Nghiên cứu sử dụng hệ enzyme cellulase và acid lactic của vi khuẩn B. subtilis, L. plantarum để xử lý lớp nhớt hạt cà phê

Cà phê mới được biết đến khoảng hơn 300 năm nay, muộn hơn rất nhiều so với nhiều cây lương thực, thực phẩm quan trọng khác. Tuy nhiên, ngày nay cây cà phê đã trở thành một loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao, là một mặt hàng xuất khẩu quan trọng của nhiều quốc gia trên thế giới. Ở một số nước, cà phê là một loại thức uống không thể thiếu. Cà phê còn là nguyên liệu để sản xuất một số mặt hàng thực phẩm như sữa, bánh, kẹo.... sự có mặt của cà phê sẽ làm tăng thêm hương vị và giá trị dinh dưỡng cho sản phẩm. Sở dĩ cà phê được sử dụng ngày càng nhiều vì trong hạt cà phê chứa 0,8 – 3% caffeine, một hoạt chất có tác dụng kích thích thần kinh, giúp tế bào não tăng cường khả năng làm việc, khả năng tư duy và qua đó thúc đẩy hoạt động của hệ tuần hoàn, tăng cường phản ứng của cơ bắp,… Ngoài ra, trong hạt cà phê còn chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể con người như đường saccharose, đường khử, các protein hòa tan,… đặc biệt là các vitamin B1, B2, B6, B12 và PP có hàm lượng khá cao, đó là những chất cần thiết cho nhu cầu sinh lý của cơ thể chúng ta. Do đó cà phê giúp nâng cao sinh lực, chống mệt mỏi, giúp con người làm việc sáng suốt và thoải mái hơn. Trong những năm gần đây diện tích đất trồng và sản lượng cà phê nước ta tăng mạnh, ngành chế biến và xuất khẩu cà phê nước ta đang dần hoàn thiện hơn. Tuy nhiên chất lượng cà phê nước ta còn thấp do phương pháp chế biến còn hạn chế và còn phải nhập khẩu các dạng chế phẩm enzyme thương mại đắt tiền trong sản xuất cà phê theo phương pháp ướt. Vì vậy tôi chọn đề tài “Nghiên cứu sử dụng hệ enzyme cellulase và acid lactic của vi khuẩn B. subtilis, L. plantarum để xử lý lớp nhớt hạt cà phê”. Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần hoàn thiện qui trình sản xuất cà phê theo phương pháp ướt, góp phần tăng chất lượng sản phẩm cà phê.

MỞ ĐẦU

Cà phê mới được biết đến khoảng hơn 300 năm nay, muộn hơn rất nhiều sovới nhiều cây lương thực, thực phẩm quan trọng khác Tuy nhiên, ngày nay cây càphê đã trở thành một loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao, là một mặt hàngxuất khẩu quan trọng của nhiều quốc gia trên thế giới Ở một số nước, cà phê làmột loại thức uống không thể thiếu Cà phê còn là nguyên liệu để sản xuất một sốmặt hàng thực phẩm như sữa, bánh, kẹo sự có mặt của cà phê sẽ làm tăng thêmhương vị và giá trị dinh dưỡng cho sản phẩm

Sở dĩ cà phê được sử dụng ngày càng nhiều vì trong hạt cà phê chứa 0,8 – 3%caffeine, một hoạt chất có tác dụng kích thích thần kinh, giúp tế bào não tăngcường khả năng làm việc, khả năng tư duy và qua đó thúc đẩy hoạt động của hệtuần hoàn, tăng cường phản ứng của cơ bắp,… Ngoài ra, trong hạt cà phê còn chứanhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể con người như đường saccharose,đường khử, các protein hòa tan,… đặc biệt là các vitamin B1, B2, B6, B12 và PP

có hàm lượng khá cao, đó là những chất cần thiết cho nhu cầu sinh lý của cơ thểchúng ta Do đó cà phê giúp nâng cao sinh lực, chống mệt mỏi, giúp con người làmviệc sáng suốt và thoải mái hơn

Trong những năm gần đây diện tích đất trồng và sản lượng cà phê nước ta tăngmạnh, ngành chế biến và xuất khẩu cà phê nước ta đang dần hoàn thiện hơn Tuynhiên chất lượng cà phê nước ta còn thấp do phương pháp chế biến còn hạn chế vàcòn phải nhập khẩu các dạng chế phẩm enzyme thương mại đắt tiền trong sản xuất

cà phê theo phương pháp ướt Vì vậy tôi chọn đề tài “Nghiên cứu sử dụng hệ enzyme cellulase và acid lactic của vi khuẩn B subtilis, L plantarum để xử lý lớp nhớt hạt cà phê” Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần hoàn thiện qui trình

sản xuất cà phê theo phương pháp ướt, góp phần tăng chất lượng sản phẩm cà phê

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tìm hiểu về cà phê

Cà phê là tên một chi thực vật thuộc họ thiên thảo bao gồm khoảng 500 chikhác nhau với trên 6000 loài cây nhiệt đới Cây cà phê thân nhỏ, cao 6 – 10 m, thâncành hình trụ hoặc hình vuông, phân nhánh nhiều Lá mọc đối, hình bầu dục hoặchình trứng, dài 10 – 15 cm, rộng 5 – 6 cm, đầu nhọn, mặt trên xanh sẫm bóng, mặtdưới rất nhạt, gân nổi rõ, mép uốn lượn; cuống lá dài 0,7 -1 cm; lá kèm có gốc rộng,đầu nhọn Cụm hoa gồm 8 – 15 hoa ở nách lá; hoa trắng, rất thơm, đài cụt, trànghình ống ngắn, 5 cánh hoa đều; nhị 5 dính ở họng tràng, xen kẽ với cánh hoa, bầu 2

ô, mỗi ô chứa một noãn Quả hình hạch xoan hơi dẹt, lúc chưa chín có màu xanhlục, khi chín chuyển sang màu đỏ, chứa 2 hạt Mùa cà phê nở hoa và kết trái vàokhoảng từ tháng 11 đến tháng 4 [1]

1.1.1 Thành phần hóa học và cấu tạo của hạt cà phê

1.1.1.1 Thành phần hóa học và cấu tạo của hạt cà phê

Chất lượng hạt cà phê là yếu tố quan trọng trong tiêu chuẩn xuất khẩu cà phê.Các biện pháp canh tác, thu hoạch và chế biến đóng vai trò quan trọng trongviệc tạo ra cà phê nhân sống đạt tiêu chuẩn xuất khẩu Hạt cà phê xanh giàu glucid

và lipid, glucid chiếm hơn 50%, phần lớn là các polysaccharide Lipid (10-15%),protein (10-15%) và acid hữu cơ, đặc biệt là các acid cafeylquinic hay acidchlorogenic Hàm lượng caffeine thay đổi, từ 0,5 đến 1,8%, một phần của caffeinethường kết hợp với acid chlorogenic Cà phê rang lên có những chất thơm, gọi

Hình 1.1 Cây cà phê

chung là cafeol (acid cafeic, oleic, linoleic, palmitic), khoảng 0,05%, nhưng đồngthời lại tạo ra một yếu tố phức hợp độc là cafeotoxin (0,07%) Thành phần hóa họctrong hạt cà phê có ảnh hưởng rất lớn trong quá trình đánh giá chất lượng.

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của hạt cà phê

(Nguồn: Lê Quang Hưng, 1999)

Caffeine là một alkaloid chứa đạm, công thức là C8H10O2N4.H2O, được Runge

và Robiquet tìm ra năm 1820 Caffeine kết tinh với một phân tử nước nhưng trởnên khan khi nung nóng đến nhiệt độ 80-100oC Caffeine khan chứa 28,8% N.Caffeine khan ở dạng tinh thể trắng hình kim, tan trong nước và chloroform.Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) là purine chính trong hạt cà phê Ngoài ra còn cótheobromine(3,7-dimethylxanthine) và rất ít theophylline(1,3-dimethylxanthine).[4],[7]

Cấu tạo: hạt cà phê bao gồm có vỏ quả, lớp thịt quả, vỏ thóc, vỏ lụa và nhân.

