tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ------ HỨA THỊ SƠN Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc LUẬ

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- -

HỨA THỊ SƠN

Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối

kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum

gây bệnh héo xanh cây lạc

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2010

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- -

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum

gây bệnh héo xanh cây lạc

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Hướng dẫn khoa học: TS Lê Như Kiểu

Hà Nội – 2010

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin cảm ơn phòng đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập

Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Lê Như Kiểu, Phó viện trưởng Viện Thổ nhưỡng Nông hóa–Viện Khoa học Nông nghiệp Việt nam, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và định hướng cho tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn thạc sĩ này

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể bộ môn Vi sinh vật-Viện Thổ nhưỡng Nông hóa và tập thể bộ môn Sinh học Môi trường Nông nghiệp-Viện Môi trường Nông nghiệp đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình làm thực nghiệm cũng như chia sẽ những kinh nghiệm trong công việc để tôi có thể hoàn thành luận văn đúng thời gian qui định

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã tạo điều kiện, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn

Tôi chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó./

Hà nội, ngày 2 tháng 12 năm 2010

Học viên

Hứa Thị Sơn

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

A, T, G, C Adenine, Thyamine, Guanine, Cytosine

ADN Acid deoxyribonucleic

ALIV African lampeye iridovirus

BIV bream iridovirus

DGIV Dwarf gourami iridovirus

EBI European Bioinformatics Institute

EDTA Ethylenediamin Disodium Tetra Acetate

EHNV Epizootic haematopoietic necrosis virus

GIV Grouper iridovirus

GSDIV Grouper sleepy disease iridovirus

ISKNV Infectious spleen and kidney necrosis virus

LCDV Lymphocystis disease virus

MCP Major capsid protein

NCBI National Center for Biotechnology Information OIE World Organisation for Animal Health

OSGIV orange spotted grouper iridovirus

PCR Polymerase Chain Reaction

RBIV Rock bream iridovirus

RSIVD red sea bream iridoviral disease

SBIV Red sea bream iridovirus

SN-PCR Semi-nested - Polymerase chain reaction

TAE Tris - Acetic – EDTA

TGIV Taiwan Grouper Iridovirus

MỤC LỤC

Trang

1.2 Tình hình bệnh hại lạc trên thế giới và Việt Nam 7

2.2.1 Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng 33 2.2.2 Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng bằng phương pháp đục lỗ thạch 34 2.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng bằng phương pháp cấy chấm điểm 35 2.2.4 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đối kháng 36 2.2.5 Phân loại vi sinh vật đối kháng bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen

2.2.5.1 Phương pháp PCR thông thường (đơn) 39

2.2.5.2 Phương pháp kiểm tra độ sạch và xác định nồng độ 40

2.2.5.4 Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen 43

2.2.5.5 Phương pháp tin sinh học (sử dụng phần mềm NCBI, EBI, Expasy…) 46

3.1 Thu mẫu, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng 47

3.2 Đánh giá hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn 50

3.3 Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đối kháng 52

3.4 Một số đặc điểm cơ bản của các chủng vi khuẩn đối kháng 54

3.4.1.Một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đối kháng 54

3.4.2 Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đối kháng đến quá trình nảy

3.4.3 Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do R solanacearum của các

3.4.4 Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đối kháng lên quá trình sinh

3.5 Xác định vi trí phân loại các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phương pháp

giải trình tự đoạn gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom 63

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 3.1 Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn 47

phân lập được

Bảng 3.2 Hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn với đại diện các chủng vi khuẩn 50

gây bệnh héo xanh R Solanacearum

Bảng 3.3 Một số đặc điểm sinh học của 8 chủng vi khuẩn đối kháng 52

Bảng 3.4 Một số đặc điểm sinh học cơ của các chủng vi khuẩn đối kháng 55

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của 8 chủng vi khuẩn đối kháng lên khả năng nảy mầm 57

MỤC LỤC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Hoạt tính đối kháng của một số chủng vi khuẩn đối kháng với 51

R solanacearum BHT gây bệnh héo xanh lạc

vi khuẩn đối kháng đại diện

Hình 3.3 Hình thái tế bào chủng vi khuẩn TH24 chụp dưới kính hiển vi 54 điện tử với độ phóng đại 20.000 lần

