ứng dụng phương pháp phân tích dna góp phần vào việc phân loại một số loài gỗ quý thuộc chi dalbergia của việt nam

Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo phương pháp Neighbor – Joining của 5 loài nghiên cứu với 35 loài thực vật khác dựa trên phân tích trình tự gen trnL 52 Hình 3.13.. Phương ph

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

DƯƠNG VĂN TĂNG

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA GÓP PHẦN VÀO VIỆC PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI GỖ QUÝ

THUỘC CHI DALBERGIA CỦA VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội – 2010

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Người hướng dẫn: PGS TS Đinh Thị Phòng

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Đinh Thị Phòng, Phòng Phân loại thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

đã tận tình, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Ban Giám đốc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong cả quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ của cơ sở đào tạo sau Đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học

Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn những chia sẻ, hỗ trợ nhiệt tình và các ý kiến đóng góp của TS Nguyễn Minh Tâm, Ths Trần Thị Việt Thanh và CN Vũ Thị Thu Hiền cùng toàn thể cán bộ phòng Phân loại thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

Để hoàn thành bản luận văn này, tôi chân thành cảm ơn Ths Nguyễn Quốc Bình, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã cung cấp mẫu cho nghiên cứu và sự hỗ trợ kỹ thuật của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học trong việc xác định trình tự DNA

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 29 tháng 12 năm 2010

Học viên

Dương Văn Tăng

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực

và chưa được sử dụng công bố trong bất kỳ tài liệu nào

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm

ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 29 tháng 12 năm 2010

Học viên

Dương Văn Tăng

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU 1

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu tổng quát về một số loài gỗ quý hiếm thuộc chi trắc (Dalbergia) 3

1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.2 Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị bảo tồn một số loài gỗ quý 4

1.1.2.1 Dalbergia assamica Benth 5

1.1.2.2 Dalbergia cochinchinensis Pierre 6

1.1.2.3 Dalbergia oliveri Gamble ex Prain 7

1.1.2.4 Dalbergia tonkinensis Prain 7

1.1.2.5 Dalbergia nigrescens Kurz 8

1.2 Giới thiệu một số phương pháp phân loại thực vật 9

1.2.1 Phương pháp hình thái học (phân loại học truyền thống) 9

1.2.2 Phương pháp giải phẫu so sánh 10

1.2.3 Phương pháp hoá học 10

1.2.4 Phương pháp phân loại học phân tử 11

1.3 Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật 13

1.3.1 Cấu trúc hệ gene lục lạp 13

1.3.2 Vùng ITS nhân 15

1.4 Một số thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử 16

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA và làm sạch DNA tổng số 23

2.2.2 Thiết kế cặp mồi 23

2.2.3 Nhân bản trình tự đích bằng kỹ thuật PCR 23

2.2.4 Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR 24

2.2.5 Giải trình tự DNA 24

2.2.6 Phân tích số liệu 24

Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Kết quả tách chiết DNA 25

3.2.4 Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi trnL - trnL 29

3.3 Kết quả giải mã trình tự 4 gen nghiên cứu 30

3.3.1 Kết quả xác định trình tự gen ITS nhân 30

3.3.2 Kết quả giải trình tự vùng psbA - trnH 33

3.3.3 Kết quả giải mã trình tự gen matK 35

3.3.4 Kết quả giải mã trình tự gen trnL 38

3.4 Kết quả thống kê đặc điểm DNA của bộ số liệu trình tự giữa 5 loài 40

3.4.1 Các vị trí nucleotide mang thông tin tiến hoá (parsimony) 40

3.4.2 So sánh sự biến đổi nucleotide giữa 4 vùng gen nghiên cứu của 5 loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia 43

3.4.3 Khoảng cách di truyền giữa 5 loài nghiên cứu 44

3.4.4 Cây phát sinh chủng loại 48

3.5 Xác định nguồn gốc loài 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

Kết luận 57

Kiến nghị 58

PHỤ LỤC 67

Polymorphism) Barcode Mã vạch

bp Cặp bazơ (base pair)

BTTNVN Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

CITES Công ƣớc về buôn bán quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp

(Convention on International Trade in Endangered Species) cpDNA Axít Deoxyribonucleotide lục lạp (Choloroplast Deoxyribo Nucleotide Acid) cpSSR Các trình tự lặp lại đơn giản của lục lạp (Chloroplast Simple Sequence

Repeat) DNA Axít Deoxyribonucleotide

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EN Nguy cấp (Endangered)

Genbank Ngân hàng gen quốc tế

ISSR Các trình tự lặp lại bên trong (Inter-Simple Sequence Repeat)

ITS Internal Transcribed Spacer

IUCN Hiệp hội bảo vệ thiên nhiên quốc tế (International Union for

Conservation of Nature) MEGA Phần mềm phân tích di truyền tiến hoá phân tử (Molecular Evolutionary

Genetics Analysis) NCBI Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia (Nationa Center for

Biotechnology Information)

OD Mật độ quan học (Optical Density)

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

psbA Gen mã hóa protein D1, enzyme tham gia quang hóa II

RAPD Đa hình các đoạn nhân bản ngẫu nhiên (Randomly Amplified

Polymorphic DNA) RNA Axít Ribonucleotide

RFLP Đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length

Polymorphism) SSR Các đoạn lặp lại (Simple Sequence Repeat)

tRNA RNA vận chuyển (transfer- RNA)

trnF RNA vận chuyển Phenylalanine

trnH RNA vận chuyển Histidine

trnL RNA vận chuyển Leucine

trnT RNA vận chuyển Threonine

UV Ánh sáng tử ngoại (Ultraviolet)

VQG Vườn quốc gia

Bảng 2.1 Danh sách và một số thông tin về mẫu vật nghiên cứu 20

Bảng 2.3 Mã số của 50 trình tự nulcleotide gen trnL thuộc 36 loài trong Genbank sử

dụng lập cây phân loại

Hình 1.1 Hệ gen lục lạp của hoa Nhài Jasminum nudiflorum (Lee et al, 2007) 13

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ một số mẫu lá nghiên cứu trên gel agarose 0,9%

25

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản được của một số mẫu đại

diện với cặp mồi ITS1 - ITS4 trên gel agarose 0,9% 27

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản được của một số mẫu đại diện với

cặp mồi psbA - trnH trên gel agarose 0,9% 28

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản được của một số mẫu đại diện

với cặp mồi matK - matK trên gel agarose 0,9%

29

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản được của một số mẫu đại diện với

cặp mồi trnL - trnL trên gel agarose 0,9%

29

Hình 3.6 Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng ITS giải mã từ 25 mẫu nghiên

Hình 3.7 Kết quả so sánh trình nucleotide vùng đệm psbA - trnH giải mã từ 25

Hình 3.8 Kết quả so sánh trình nucleotide gen matK giải mã từ 25 mẫu nghiên

Hình 3.9 Kết quả so sánh trình nucleotide gen trnL giải mã từ 25 mẫu nghiên

Hình 3.11 Cây phát sinh chủng loại của 5 loài Dalbergia nghiên cứu với 4 gen

ITS, trnL, matK và psbA – trnH

50

Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo phương pháp Neighbor

– Joining của 5 loài nghiên cứu với 35 loài thực vật khác dựa trên phân tích trình

tự gen trnL

52

Hình 3.13 Cây hình toả tròn của 5 loài nghiên cứu với 35 loài thực vật khác dựa

trên phân tích trình tự gen trnL 54

MỞ ĐẦU

Chi trắc (Dalbergia) gồm nhiều loài cây thân gỗ có kích thước từ nhỏ đến trung bình, thuộc họ đậu (Febaceae) Đây là chi điển hình của rừng nhiệt đới với khoảng 300 loài Ở Việt Nam có khoảng 27 loài, phân bố rộng khắp ở các vùng rừng kín từ Bắc vào Nam [13] Hiện nay, nhiều loài cây gỗ quý thuộc chi Dalbergia đang

bị khai thác cạn kiệt do có giá trị kinh tế và thương mại cao như Cẩm lai (Dalbergia oliveri Gamble ex Prain), Trắc đỏ (Dalbergia cochinchinensis Pierre), Trắc đen (Dalbergia nignescens Kurz), cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain), Cọ khẹt (Dalbergia assamica Benth) và Trắc dao (Dalbergia cultrata Grah ex Benth) Trong

đó, ba loài Cẩm lai, Trắc đỏ và Sưa đã được ghi vào “Danh Lục Đỏ Việt Nam, 2007” [1] và cũng đã được Chính phủ Việt Nam quy định trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP

về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý, hiếm (Nghị định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30/6/2006)