Cấu tạo của hạt cà phê trình bày trong hình 1.2

Hình 1.2 Cấu tạo hạt cà phê

1.1.1.2 Lớp nhầy (nhớt)

Bề dày của lớp nhầy trong trái cà phê khoảng 1,5 mm nhưng thay đổi tùy theogiống cà phê Lớp nhầy không hòa tan trong nước, không có cấu trúc tế bào

rõ rệt nhưng ở thể keo vô định hình, nó kết dính rất chặt vào hạt cà phê Lớp nhầy

cà phê chứa khoảng 85% nước liên kết lỏng và 15% chất rắn ở dạng không hòa tan

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của lớp nhầy cà phê

và các ester.[4],[7]

Khi trái cà phê được tiến hành xát vỏ, vô số các vi sinh vật như nấm men, nấmmốc, vi khuẩn,… trong môi trường chung quanh khối hạt đã tìm thấy ở đây mộtmôi trường vô cùng thuận lợi cho sự phát triển của chúng Trong quá trình pháttriển, chúng tự sản xuất ra các enzyme và tác động lên lớp nhầy của khối cà phê xát

vỏ Chính lớp nhầy này sẽ gây ảnh hưởng tới chất lượng cà phê khi chế biến, nếukhông loại bỏ lớp nhầy thì quá trình chế biến hạt cà phê sẽ lâu hơn dẫn đến chấtlượng hạt cũng giảm theo

1.1.2 Các phương pháp chế biến cà phê

Hình 1.3: Qui trình của cà phê từ khi nở hoa cho đến thành phẩm cuối cùng

Phẩm chất và hương vị cà phê phụ thuộc vào một số yếu tố chính sau đây:Giống, khí hậu, độ phì nhiêu của đất và chế độ bón phân, độ chín khi thu hái, kỹthuật chế biến và chế độ bảo quản Trong kỹ thuật chế biến cà phê nhân, có 2phương pháp chính:

+ Phương pháp chế biến khô

+ Phương pháp chế biến ướt

Ngoài ra, còn có phương pháp trung gian là nửa khô nửa ướt Cà phê đem xáttươi còn lẫn cả vỏ quả đem phơi không qua công đoạn lên men và ngâm rửa

Khi thu hoạch người ta chỉ hái những quả chín, không hái quả xanh và quả cònnon Cà phê hái ngày nào nên được chế biến ngay trong ngày hôm đó, số lượng cònlại không nên ủ thành đống lâu quá 24 giờ Để có cà phê nhân phục vụ cho xuấtkhẩu, tỷ lệ quả chín khi thu hái phải đạt trên 95% Cà phê là một sản phẩm dùng đểchế ra loại nước uống cao cấp Để cấu tạo thành nhân của cà phê, theo những kếtquả phân tích người ta thấy có tới 670 hợp chất hữu cơ hợp thành trong đó có nhiềuchất tạo nên hương thơm của cà phê Do vậy, các khâu thu hái, chế biến, phơi sấy,

bảo quản cà phê có một vị trí hết sức quan trọng Các công đoạn trong thu hoạch,chế biến, phơi sấy và bảo quản có mối liên hệ với nhau [4],[7]

1.1.2.1 Phương pháp chế biến khô

Đây là phương pháp chế biến lâu đời và đơn giản hơn so với phương pháp chếbiến ướt, thường được áp dụng trong chế biến cà phê Robusta Trước tiên, người taphơi hay sấy nhằm làm giảm độ ẩm của trái cà phê tươi, trong khoảng 1-3 tuần lễđến khi độ ẩm của trái cà phê đạt 11% thì ngừng Phương pháp phơi nắng cà phêlàm tốn nhiều công sức do phải thường xuyên cào đảo khi phơi, phải che phủ cho

cà phê vào ban đêm và khi trời mưa Trong những điều kiện thời tiết thuận lợi, côngviệc phơi nắng cho cà phê hoàn tất sau 10-14 ngày Việc phơi cà phê trên các sânphơi bằng đất sẽ làm cho thành phẩm cà phê về sau khi uống sẽ có mùi của đất.Ngoài ra, do sự không đồng đều về độ ẩm của khối hạt khi phơi nắng nên sẽ tạođiều kiện cho việc bị nhiễm các vi sinh vật, kết quả là làm giảm mùi vị của cà phêkhi uống Sau khi hoàn tất công đoạn phơi/sấy (vỏ cà phê hột có màu nâu đậm vàgiòn), cà phê hột được thu gom lại và chuyển sang giai đoạn bóc vỏ để thu được càphê nhân và đem đi bảo quản [18]

1.1.2.2 Phương pháp chế biến ướt

Phương pháp chế biến ướt tốn kém và phức tạp hơn so với phương pháp chếbiến khô Tuy nhiên, phương pháp này sản xuất ra cà phê nhân sạch và phẩm chấttốt hơn Phương pháp này tiêu thụ một lượng nước đáng kể, và được ứng dụng rộngrãi nhiều nơi trong sản xuất Arabica, đặc biệt ở Kenya và Colombia Phương phápchế biến ướt nhằm biến đổi trái cà phê tươi ban đầu thành dạng cà phê thóc, baogồm các công đoạn sau: [14],[15],[16],[18]

+ Thu nhận và phân loại

+ Xát vỏ

+ Tách lớp nhầy (lên men)

+ Rửa và phân loại theo tỷ trọng dòng nước

+ Phơi/sấy

+ Tách vỏ trấu, phân loại

 Thu nhận và phân loại

- Cà phê sau khi thu hái về được phân loại trước khi vào máy xát tươi để loại

bỏ các tạp chất như đất, đá sắt, cành lá…đồng thời phân loại riêng các quả cà phêkhông đạt yêu cầu như: quả xanh, khô, lép, sâu bệnh

- Phân loại bằng cơ giới trên các bàn rung, các trụ quay,… không hiệu quảbằng phân loại theo tỷ trọng bằng bể xiphong vì làm theo cách này không nhữngphân loại được cà phê mà còn rửa sạch quả cà phê trước khi qua máy xát Cà phêthu hái về đổ vào bể xiphong dưới tác dụng của tỷ trọng thì trái nào nặng sẽ chìmxuống dưới, trái nào chín khô nhẹ hơn và cành lá sẽ nổi lên trên

- Bể được bơm nước tới 4/5 và được cấp nước liên tục theo ống đứng và ốngngang phía trên chảy ra ngoài, kéo theo các quả cà phê theo nguyên lý bìnhxiphong Nước dư thừa chảy qua 1 miệng xả đặt gần thành bể, kéo theo các tạp chấtnhẹ như rác, cành, lá, quả lép, sâu bệnh,… Các tạp chất nặng như gạch, đất, đá, cát,sạn,… lắng xuống đáy bể và được xả ra ngoài sau mỗi lần ngừng

nhưng vẫn còn lớp nhớt bao quanh lớp vỏ

trấu Lớp nhớt này dù phơi khô nhưng sau này

vẫn hút ẩm rất nhanh, gây khó khăn cho việc

Hình 1.4 Phân loại cà phê trong bể xiphong

phơi sấy nên cần phải loại bỏ ngay lớp nhớt này sau khi xát tươi (giai đoạn tiếp theo

đi lên men làm sạch lớp nhớt)

 Tách lớp nhầy

Các phương pháp loại lớp nhầy (nhớt):

- Phương pháp sinh học: sử dụng các enzyme: pectinase, protopectinase,cellulose…

- Phương pháp lên men: sử dụng các vi sinh vật có khả năng phân hủy lớpnhớt

- Phương pháp hóa học: sử dụng NaOH, Na2CO3,vôi

- Phương pháp dùng nước ấm

- Phương pháp cơ giới: sử dụng máy trà xát tươi

Ở đây chúng ta sử dụng phương pháp lên men:

+ Cà phê (thóc) sau khi qua máy xát tươi được dẫn đến bể ngâm bằng ximăng, thể tích bể 1÷10m3, thành bể cao 1÷1,5m Hiện nay có 2 phương pháp lênmen: lên men khô và lên men ướt