Hình 3.4 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn của các chủng 60

vi khuẩn đối kháng trên Lạc

Hình 3.5 Điện di đồ ADN tổng số của hai chủng vi khuẩn nghiên cứu 64

Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 65

Hình 3.7 Tuyển chọn các khuẩn lạc mang gen mã hóa đoạn 16S ARN riboxom 66

của các chủng vi khuẩn NA10 và TH24 bằng phương pháp colony PCR

Hình 3.8 Tách và kiểm tra plasmid mang đoạn gen mã hóa phần tử 16S 67 riboxom của các chủng vi khuẩn đối kháng

Hình 3.9 Kết quả tinh sạch vectơ tái tổ hợp bằng enzim ARNaza 68

Hình 3.10 Trình tự nucleotit gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom của 70 chủng TH24

Hình 3.11 Trình tự nucleotit gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom của 70 chủng vi khuẩn NA10

MỞ ĐẦU

Bệnh héo xanh cây trồng do khuẩn Ralstonia solanacearum là một bệnh

phổ biến và nghiêm trọng ở nhiều loại cây trồng như cà chua, khoai tây, lạc, ớt, gừng (1, 2, 54,58,57) Đây là bệnh chủ yếu làm giảm năng suất và mất mùa lạc

ở nhiều nước như Trung Quốc, Thái Lan, Việt nam, Indonesia Hàng năm dịch bệnh có thể gây thiệt hại từ 50-80% năng suất cây trồng Tình hình gây hại là như vậy nhưng cho tới nay những nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuẩn ở lạc

và vừng chủ yếu chỉ giới hạn trong phạm vi xác định mức độ thiệt hại, sự phân

bố của bệnh và bước đầu xác định nguồn gen kháng trong tập đoàn các giống hiện có

Kiểm soát dịch bệnh bằng phương pháp sinh học (kiểm soát sinh học) đang dần trở thành xu hướng phổ biến và được áp dụng rộng rãi trong nông nghiệp ở nhiều nước trên thế giới Bằng việc áp dụng các biện pháp sinh học người ta có thể thay thế các loại thuốc trừ sâu hóa học có hại đến sức khỏe con người và môi trường sinh thái Trong đó biện pháp sử dụng vi sinh vật như một tác nhân kiểm soát và phòng ngừa bệnh hại đang dần trở lên phổ biến (5, 7) vì hiệu quả rõ rệt mà nó mang lại, các chủng vi sinh vật lựa chọn phải có hoạt tính đối kháng cao, ổn định trong thời gian dài và không gây hại cho động, thực vật

Với mục đích này tôi được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài “Tuyển chọn

và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia

solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc”

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình trồng lạc trên thế giới và Việt nam

1.1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới

Trong các loại cây trồng làm thực phẩm cho con người, lạc có vị trí quan

trọng Mặc dù có nguồn gốc từ lâu đời nhưng tầm quan trọng kinh tế của cây lạc

36 được xác định cách đây khoảng trên 100 năm Khi những xưởng ép dầu ở Macxây (Pháp) bắt đầu nhập cảng lạc từ Tây Phi, mở đầu cho thời kỳ dùng lạc

ép dầu trên qui mô lớn Công nghiệp ép dầu đã hình thành và phát triển nhanh chóng ở các nước Châu Âu và lan ra trên toàn thế giới Phần lớn diện tích trồng lạc trên thế giới còn sản xuất theo lối cổ truyền, kỹ thuật canh tác lạc hậu Những năm gần đây nhờ ứng dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật mới vào sản xuất năng suất lạc đã được nâng lên Tuy nhiên các tiến bộ kỹ thuật ở các nước không đồng đều, ở các nước phát triển năng suất lạc tăng nhanh còn ở các nước chậm phát triển thì hàng năm năng suất lạc tăng không đáng kể Các nước có năng suất lạc tăng nhanh đó là: Mỹ trong vòng từ năm 1961 đến 1975 năng suất bình quân đã tăng từ 1.564kg/ha lên 2.875kg/ha Ở Trung Quốc chương trình nghiên cứu nâng cao năng suất lạc được tiến hành từ 1979 và đã đạt được kết quả khả quan Các thành tựu về chọn giống lạc trong những năm 80 đã được ứng dụng vào sản xuất tạo nên các điển hình năng suất cao như giống Nonghua 22 đạt năng suất trung bình 4.219kg/ha ở miền trung và miền nam Trung Quốc Ngoài ra nhiều giống lạc mới có năng suất cao đã và đang được đưa ra sản xuất và mở rộng (5, 14)

