 Hình thái tế bào vi khuẩn

Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ta sẽ thấy được hình dạng tế bào vi khuẩn.Dựa vào đó mà có thể phân vi khuẩn thành các dạng: Hình cầu, hình que, hình dấuphẩy, hình xoắn…

2.3.4.4 Khả năng di động

Có loài vi khuẩn không di động, một số ít di động, một số khác lại di động rấtmạnh Để nhận biết được khả năng này, ta quan sát tiêu bản sống của vi khuẩn dướikính hiển vi sẽ nhìn thấy một cách chính xác Tuy nhiên, ta cũng có thể quan sát hìnhthái khuẩn lạc để dự đoán được khả năng di động của vi khuẩn: Những khuẩn lạc cóviền nhẵn là những tế bào vi khuẩn không có tiên mao nên không có khả năng di động,những khuẩn lạc có viền không nhẵn là tế bào vi khuẩn có tiên mao nên có khả năng

từ các nguyên tố C, H, O, N, các nguyên tố khoáng đa và vi lượng Khi chọn lựa môitrường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật cần chú ý đến thành phần chất lượng và sựtương quan về số lượng giữa các cấu tử trong môi trường (Lương Đức Phẩm, 2004)

- Nguồn Cacbon: Thường sử dụng đường làm nguồn cacbon khi nuôi cấy phầnlớn các vi sinh vật dị dưỡng Trong công nghiệp lên men, rỉ đường là nguồn cacbon rẻtiền và rất thích hợp cho sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật khác nhau Muốn thuđược enzyme cao thì phải có cơ chất để cảm ứng giúp vi sinh vật có thể sinh tổng hợpenzyme để thuỷ phân nguồn cơ chất đó nguồn cacbon đóng vai trò là chất cảm ứngcho sinh tổng hợp chitosanase là chitosan, chitin (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2004)

- Nguồn Nitơ: Nguồn nitơ dễ hấp thụ với vi sinh vật là NH3 và NH4+ Nguồnnitơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là peptone Nguồn acid amin của cácloại vi sinh vật khác nhau là rất khác nhau

- Nguồn khoáng: Sự có mặt của các nguyên tố đa lượng và vi lượng ảnh hưởnglớn đến sự sinh tổng hợp enzyme Phospho, lưu huỳnh rất cần cho vi sinh vật vì chúngtham gia vào thành phần của những chất quan trọng như nucleotid, protein, enzyme,

vitamin… phospho còn tham gia vào nhiều phản ứng trao đổi chất của tế bào Cácnguyên tố như sắt, kẽm, đồng, coban… tuy chỉ cần một lượng rất nhỏ nhưng rất cầnthiết cho vi sinh vật để cấu tạo nên một loại enzyme (Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự,1998).

2.4.2 Điều kiện lên men

Với phương pháp lên men chìm thì các điều kiện như nhiệt độ, pH, chế độthoáng khí, tốc độ lắc, áp suất thẩm thấu đều có ảnh hưởng nhất định đến quá trìnhsinh tổng hợp enzyme

Nhiệt độ nuôi cấy là một yếu tố quan trọng trong quá trình lên men Nó ảnh hưởngtrực tiếp lên quá trình sinh trưởng, phát triển và sản xuất sinh khối của vi sinh vật Còn pHmôi trường ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Ngược lại, trong quátrình nuôi cấy, các sản phẩm của quá trình trao đổi chất có thể làm thay đổi pH môitrường, làm ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật Chính vì vậy, việc lựa chọn vàduy trì giá trị này trong suốt quá trình nuôi cấy là rất quan trọng Mỗi loại vi sinh vật đều

có một giá trị hoặc khoảng giá trị nhiệt độ, pH tối ưu cho sự sinh tổng hợp enzyme(Lương Đức Phẩm, 2004)