• Lên men khô: nước được tháo hết khỏi bể chứa, cà phê được giữ ở đócho tới khi lớp nhầy hoàn toàn tan ra và cũng được xả ra ngoài liên tục Để tránhcho lớp hạt bên trên khỏi bị khô, người ta dùng lá chuối, bao bị ướt…phủ lên trên

• Lên men ướt: quá trình tiến hành trong khối nước và dịch lên men chỉđược xả ra 1 lần khi hoàn tất quá trình lên men

Mục đích của quá trình lên men là làm sạch hết lớp chất nhầy có trên vỏ càphê Việc ủ cà phê được thực hiện trong bể xi măng hay trong các thùng nhựa…đổhạt cà phê vừa bóc vỏ vào bể, chế phẩm vi sinh (các vi sinh vật) và 1 lượng nướcnhất định, dàn đều rồi dung bao tải phủ lên trên Thời gian lên men kéo dài từ12÷24 giờ tùy theo thời tiết, nếu nhiệt độ môi trường cao thì thời gian lên men sẽnhanh hơn Sau 5÷6 giờ lên men tiến hành đảo trộn để cung cấp đủ oxi cho khối ủ

và nhiệt độ đều khắp khối ủ

10SHLT

Sau khi lên men ta kiểm tra thấy các hạt xát vào nhau không còn trơn mà cócảm giác nhám, thì quá trình lên men đã đạt, có thể rửa lại khối hạt và đưa đi phơisấy.

 Rửa:

- Mục đích: loại bỏ lớp chất nhờn đã lên men, tạp chất… Quá trình rửa có ảnhhưởng rất quan trọng đến phẩm chất cà phê nhân vì nó tẩy sạch những chất gây ảnhhưởng đến màu sắc hạt và mùi vị hạt lúc rang

- Cách tiến hành: cà phê được rửa trong bể ngâm ủ, khuấy trộn, thay nước liêntục cho đến khi nước hoàn toàn trong vắt

 Phơi sấy:

Cà phê thóc sau khi rửa và để ráo nước, còn chứa 50÷60% nước Để giảm độ

ẩm xuống còn 12%, ta tiến hành phơi sấy

 Tách vỏ trấu và phân loại:

Sau khi phơi, sấy khô ta bóc lớp vỏ trấu của hạt cà phê trên máy chà vỏ, sau

đó đem phân loại các hạt theo kích thước và màu sắc rồi đem chế biến hoặc bán trênthị trường.[14],[15],[16],[18]

10SHLT

Hình 1.7 Quá trình rửa cà phê sau khi lên men

1.2 Chế phẩm vi sinh sử dụng trong quá trình lên men cà phê theo phương pháp ướt

1.2.1 Tìm hiểu về pectin, cellulose, enzyme pectinase, cellulase và acid lactic

1.2.1.1 Pectinase

- Định nghĩa: Pectin là một phân tử tương tự như tinh bột, khác ở chỗ đơn vịtuần hoàn của pectin là acid galacturonic thay vì glucose ở tinh bột Pectin là hợpchất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của các acid galacturonic quacác liên kết -1,4-glucoside

Trong thực vật, pectin có chức năng tự nhiên như một chất keo để giữ thành tếbào cũng như các tế bào lại với nhau Tùy thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khốilượng phân tử từ 80.000 – 200.000 Da Pectin không hòa tan trong rượu và cácdung môi hữu cơ khác Pectin tan trong nước, NH3, dung dịch kiềm, Na2CO3 vàtrong glycerin nóng

- Phân loại

Trong thực vật, pectin tồn tại dưới 3 dạng:

+ Pectin hòa tan: là ester methylic của acid polygalacturonic

Hình 1.10 Cấu trúc hóa học của

phân tử pectin Hình 1.9 Cấu trúc thành tế bào thực vật

+ Pectinic acid: là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxylđược ester hóa bằng methanol

+ Protopectin: tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước Trong thànhphần có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca2+, Mg2+, cácgốc phosphoric acid, acetic acid và đường Protopectin khi bị thủy phân bằng acidthì giải phóng pectin hòa tan [4],[7]

và cây thân mềm (cỏ, rơm rạ,…) gồm cellulose, hemicellulose và lignin

- Định nghĩa: Cellulose là polymer thẳng của các đơn vị -D-glucose được nối vớinhau qua liên kết -D-1,4-glucan Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghenngười ta biết rằng cellulose có cấu tạo dạng sợi Các sợi này liên kết lại thành những

bó nhỏ gọi là các microfibril (vi sợi) có cấu trúc không đồng nhất, chúng có nhữngphần đặc (phần kết tinh) và những phần xốp hơn (phần vô định hình)

- Cấu trúc

Các phân tử cellulose kết hợp với nhau bằng lực hút Vanderwall vàliên kết hydro Chúng tạo nên sợi sơ cấp, sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành visợi

Hình 1.4 Cấu trúc cellulose trong tế bào thực vật

- Tính chất

Cellulose có trọng lượng phân tử từ 50.000 đến 2.500.000 Da Cellulosethường chứa 10.000 – 14.000 gốc đường Cellulose là một trong những hợp chất tựnhiên khá bền vững Nó không tan trong nước mà chỉ có thể bị phồng lên do hấpthu nước, bị phân hủy khi đun nóng với acid hoặc kiềm ở nồng độ khá cao.Cellulose bị thủy phân ở nhiệt độ bình thường hoặc ở nhiệt độ 40÷50oC nhờ cácenzyme thủy phân cellulose được gọi chung là cellulase

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trongđiều kiện hiếu khí lẫn yếm khí Các loài vi sinh vật thay phiên nhau phân hủycellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose Tuy nhiên, sự phân giải cellulosetrong điều kiện tự nhiên thường rất chậm và thường không triệt để Trong tế bàothực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (chiếm 20÷40% trọng lượngkhô) là một loại heteropolymer chứa nhiều loại monosaccharide như galactose,mannose, glucose, xylose, arabinose và các nhóm acetyl Do bản chất không kếttinh nên hemicellulose tương đối dễ bị thủy phân Cellulose còn liên kết chặt chẽvới lignin (10 – 25% trọng lượng khô) Đây là thành phần ảnh hưởng rất nhiều đến

sự thủy phân cellulose của enzyme Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ trong sợibông) cellulose tồn tại ở trạng thái một polymer gần tinh khiết

Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất các enzyme thủy phân cơ chấtnày có tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như hóa chất, nhiênliệu, thực phẩm, rượu bia, thức ăn gia súc, vải sợi, bột giặt, giấy, bột giấy,…

- Vai trò

Cellulose là nguồn hữu cơ nhiều nhất trong thực phẩm, chất đốt và hóa chất.Cellulose tồn tại một lượng rất lớn trong thực vật, không đều ở các cơ quankhác nhau, ít nhất ở lá và nhiều nhất là ở thân cây

Sự hiện diện của cellulose đóng vai trò là một vật liệu phổ biến của vách tếbào thực vật được phát hiện lần đầu tiên bởi Anselm Payen vào năm 1838 Nó tồntại ở hầu hết những hình thức nguyên trong sợi cotton và trong tổ hợp với những vậtliệu khác, như lignin và hemicellulose, trong gỗ, lá và thân … Mặc dù, nhìn chung

được xem như vật liệu thực vật nhưng cellulose cũng được sản xuất bởi một số vikhuẩn

Cellulose là nền tảng bộ xương của thành tế bào thực vật Ngoài ra người tacòn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (cellulose ở vi sinh vậtthuộc loại vô định hình, việc phân hủy thường dễ thực hiện) Cellulose không

- Phân loại và cơ chế tác dụng của các loại enzyme pectinase

Các pectinase được chia thành hai nhóm chủ yếu:

+ Pectimetylylesteraza (Pectinhydrolaza): xúc tác sự thủy phân liên kết estetrong phân tử pectin hoặc axit pectinic khi toàn bộ nhóm metoxyl bị tách ra khỏi cơchất thì sản phẩm là methanol và các axit polygalacturonic Sự thủy phân chỉ xảy ra