Mặc dù việc phân loại những loài thuộc chi Trắc ở Việt Nam đã được thực hiện

từ những năm 1875 (Niyomdham et al, 1987), [50] nhưng đến nay vẫn chưa có công trình nghiên cứu phân loại nào được thực hiện có hệ thống chi tiết cho tới loài Hiện nay, phương pháp phân loại vẫn chủ yếu dựa trên đặc điểm hình thái trước hết là cơ quan sinh sản nên thường gặp khó khăn trong nhiều trường hợp do quá trình biến đổi trung gian về một số đặc điểm Hơn nữa, trong thực tế, sự biến đổi hình thái theo môi trường sống của một loài đã tạo ra không ít khó khăn cho việc nhận dạng bằng phương pháp hình thái, thậm chí trong một số trường hợp còn có sự nhầm lẫn và sai lệch về vị trí phân loại Công nghệ sinh học hiện đại hoàn toàn có thể khắc phục được nhược điểm này mà không lệ thuộc vào bất cứ yếu tố khách quan nào của mẫu

Phương pháp phân loại học phân tử (Molecular taxonomy) sử dụng các dữ liệu

về cấu trúc phân tử DNA, ARN, protein để xây dựng mối quan hệ tiến hoá giữa các loài sinh vật, giải thích tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử giữa các loài và trong

phạm vi loài Mặc dù mới ra đời nhưng phương pháp phân loại học phân tử đã nhanh chóng trở thành một phương pháp nghiên cứu có hiệu quả trong việc nhận dạng taxon mức độ loài Tuy chưa thể trở thành phương pháp phân loại chính thống, xong phân loại học phân tử đang là công cụ đắc lực hỗ trợ cho nghiên cứu phân loại hình thái và

là phương pháp phù hợp cho nghiên cứu phân loại học hiện nay (Weiguo et al., 2005; Eric et al., 1992; Jose et al., 2007) [71, 36] Đối với thực vật hai nhóm gen chính

thường được sử dụng là gen nhân (ITS) và hệ gen lục lạp (cpDNA) So với chỉ thị hình thái thì chỉ thị DNA cho độ chính xác cao mà không lệ thuộc vào các yếu tố môi trường Vì tính ưu việt này, đến nay trong ngân hàng Genbank đã lưu trữ hàng trăm trình tự DNA khác nhau đặc trưng cho chi Dalbergia, đây là nguồn dữ liệu có giá trị để

chúng ta có thể khai thác ứng dụng để nghiên cứu phân loại (Benedic et al., 2007; Juschum et al., 2007) [25, 37]

Nhằm ứng dụng phương pháp phân loại phân tử vào phân loại và nhận dạng

những loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu: “Ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp phần vào việc phân loại một số loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia của Việt Nam” với các mục tiêu và nội dung nghiên cứu sau:

- Sử dụng hai vùng gen nhân và vùng gen lục lạp góp phần vào việc phân loại 5

loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia đang bị đe doạ tuyệt chủng của Việt Nam

- Góp phần đánh giá nhanh và hữu hiệu tính đa dạng sinh học làm cơ sở cho việc bảo tồn và phục hồi một số loài gỗ quý hiếm ở Việt Nam đồng thời giúp các nhà quản lý và cộng đồng các nhà khoa học hiểu biết sâu hơn về quan hệ họ hàng ở mức độ taxon và mức độ tiến hoá phân tử

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu tổng quát về một số loài gỗ quý hiếm thuộc chi trắc (Dalbergia) 1.1.1 Vị trí phân loại

Dalbergia là một chi lớn thuộc họ đậu (Fabaceae) nằm trong bộ Đậu (Fabales) phân lớp Hoa hồng (Rosidae) thuộc lớp hai lá mầm (Dicotydoneae) ngành thực vật

hạt kín (Magnoliophyta) Tên họ trước đây là Leguminosae Đứng sau họ

Orchidaceae và Asteraceae, với khoảng 730 chi và hơn 19400 loài Chi lớn nhất là

Astragalus với hơn 2000 loài, tiếp sau là Acacia với hơn 900 loài và Indigofera với khoảng 700 loài Các chi lớn khác bao gồm Crotalaria với 600 loài và Mimosa với

500 loài [53,54] Các loài thuộc họ đậu phân bố khắp thế giới, một số loài là cây nông

nghiệp quan trọng, bao gồm đậu tương (Glycine max), đậu Hà Lan (Pisum sativum), đậu nhỏ (Cicer arietinum), lạc (Arachis hypogaea), cây carob (Ceratonia siliqua) và cam thảo (Glycyrrhiza glabra)

Họ đậu được xếp vào bộ đậu Fabales theo hệ thống phân loại APG III (2009)

Họ đậu gồm 3 phân họ (theo hệ thống Cronquist và Dahlgren) :

+ Mimosoideae: gồm 80 chi và 3200 loài Hầu hết phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á và châu Mỹ, nơi có nhiệt độ ấm áp

+ Caesalpinioideae: gồm 170 chi và 2000 loài

+ Faboideae: gồm 470 chi và 14000 loài

Tuy nhiên, sự phân chia của Cronquist và Dahlgren không được các nhà nghiên cứu DNA cuối thể kỷ XX và đầu thế kỷ XXI ủng hộ Kết quả nghiên cứu sinh học phân

tử cho thấy phân họ Caesalpinoideae là một paraphyly, nghĩa là các loài trong phân họ này không có cùng nguồn gốc tiến hoá Ngược lại 2 phân họ Faboideae và Mimosoideae là những monophyly lớn, nghĩa là các loài trong phân họ có cùng nguồn gốc tiến hoá Tông Cercideae của phân họ Caesalpinioideae có thể là một nhóm chị em với nhóm các loài còn lại của phân họ này Hơn nữa, một số chi được xếp vào phân họ

Caesalpinioideae không được chấp nhận Các bằng chứng hoá thạch và phát sinh loài cho thấy họ đậu được hình thành ở những vùng khô hạn hoặc nửa khô hạn dọc theo con đường biển Tethys ở kỷ thứ ba (Tertiary) của quá trình hình thành địa chất

Họ đậu gồm các cây từ thân gỗ lớn đến các cây bụi, có cụm hoa không rõ ràng, đôi khi tiêu biến thành hoa đơn tính Hoa có đài hoa (hypanthium) ngắn và noãn đơn với cuống noãn ngắn sau khi thụ phấn sẽ tạo thành quả được gọi là quả đậu Lá thường kép mọc so le, có thể chẵn hoặc lẻ, có hình xẻ lông chim, luôn luôn có lá kèm Lá kèm

có dạng hình lá, hình gai hoặc khó nhìn thấy Mép lá có thể liền hoặc xẻ răng cưa Tuyến mật ngoài hoa thường thấy ở những loài thuộc phân họ Mimosoideae và Caesalpinioideae, nó cũng có ở một số loài thuộc phân họ đậu Faboideae [53, 55]

1.1.2 Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị bảo tồn một số loài gỗ quý

Dalbergia là một chi lớn bao gồm những cây có kích thước trung bình và nhỏ, thân bụi hoặc dây leo, thuộc họ đậu Fabaceae, phân họ Faboideae Chi này có phân bố rộng ở các vùng nhiệt đới Trung, Nam Mỹ, Châu Phi, Madagascar và Châu Á Số lượng loài trong chi đến nay vẫn là dấu hỏi và chưa có câu trả lời chính xác Theo thống kê của các nhà khoa học trên thế giới, hiện nay ước tính có từ 100 – 600 loài

(International Legume Database & Information Service) Nhiều loài trong chi Dalbergia

là những cây gỗ quý, có hoa vân đẹp, có giá trị kinh tế và giá trị bảo tồn cao Một số loài có giá trị trong chi Dalbergia như hai loài hồng sắc (rosewood), một loài có ở tây

bán cầu (Hồng Sắc Brazilian - D nigra) được đưa vào phụ lục I của CITES (Công ước

về buôn bán quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp) Loài thứ hai là hồng

sắc Ấn Độ - D latifolia, loài này có giá trị kinh tế cao vì gỗ cứng và có vân rất đẹp Ngoài ra trong chi Dalbergia còn có nhiều loài có giá trị bảo tồn như: Dalbergia baronii, Dalbergia brownei, Dalbergia cearensis, Dalbergia cochinchinensis, Dalbergia decipularis, Dalbergia ecastaphyllum, Dalbergia frutescens, Dalbergia louvelii, Dalbergia madagascariensis, Dalbergia melanoxylon, Dalbergia nigra,

Dalbergia oliveri, Dalbergia sissoo, Dalbergia stevensonii, Dalbergia tonkinensis, Dalbergia tucarensis, Dalbergia variabilis

Ở Việt Nam, chi Dalbergia có khoảng 27 loài, trong đó nhiều loài còn chưa rõ

ràng (chưa định tên chính xác hoặc còn nghi ngờ) Ba loài Cẩm Lai (Dalbergia oliverri), Trắc đỏ (Dalbergia cochinchinensis) và Sưa (Dalbergia tonkinensis) là loài