Cây lạc được trồng ở tất cả các châu lục với trên 100 nước trên thế giới, diện tích trồng lạc khoảng 20-21 triệu ha, năng suất biến động từ 11-12tạ/ha và

sản lượng đạt 23-34 triệu tấn/năm Diện tích trồng lạc lớn nhất tập trung ở châu

Á chiếm 63,17% Châu Phi chiếm 31,81% Những nước trồng lạc lớn trên thế giới là Ấn Độ, Trung Quốc, Mỹ, Indonesia, Xenegal, Miến Điện, Xu Đăng, Nigeria, Zaia và Achentina …(8, 21) Nước có diện tích trồng lạc lớn nhất là Ấn

Độ (8,6triệu ha) Sau đó là trung Quốc (2,65 triệu ha) tiếp đến là Nigeria (1,0 triệu ha) Năng suất lạc ở châu Mỹ, châu Âu và vùng cận đông bình quân đạt 2,2tấn/ha Năng suất lạc ở châu Đại Dương chỉ tương đương năng suất bình quân của thế giới (1,1 tấn/ha) và đặc biệt năng suất lạc ở các nước châu Phi và các nước đang phát triển năng suất lạc còn thấp dưới 1.000kg/ha (châu Phi chỉ đạt 0,7 tấn/ha còn thấp xa so với mức bình quân của thế giới) Năng suất đạt cao nhất thế giới là Israel đạt 6,8 tấn/ha, thứ hai là Irăc (3,4 tấn/ha) thứ ba là Mỹ với (2,8 tấn/ha) và tiếp đến là Trung Quốc 2,1 tấn/ha Tuy nhiên một vài năm trở lại đây năng suất lạc của một số nước đã tăng lên đáng kể Ở Ấn độ năng suất trên diện tích trồng hẹp đã đạt 5 tấn/ha, còn ở Trung Quốc trên diện rộng đã đạt 6,0-7,5 tấn/ha (Newsletter-ICRISAT, 1997) Về xuất khẩu châu Á và châu Mỹ là hai châu lục có khối lượng lạc xuất khẩu lớn nhất chiếm 78,56% khối lượng lạc xuất khẩu thế giới Trong số các nước xuất khẩu lạc chính thì Mỹ là nước đứng đầu

về xuất khẩu lạc trên thế giới chiếm 28,1%, theo sau là Trung Quốc và Achentina Hầu hết các nước xuất khẩu lạc chính đều thuộc các châu lục sản xuất nhiều lạc như châu Á, châu Phi và châu Mỹ (21)

1.1.2 Tình hình sản xuất lạc trong nước

Theo số liệu của cục thống kê : ở Việt Nam, cây lạc được xác định là cây công nghiệp ngắn ngày có vị trí quan trọng, diện tích đất trồng lạc chiếm gấn 40% so với tổng số diện tích cây công nghiệp ngắn ngày và chiếm tỉ trọng lớn nhất Trong thời kỳ Pháp thuộc diện tích lạc ở miền Bắc khoảng 4.600ha Sau

ngày hoà bình 1954 diện tích lạc được mở rộng khá nhanh Giai đoạn 1975-1989

là giai đoạn mở rộng sản xuất, từ năm 1975 diện tích trồng lạc của cả nước mới

có 68.000 ha, đến đầu năm 80 thế kỷ XX đã là 100.000 ha Tốc độ tăng trưởng diện tích-năng suất-sản lượng tương đối đều từ 1975 đến 1998 diện tích tăng 6,16% năm nhưng năng suất chỉ tăng 1,8% năm, sản lượng tăng 8,08 % năm

- Trong những năm đầu của thập kỷ 80 diện tích và năng suất, sản lượng lạc của ta còn rất thấp, diện tích đất trồng lạc giao động trong khoảng 106.000-170.000ha, sau đó tăng dần từ năm 1985 và đạt 237.800ha vào năm 1987 (diện tích lạc tăng gấp 3 lần năm 1960) kéo theo sản lượng tăng mặc dù năng suất tăng chậm Trong giai đoạn này sản lượng tăng (8,62% năm) chủ yếu là do tăng diện tích (8,33%), năng suất tăng chậm chỉ đạt 0,22% năm