ở liên kết este liền kề với nhóm cacboxyl tự do

+ Polygalacturonaza (Polygalacturonic - glucanohydrolaza): xúc tác sự thủyphân liên kết 1-4 glucozit trong phân tử pectin Có nhiều polygalacturonaza có tínhđặc hiệu rất khác nhau:

· Polymetylgacturonaza: tác dụng chủ yếu lên các este metylic của các axitpolygalacturinic, chia thành hai nhóm nhỏ:

* Endoglucozidaza – polymetylgalacturonaza I: xúc tác sự thủy phân liên kếtglucozit nội mạch của các phân tử polygalacturonic được este hóa ở mức độ cao

* Exoglucozidaza – polymetylgalacturonaza III: xúc tác sự thủy phân các liênkết glucozit ở đầu mạch để tách từng gốc axit polygalacturonic ra khỏi phân tử

pectin, bắt đầu từ đầu không khử Enzyme này có ái lực với gốc axit galacturonic đã

Ngoài các enzyme kể trên, tham gia vào sự phân giải các hợp chất pectin còn

có enzyme protopectinaza xúc tác sự phân giải protopectin không tan thành pectinhòa tan và enzyme transeliminaza xúc tác sự phân cắt các hợp chất pectin bằng cáccon đường thủy phân tạo thành galacturonic mạch ngắn hơn với liên kết kép ởnguyên tử cacbon số 4 và số 5

- Các vi sinh vật tổng hợp pectinase

+ Nấm mốc:

Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus niger,

Aspergillus terrus, Aspergillus saitoi

Fusarium moniliforme

Penicillium glaucum, Penicillium ehrlichii, Penicillium chrysogenum, Penicillium expanam, Penicillium cilrrimim,…

+ Nấm men: Saccharomyces fragilis

+ Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella

aerogenes,…

Ngoài ra, pectinase cũng được tiết ra bởi một số mầm bệnh cây trồng như:

Nấm Monilinia fructigena, vi khuẩn gây thối rữa Enwinia carotovora [5],[6]

1.2.1.4 Cellulase

- Định nghĩa: Cellulase là một phức hệ hydrolase gồm từ cellulase C1 đếncellulase Cx và glucosidase Chúng sẽ phân hủy lần lượt cellulose để cuốicùng tạo ra sản phẩm đường glucose

- Tính chất

Hoạt tính của hệ enzyme cellulase đạt cao nhất ở nhiệt độ nằm trong khoảng40÷60oC, pH nằm trong khoảng 4÷7 Cellulase bị ức chế bởi những sản phẩmphản ứng của nó như glucose, cellobiose Hg ức chế hoàn toàn cellulase, trongkhi các ion như Mn2+, Ag+, Cu2+ và Zn2+ chỉ ức chế nhẹ Hoạt tính của chế phẩmcellulase bị mất hoàn toàn sau 10÷15 phút ở 80oC

- Ứng dụng

Hiện nay, cellulase từ vi sinh vật được sản xuất với quy mô côngnghiệp và được ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau Các ứng dụng quantrọng nhất có thể kể đến là:

Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase được sử dụng để sản xuất glucose,mật đường từ nguyên liệu chứa nhiều cellulose như rơm, rạ, gỗ vụn, mạt cưa,… Trong công nghiệp sản xuất ethanol từ các phế liệu có chứa cellulose

Trong chăn nuôi động vật ăn cỏ: việc bổ sung cellulase vào thức ăn sẽ tăngcường sự tiêu hóa hấp thụ thức ăn ở các loài này

Trong sản xuất dược liệu có nguồn gốc thực vật: cellulase phá vỡ thành tế bào thực vật giúp cho việc trích ly được dễ dàng

- Phân loại và cơ chế tác dụng của các loại enzyme cellulase

Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của hệ enzyme cellulose xảy ra theo bagiai đoạn chủ yếu sau:

C1 Cx β - Glucozidase

Cellulose Cellulose Cellobiose Glucose+ Giai đoạn thứ nhất: dưới tác dụng của tác nhân C1cellulose nguyên thểchuyển thành cellulose hòa tan Người ta cho rằng tác nhân C1 gây ra sự biến đổicellulose trong giai đoạn này không phải là enzyme mà là bao gồm một số tác nhânnào đó đặc trưng của môi trường có vi sinh vật phát triển

+ Giai đoạn thứ hai: cellulose (đã biến đổi sau giai đoạn 1) bị thủy phân dướitác dụng xúc tác của hệ enzyme thủy phân Cx tạo thành đường cellobiose Enzyme

Cx còn được gọi là enzyme β – 1,4 – glucanase Chữ x có nghĩa cho ta biết đây làloại enzyme có nhiều thành phần khác nhau Người ta thường chia thành hai loại:Exo – β – 1,4 – glucanase: xúc tác việc tách ra một cách liên tiếp các đơn vịglucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose

Endo – β – 1,4 – glucanase: phân cắt liên kết β – 1,4 – glucozit ở bất kì vị trínào bên trong chuỗi cellulose.

+ Giai đoạn cuối cùng: dưới tác dụng của enzyme cellobiose (β Glucozidase), đường cellobiose bị thủy phân thành glucose

Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme cellulase

Hệ vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase khá phong phú,thuộc 3 nhóm: nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn Trong công nghiệp sản xuất cellulasehiện nay, người ta chủ yếu nuôi cấy nấm sợi và xạ khuẩn, còn vi khuẩn ít được sửdụng

+ Nấm sợi: Chủ yếu là nấm mốc và nấm quả thể, đa số có khả năng sinh tổnghợp các loại enzyme ngoại bào (được nấm tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy)

Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sydovii, Aspergillus terrus

Trichoderma koningi, Trichoderma lignorum, Trichoderma roseum, Trichoderma reesei

Hệ vi sinh vật trong dạ dày của động vật ăn cỏ, ví dụ: Cillobacterium

cellulosolvens, Ruminococcus albus, Ruminobacter parum,…

- Giới thiệu về acid lactic: Acid lactic là một hợp chất hữu cơ thu được bằng

phương pháp lên men do tác nhân lên men chủ yếu là vi sinh vật

Công thức phân tử: C3H6O3

Công thức tổng quát: CH3-CHOH-CH(COOH)

Acid lactic còn có tên gọi khác là 1- hydroxyethanol cacbonxylic hay acid 2 - hydroxypropanoic Trong cấu tạo của chúng có một cacbon bất đối xứng nên chúng

có hai đồng phân quang học: D-acid lactic và L-acid lactic Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang trái và một sang phải Do đó tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau

Ở dạng đồng phân D-acid lactic và L-acid lactic lần lượt có nhiệt độ nóngchảy và nhiệt độ sôi là 28ºC và 103ºC

- Ứng dụng của acid lactic: Ngày nay acid lactic được sử dụng khá phổ biến

trong nhiều lĩnh vực như trong thực phẩm, y học, nông nghiệp… Như: sản xuất cácsản phẩm sữa chua và các sản phẩm rau quả muối chua, các sản phẩm men tiêuhóa… Lượng acid lactic do các vi khuẩn tổng hợp có thể giúp các phản ướng thủyphân lớp nhớt của hạt cà phê diễn ra nhanh hơn đồng thời cải thiện hương vị cho hạt

các sản phẩm cà phê có chất lượng và hương vị tốt hơn Một số chế phẩm vi sinh đãđược nghiên cứu và sản xuất:

- Chế phẩm biocoffee-1 từ chủng nấm mốc Aspergillus niger chứa hoạt tính

enzyme pectinase và cellulase cao với thành phần môi trường tối ưu là 9% cà rốt,15% vỏ trấu và những thành phần khác là 75% cám và 1% NH4(SO4)2 và các yếu tốkhác như sau: điều kiện nhiệt độ khoảng 27-30oC (nhiệt độ phòng), độ ẩm từ 56-64%W và thời gian từ 40-44 giờ Quá trình nhân lên của chế phẩm, hai loại bột mì

và bột sắn nhận thấy là tốt nhất và tỉ lệ tốt nhất là bột mì: bột sắn = 2:1, với độ ẩm56% và thời gian 30 giờ Điều kiện tối ưu cho quá trình dung chế phẩm để lên men

cà phê là cà phê nên ngâm nước 1 giờ và để ráo, thời gian lên men 16 giờ và tỉ lệchế phẩm: Trọng lượng cà phê sử dụng là 16/1000 [7]