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme chitosanase

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Tiềm năng ứng dụng rộng lớn chitosanase đang được các nhà khoa học quantâm và nghiên cứu sản xuất rất nhiều trên thế giới Rất nhiều nước đang tiến hànhnghiên cứu quá trình sản xuất enzyme chitosanase như: Nhật, Canada, Mỹ, HànQuốc…Nhưng quy trình sản xuất chitosanase hiện nay chưa có quy mô công nghiệp,chỉ tiến hành nghiên cứu trong viện và các trường đại học

Sơ lược kết quả nghiên cứu về enzyme chitosanase trên thế giới

Đề tài nghiên cứu Kết quả Tác giả và đơn vị tiến

hànhNghiên cứu sinh tổng hợp

Enzyme có khối lượng 39.5kDa, pH tối thích 4.5-6.5, và

A Pelletieer and J.Sygusch (1990),thuộc trường đại họcSherbrooke.Canada

nhiệt độ 450C, hai enzymecòn lại có khối lượng 43kDa

và 22 kDaTinh sạch và xác định tính

ở 370C và bị bất hoạt ở 600c

Yeon Jin Choi, Eunjung Kim, Zhe Pion(2003), Đại học quốcgia Gyeongsans HànQuốc

độ tối thích là 500C Duy trìhoạt tính được từ 250C-400C

và bất hoạt ở 700C

San-Lang Wang,

pe-Yi Ye (2007), Đạihọc Tamkang

Các chủng vi sinh vật được phân lập, tuyển chọn từ tự nhiên :Môi trường đất,môi trường nước, từ một số sản phẩm hoặc từ bộ giống có sẵn Nhiều đề tài nghiêncứu về điều kiện thu nhận cũng như tinh sạch enzyme và khảo sát các điều kiện phảnứng cũng như các nhân tố ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme chitosanase được cácnhà khoa học tiến hành Hơn thế nữa với sự phát triển của ngành công nghệ sinh họcđặc biệt là sinh học phân tử đã tạo ra các chủng vi sinh vật mới có khả năng sịnh tổnghợp enzyme có hoạt tính cao Tuy nhiên hiện nay, phương pháp cải biến di truyềnbằng gây cảm ứng và chọn lọc kinh điển để cải tiến các chủng vi sinh vật đã không cònhấp dẫn vì tốn thời gian và giá thành lại cao Việc sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợpkhông chỉ tạo ra những chủng vi sịnh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao mà

còn tạo ra cho các enzyme đó những đặc tính vượt trội Như việc tạo ra chủng Bacillus

sp.strain CK4 có khả năng sinh tổng hợp chitosanase chịu nhiệt Enzyme chitosan chịu

nhiệt này gồm 242 aminoacid, có khối lượng phân từ là 30 kDa Người ta nhận thầy

chuỗi polypeptide của nó có tới 76% giống chuỗi chitosanase thu nhận từ Bacillus

subtilis Chitosanase này có khả năng chịu nhiệt, thời gian bán huỷ của nó là 90 phút ở

800C Nhờ đặc tính này mà nó rất có ích trong công nghiệp

2.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Các nghiên cứu về enzyme chitosanase ở nước ta cho đến thời điểm hiện naycòn rất ít, hầu hết các nghiên cứu còn dừng ở những giai đoạn ban đầu mà chưa có

điều kiện đi sâu hơn và còn chậm hơn rất nhiều so với các nước trên thế giới Hiện nay

ở nước ta mới có một số đề tài nghiên cứu về chitosan:

-“ Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces

griceus” (Đại học thuỷ sản nha trang)

-“Biểu hiện và xác định một số đặc tính của chitosanase tái tổ hợp từ vi khuẩn

Bacillus circulans MH-KL” ( Đại Học Bách Khoa Hà Nội)

-“Bước đầu xây dựng quy trình công nghệ enzyme thuỷ phân chitin/chitosanbằng enzyme chitinase/chitosanase “(Viện Công Nghệ Sinh Học)

-“ Nghiên cứu ảnh hưởng pH lên cấu trúc phân tử enzyme chitosanase từ vi

khuẩn Bacillus circulans MH-KL” (ĐHKHTN-ĐHQGTPHCM)

Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.l Đối tượng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu giống vi khuẩn Bacillus lícheniformis do bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ

vi sinh - Công nghệ sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội phân lập từ mẫunước lấy từ mẫu nước lấy từ suối nước nóng Kênh Gà – Ninh Bình

3.1.2 Địa điểm

Nghiên cứu đề tài được tiến hành tại bộ môn Hoá sinh – Công nghệ sinh họcthực phẩm - Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

3.1.3 Vật liệu nghiên cứu

3.1.3.1 Môi trường cấy truyền, hoạt hoá và nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

(môi trường LB-Agar)

Môi trường hoạt hoá và nuôi cấy vi

khuẩnThành phần Hàm lượng(%)

Giống môi trường cấy truyền, chỉ thayAgar bằng dung dịch chitosan 0.2%

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Bảo quản và giữ giống

- Sau khi tiếp nhận, các mẫu giống vi khuẩn được cấy truyền vào môi trường

thạch nghiêng và nuôi cấy ở tủ ấm 48oC để giữ giống Sau khi các giống đã mọc tốt,bảo quản các ống giống trong tủ lạnh ở nhiệt độ 3 – 4oC, sau 2 - 3 tuần phải cấytruyền lại một lần Bảo quản giống là khâu hết sức quan trọng.

3.2.2 Thử khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase của vi khuẩn

Bacillus licheniformis

Sử dụng môi trường thử hoạt tính Cấy chấm điểm trên môi trường thử hoạt tính

để thử hoạt tính sơ bộ Sau thời gian nuôi cấy 1 ngày, xác định các mẫu có hoạt tínhbằng cách đổ một lớp mỏng dung dịch Lugol lên bề mặt đĩa thạch Vì chitosanase làenzyme đặc hiệu đối với cơ chất chitosan nên những vi sinh vật có khả năng sinhchitosanase ngoại bào sẽ tiết enzyme ra ngoài môi trường để phân giải cơ chất chitosantạo nên vòng phân giải trên môi trường Enzyme có hoạt tính càng cao thì vòng phângiải càng to, rộng và sáng Những mẫu giống có hoạt tính chitosanase cao sẽ đượcnghiên cứu tiếp ở điều kiện nuôi cấy thích hợp

3.2.3 Nuôi cấy mẫu giống có hoạt tính

Môi trường nuôi cấy được phân chia vào các bình tam giác vô trùng có thểtích 250 ml Cấy mẫu giống đã hoạt hoá (hoạt hóa 1 vòng que cấy trong ốngnghiệm với thể tích môi trường hoạt hoá 5ml) vào môi trường nuôi cấy ở chế độ vôtrùng Quá trình nuôi cấy được tiến hành trên máy lắc ở chế độ 200 rpm, 48oC trongthời gian 1 ngày

3.2.4 Xác định đường kính vòng phân giải của enzyme thô (phương pháp đục lỗ thạch)

Sau khi dừng nuôi cấy, tiến hành ly tâm để loại bỏ kết tủa, thu dịch nuôi cấy Dịchenzyme thu được sẽ được đem đi phân tích hoạt tính enzyme để tiếp tục tuyển chọn ra mẫugiống có khả năng sinh tổng hợp chitosanase hoạt tính cao

Đổ môi trường agar – chitosan ra các đĩa petri, để nguội Dùng dụng cụ đục lỗmôi trường có đường kính 1cm, đục các lỗ trên đĩa thạch (3 lỗ/đĩa) Hút 50µl dịch nổienzyme cho vào mỗi lỗ thạch, để 2h trong tủ lạnh, sau đó đem ủ ở 48oC, 22h sau đóquan sát, đo đường kính vòng phân giải của các mẫu, chọn lọc các mẫu có hoạt tính tốt