- Từ năm 1988-1991 diện tích lạc giảm do mất thị trường tiêu thụ truyền thống, nhưng năm 1990 là năm đầu Việt Nam vượt ngưỡng năng suất 1,0 tấn/ha

- Từ năm 1991 cả diện tích, năng suất và sản lượng đều tăng nhanh, đặc biệt là năng suất Năm 1995 năng suất tăng 34,7% so với 1989 và 20,8% so với

1990 Năm 1995 có diện tích trồng lạc 259.000ha, năng suất đạt 12,8tạ/ha và sản lượng đạt 334.000 tấn

- Năm 1998 diện tích trồng lạc của cả nước đạt 269.400 ha, năng suất bình quân 14,3 tạ/ha, tổng sản lượng 386.000 tấn Như vậy chỉ trong vòng 10 năm gần đây năng suất lạc đã tăng gần 30%

- Hiện tại cây lạc được trồng phổ biến và quen thuộc của nhân dân ta từ Miền Bắc đến Miền Nam và được trồng ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước, lạc trồng nhiều ở các tỉnh khu 4 cũ (26,4%), Đông nam bộ (25,5%), Trung du miền núi phía Bắc (15,7%), Duyên hải Nam trung bộ (10,7%) Tây Ninh là tỉnh

có diện tích trồng lạc lớn nhất (40.000ha) sau đó là Nghệ An (28.000ha)

 Các tỉnh: Đắc lắc, Bình Dương, Quảng Nam, TP Hồ Chí Minh sản lượng đạt trên 10.000-20.000tấn/năm

 Tây Ninh, Nghệ An, Thanh hóa, Hà Tĩnh, Long An là các tỉnh có sản lượng đạt trên 20.000tấn/năm Tổng sản lượng lạc của 5 tỉnh này chiếm trên 50% tổng sản lượng lạc của cả nước Trong khi diện tích trồng lạc chỉ chiếm hơn 40%

 Các tỉnh có năng suất lạc bình quân 15-19,5tạ/ha: Long An, Trà Vinh, Bến Tre, Hải Phòng, Thái Bình

 Những tỉnh đạt năng suất bình quân trên 20tạ/ha như Sóc Trăng 40 tạ/ha, An Giang 26,7 tạ/ha, Đồng Tháp 25 tạ/ha, TP Hồ Chí Minh 21,5 tạ/ha, Tây Ninh đạt năng suất bình quân 22,8tạ/ha trên diện tích 40.000ha

Năm 2000 diện tích và sản lượng lạc tăng rõ rệt, năng suất đạt 1,5 tấn/ha Một trong những yếu tố quan trọng nhất góp phần nâng cao năng suất lạc là do việc áp dụng các tiến bộ kỹ thuật Mục tiêu của nước ta đến năm 2005, năng suất bình quân đạt 1,5-2,0tấn/ha và diện tích trồng lạc đạt 400.000ha Nước ta đã hình thành vùng sản xuất tập trung, có khối lượng lạc hàng hóa lớn Các vùng trồng lạc ở nước ta gồm: (tổng quan nông nghiệp Việt Nam, 2000) :

- Vùng trung du Bắc Bộ chủ yếu là các tỉnh Bắc Giang, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Phú Thọ Lạc trồng trên đất bạc màu, nghèo dinh dưỡng,

bị rửa trôi mạnh Năng suất lạc không cao, trung bình 8,0-9,5tạ/ha nhưng lạc là cây trồng có khả năng đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn nhiều loại cây trồng khác, hơn nữa lạc còn đóng vai trò tích cực để cải tạo đất bạc màu Diện tích hiện tại khoảng 41.000 ha (Chiếm 15,7%) Khả năng mở rộng còn rất lớn

- Vùng khu 4 cũ (Vùng ven biển Bắc trung bộ): gồm các tỉnh Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh đây là vùng trồng lạc lớn có khả năng cho năng suất cao Lạc trồng chủ yếu trên đất cát thô ven biển Vùng này đất đai tương đối phù hợp với cây lạc Một phần diện tích là đất phù

sa ven sông và đất dốc bán sơn địa Hiện tại diện tích đạt trên 71.000

ha (Chiếm 26,4%)