đặc hữu và có giá trị bảo tồn cao Tuy nhiên, những năm gần đây, số lượng cá thể của những loài này đã giảm sút nghiêm trọng do nhiều nguyên nhân khác nhau, nhưng chủ yếu là do lợi nhuận kinh tế nên 3 loài trên bị khai thác quá mức Năm 2007, ba loài Cẩm lai, Trắc đỏ, Sưa được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam - cấp EN A1a, c,d (có nguy cơ

tuyệt chủng) (Đặng Ngọc Thanh et al., 2007) [1] và được Chính phủ Việt Nam quy định trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy

cấp, quý, hiếm Ngoài ra hai loài Trắc đen (Dalbergia nigresens) và Cọ khẹt (Dalbergia assamica) là những loài gỗ quý có giá trị kinh tế và đang có nguy cơ bị thu

hẹp do vậy hai loài này cũng cần được quan tâm bảo vệ và khai thác một cách hợp lý

1.1.2.1 Dalbergia assamica Benth

Dalbergia assamica Benth được Bennth đặt tên vào năm 1852, có tên gọi khác

là D lanceolaria (Thoth, 1983), D balansae (Prain, 1901) Ở Việt Nam thường gọi là

Cọ khẹt, Cọ khiết, Bạt ong, Trắc balansa, Sưa hạt tròn, Muồng nước, Trắc assam

Cọ khẹt là cây gỗ trung bình, cao từ 12 – 20m Lá có sóng dài 20 – 25cm; lá phụ

13 – 21, tròn dài 4- 5 x 2-3 cm, đầu tròn hay hơi lõm, gân - phụ rất mảnh, mặt dưới có lông nằm cuống - phụ 4 – 5 mm Chùm tụ tán ngắn ở nách lá, cao 10 – 15cm, trục và nhánh có lông mịn; vành trắng; tiểu nhuỵ 5 Nhánh mang trái đen kích thước 5- 7 x 1,2cm, không lông; hột 1 (có thể có 3 – 4 hột), tròn, rộng 12mm

Cọ khẹt là cây ưa sáng, phát triển nhanh, mọc trong rừng hỗn giao thứ sinh thường xanh hoặc rụng lá, ở độ cao 1500m, trên đất sung tích ven sông suối Ra hoa vào thời gian từ tháng 5 đến tháng 7, có quả tháng 9 -12 và tồn tại lâu trên cây

Ở Việt Nam: Cọ khẹt phân bố ở Lai Châu (Pù Nhung), Lào Cai (Bắc Hà, Phố

Lu, Bảo Nhai), Sơn La (Thuận Châu, Sông mã, Mộc Châu), Quảng Ninh (Hà Cối), Vĩnh Phúc, Hà Tây (Ba Vì), Hoà Bình (Chợ Bờ), Hà Nam (Đại Đồng), Ninh Bình (Cúc Phương), Thanh Hoá (Phong Y), Nghệ An (Quỳ Châu), Hà Tĩnh (Hương Sơn), Quảng Trị (đèo Ailao, Đông Chê), Lâm Đồng (Đơn Dương), Đồng Nai

Trên thế giới: Cọ khẹt chỉ còn ở Ấn Độ, My-an-ma, Trung Quốc, Lào, chia và Thái Lan [13, 14, 41, 6]

Căm-pu-1.1.2.2 Dalbergia cochinchinensis Pierre

Do Pierre đặt tên vào năm 1898 Có tên gọi khác là Dalbergia cambodiana

(1898, Pierre), tên thường gọi ở Việt Nam là Trắc đỏ, Trắc bông, Cẩm lai nam, Giầu

ca (Gia Rai), Ka rắc (Ba Na), Ka nhoung

Trắc đỏ là cây gỗ trung bình, cao 15 – 30m đường kính 80cm hoặc hơn Gỗ đỏ sậm, sau đen đi Lá dài 15 – 20 cm; lá - phụ 7 – 9 mọc như đối, dài 3 – 5 cm, xoan, có mũi ngắn, không lông, mốc mốc mặt dưới Chùm-tụ tán dài 7 -15cm; hoa trắng; đài không lông; tiểu nhuỵ 9 Trái rất mỏng, hẹp, có kích thước 5 – 6 x 1cm, hột 1 – 2, màu nâu Cây mọc trong rừng rậm nửa rụng lá hoặc rừng thưa hỗn giao rụng lá, ở độ cao dưới 800m, ưa đất sét pha cát có lớp đất sâu Ra hoa tháng 5 – 8, có quả tháng 9 – 12

Ở Việt Nam Trắc đỏ phân bố ở Quảng Nam, Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc, Lâm Đồng, Bình Dương, Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Thành phố Hồ Chí Minh, Kiên Giang (VQG Phú Quốc)

Trên thế giới Trắc đỏ chỉ có ở Lào, Căm-pu-chia và Thái Lan

Trắc đỏ là loài gỗ quý, thớ mịn, nặng, rất cứng, không bị mối mọt, dùng đóng đồ mộc cao cấp (bàn ghế, salông, sập, giường, tủ), làm nhạc cụ, đồ chạm trổ và hàng mỹ nghệ Trắc đỏ là cây gỗ quý nên bị khai thác cạn kiệt, số cá thể trưởng thành giảm

mạnh, hơn nữa nạn phá rừng đã làm cho loài này bị xâm hại nghiêm trọng Sách Đỏ Việt Nam 2007 đã xếp loài này vào loại nguy cấp EN A1a, c, d [13, 1, 14, 41, 6]

1.1.2.3 Dalbergia oliveri Gamble ex Prain

Do Prain và Gamble đặt tên năm 1897, tên gọi khác là Dalbergia bariensis

(Pierre, 1898), Dalbergia dongnaiensis (Pierre, 1898) Tên thường gọi là Cẩm lai,

Cẩm lai bà rịa, Cẩm lai đồng nai, Cẩm lai vú, Cẩm lai bông, Cẩm lai mật, Trắc lai Cẩm lai được ghi nhận trong Sách Đỏ Việt Nam, 2007 – cấp EN A1a, c, d (đang có nguy cơ rất lớn bị tuyệt chủng ngoài thiên nhiên)

Cẩm lai là loài gỗ lớn, cao từ 25 – 30m, đường kính 60 – 80cm, rụng lá mùa khô, gỗ quý, màu đỏ, thớ mịn, nặng, cứng, không bị mối mọt dùng đóng đồ mộc cao cấp Cây ưa sáng, mọc trong rừng rậm thường xanh hoặc nửa rụng lá, rừng thưa hỗn giao rụng lá và rừng thưa cây họ Dầu, ở độ cao tới 1000m, phát triển mạnh trên đất feralit đỏ nâu và vàng nâu, đất đỏ bazan ẩm, ven suối Ra hoa tháng 12 – 1 (năm sau),

có quả tháng 2 – 4

Ở Việt Nam: Cẩm lai phân bố ở Quảng Trị, Đà Nẵng, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Lâm Đồng, Phú Yên, Khánh Hoà, Ninh Thuận, Bình Thuận, Bình Dương, Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu

Trên thế giới: quần thể Cẩm lai chỉ còn ở My-an-ma, Lào, Căm-pu-chia, Thái Lan [1,

13, 41]

1.1.2.4 Dalbergia tonkinensis Prain

Được đặt tên bởi Prain, 1901 Tên gọi khác là Dalbergia rimosa (Phamh, 1991)

Tên thường gọi là Sưa, Sưa trắng, Trắc bắc bộ, Trắc thối

Cây Sưa cao 15 – 25m, đường kính 40 – 80 cm, gỗ thớ mịn, cứng, thơm, không

bị mối mọt, dùng trong xây dựng, đóng đồ mộc cao cấp, làm hàng mỹ nghệ và đồ tiện

khắc Mọc rải rác trong rừng rậm thường xanh nguyên sinh và thứ sinh, ở độ cao tới 350–500m, trên đất tốt, sâu, dày Ra hoa tháng 3–5, có quả tháng 9–11

Ở Việt Nam: cây Sưa phân bố ở Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Phú Thọ,

Hà Tây, Hoà Bình, Ninh Bình, Nghệ An

Trên thế giới: cây Sưa chỉ có còn ở Trung Quốc

Với quần thể ngày càng thu hep, cây Sưa đang có nguy cơ tuyệt chủng cao ngoài thiên nhiên Cây Sưa được ghi nhận trong Sách Đỏ Việt Nam, 2007 – cấp EN A1a, c, d Hiện nay cây Sưa đang bị “tàn sát” ngoài thiên nhiên do giá trị kinh tế cao và

có những thông tin cho rằng người Trung Quốc dùng gỗ cây Sưa để làm đồ thờ, chế thuốc chữa ung thư dạ dầy và các chủ buôn săn lùng Sưa với giá 200 triệu đồng/1kg Chính những nhu cầu “thất thiệt” đã đẩy cây Sưa phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng rất cao [13, 1, 14, 41]