- Chế phẩm sinh học (chủ yếu là enzyme pectinase và enzyme cellulase), từ

chủng nấm mốc Aspergillus niger và Trichoderma reesei có hoạt tính phân giải

mạnh trên đối tượng cà phê nhân, tác động chủ yếu vào hai thành phần chính làpectin và cellulose Với các điều kiện tối ưu như sau:

+ Tỉ lệ cơ chất tối ưu cho chế phẩm là 2 phần bột mì và 1 phần bột sắn

+ Thời gian nuôi các vi sinh vật tối ưu cho sinh tổng hợp pectinase và cellulase

là 30 giờ

+ Chế phẩm có hiệu quả tốt trong lên men ba loại cà phê phổ biến ở Việt Nam(cà phê Bi, Sẻ và Mokka) Cà phê sau lên men có độ hòa tan và khối lượng chất tanthu được tăng rõ rệt so với cà phê không được lên men

+ Ngâm hạt cà phê trước khi lên men trong 1 giờ là thời gian ngâm thích hợpgiúp thu được nhiều chất hòa tan nhất

+ Thời gian lên men hạt cà phê tối ưu là 16 giờ

+ Tỉ lệ chế phẩm sử dụng là 0,16% thì hiệu suất trích ly của hạt sau lên menđạt tối đa, lượng chất hòa tan thu được cao nhất

+ pH khối hạt khi lên men giảm dần theo thời gian và cũng giảm theo sự giatăng của hàm lượng chế phẩm

+ Trọng lượng khối ủ giảm dần theo sự gia tăng của hàm lượng chế phẩm.Theo thời gian lên men thì trọng lượng khối ủ giảm dần, về sau lại tăng nhẹ

+ Nhiệt độ khối ủ đạt cao nhất sau khi lên men 8 giờ

1.3 Chế phẩm vi sinh Bacillus subtilis và Lactobacillus plantarum trong sản

xuất cà phê lên men theo phương pháp ướt

1.3.1 Giới thiệu về chế phẩm

Chế phẩm được sản xuất nhờ phối hợp 4 chủng vi sinh vật:

- Hai chủng nấm mốc Aspergillus niger và Mục trắng

- Hai chủng vi khuẩn Bacillus subticlic và Lactobacillus plantarum

Trong đó có 3 chủng vi sinh vật: Aspergillus niger, Ph chrysosporium và

Bacillus subticlic có khả năng phân hủy lớp nhớt bên ngoài hạt cà phê nhờ chúng có

hệ enzyme pectinase và hệ enzyme cellulose Vi khuẩn Lactobacillus plantarum có

khả năng lên men lactic giúp tăng hương vị cà phê sau lên men

Cà phê nhân sau khi thu hái về và bóc vỏ tiến hành đem xử lý bằng chế phẩm,khối hạt cà phê được cho vào bể xi măng, bổ sung chế phẩm vào trộn đều rồi tiếnhành lên men trong khoảng thời gian 12 giờ đến 20 giờ Trong quá trình lên mentiến hành đảo trộn, sau đó đem đi rửa và xem hiệu quả xử lý rồi tiến hành chế biếncông đoạn tiếp theo

1.3.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis

1.3.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis được Cohn phát hiện năm 1872 (Ban đầu Bacillus subtilis tên Vibrio (1835), sau đó đã được đổi tên Bacillus subtilis vào năm 1872), nó phân bố

phổ biến trong đất, đặc biệt trong cỏ khô nên còn có tên gọi khác là trực khuẩn cỏ

khô, dễ tìm thấy trong đất, cỏ khô và trong các chất hữu cơ bị thối rữa, Bacillus

subtilis hiện diện nhiều ở mang, da và ống tiêu hoá của tôm Chúng cũng hiện diện

tự nhiên trong môi trường nước ngọt và nước mặn

Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màngmịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch Nhiệt độ

thích hợp cho B subtilis sinh trưởng là 30-50oC, thường nuôi cấy ở 37oC

Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6-0,9µm, phân bố lệch tâm, gần tâm nhưngkhông chính tâm Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm Đã có những

chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử B subtilis trong 200-300 năm Vi khuẩn B subtilis có màng nhày (giác mạc) giúp vi khuẩn có khả năng chịu đựng

được điều kiện thời tiết khắc nhiệt, vì màng nhày có thể dự trữ thức ăn và bảo vệ vikhuẩn tránh tổn thương khi khô hạn Màng nhày có thể quan sát được khi nhuộmtiêu bản, qua kính hiển vi thấy màng nhày trong suốt còn tế bào vi khuẩn bắt màunâu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen

Theo sự phân loại khoa học Bacillus subtilis thuộc Giới (Kingdom): Bacteria, Ngành (Division): Firmicutes, Lớp (Class): Bacilli, Bộ (Ordo): Bacillales, Họ (Familia): Bacillaceae Chi (Genus): Bacillus Bacillus subtilis (B subtilis) là một

trong những vi khuẩn đầu tiên được nghiên cứu

Các loài:

B subtilis là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, là

sinh vật có nhân điển hình có thể kết thành chuỗi dài ngắn khác nhau và tế bào cóthể đứng riêng rẽ, tế bào có kích thước 3-5x0,6-0,9 μm, sinh bào tử, bào tử chịunhiệt khá cao Ở điều kiện 1000C, bào tử của B subtilis chịu được 180 phút, có tính

ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ(Kerovuo et al., 2000)

Bacillus là vi khuẩn gam dương tính và catalase dương tính, sử dụng khí oxy

làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất Qua kính hiển

vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những chiếc que

này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu Thường thìngười ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạngbất định và đang phát triển lan rộng

Chủng này có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại bào:

protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase và dextranase, protease kiềm

có giá trị cao, đặc biệt có khả năng sinh tổng hợp roboflavin (tiền vitamin B2) Vì

vậy B.subtillis được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp [5],[9],[10].

1.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của Bacillus subtilis

- Nhiệt độ: Hoạt động của vi khuẩn tối ưu nhất xảy ra tại nhiệt độ 37-400C, tạivùng nhiệt độ này lượng amylase sản sinh ra là lớn nhất Ở nhiệt độ 400C-500C vànhiệt độ 300C-400C lượng amylase giảm dần nhưng khi nhiệt độ lớn hơn 600C thìlượng enzyme tạo ra giảm đáng kể

- pH: Ở pH axit yếu thì lượng amylase tạo thành cao hơn so với pH axit hay pH

kiềm pH tối ưu để đạt lượng enzyme amylase là khoảng pH = 5,5-6,5, tốt nhất là tại

pH = 6,5

1.3.2.3 Môi trường nuôi cấy

Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường chứa các chất như là nguồn cacbon,nitơ, muối vô cơ và chất dinh dưỡng hữu cơ Các nguồn carbon bao gồmcarbohydride như glucose, tinh bột hay maltose và acid hữu cơ như axit axetic, mỡ,rượu…Tuy nhiên trong nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme amylase thìđường glucose có thể kìm hãm khả năng sinh tổng hợp enzyme

Nguồn nitơ là các muối amoni vô cơ như: amoni clorua, sulfat amoni hoặcnitrat amoni, hay nguồn nitơ là các hợp chất hữu cơ như: bánh đậu tương, bột đậutương, casein sữa, pepton, các chiết xuất từ thịt và các acid amin

Hình 1.12: Hình dạng mặt cắt ngang

tế bào của Bacillus subtilis Hình 1.11: Khuẩn lạc của vi khuẩn

Bacillus subtilis

Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng cũng có ảnh hưởng dến quá trìnhsinh trưởng của vi sinh vật.Trong môi trường nuôi cấy có đủ các yếu tố dinh dưỡngcần thiết cho sự phát triển và tích lũy enzyme của vi sinh vật