- Vùng ven biển Nam trung bộ: Lạc được trồng tập trung ở hai tỉnh Quảng Nam và Đà Nẵng với diện tích khoảng 29.000 ha (chiếm 10,7%)

- Vùng đồng bằng Bắc Bộ gồm các tỉnh Hà Nội, Hà Tây diện tích 18.900ha, năng suất 10,7tạ/ha

- Vùng Đông Nam bộ: gồm thành phố Hồ Chí Minh, Tây Ninh… đất trồng lạc ở đây là đất xám nhẹ và thoát nước, tưới tiêu thuận lợi từ nước hồ Dầu Tiếng Vì thế tiềm năng phát triển lạc ở đây là rất lớn, diện tích 65.900ha, năng suất bình quân 17,5tạ/ha

- Vùng cao nguyên Nam bộ, diện tích trồng lạc vào khoảng 18.600 ha (chiếm 6,9%), chủ yếu ở tỉnh Đắc Lắc và Gia Lai Komtum

Lạc trở thành cây trồng quan trọng hàng đầu về mặt xuất khẩu và nhu cầu tiêu thụ của nhân dân Những năm trước đây thị trường xuất khẩu lạc của ta chủ yếu là các nước đông Âu và Liên Xô cũ Từ năm 1988 do khủng hoảng chính trị sâu sắc ở khu vực này làm mất thị trường xuất khuẩu lạc truyền thống của nước

ta Những năm gần đây Việt Nam đã tiếp cận với thị trường mới giá lạc đã được phục hồi Tuy nhiên giá lạc xuất khẩu của nước ta mới chỉ bằng 60-70% so với giá xuất khẩu của Mỹ và Trung Quốc, do chất lượng lạc của Việt Nam thấp hơn

cả về trọng lượng và hàm lượng dầu Ngoài ra lạc của chúng ta chủ yếu vẫn còn

phải xuất qua các nước trung gian như: Singapore, HồngKông, giá xuất khẩu năm 1995 là 650 USD/tấn Năm 2001 xuẩt khẩu 80 nghìn tấn lạc đạt 39,1 triệu USD tăng so với năm 2000 là 105,4%nghìn tấn, trị giá tăng 95,3% USD (số liệu của Cục thống kê, sản xuất thị trường NN&DTNT số 6,7/2002)

Nhu cầu tiêu thụ lạc ở trong nước còn rất lớn Theo đánh giá của tổ chức sức khỏe thế giới (WHO) thì hiện nay mức tiêu thụ dầu, mỡ của người Việt Nam còn rất thấp, bình quân 3kg/người/năm Trong khi mức khuyến cáo là 20kg/người/năm

1.2 Tình hình bệnh hại lạc trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình bệnh hại lạc trên thế giới

Thực tế trồng lạc ở các nước trên Thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng gặp rất nhiều khó khăn, do xuất hiện nhiều loại sâu bệnh gây hại chủ yếu như

1/ Bệnh chết héo cây

Bệnh chết héo có nhiều nguyên nhân Bệnh chết héo lạc: Phát sinh ở hầu hết các vùng trồng lạc của thế giới và cũng như ở Việt Nam và bao gồm nhiều tác nhân gây hại khác nhau Theo D.Morris Poster và Donal H Smith (34) đã tập hợp các kết quả nghiên cứu những bệnh truyền qua đất và cho thấy rằng có 17 loại bệnh gây héo lạc do 17 loại vi sinh vật khác nhau gây ra như nấm

Sclerotium, Fusarium, Cylindrocladium, Pythium, Rhizoctonia, Aspergillus niger, Aspergillus flavus cùng với một số nấm khác và vi khuẩn Pseudomonas solanasearum Các tác giả đã phân chia các nhóm bệnh theo triệu chứng bị hại

như: bệnh hại trên thân, trên cổ rễ, trên rễ, tia và quả

2/ Bệnh thối thân lạc (Stem rot)

Bệnh thối thân lạc được biết đến như là bệnh mốc trắng, bệnh thối thân miền Nam, bệnh cháy lá miền Nam và bệnh thối Sclerotium Bệnh được phát hiện thấy