1.1.2.5 Dalbergia nigrescens Kurz

Do Kurz đặt tên năm 1875 Tên gọi khác là Dalbergia paniculata (Roxb, 1789)

Dalbergia lanceolaria (Thoth, 1987) Tên thường gọi là Trắc đen, Quành quạch

Trắc đen là cây gỗ trung bình, cao 10 – 20m, dùng trong xây dựng, đóng đồ mộc cao cấp, vỏ dùng nhuộm đen Trắc đen thường mọc rải rác trong rừng thưa và rừng hỗn giao rụng lá, ở độ cao dưới 500m Ra hoa tháng 3–5, có quả tháng 8–12

Ở Việt Nam: Trắc đen phân bố ở Đắk Lắc, Đồng Nai, Biên Hòa, Tây Ninh, Sơn La Trên thế giới: Trắc đen chỉ có ở My-an-ma, Lào và Thái Lan

Gỗ của loài Trắc đen được dùng trong xây dựng hay đóng đồ mộc như giường,

tủ, bàn, ghế Với quần thể hẹp và có giá trị sử dụng, loài này đang bị săn lùng quá mức (Nguyễn Tiến Bân, 2003) [13]

1.2 Giới thiệu một số phương pháp phân loại thực vật

Hiện nay, phương pháp phân loại thực vật đều dựa trên nguyên tắc chung đó là những thực vật có chung nguồn gốc thì có những tính chất giống nhau, thực vật càng gần nhau tính chất giống nhau càng nhiều Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá , một số phương pháp thường được sử dụng như:

1.2.1 Phương pháp hình thái học (phân loại học truyền thống)

Dựa vào đặc điểm hình thái, đặc biệt là hình thái cơ quan sinh sản, vì cơ quan này ít biến đổi hơn so với cơ quan sinh dưỡng khi điều kiện môi trường thay đổi Những thực vật càng gần nhau càng có nhiều đặc điểm chung về hình thái Đây là phương pháp cổ điển nhưng hiện nay vẫn được dùng phổ biến [10] hạn chế của phương pháp này đã được ghi nhận trên một số taxa, thực tế nhiều loài khác nhau nhưng có hình thái rất giống nhau và ngược lại Phương pháp phân loại hình thái thực

sự gặp khó khăn khi phân loại ở các đơn vị taxon dưới loài [2]

Phân loại học truyền thống sử dụng chủ yếu các đặc điểm hình thái nhưng các tính trạng hình thái thường biến đổi rất phức tạp, nên đôi khi việc xác định sự tương đồng là rất khó Hiện tượng tiến hoá hội tụ, tiến hoá song song và tiến hoá ngược dẫn đến các đặc điểm tương tự giữa các loài có họ hàng rất xa nhau, nghĩa là các đặc điểm giống nhau do tiến hoá độc lập từ các nguồn gốc khác nhau để thích nghi với điều kiện môi trường giống nhau là khá phổ biến trong sinh giới Việc phân biệt đặc điểm tương đồng với đặc điểm tương tự trong hệ thống học truyền thống là không dễ dàng, nhất là

ở các bậc phân loại thấp Ngoài ra, việc so sánh trực tiếp giữa các bậc phân loại cao là rất khó, vì nhiều đặc điểm không còn khả năng xác định được sự tương đồng Vì vậy

hệ thống học truyền thống phải sử dụng các đặc điểm, các khoá định loại riêng cho những nhóm sinh vật nhất định Ưu điểm lớn nhất của hệ thống học truyền thống là có lịch sử phát triển lâu dài và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật tương đối đầy đủ, tiện lợi trong nghiên cứu ứng dụng Nhưng hệ thống học truyền thống có

nhược điểm là thiếu tính thống nhất, phải sử dụng nhiều tiêu chuần và nhiều khoá phân loại khác nhau, nên bị hạn chế khi nghiên cứu các biến đổi tiến hoá nhỏ, khó xác định chính xác mối quan hệ giữa các nhóm sinh vật ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài [2]

1.2.2 Phương pháp giải phẫu so sánh

Đến thế kỷ IXX, nhờ sự phát triển của kính hiển vi mà giải phẫu học thực vật có điều kiện phát triển Ngoài những đặc điểm hình thái bên ngoài, các nhà phân loại học còn sử dụng cả những đặc điểm hình thái giải phẫu hay vi hình thái (micromorphologie), tức là hình thái cấu trúc bên trong cơ thể, của mô, của tế bào,

kể cả cấu trúc siêu hiển vi, để phân loại Việc sử dụng phương pháp này đã nhận được các kết quả nghiên cứu chính xác và khách quan cho phân loại thực vật Các đặc điểm giải phẫu so sánh cho phép xác lập mối quan hệ gần gũi không những của các nhóm lớn, mà cả của các bậc taxon nhỏ, có thể xây dựng được những tiêu chuẩn phân loại cho các chi, các loài thuộc họ Labiaceae

Phương pháp giải phẫu so sánh không đòi hỏi kỹ thuật quá phức tạp nhưng cho kết quả khá chính xác Đối với các loài cây gỗ thường sử dụng đặc điểm giải phẫu thân

gỗ để định loại, ngược lại các loài thân thảo thường sử dụng đặc điểm cấu trúc của biểu

bì Phương pháp này được sử dụng để định loại gỗ và các thanh gỗ thành phẩm dùng

để xuất khẩu

1.2.3 Phương pháp hoá học

Có nhiều phương pháp phân tích hoá học khác nhau được sử dụng trong nghiên cứu và kiểm định nhất là đối với mẫu cây chứa các nhóm chất có hoạt tính sinh học, các cây chứa tinh dầu (Trầm hương, Xá xị, Pơ mu ) dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cao áp, điện di mao quản, sắc kí khí - khối phổ… đặc điểm chung của phương pháp hóa học là cho kết quả nhanh, chính xác và có thể cho các thông số về cấu trúc hoá học Ưu điểm của phương pháp này là yêu cầu về tính nguyên vẹn của

mẫu vật không cao Trên thế giới, phương pháp này đang được sử dụng nhiều Ở nước

ta, phương pháp này mới chỉ được bắt đầu nghiên cứu ở một vài cơ sở

1.2.4 Phương pháp phân loại học phân tử

Phân loại học phân tử là phương pháp phân loại sử dụng sự khác biệt các cấu trúc phân tử để đạt được các thông tin về mối quan hệ tiến hoá giữa các loài Kết quả của một phân tích hệ thống phân tử được thể hiện bằng cây phát sinh loài Phương pháp phân loại phân tử ra đời vào những năm 1960 với các nghiên cứu của Emile và công sự (1999), Zuckerkandl , Emanuel Margoliash , Linus Pauling và Walter M Fitch [66] Những hệ thống học phân tử được thực hiện đầu tiên là của tác giả Charles G Sibley (nghiên cứu về chim), Herbert (nghiên cứu về lưỡng cư), Morris Goodman (nghiên cứu về linh trưởng) [61, 28, 43, 44, 45], và được phát triển tiếp bởi các nhà nghiên cứu Allan C Wilson, Robert K Selander, John C Avise và đã thu được những thành công lớn, làm sáng tỏ nhiều vấn đề trong phân loại và tiến hoá [15, 18, 20, 27] Phân loại học phân tử được sử dụng ban đầu là phân tử protein, với kỹ thuật điện di protein Mặc dù khi thực hiện cách này đã không đem lại nhiều hiệu quả xong đã thúc đẩy sự phát triển của phân loại học phân tử Giai đoạn từ 1974 – 1986, phân loại học phân tử chuyển sang sử dụng các đặc điểm của vật chất di truyền (DNA) với kỹ thuật ứng dụng lai DNA – DNA, tiếp đến là các kỹ thuật phân tích bằng enzyme giới hạn và cuối cùng là kỹ thuật đọc trình tự DNA [15, 19]

Nguyên lý của phân loại học phân tử: Phân loại học phân tử dựa trên nguyên

lý mỗi sinh vật sống đều mang các phân tử DNA, ARN và protein, các sinh vật có họ hàng gần gũi sẽ có mức độ tương đồng cao trong cấu trúc phân tử những chất này, ngược lại những sinh vật có họ hàng xa nhau sẽ cho thấy những đặc điểm cấu trúc khác nhau Hiện nay, các phân tử có tính bảo thủ như DNA ty thể, DNA lục lạp đang được

sử dụng nhiều nhất cho phân loại và được coi là tích luỹ các đột biến theo thời gian Thêm vào đó nếu coi tốc độ đột biến không đổi, chúng ta sẽ tạo ra được một đồng hồ

phân tử cho biết thời gian diễn ra các đột biến, nói cách khác chúng ta có thể ước lượng được thời gian hình thành loài Mặc dù phân loại học phân tử là phương pháp phân loại

sử dụng đặc điểm cấu trúc của các phân tử để xây dựng hệ thống phát sinh chủng loại, tuy nhiên mãi cho đến những thập kỷ gần đây, con người mới có khả năng tách chiết và xác định được cấu trúc phân tử của những chất này