để nghiên cứu tiếp

3.2.5 Chuẩn bị cơ chất chitosan

Cân 2,35g chitosan (>85%) dạng vảy ngâm trong 500ml dung dịch acid acetic1% trong 48h Sau đó ly tâm loại bỏ cặn không tan, rồi lên thể tích 1000ml bằng nướccất Dùng NaOH 0,1N và HCl 0,1N chỉnh pH của dung dịch chitosan về pH 8, ta đượcdung dịch chitosan 0,2%, pH = 8 để sử dụng

3.2.6 Xác định hoạt tính enzyme chitosanase bằng phương pháp acid

dinitrosalicylic

 Nguyên tắc: Khi enzyme chitosanase thuỷ phân chitosan sẽ tạo các

Oligosaccharide có đầu chứa đường khử D-glucosamine Phương pháp aciddinitrosalicylic xác định sự có mặt của nhóm (C = O) trong đường khử, oxy hoá nhómaldehyt trong đường, đồng thời 3,5-dinitrosalicylic acid bị khử tạo thành 3-amino,5-nitrosalicylic acid trong môi trường kiềm

CHO- oxh nhóm COO

-3,5 – dinitrosalicylic acid 3-amino,5-nitrosalicylic acidSulfite được bổ sung vào phản ứng để hấp thụ oxi hoà tan trong môi trường vìoxi hoà tan không cần cho phản ứng màu.Theo trình tự phản ứng, một phân tử đường sẽphản ứng với 1 phân tử DNS (Wang, 2007)

 Xác định hoạt độ enzyme chitosanase bằng phương pháp acid dinitrosalicylic(DNS) (Nguyễn Văn Mùi, 2001)

- Đun ở 90oC trong 5 - 10phút → dung dịch có màu nâu đỏ

- Thêm 1ml potassium sodium tartrate (Kali natri tartrat) 40% vào phản ứng để ổnđịnh màu

- Làm lạnh đến nhiệt độ phòng

- Đo độ hấp thụ quang học (Absorbance) ở bước sóng 575nm (A575)

 Dựng đường chuẩn Glucosamine: Pha dãy glucosamine chuẩn từ 0; 0,5;

1,0; 1,5; …9,0; 9,5; 10mg trong 1ml Cho 3ml dung dịch glucosamine chuẩn vào mộtống nghiệm, thêm 3ml thuốc thử DNS Đun sôi 90oC trong 5phút Thêm 1ml dungdịch potassium sodium tartrate 40% Làm lạnh đến nhiệt độ phòng Đo độ hấp thụquang học ở bước sóng 575nm (A575) Vẽ đường chuẩn glucosamine với trục tung là độhấp thụ quang học A575, trục hoành là nồng độ glucosamine

 Chuẩn bị mẫu và đo độ hấp thụ quang học của các mẫu enzyme:

Chuẩn bị 2 ống nghiệm, một ống thí nghiệm, một ống đối chứng Lấy 2ml dịchenzyme cho vào mỗi ống, ở ống đối chứng cho thêm 100μl dung dịch NaOH 10N để bấtl dung dịch NaOH 10N để bấthoạt enzyme Sau đó, thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch chitosan 0,2% Đặt 2 ốngnghiệm trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 50oC trong 30phút Sau đó, nhỏ 100 μl dung dịch NaOH 10N để bấtl NaOH 10Nvào ống thí nghiệm để dừng phản ứng Từ mỗi ống này lấy ra 3ml rồi thêm vào 3mlDNS, đặt 2 ống nghiệm trong bể ổn nhiệt 90oC trong 5 - 10phút Sau đó, nhỏ vào mỗiống 1ml dung dịch Kali natri tartrate 40% Rồi để nguội đến nhiệt độ phòng và đo A575

- Mỗi mẫu được làm lặp lại 3 lần

- Kết quả hoạt tính enzyme được tính theo phương trình đường chuẩn

 Định nghĩa đơn vị hoạt tính enzyme chitosanase: Một đơn vị hoạt tính

enzyme chitosanase là lượng enzyme cần thiết xúc tác phản ứng thuỷ phân chitosan để giải phóng ra 1[mol đường khử trong thời gian 1 phút ở các điều kiện tiêu chuẩn của phương pháp phân tích.