Điều kiện nuôi cấy được tiến hành đối với vi khuẩn ở nhiệt độ từ 25-45°C, tốthơn giữa 30-40°C, trong điều kiện hiếu khí bằng cách lắc, khuấy Độ pH trung bìnhtốt nhất của môi trường phụ thuộc vào chủng vi sinh vật được nuôi cấy.[5],[9],[10]

1.3.3 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum

1.3.3.1 Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus plantarum

Từ lâu acid lactic (CH3CHOHCOH) đã được con người sử dụng để bảo quản

và chế biến thực phẩm Acid này lần đầu tiên được phát hiện ra từ sữa bò lên menchua bởi nhà hoá học Thụy Điển Carl Scheele năm 1780 và được gọi là “acid sữa”.Năm 1857 Louis Pasteur lần đầu tiên đã chứng minh được rằng việc làm chua sữa

bò là kết quả của một nhóm VSV đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic Năm 1878, Joseph

Lister lần đầu tiên phân lập được một loại vi khuẩn lactic đặt tên là Bacterium lactic (hiện nay gọi là Streptococcus lactic) Từ đó đến nay nhiều loài vi khuẩn lactic khác nhau đã được phân lập và nghiên cứu trong đó phải kể đến vi khuẩn Lactobacillus

và xác thực vật đang bị phân giải, trên bề mặt các loại rau quả, trái cây,trong ruột vàcác niêm dịch ở người và động vật…[5],[8],[9]

Lactobacillus plantarum là một vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử, không có

khả năng di động, khuẩn lạc tròn, nhẵn, màu trắng sữa, tế bào có dạng hình que

A B

Hình 1.13 Hình ảnh Lactobacillus plantarum khi quan sát dưới kính hiển vi(A),

khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường thạch(B) 1.3.3.2 Đặc tính sinh học và ứng dụng

Vi khuẩn Lactobacillus plantarum có phản ứng catalase âm tính, có khả

năng đồng hoá cacbonhydrat arabinnose, xenlobiose, fructose, glucose, lactose,maltose, manitol, melezitose, saccarose, nhưng không sử dụng sorbitol Chúng hôhấp tùy tiện, nhiệt độ phát triển được giới hạn trong khoảng từ 15ºC ÷ 40ºC vì là

loài ưa ấm nên nhiệt độ thích hợp để Lactobacillus plantarum phát triển là ở nền

nhiệt độ ấm (30ºC ÷ 35ºC) và pH thích hợp là từ 5,5 ÷ 6,6

Tính chất đặc trưng của các vi khuẩn lactic nói chung và Lactobacillus

Plantarum nói riêng là có khả năng sinh acid lactic nên được sử dụng rất nhiều

trong công nghiệp đặc biệt là trong lên men sản xuất các sản phẩm từ sữa như: sữachua, phomat, kefia, yaourt…, hay dùng trong muối chua rau quả vốn đã là một sảnphẩm truyền thống lâu đời

Một đặc tính quan trọng nữa của Lactobacillus plantarum đó là chúng có khả

năng sinh bacterioxin, một loại loại protein có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác

do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loạibacterioxin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan

để làm suy yếu thành tế bào

Ngoài ra Lactobacillus plantarum còn được tìm thấy trong đường ruột con

người và hoạt động như một probiotic vi khuẩn có tác dụng tốt đối với hệ tiêu hóa.[5],[8],[9]

1.3.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của Lactobacillus plantarum

Để vi khuẩn Lactobacillus plantarum có thể sinh trưởng và phát triến tốt thì

môi trường nuôi cấy chủng cần phải được quan tâm đến các yếu tố sau:

• Nguồn dinh dưỡng cacbon: Lactobacillus plantarum sử dụng nguồn

năng lượng chính từ các nguồn đường mono- và disaccharide như glucose, lactose,saccarose, maltose và các acid hữu cơ như acid citric, malic, pyruvic, fumaric,…làmnguồn năng lượng và trao đổi cấu trúc Khi không có mặt nguồn cơ chất như trên, vikhuẩn sẽ sử dụng nguồn năng lượng và vật liệu tế bào là các acid amin (acidglutamic, arginin, tirozin,…) và giải phóng CO2 Chúng không sử dụng được nguồncacbon là polysaccharide

• Nguồn dinh dưỡng nitơ: phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổnghợp được các hợp chất chứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và pháttriển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường

Các nguồn nitơ hữu cơ mà vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, caonấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,… Hiện nay cao nấm men

là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất

Còn đối với nitơ vô cơ thì nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vậtchính là muối amon Đôi khi có lòai không sử dụng được muối này thì nguyên nhânkhông phải do bản chất của NH4+ mà do sau khi đồng hóa gốc amon , môi trường sẽtích lũy các gốc anion vô cơ như SO42-, HPO42-, làm giảm pH của môi trường Đốivới vi khuẩn lactic thì đây là một đặc điểm rất quan trọng vì quá trình sinh trưởngcủa chúng phụ thuộc rất nhiều vào giá trị pH

• Nguồn vitamin: vi khuẩn lactic nói chung và với Lactobacillus

plantarum nói riêng rất cần vitamin làm nguồn chất sinh trưởng Tuy nhiên, đa số

các loài vi khuẩn lactic lại không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổsung vào môi trường các loại vitamin Các chất chứa vitamin thường sử dụng nhưnước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men… Người ta cũng xácđịnh được rằng: yêu cầu về vitamin riêng biệt của vi khuẩn lactic có thể thay đổi khitrong môi trường có các acid amin hay acid béo khác nhau Bazơ purin (adenine,guanine) cũng làm ảnh hưởng tới nhu cầu của vi khuẩn về acid n-aminobenzoic,nhu cầu về acid folic giảm nhiều nếu như môi trường có chứa tất cả các acid amin

đã biết, timine hoặc bazơ purin được tổng hợp nhờ vi khuẩn trong sự tham gia củaacid folic.

• Các chất vô cơ: để phát triển và phục vụ các hoạt động sống của vikhuẩn lactic, cũng cần có các hợp chất vô cơ như: Cu, Fe, Na, P, I2, Mn,… đặc biệt

là Mn có tác dụng chống tế bào tự phân Vi khuẩn làm giảm độ acid có trong môitrường cần có phức hợp các chất khoáng Khi vi khuẩn đã kém hoạt lực có thể chochúng hoạt hóa ở môi trường đã được bổ sung những ion K+, Mg2+ hoặc Mn2+

• Nguồn Oxy: vi khuẩn lactic không có hệ enzyme cytochrom tham giavào hô hấp, nhưng chúng lại thực hiện được hô hấp nhờ hoạt tính của một số hợp

chất có mặt của hệ flavoproteit Lactobacillus plantarum thường sinh trưởng tốt

trong điều kiện kị khí

• Nhiệt độ: vi khuẩn Lactobacillus plantarum là loài ưa ấm nên thích hợp phát triển trên nền nhiệt 30ºC, từ 45ºC trở đi vi khuẩn Lactobacillus plantarum

ngừng hoạt động

• pH môi trường: các chủng vi khuẩn lactic chịu được pH thấp khác

nhau, pH thích hợp cho Lactobacillus plantarum phát triển giới hạn trong khoảng

5,5 ± 6,6 [5],[8],[9]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Vật liệu và dụng cụ, máy móc

2.1.1 Vật liệu

Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis và chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum

được phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường ĐH Bách Khoa ĐàNẵng cung cấp

Cà phê tươi sau khi thu hái được sử dụng để nghiên cứu, các loại cà phê nàyđược trồng ở tỉnh Đắk Lắk

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong thí nghiệm

2.1.2.1 Thiết bị

Thiết bị, máy móc ở trong phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Khoa Hóa,Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng như:

- Tủ cấy

- Máy đo màu

Và các thiết bị, dụng cụ thông dụng khác trong phòng thí nghiệm Công NghệSinh Học theo hình ảnh ở phụ lục 1.1