Sự ra đời của kỹ thuật giải trình tự DNA của Maxam – Gilbert (1977, 1980) và Singer (1977) [19] đã mở ra một ứng dụng to lớn cho phân loại học phân tử Hiện nay phân tích hay được sử dụng trong phân loại học phân tử là so sánh trình tự DNA, sử dụng kỹ thuật sắp xếp phân tử (alignment) để xác định mức độ giống nhau Các biến đổi phân tử đơn giản hơn nhiều so với các biến đổi hình thái, vì vật chất di truyền DNA chỉ cấu thành từ 4 loại nucleotide (adenine, guanine, thymine và cytosine) Mặc khác, các biến đổi phân tử ít bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường Ưu thế lớn nhất của

hệ thống học phân tử là có thể phân biệt rõ ràng các đặc điểm tương đồng với đặc điểm tương tự (Avise, 1993; Page, 2000) [19, 51] Ngoài ra, nhiều phần của vật chất di truyền có nguồn gốc và kiểu biến đổi chung cho mọi sinh vật, nên có thể so sánh trực tiếp bất kể nhóm sinh vật nào với nhau Các biến đổi tiến hoá nhỏ (microevolution), hay đa dạng di truyền giữa các quần thể sinh vật cũng thể hiện qua các biến đổi phân tử

rõ hơn so với các biến đổi hình thái

Tính thống nhất cao là một trong những ưu điểm của hệ thống học phân tử, sử dụng tiêu chuẩn phân tử chung cho cả sinh giới, có lợi thế trong nghiên cứu biến đổi tiến hoá nhỏ, nên số liệu phân tử có giá trị cao trong phân tích quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon ở bậc phân loại thấp, cũng như đa dạng di truyền quân thể Nhược điểm chính của hệ thống học phân tử là không tiện dụng khi nghiên cứu và ứng dụng trong tự nhiên và hiện chưa hình thành một hệ thống phân loại riêng

Sự kết hợp giữa hai hệ thống phân loại phân tử và phân loại truyền thống sẽ đem lại kết quả tốt nhất Thực tế cũng chứng minh rằng hầu hết những gì hệ thống học

truyền thống đã giải quyết tốt, đều không mâu thuẫn với các kết quả nghiên cứu của hệ thống học phân tử (Avise, 1993) [19] Phân tích phân tử thường được sử dụng để giải quyết một số vấn đề mà hệ thống học truyền thống còn gặp khó khăn, trong khi chỉ thị phân tử có lợi thế hơn Hiện tại, hệ thống học phân tử là phương pháp hữu hiệu hỗ trợ cho phương pháp phân loại truyền thống và cho kết quả khá tin cậy

1.3 Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật

1.3.1 Cấu trúc hệ gene lục lạp

Lục lạp là bào quan nằm trong tế bào chất của thực vật và tảo (algae), chúng có chứa DNA riêng DNA lục lạp có từ 102

– 104 bản sao trong mỗi tế bào [51] Lục lạp

có chứa chất diệp lục (chlorophyll) và là nơi thực hiện quá trình quang hợp của cây Genome lục lạp thường được sử dụng cho phân loại ở thực vật do đặc tính di truyền

theo dòng me, không bị tái tổ hợp di truyền cho thế hệ sau và tốc độ đột biến cũng khá cao Hệ gen lục lạp được các nhà phân loại học phân tử đánh giá chúng là sự tích luỹ các đột biến theo thời gian, do vậy sẽ phản ánh đúng mức độ tiến hoá giữa các loài

Genome lục lạp (cpDNA) thực chất là một phân tử DNA vòng, sợi đơn, mỗi gen thường không lặp lại Không giống như các gen nhân, các gen lục lạp chỉ mã hoá cho

Hình 1.1 Hệ gen lục lạp của hoa Nhài Jasminum nudiflorum (Lee et al, 2007) [42]

các protein cần thiết cho chức năng quang hợp và bộ máy biểu hiện những protein này Vùng DNA không mã hoá trên hệ gen lục lạp là rất ít

Genome lục lạp (cpDNA) có kích thước từ 120kb – 220 kb (hình 1.1), kích thước này thay đổi do có sự tồn tại của 2 vùng lặp lại ngược chiều nhau (Inverted repeat), tách genome lục lạp thành hai vùng (vùng lớn LSC và vùng nhỏ SSC) Mặc dù phần lớn DNA lục lạp đều mang số lượng gen như nhau, tuy nhiên đôi khi một số gen

di trú vào DNA nhân và biến mất khỏi hệ gen lục lạp Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấp hơn từ 4 – 5 lần so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng ba lần so với DNA ty thể thực vật và thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu phân loại [19, 51]

Hiện nay, các gen lục lạp thường được sử dụng trong nghiên cứu hệ thống học

phân tử thực vật bao gồm: gen matK, gen trnL, vùng đệm trnH – psbA, tất cả các gen

thuộc hệ gen lục lạp thường có mức độ biến đổi không lớn hơn 2% giữa các loài lân cận

Vùng đệm psbA - trnH: thường được sử dụng cho nghiên cứu phân loại (Shaw

et al, 2005) [59, 60] Vùng này có kích thức xấp xỉ 450bp, xác suất nhân bản thành công rất cao (100% với các loài đã được nghiên cứu) Mức độ khác biệt trình tự nucleotide giữa các loài là 1,24% và sự khác biệt bên trong loài rất thấp từ 0.00 –

0.08% (Kress et al, 2005) [40] Trình tự psbA - trnH cũng đã được công bố trên ngân

hàng gen với nhiều loài khác nhau thuộc thực vật hạt trần, dương xỉ, rêu và rêu tản (liverwort)

Gen matK: cùng với vùng đệm psbA - trnH đã được đề xuất làm DNA

barcoding cho nhóm thực vật có hoa Kết quả sử dụng gen matK cho phân loại đã thu

được sự tương đồng rất cao với phân loại hình thái và cho giá trị bootstrap từ 92 – 100% (Mort et al., 2001) [47, 48]

Gen trnL: Là gen mã hoá cho tRNA vận chuyển Leucine trong lục lạp, có kích

thước từ 452bp đến 528bp với các loài thuộc họ đâu Gen này được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phân loại phân tử (Mort, 2005; Kim, 2007; Son, 2010) [46, 39, 65]

Các kết quả thu được trong các nghiên cứu nguồn gốc phát sinh loài sử dụng gen trnL

cho thấy đây là một vùng DNA hữu ích cho phân loại

Ngoài các locus được nêu trên, các vùng DNA: gen rbcL, vùng đệm trnL – trnF, trnT – trnL thuộc hệ gen lục lạp cũng thường được sử dụng cho phân tích Việc sử

dụng mỗi đoạn gen cho những ưu nhược điểm khác nhau, kết quả phân loại sẽ chính xác hơn khi phân tích tổ hợp nhiều gen

1.3.2 Vùng ITS nhân

Vùng gen ITS: vùng ITS (internal transcribed spacer) của gen mã hoá cho

ribosome nhân gồm các đơn vị gen 18S, 5,8S và 26S (hình 1.2) Giữa các đơn vị gen

có các đoạn ITS-1 và ITS-2, các thành phần này tạo thành một nhóm gen cơ bản Các nhóm gen như vậy lặp lại liên tục trong hàng nghìn bản sao trong hệ gen nhân và chúng được ngăn cách bởi vùng NTS (nontranscribed spacer) (hình 1.2)

Hình 1.2 Sơ đồ vùng gen ITS (Hillis, 2006)

Trong các nghiên cứu phân loại thực vật ở mức độ loài, vùng ITS là locus được giải mã phổ biến nhất (Alvarez et al, 2003) [22] Vùng ITS cho thấy có sự hiệu quả cao trong nghiên cứu phân loại nhiều đối tượng thực vật và nấm (ngoại trừ dương xỉ), và

mồi

mồi

đây là một locus được kiến nghị làm vùng DNA barcode cho thực vật (kỹ thuật nhận biết các loài sử dụng trình tự DNA ngắn) Ở mức độ loài, vùng ITS có mức độ đa dạng cao (khoảng 13,6% giữa các loài gần gũi) và đã được chứng minh trong hầu hết các nghiên cứu Thuận lợi của vùng ITS là có thể nhân bản theo hai đoạn nhỏ hơn (ITS1 và ITS2) nằm hai bên với locus 5,8S, điều này rất có ý nghĩa khi nhân bản các mẫu bị hư hại Vùng ITS cũng đã được chứng minh có mức độ biến đổi thấp bên trong loài (Baldwin et al, 1993, 1995) [21, 22]