Từ định nghĩa ta có công thức tính hoạt tính enzyme chitosanase là:

Hoạt tính = X*4*1000/30*180*2

Trong đó : X là nồng độ glucosamine tính theo đường chuẩn (mg/ml)

4 là tổng thể tích dịch sau phản ứng (2ml dịch enzyme và 2ml dung dịchchitosan)

3.2.7.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc

Cấy trang mẫu giống vi khuẩn đã được tuyển chọn lên đĩa thạch chứa môi trườngcấy truyền, sau đó nuôi trong tủ ấm 480C, sau 22h đem quan sát hình thái khuẩn lạc

3.2.7.2 Quan sát hình thái tế bào

Tiến hành nhuộm Gram, được thực hiện như sau:

- Phiến kính được rửa sạch và làm khô Nhỏ một giọt nước cất lên phiến kính,dùng que cấy lấy một lượng nhỏ vừa đủ tế bào vi sinh vật rồi dàn đều trong giọt nước

- Hong khô và cố định vết bôi

- Nhuộm tiêu bản bằng tím gentian 1% hay tím kết tinh (1 – 2 phút), để nghiêngcho thuốc nhuộm thừa cháy xuổng

- Nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi (1 – 2 phút)

- Rửa tiêu bản bằng nước và tấy bằng ethanol

- Nhuộm màu bổ sung bằng dung dịch Fuschin 0.1% hay safranin trong 1 – 2phút

- Rửa tiêu bản bằng nước, hong khô trong không khí, soi với vật kính dầu

Trên tiêu bản nhuộm đúng, vi khuẩn G+ bắt màu tím, vi khuẩn G- bắt màu đỏ

3.2.8 Xác định đường cong sinh trưởng của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis

Tiến hành nuôi mẫu giống vi khuẩn đã lựa chọn trong môi trường hoạt hoá, ở

480C, lắc 200 rpm Cứ sau 2h lấy dịch nuôi cấy đem đo độ hấp thụ quang học

(Absorbance) ở bước sóng 620nm (A620)

3.2.9 Chọn lựa điều kiện nuôi cấy cho vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme chitosanase hoạt tính cao

Điều kiện nuôi cấy là một yếu tố vô cùng quan trọng giúp cho vi khuẩn sinhtrưởng phát triển, cũng là yếu tố quyết định đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Điềukiện nuôi cấy là sự tổng hoà của các yếu tố như thành phần môi trường, pH môitrường, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy… Từng điều kiện nuôi cấy riêng rẽ đều có ảnhhưởng đến hoạt động sống của vi khuẩn Tìm được giá trị tối ưu của từng yếu tố riêng

rẽ nhưng chưa chắc sự kết hợp của từng yếu tố riêng rẽ đó đã là tìm được điều kiện tốtnhất cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển, bởi lẽ giữa các yếu tố riêng rẽ đó lại có sựtác động tương tác lẫn nhau Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành chọn lựa điều kiện củatổng hợp các yếu tố nuôi cấy cho vi khuẩn Trong điều kiện có hạn, và căn cứ vào cáctài liệu đã công bố và một thí nghiệm khảo sát về khoảng nhiệt độ, pH, nồng độ cơchất chitosan cho sự phát triển của vi khuẩn, chúng tôi tiến hành tìm điều kiện nuôicấy gồm ba yếu tố: nồng độ cơ chất chitosan trong khoảng [0.1%; 0.3%], pH môitrường trong khoảng [7; 9] và nhiệt độ [ 400C; 560C]

Từ phương trình hồi qui có dạng:

Y – hàm mục tiêu, là hoạt tính enzyme chitosanase (U/ml)

b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23 - các hệ số của phương trình hồi quy

Chúng tôi xây dựng được ma trận qui hoạch thực nghiệm được thể hiện trong Bảng3