2.1.3 Hóa chất và thành phần môi trường nuôi cấy

2.1.3.1 Hóa chất

- Các hóa chất được sử dụng để đánh giá hoạt lực enzyme: tinh bột tan, thuốcnhuộm màu Iod, thuốc thử DNS và một số loại hóa chất khác Các hóa chất đượcphòng thí nghiệm Công nghệ sinh học cung cấp Các hóa chất sử dụng đều có độtinh khiết cao, còn nguyên phẩm chất, không bị biến tính

2.1.3.2 Thành phần môi trường nuôi cấy

a) Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn B subtilis

- Môi trường hoạt hóa: Cao thịt 3 g/l, pepton 10g/l, muối 20g/l, agar 20%

Để thu enzyme pectinase và cellulase chúng tôi sử dụng môi trường theonghiên cứu của Lê Hương Thuỷ, Võ Hoài Bắc, Lê Thị Lan Oanh có thành phần môitrường bao gồm: bột đậu tương 2g, bột gạo 2g ; NH4Cl 0,4g, KH2PO4 0,6g ;

K2HPO4 1g ; nước cất 1lít [16]

Để thu enzyme sử dụng chất cảm ứng là vỏ cà phê và CMC theo bảng 1.1; 1.2(phụ lục 1.2)

b) Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus plantarum

- Để hoạt hóa vi khuẩn L plantarum sử dụng môi trường MRS có thành phần

theo bảng 1.3 (phụ lục 1.2)

- Để khảo sát khả năng sinh acid của vi khuẩn L plantarum sử dụng môi

trường theo nghiên cứu chế phẩm vi sinh, probiotic sử dụng trong thức ăn gia súccủa Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông Thôn có thành phần: nước cà chua 10%,nước dừa 10%, cao nấm men 10g/l và bổ sung thêm vỏ cà phê với lượng thay đổitheo các nghiên cứu theo bảng 1.4 (phụ lục 1.2) [17],[19]

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Để tiến hành quá trình nghiên cứu chúng tôi sử dụng các phương pháp sau:

2.2.1 Hoạt hóa và nhân giống vi sinh vật

Giống các chủng vi khuẩn chứa trong eppendorf bảo quản trong tủ lạnh -20oCđược hoạt hóa trên đĩa thạch có chứa môi trường hoạt hóa, bằng cách cấy trang vàzichzăc.[11]

- Quy trình hoạt hóa giống tiến hành như sau:

2.2.2 Đánh giá hoạt tính enzyme bằng phương pháp đo đường kính vòng thủy phân

* Nguyên tắc của phương pháp: Cho enzyme khuếch tán trên đĩa thạch-cơ

chất Hoạt tính enzyme được đánh giá dựa trên mức độ thủy phân cơ chất làm mấtkhả năng bắt màu với thuốc nhuộm lugol, tạo vòng thủy phân Hoạt tính xúc tác củaenzyme được đánh giá thông qua độ lớn của vòng phân giải [10],[11]

- Khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase của các chủng vi sinh vật được

đánh giá thông qua độ lớn của đường kính vòng phân giải cơ chất pectin 0,5%

- Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của các chủng vi sinh vật đượcđánh giá thông qua độ lớn của đường kính vòng phân giải cơ chất CMC 1%

Giống gốcPha loãng trong nước muối vô trùng

Pha loãng thập phân (10-3, 10-4, 10-5)

Cấy trangNuôi ở 30oC

Khử trùngMôi trường

Đổ đĩa thạch, để nguội

Quá trình thực hiện theo sơ đồ sau:

2.2.3 Đánh giá hoạt độ enzyme cellulase của vi khuẩn Bacillus subtilis theo phương pháp Bernfeld.

Nguyên tắc: Phương pháp Bernfeld dựa trên cơ sở của phản ứng tạo màu giữa

nhóm C=O (của glucose) với thuốc thử 3,5- dinitrosalicylic acid (DNS)

Phương pháp này dựa trên sự thủy phân cơ chất CMC (Sodium carboxymethylcellulose) bằng enzyme cellulase Sau phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượngđường khử, lượng đường khử này sẽ tác dụng với thuốc thử DNS(3,5-dinitrosalicylic acid) tạo thành hợp chất có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng

540 nm Tiến hành đo độ hấp thụ quang (OD) của dung dịch ở 540 nm Dựa vào

đường chuẩn xây dựng thực tế để xác định nồng độ đường khử tạo thành, từ đó tínhhoạt độ của enzyme Cách tiến hành phụ 1.3 [10],[11]

- Khái niệm đơn vị hoạt độ enzyme cellulase (đvHc): một đơn vị hoạt độ được

tính bằng lượng enzyme có khả năng phân giải cơ chất để tạo ra 1µg đường khửtrong thời gian 1 phút ở 30 oC

2.2.4 Phương pháp đánh giá khả năng tổng hợp acid của L plantarum

Dịch nuôi cấy

Rửa dd lugol bằng nước cất

Đổ dd lugol vào, để khoảng 1h

Đổ đĩa Petri (2 đĩa), đục lỗ thạch

Hòa tan, đun sôiPectin 0,5% + Agar 2%

Ủ qua đêm trong tủ ấm (20h)Dịch ly tâm

Ly tâm 6000 v/p, trong 10 phút

Quan sát vòng thủy phân

Nguyên tắc: Khi vi khuẩn L plantarum phát triển trên môi trường, chúng tổng

hợp acid làm giảm pH của môi trường Sự thay đổi pH của môi trường được đobằng máy đo pH (OAKION 510)

2.2.5 Phương pháp đánh giá khả năng phát triển của vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang

Theo định luật Lambert-Beer, độ lớn của tín hiệu hấp phụ tỉ lệ thuận với nồng

độ chất phân tích, các chất khác nhau sẽ hấp thụ tốt ở các bước sóng khác nhau.Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường, khi vi sinh vật phát triển trênmôi trường nuôi cấy sẽ làm thay đổi về độ hấp thụ quang của môi trường, có thểdựa vào đó để khả sát khả năng sinh trưởng của vi khuẩn

Công thức định luật Lambert-Beer:

It = I0.10-aClTrong đó:

a: hằng số hấp thụ

C: nồng độ chất hấp thụ

l: Bề dày cuvet

Độ truyền qua: T= It/I0 = 10-aCl

Độ hấp thụ quang: A =log1/T =log 1/10aCl

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, mức độ sinh trưởng vàphát triển của vi khuẩn được xác định gián tiếp thông qua độ đục của môi trườngnuôi cấy Độ đục tỷ lệ với mật độ tế bào, số lượng tế bào càng nhiều (C càng cao)thì độ đục (A) càng cao

Khi một pha lỏng có chứa cấu tử không tan tạo nên hệ huyền phù có độ đục,chúng có tác dụng cản trở ánh sáng, làm phát tán chùm ánh sáng tới Vì vậy có thểdựa vào độ đục để khảo sát khả năng sinh trưởng của vi khuẩn

Khảo sát khả năng sinh trưởng của vi sinh vật: Tế bào vi sinh vật hấp thụ tốt ởbước sóng 620nm, giá trị mật độ quang đo được ở bước sóng này đánh giá tổnglượng tế bào vi sinh vật có trong mẫu phân tích Phương pháp này dùng để xác địnhkhả năng sinh trưởng của vi sinh vật theo từng khoảng thời gian nuôi khác nhau.[5],[9],[11]

2.2.6 Phương pháp đánh giá hạt cà phê sạch nhớt

Đánh giá hạt cà phê sạch nhớt dựa theo phương pháp mô tả của Phan Thị Loan[4],cách thực hiện như sau:

- Lấy một nắm cà phê sau khi lên men, rửa kỹ, cho vào lòng bàn tay bóp mạnh,

nghe tiếng lạo xạo của sỏi là sạch nhớt Còn hạt cà phê trơn trượt ra khỏi tay thìchưa sạch Sau đó, lấy một lượng cà phê sau khi lên men với thời gian tương ứng,dùng tay miết trên khối hạt và thả vào nước, khuấy đều Nếu các phần thịt quảkhông còn bám dính trên lớp vỏ thóc và dễ dàng phân tán trong nước, bề mặt hạt càphê thóc ướt nhẵn bóng thì cà phê thóc được coi là sạch Đếm số hạt sạch nhớttrong 100 hạt được lấy ra ngẫu nhiên, khả năng phân giải lớp nhớt trên hạt cà phêđược tính theo công thức:

Q = ×100%

B S

Trong đó: Q: khả năng phân giải lớp nhớt trên hạt cà phê của vi khuẩn

S: số hạt sạch nhớt B: số hạt lấy ra (B=100 hạt)

2.2.7 Sản xuất chế phẩm enzyme

Canh trường vi khuẩn thu nhận sau khi nuôi ở thời gian tối ưu được coi làchế phẩm enzyme dạng ướt Đem chế phẩm enzyme ướt sấy ở nhiệt độ 40-450Ctrong thời gian 48 giờ,sản phẩm thu nhận được coi là chế phẩm enzyme khô

2.2.8 Tối ưu hóa các điều kiện khi sử dụng chế phẩm vào lên men cà phê

Sử dụng mô hình thống kê để chọn ra các điều kiện tối ưu của việc sự dụng chếphẩm vào quá trình lên men cà phê Xây dựng bài toán tối ưu các điều kiện ảnhhưởng tới quá trình lên men cà phê sao cho số lượng hạt cà phê sạch nhớt trong mẫu

là nhiều nhất (hàm mục tiêu tiến tới max)

Xây dựng mô hình tối ưu với các yếu tố ảnh hưởng hàm mục tiêu: thời gian xử

lý 8÷20 giờ, tỷ lệ giống sử dụng 4÷10% và là số hạt sạch nhớt/số hạt trong mẫu (%)tiến tới max Tiến hành xây dựng mô hình thực nghiệm và tiến hành làm thí nghiệmtheo bảng ma trận, sử dụng các công cụ toán học để giải bài toán tối ưu từ đó chọn

ra điều kiện tối ưu nhất [3]

Phương pháp quy hoạch quay cấp 2 gồm các bước:[12]

- Xác định các yếu tố ảnh hưởng và mức các yếu tố

- Lập ma trận QHTN phương án quay cấp 2

- Tổ chức thí nghiệm theo ma trận

- Xây dựng mô tả toán học theo phương pháp QHTN quay cấp 2 (n=3)

Phương trình hồi quy:

2.2.9 Đánh giá một số chỉ tiêu của hạt cà phê sau khi lên men

2.2.9.1 Xác định lượng chất hòa tan khi trích ly của hạt cà phê sau khi lên men Nguyên tắc: Xác định khối lượng các chất hòa tan trong có hạt cà phê thông

qua phương pháp trích ly với dung môi là nước cất

Cách tiến hành theo phục lục 1.8 Trong nghiên cứu này, khối lượng chất tanđược hiểu là khối lượng các chất hòa tan có trong 10g cà phê bột sau khi trích ly, côcạn và sấy khô.[12]

2.2.9.2 Xác định hàm lượng tro và tổng hàm lượng hữu cơ

* Tro hóa và xác định tổng lượng tro theo TCVN 5253:90

Cân 5g cà phê mẫu cho vào chén sứ và được nung trong lò nung ở nhiệt độ

5500- 6000C trong 2h, đến khi cà phê chuyển thành mẫu tro trắng Làm nguội và cân

a: trọng lượng tro (g)

b: trọng lượng mẫu khô (g), b= 5g

100: hệ số chuyển thành %

* Xác định tổng hàm lượng hữu cơ

Cấu trúc hữu cơ của sinh vật dễ bị phá hủy bởi các tác nhân kiềm, acid, hay nhiệt độ cao Các chất hữu cơ bị đốt cháy hoàn toàn tạo thành CO2 và H2O bay ra khỏi chén sứ, chỉ còn một ít chất khoáng trong chén sứ

Hàm lượng hữu cơ được tính theo công thức:

Tổng hữu cơ (%) = 100 – Tổng lượng tro (%)

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 Hoạt hóa và nhân giống vi sinh vật

Giống ban đầu được giữ trong glycerol ở nhiệt độ -20oC, sau đó lấy ra để trong

tủ lạnh 4oC để rã đông từ từ, rồi đem đi hoạt hóa Giống gốc ban đầu được phaloãng thập phân bằng nước muối sinh lý đến 10-5, cấy trải trên đĩa pectri có chứamôi trường hoạt hóa, pH = 6,5, tiến hành nuôi ở nhiệt độ 30oC Sau thời gian 24 giờ

vi khuẩn B subtilis thấy xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng còn L plantarum khuẩn lạc

xuất hiện sau 48 giờ Hình ảnh khuẩn lạc của các chủng nghiên cứu được trình bàytại hình 3.1 và 3.2

Khuẩn lạc B subtilis có mép viền răng cưa đặc trưng, màu trắng, có nhân nhăn

ở giữa Khuẩn lạc L plantarum nhỏ, màu trắng, mép trơn, bề mặt nhẵn Đối chiếu

về hình thái khuẩn lạc với chủng gốc thì không có gì thay đổi, qua đó cho thấy 2chủng đã được bảo quản tốt trong glyxerol ở -20oC

Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100x, với độ phóng đại này không thấy

rõ hình thái của các vi khuẩn mà chỉ thấy hình dạng của chúng: vi khuẩn B Subitlis

có hình que nhỏ nằm rải rác, vi khuẩn L plantarum có dạng hình que hơi tròn và

chúng nằm cạnh nhau xếp thành chùm

3.2 Khảo sát khả năng sinh enzyme của vi khuẩn B subtilis trên môi trường có

chứa vỏ cà phê

Hình 3.1: B subtilis trên đĩa Petri và quan sát dưới kính hiển vi

Hình 3.2 Hoạt hóa L plantarum trên đĩa petri và quan sát dưới kính hiển vi

Khi nuôi các vi khuẩn trên môi trường chúng sẽ sinh trưởng phát triển, tổnghợp ra các enzyme, quá trình này phụ thuộc vào thời gian và thành phần môi trường

nuôi cấy Khảo sát khả năng sinh enzyme của vi khuẩn B subtilis trên môi trường

có chứa vỏ cà phê để đánh giá xem các vi khuẩn đó có phát triển tốt trên môi trườngnuôi cấy này không và từ đó chọn ra điều kiện môi trường nuôi cấy tối ưu cho từngchủng để sản xuất ra chế phẩm enzyme sau này

3.2.1 Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase

* Khảo sát hoạt tính enzyme bằng phương pháp đo đường kính vòng thủy phân

Để thu enzyme cellulase của vi khuẩn B subtilis chúng tôi sử dụng môi trường

có thành phần như mục 2.1.2 với chất cảm ứng là CMC Với mục đích sử dụng vi

khuẩn B subtilis vào xử lý lớp nhớt hạt cà phê, nên chúng tôi bổ sung thêm vỏ cà

phê vào môi trường với lượng thay đổi khác nhau: 2g/l (MTC1) ; 4g/l (MTC2) ; 6

g/l (MTC3), sau đó khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của B subtilis trên các môi trường đó Vi khuẩn B subtilis được nuôi trên máy lắc ở 30oC, 200 vòng/phút,trong 72 giờ, sau đó tiến hành ly tâm 6000v/phút dịch nuôi cấy để loại bỏ tế bào vikhuẩn và thu dịch enzyme thô

Thử hoạt tính enzyme cellulase của B subtilis trên môi trường CMC 1% +

agar 2%, trên các đĩa petri (30ml môi trường) Nhỏ dịch enzyme (20µl) vào các lỗthạch đã đục sẵn trên đĩa thạch, để trong tủ ấm ở 30oC sau 20 giờ khuếch tán, lấy ra

và nhỏ dung dịch nhuộm màu Lugol để quan sát vòng thủy phân, đo đường kínhvòng thủy phân để đánh giá hoạt tính enzyme

- Đường kính vòng thủy phân được trình bày tại bảng 3.1 và hình 3.4

Bảng 3.1 Kết quả đo đường kính vòng thủy phân enzyme cellulose của vi

khuẩn B subtilis

Ghi chú: kết quả biểu diễn trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần đo

Môi trường Đường kính vòng thủy phân

enzyme cellulase (cm)