Ngày nay với sự hiện diện của trên 60.000 trình tự ITS (tính đến 8/2010) được công bố trên ngân hàng Genbank, đây là nguồn tư liệu có giá trị, mở ra những triển vọng lớn cho nghiên cứu phân loại và giám định, số lượng các trình tự vẫn tiếp tục được bổ sung hàng ngày

1.4 Một số thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử

Ngoài nước: trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang được

áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hoá, phân loại và đa dạng di truyền quần thể sinh vật Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân tích DNA Các chỉ thị AFLP (đa hình các đoạn nhân chọn lọc), RFLP (đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn), RAPD (đa hình các đoạn được nhân bản ngẫu nhiên), SSR (DNA vệ tinh hay trình tự lặp lại đơn giản), cpSSR (trình tự lặp lại đơn giản genome lục lạp), gen

mã hoá 18S rRNA,… hay được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền, nhận dạng các đoạn DNA hoặc các trình tự đặc trưng cho loài [8] Với số lượng bản sao lớn trong hệ gen là điều kiện thuận lợi cho kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase) với các cặp

mồi (primers) thích hợp

Vì thế chỉ trong vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (Genbank, 2007) đã lưu giữ trên

70 triệu trình tự DNA với gần 90 tỷ nucleotit Đây là nguồn dữ liệu có giá trị trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý do chính là (1) số liệu về trình tự các nucleotit rất có giá trị trong việc xác định các đơn vị bảo tồn giúp cho đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dưới loài; (2) số liệu trình tự nucleotit đảm bảo

độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốt nhất cho bảo tồn đa dạng di truyền, trong

nghiên cứu di truyền quần thể (population genetics), vì nó bộc lộ rõ các biến đổi di truyền ở trong và giữa các quần thể, giữa các cá thể, giữa cha mẹ và con cái ; (3) kết quả phân tích DNA cho phép xác định chính xác loài, quần thể cho đến tận cá thể từ các mẫu vật không còn nguyên vẹn mà vẫn xác định thấy hiện tượng tạp lai giữa các loài, các quần thể địa lý…; và (4) kết quả nghiên cứu DNA không bị ảnh hưởng vào bất cứ yếu tố khách quan do môi trường hay con người gây ra

Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang là công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài mới, giải quyết các nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan

hệ chủng loại và mức độ tiến hoá của nhiếu loài động thực vật và vi sinh vật (Avise, 1993) [19].Các kết quả nghiên cứu ở mức độ DNA đã và đang góp phần đánh giá tính

đa dạng sinh học, định hướng khoa học cho việc bảo tồn và khai thác một cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế giới cũng như ở Việt Nam (Phillip, 1997) [52]

Do có giá trị sử dụng và thương mại lớn, nên nghiên cứu đa dạng di truyền đối với một số loài cây gỗ quý của chi Dalbergia sử dụng các chỉ thị RAPD, cpSSR, AFLP cũng được nhiều quốc gia quan tâm nghiên cứu Chẳng hạn, Olivarimbola và

cộng sự (2004) [17] đã dựng mối quan hệ di truyền của 122 cá thể loài Dalbergia monticola của Madagascar bằng việc phân tích với 60 chỉ thị RAPD và 03 chỉ thị

cpSSR, kết quả nhận được cho thấy các quần thể cây ở vùng trung tâm phía Bắc có nguồn gốc từ vùng Holocene của phía Nam Tương tự, các nhóm tác giả ở Pháp, Ấn

Độ, Brasil cũng đã sử dụng các chỉ thị RAPD, SSR để nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các loài, các quần thể và xác định trình tự các đoạn gen đặc trưng cho một

số loài cây thân gỗ thuộc chi Dalbergia (Rout et al., 2003; Benedic et al., 2006; Subhash et al., 2004; Juchum et al., 2007) [26, 37, 56, 67] Vì thế, riêng đối với chi Dalberrgia trong ngân hàng Genbank cũng đã lưu dữ hàng trăm trình tự nucleotide đặc trưng cho một số loài ở một số quốc gia Đây là nguồn dữ liệu có giá trị để chúng tôi có thể khai thác ứng dụng cho nghiên cứu chi này của Việt Nam

Trong nước: nhìn chung, các nghiên cứu về đa dạng di truyền phục vụ công tác

bảo tồn đa dạng sinh học và tái tạo nguồn gen đã được thế giới quan tâm và phát triển Theo hướng này, các nhà nghiên cứu trong nước cũng đã từng bước tiếp cận Tuy

nhiên, nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu DNA có tính hệ thống cao mới được thực hiện tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cho một số loài động vật quý hiếm Còn đối với thực vật thì hầu như chưa có, hơn nữa trong thực tế, sự tồn tại phân bố của nhiều loài ở dạng biệt lập, nên chứa đựng tính đa dạng nguồn gen rất lớn mà chưa được nghiên cứu

Vài năm trở lại đây, nghiên cứu đa dạng DNA ở thực vật đã và đang được tiến hành nghiên cứu ở Viện Công nghệ sinh học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Trường Đại học Lâm nghiệp và Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, nhưng mới chỉ tập trung được vào vài đối tượng cây trồng (cây lạc, lúa, một số loài hoa lan, một số loài thuộc chi họ Dầu, Vạn tuế, Bách xanh và Giổi) Mặc dù các nghiên cứu mới chỉ tập trung vào việc đánh giá đa dạng di truyền quần thể nhưng cũng rất có giá trị cho nghiên cứu bảo tồn, tiến hoá và tái tạo nguồn gen

Gần đây, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng

di truyền, phân loại và nhận dạng mẫu sinh vật ở Việt Nam cũng đã đạt được nhiều kết quả có giá trị Đối với một số loài động thực vật là nhóm nghiên cứu của Nông Văn Hải [8] đã dùng gen ty thể (18S rRNA) để nghiên cứu phả hệ và giám định DNA một

số loài lan Hài, cây Bình vôi, chim (gà Lôi), cá (cá Vược) và đã phát hiện ra mức độ tiến hóa của chúng Hay nhóm tác giả của Đặng Tất Thế (2003-2006) cũng sử dụng các nhóm gen này để phân tích sự tiến hóa phân tử và phát sinh chủng loại của một số loài thú, bò sát quý hiếm của Việt Nam [3, 4] Nguyễn Thuý Hạnh (2006), Lê Thị Muội và

cs (2005) đã dùng chỉ thị ISSR và cpSSR để nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài chi họ Dầu và Lạc của Việt Nam [7, 11] Hay nhóm tác giả của Nguyễn Minh Tâm đã dùng các chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng nguồn gen cây Vạn tuế của Việt Nam làm cơ

sở cho công tác bảo tồn đa dạng di truyền [9] Tuy nhiên nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp phần vào việc phân loại mẫu thực vật đang còn rất ít Đặc

biệt đối với nhóm cây rừng nói chung và loài gỗ quý có nguy cơ truyệt chủng nói riêng nên cần tập trung nghiên cứu có hệ thống

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu: Bao gồm 25 mẫu lá và mẫu gỗ của 5 loài cây gỗ quý thuộc chi Trắc

(Dalbergia) là D assamica, D cochinchinensis, D nigrescens, D oliveri và D tonkinensis (mỗi loài chọn ra 5 mẫu đại diện cho các vùng thu mẫu), mẫu do phòng

Sinh học - Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam cung cấp Các mẫu lá đã được xác định

chính xác về mặt hình thái theo phương pháp hình thái của Phạm Hoàng Hộ (1991) và

Niyomdham & cộng sự (1987) [14, 67] Mẫu lá tươi sau khi thu được bảo quản trong silical gel và giữ ở nhiệt độ phòng hoặc bảo quản lâu dài ở - 200C cho tới khi sử dụng

Kí hiệu và địa điểm thu thập của 25 mẫu nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh sách và một số thông tin về mẫu vật nghiên cứu

Nơi thu mẫu

stt Kí hiệu mẫu

Tên khoa học

Nơi thu mẫu

8 D.coc 3 D cochinchinensis Đăk Lăk 21 D.ton 1 D tonkinensis Hà Nội

9 D.coc 4 D cochinchinensis Gia Lai 22 D.ton 2 D tonkinensis Hà Nội

10 D.coc 5 D cochinchinensis Gia Lai 23 D.ton 3 D tonkinensis Hà Nội

11 D.nig 1 D nigrescens Đăk Lăk 24 D.ton 4 D tonkinensis Quảng Bình

12 D.nig 2 D nigrescens Đăk Lăk 25 D.ton 5 D tonkinensis Quảng Bình

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu bao gồm: các hóa chất tách chiết và tinh

sạch DNA (NaCl, CTAB, EDTA, Tris-HCl, β-Mercaptoethanol, Isopropanol, Sodium acetate 3M, ethanol 100%, 70%, Rnase (10mg/ml)…); Genomic Purification Kit

(Fermentas), bộ hóa chất PCR (Fermentas), kit tinh sạch sản phẩm PCR : ( QIAGEN Quick Gel Extraction Kit QIAGEN , Mỹ); hóa chất điện di agarose (agarose, đệm TAE )

Các thiết bị sử dụng : như máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ),

máy ly tâm của hãng Hitachi (Nhật bản), bộ điện di Nytechnich (Anh), máy chụp ảnh gel (Cleaver, Đức) máy ổn nhiệt (Memmert, Đức) Giải mã trình tự trên máy ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems)

Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu: Cặp mồi nhân bản vùng trnH – psbA

bao gồm: mồi psbA3'f do Sang và cộng sự thiết kế 1997 (Sang et al, 1997)[58] và mồi

trnHf do Tate và cộng sự thiết kế năm 2003 (Tate et al, 2003)[68] Cặp mồi ITS1/ITS4

nhân bản vùng ITS do White và cộng sự thiết kế năm 1990 (White et al, 1990) [72]

Cặp mồi trnL được thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen tRNA - Leu (trnL) của loài Dalbergia foliolosa có mã số EF451106 và cặp mồi matK thiết kế dựa

trên trình tự loài Dalbergia congestiflora có mã số AF142696 trong Ngân hàng gen

(Genbank) Trình tự nucleotide, kích thước lý thuyết và nhiệt độ bắt mồi như trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

ITS4

TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC

trnL trnLF

trnLR

GTGATAACTTTCAAATTCAGAG CTCACGATTTCTTAAGTCGA

matK matKF

matKR

TCAGAGGGTTTTGCCGTCGTC CACTGAAAAATTGAGCCGCACAT

Bảng 2.3 Mã số của 50 trình tự nulcleotide gen trnL thuộc 36 loài

trong Genbank sử dụng lập cây phân loại

Tên khoa học loài Mã số

genBank Tên loài khoa học của loài Mã số

Genbank

Các trình tự sử dụng lập cây phát sinh chủng loại: Dữ liệu trình tự DNA của

gene trnL tương ứng với 36 loài khác nhau, trong đó có 19 loài thuộc chi Dalbergia đã

được lấy từ ngân hàng Genbank để sử dụng cho phân tích mối quan hệ di truyền với 5

loài trong nghiên cứu Mã hiệu và một số thông tin của gen trnL được trình bày trong

bảng 2.3

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA và làm sạch DNA tổng số

DNA tổng số được tách chiết từ mẫu lá hoặc mẫu gỗ theo phương pháp CTAB được miêu tả bởi (Doyle và Doyle (1987) [29], tinh sạch DNA bằng bộ Kit Genomic Purification Kit (Fermentas) Sản phẩm DNA tổng số được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,9% Nhuộm gel bằng Ethidium bromide và soi dưới đèn UV

2.2.2 Thiết kế cặp mồi

Để thiết kế được cặp mồi có tính đặc hiệu cao và giảm thiểu khả năng bắt cặp không đặc hiệu Chúng tôi đã khai thác dữ liệu trong ngân hàng dữ liệu gen NCBI để tìm ra tất cả các trình tự gen mã hoá cho trnL (tARN-Leu) lục lạp đối với chi Dalbergia Sau đó sử dụng phần mềm Bioedit để so sánh, vùng bảo thủ nhất được sử dụng để thiết kế mồi Cặp mồi được thiết kế dựa trên chương trình DNAstar

2.2.3 Nhân bản trình tự đích bằng kỹ thuật PCR

Một phản ứng PCR có thể tích 50µl bao gồm các thành phần: 23µl H2O deion; 5µl dung dịch đệm buffer 10X; 5µl MgCl2 25mM; 5µl dNTPs 2,5Mm; 2,5µl mồi xuôi

(10pmol); 2,5µl mồi ngược (10pmol); 2µl Taq polymerase (5U/µl); 5µl DNA Phản

ứng được thực hiện trên máy chu trình nhiệt model 9700 (GeneAmp PCR System

9700, Mỹ), sử dụng ống PCR thành mỏng dung tích 0,2ml

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR cho các cặp mồi với giai đoạn đầu là 940trong 3 phút, tiếp sau là 35 chu ky nối tiếp nhau với các bước: biến tính 940C trong 50 giây, gắn mồi 51 đến 600

C trong 55 giây, kéo dài mồi 720C trong 45 giây và kết thúc

phản ứng ở 720

C trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 4C Sau khi kết thúc phản ứng, 5µ sản phẩm PCR mỗi ống sẽ được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,9% cùng với thang DNA chuẩn 1kb Gel agarose được nhuộm ethidium bromide 15 phút và quan sát dưới tia UV

2.2.4 Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR

Tinh sạch sản phẩm PCR là bước quan trọng để thực hiện phản ứng giải trình tự Qúa trình tinh sạch nhằm thu được sản phẩm đoạn gen mong muốn Sản phẩm PCR được tinh sạch theo bộ kit QIAquick Gel Extraction của QIAGEN Kiểm tra sản phẩm thu được trên gel agarose 0,9%

2.2.5 Giải trình tự DNA

Trình tự DNA được xác định bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp theo hai chiều (mồi xuôi và mồi ngược) trên máy đọc trình tự ABI PRIMS® 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) tại phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ gen – VCNSH

2.2.6 Phân tích số liệu

Các trình tự gen thu được được chỉnh sửa và phân tích bằng phần mềm MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis), version 4.0 (Kumar et al., 2007) [49] Khoảng cách di truyền giữa các cá thể trong loài và giữa các loài được xác định theo trình tự tổ hợp các gen Cây phát sinh chủng loại giữa 5 loài được xây dựng theo phương pháp Neighbor – Joining (NJ)

Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả tách chiết DNA

DNA tổng số của 25 mẫu lá và mẫu gỗ đại diện cho 5 loài đã được tách chiết thành công với chất lượng DNA cao (hình 3.1) Kết quả điện di kiểm tra DNA trên gel agarose 0,9% cho thấy DNA không bị gãy và tương đối sạch Kết quả đo OD cho thấy chỉ số OD260/OD280 của các mẫu luôn nằm trong khoảng 1,8 đến 2 (chỉ số cho biết dung dịch DNA có độ tinh khiết cao) Trong quá trình tách chiết DNA lá được nghiền mịn trong nitơ lỏng, ngoài chức năng làm dòn thành tế bào thì nhiệt độ thấp của nitơ lỏng còn kìm hãm hoạt động của các nuclease có trong tế bào Nuclease là các enzyme phân cắt DNA, sự hoạt động của nuclease có thể làm giảm chất lượng DNA với sự xuất hiện nhiều đoạn đứt gẫy Bước rửa được thực hiện trước khi bổ sung đệm chiết cũng rất quan trọng, bước này có thể loại bỏ phần lớn các chất bẩn có trong tế bào Với việc cải tiến ở bước rửa ban đầu, chúng tôi thu được DNA có chất lượng tốt, đạt chất lượng cho nhân bản trình tự đích bằng kỹ thuật PCR mà không cần phải dùng tới bộ Kit tách chiết DNA.Trong nghiên cứu này,để đảm bảo kết quả giải trình tự được chính xác chúng tôi tiến hành tinh sạch DNA tổng số bằng bộ Kít tách chiết DNA (Genomic Purification Kit)

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ một số mẫu lá nghiên cứu trên

gel agarose 0,9% (Giếng 1-3: D assamica; giếng 4-6: D cochinchinensis;

giếng 7-9: D negrescens; giếng 10-12: D oliveri; giếng 13-15: D

tonkinensis)

Quy trình tách chiết DNA cũng được nghiên cứu trên các mẫu gỗ khô, DNA tổng số tách được từ các mẫu gỗ khô là rất thấp Mặc dù không quan sát được băng điện di trên gel agarose 0,9%, tuy nhiên khi thực hiện phản ứng PCR vẫn diễn ra thành công Kết quả này mở ra một triển vọng phát triển một phương pháp giám định loài cho các khối gỗ thương mại bằng kỹ thuật DNA barcoding

3.2 Kết quả nhân bản trình tự DNA đích ở 01 vùng gen nhân và 03 vùng gen lục lạp

Tất cả các trình tự DNA đích bao gồm vùng ITS (Internal transcribed spacer)

nằm trên gen mã hoá cho RNA ribosomse nhân, gen matK, gen trnL mã hoá RNA vận chuyển Leucine, khoảng trống psbA - trnH – thuộc hệ gen lục lạp đã được nhân bản

thành công Trong quá trình tối ưu, theo lý thuyết các phản ứng PCR có nhiệt độ gắn mồi từ 550C trở lên đều cho phản ứng đặc hiệu, tuy nhiên do bộ gen thực vật rất lớn (466 megabase với bộ gen lúa, bộ gen người khoảng 320 megabase)[59] nên tất cả cặp mồi khi tiến hành gắn mồi ở 550C đều xuất hiện các băng phụ, hay phản ứng không đặc hiệu Phản ứng chỉ đạt được tối ưu và đặc hiệu ở nhiệt độ trên 580

C Trên 4 vùng

nucleotide giải mã, ngoài gen matK các vùng còn lại đều là các trình tự nucleotide

không mã hoá cho protein Vì vậy kích thước của các băng có thể thay đổi giữa các nhóm do xuất hiện các đột biến thêm và mất nucleotide

3.2.1 Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi ITS1/ITS4

Vùng ITS đã được nhân bản thành công với cặp mồi ITS1/ITS4 ở nhiệt độ gắn mồi là 58oC cho tất cả các mẫu của loài D oliveri, D cochinchinensis, D nigrescens,

D tonkinensis và D assamica Hình 3.2 là kết quả đại diện cho một số mẫu nghiên cứu

của 5 loài Dalbergia, sản phẩm PCR có kích thước khoảng 700 bp (đúng như kích thước lý thuyết dự đoán) Chất lượng của sản phẩm PCR được thể hiện khi điện di trên gel agarose 0,9% chỉ có một băng duy nhất, sáng đậm, đủ tiêu chuẩn cho tách đoạn gen nhân để giải mã trình tự

Sự tồn tại hai vùng bảo thủ 18S và 26S là một thuận lợi cho việc thiết kế cặp mồi nhân bản vùng ITS Có rất nhiều cặp mồi khác nhau đã được công bố, trong đó bao gồm cả những cặp mồi cho nhân bản riêng rẽ từng vùng ITS1 và ITS2 Với sự tồn

tại của hai vùng không mã hoá ITS1 và ITS2, các đột biến thêm bớt nucleotide có thể xảy ra làm thay đổi kích thước của vùng ITS Theo nghiên cứu của Ribeiro và cộng sự (2007) [57] chỉ ra rằng vùng ITS có kích thước thay đổi từ 607bp – 641bp đối với các loài thuộc chi Dalbergia, hay Son và cộng sự (2010)[65] cho thấy vùng ITS của các

loài thuộc chi Zanthoxylum có kích thước khoảng 731 bp Ngoài sự thay đổi kích thước

do đột biến trên vùng ITS, kích thước của các sản phẩm PCR cũng thay đổi theo cặp mồi được sử dụng Sản phẩm PCR của vùng ITS nhân được trong nghiên cứu của chúng tôi gồm một phần kích thước vùng 18S và 26S, do vậy vùng gen nhân được sẽ

có kích thước lớn hơn kích thước vùng ITS thực tế

3.2.2 Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi psbA - trnH

Vùng psbA – trnH được chứng minh là vùng dễ dàng thực hiện phản ứng PCR

nhất đối với các loài thực vật nói chung (Shaw et al, 2005)[60] Do một vùng không

mã hoá nên kích thước của vùng psbA - trnH cũng thay đổi khác nhau giữa các loài

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản được của một số mẫu đại diện với cặp mồi

ITS1 - ITS4 trên gel agarose 0,9% (M: marker phân tử 1kb; giếng 1: D assamica; giếng 2: D

cochinchinensis; giếng 3: D nigrescens;

giếng 4: D oliveri và giếng 5: D.tonkinensis) 700bp

Vùng này có kích thước biến đổi trong một giới hạn rất lớn, từ 247bp đến 1221bp

(Kress et al, 2005) [40] Kết quả nhân bản vùng gen đích bằng cặp mồi psbA - trnH

với 5 loài nghiên cứu đã thu được đoạn DNA có kích thước khoảng 400 bp, sản phẩm PCR trên gel agarose 0,9 % chỉ cho một băng đặc hiệu và không xuất hiện các băng phụ (hình 3.3)

3.2.3 Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi matK - matK

Sử dụng cặp mồi matK - matK do chúng tôi thiết kế đã nhân bản thành công gen matK cho 5 loài nghiên cứu (hình 3.4) Gen matK có kích thước đẩy đủ là 2450 bp, tuy

nhiên trong nghiên cứu này cặp mồi được thiết kế cho nhân bản đoạn DNA chỉ có kích

thước 750 bp và nằm gần đầu 3’ của gen Gen matK là một gen chức năng do vậy

thường không có các đột biến thêm bớt nucleotide xảy ra trên gen, nên kích thước giữa

các loài cũng tương đối ổn định Sản phẩm PCR nhân bản gen matK có kích thước đúng như kích thước lý thuyết dự đoán Kết quả nhân bản gen matK được thực hiện tốt

nhất ở nhiệt độ gắn mồi là 600

C

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản được của một số mẫu đại diện với cặp mồi

psbA - trnH trên gel agarose 0,9% (M: marker phân tử 1kb; giếng 1: D assamica;

giếng 2: D cochinchinensis; giếng 3: D nigrescens;

giếng 4: D oliveri và giếng 5: D.tonkinensis)

400bp

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản được của một số mẫu đại diện với cặp mồi

matK - matK trên gel agarose 0,9% (M:marker phân tử 1kb; giếng 1: D assamica; giếng 2:

D cochinchinensis; giếng 3: Dnigrescens;giếng 4: D oliveri và

giếng 5: D tonkinensis)

3.2.4 Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi trnL - trnL

Phản ứng nhân bản vùng gen trnL được thực hiện ở nhiệt độ tối ưu là 580

C, trnL

là gen mã hoá cho rRNA ribosome vận chuyển Leucine trong lục lạp Kích thước gen thay đổi từ 452bp – 528bp đối với một số loài trong họ đậu (Fabaceae) (Ribeiro, et al.,

2007) [57] Nhân bản gen trnL ở hình 3.5 đối với 5 mẫu đại diện cho 5 loài nghiên cứu

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản được của một số mẫu đại diện với cặp mồi trnL

- trnL trên gel agarose 0,9% M: marker phân tử 1kb; giếng 1: D assamica; giếng 2: D

cochinchinensis; giếng 3: D nigrescens;giếng 4: D oliveri và giếng 5: D tonkinensis)

750bp

510bp

Kết quả cho thấy, chỉ nhân được 1 phân đoạn đặc hiệu đúng với kích thước dự đoán, đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu giải mã trình tự DNA

3.3 Kết quả giải mã trình tự 4 gen nghiên cứu

Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch sử dụng làm DNA khuôn cho phản ứng PCR đọc trình tự Quá trình xác định trình tự được thực hiện tại Viện CNSH trên máy ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) Phản ứng đọc trình

tự được thực hiện theo hai chiều bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp

3.3.1 Kết quả xác định trình tự gen ITS nhân

Kết quả xác định trình tự vùng ITS nhân cho ảnh điện di đồ với các đỉnh huỳnh quang rõ nét, cường độ mạnh và rõ ràng (kết quả không chỉ ra ở đây) Các trình tự thu được của 25 mẫu nghiên cứu được sắp xếp theo hàng (alignment) bởi phần mềm Bioedit (hình 3.6) Sau khi loại bỏ trình tự mồi và các nucleotide so le ở hai đầu, chúng

tôi đã thu được trình tự nucleotide của các loài có độ dài như sau: 642 bp đối với D assamica, 647 bp cho D cochinchinensis, 644 bp với D nigrescens, 644 bp với D oliveri và D tonkinensis là 643 bp Sở dĩ có sự khác biệt về kích thước giữa các loài là

do có các đột biến thêm bớt nucleotde xảy ra trên hai vùng ITS1 và ITS2 Kết quả thống kê ở hình 3.6 đã chỉ ra 11 vị trí (16, 113, 117, 118, 175, 236-238, 429, 596 và 597) đột biến bởi chèn vào hay mất đi nucleotide khi so sánh giữa 5 loài nghiên cứu

Tại vị trí nucleotide thứ 16, loài D oliveri chèn thêm nucleotide (A), 4 loài D assamica, D cochinchinensis, D nigrescens và D tonkinensis đã không có nucleotide

(A) Hay tại vị trí 236 đến 238, loài D cochinchinensis đã chèn thêm 3 nucleotide (ACA), 4 loài còn lại đã không xuất hiện các nucleotide Các vùng sai khác giữa các nucleotide khi so sánh 5 loài nghiên cứu được thể hiện trên hình 3.6