ở hầu hết các vùng trồng lạc chủ yếu trên thế giới Năng suất giảm do bệnh là 25% có nơi còn lên tới 80% Đây là loại bệnh gây hại lạc nhiều nhất ở Mỹ (35)

Nghiên cứu về vi sinh vật gây bệnh, các tác giả cho rằng nấm Sclerotium rolfsii

sản sinh một lượng lớn axit axalic, độc tố được sản sinh làm biến đổi màu ở trên hạt và cũng gây nên những đốm chất hoại của lá ở giai đoạn đầu bệnh phát triển (40) Nấm gây bệnh sống sót như là nấm hoại sinh ở trên tàn dư cây trồng, thậm trí cả trên tàn dư của những cây trồng không phải là ký chủ (40) Hạch nấm tồn tại từ năm này đến năm khác ỏ tầng đất bề mặt, nhưng không thể tồn tại trong nhiều năm khi đất bị ngập sâu Nghiên cứu các thí nghiệm phòng trừ bệnh này bằng thuốc hoá học, các tác giả cho rằng thuốc trừ nấm Sterol có hiệu quả cao Biện pháp phòng trừ sinh học đối với nấm này ở điều kiện ngoài đồng ruộng đã

được áp dụng, tác giả đã dùng nấm Trichoderma harzianum Ripai, tuy nhiên

hiệu quả phòng trừ không cao

3/ Bệnh cháy Sclerotinia (Sclerotinia blight)

Bệnh này được quan sát đầu tiên trên cây lạc ở Argentina năm 1992 và hiện nay bệnh được phát triển ở hầu hết các nước trồng lạc trên thế giới (34) Nấm

Sclerotium minor Jagger là tác nhân gây bệnh Các tác giả cho thấy Sclerotinia minor qua mùa đông ở dạng hạch, ở tầng đất cày có độ sâu 20 cm Dưới những

điều kiện môi trường thích hợp, hạch của Sclerotinia minor phát triển thành hệ

sợi nấm Những bộ phận của cây ở gần hoặc tiếp xúc với đất và gần nơi hạch nảy mầm đều bị nhiễm bởi hệ sợi nấm trắng Nghiên cứu các biệp pháp phòng trừ, tác giả cho rằng sử dụng thuốc nội hấp và xông hơi có khả năng làm giảm bệnh

4/ Bệnh thối Pythium (Pythium disease)

Hầu hết các loài pythium có thể gây thối quả, gây chết cây con và gây thối rễ

lạc (37) Nấm Pythium sống trong đất và có thể tồn tại như là một loài nấm hoại

sinh, nấm có phạm vi ký chủ rộng Các tác giả cho rằng bào tử noãn là cấu trúc

sống sót đầu tiên của nấm Pythium myriotylum ở trong đất Động bào tử và bào

tử túi có thời gian sống ngắn hơn Sợi nấm được sản sinh bởi động bào tử hoặc nảy mầm của bào tử noãn Sự xâm nhập xuất hiện trong 2 giờ tại 30-340

C và không xuất hiện ở nhiệt độ dưới 250C Nghiên cứu các biện pháp phòng trừ kết quả cho thấy những thuốc trừ nấm có phổ tác động rộng hoặc sử dụng phối hợp một số thuốc trừ nấm là cần thiết để phòng trừ bệnh hại này (39) Mặc dù vậy

các tác giả đều thấy phòng trừ bệnh Pythium của lạc trên đồng ruộng là rất khó

khăn, biện pháp luân canh cây trồng là ít hiệu quả

5/ Bệnh héo Rhizoctonia

Nấm Rhizoctonia sản sinh nhiều hạch trong mô cây chủ Hạch được kết

tập lại của những sợi nấm dày, nó tồn tại trong đất với sự có mặt của cây chủ và

sẽ được nảy mầm khi được kích thích bởi những dịch rỉ chảy ra từ cây chủ bị

nhiễm bởi việc bổ sung chất hữu cơ vào đất Nấm Rhizoctonia sản sinh ra enzym

Cellulolitic, Pectinolitic và độc tố thực vật mà độc tố này giết chết mô chủ Khi

mô bị chết và bị phân huỷ, nó giải phóng chất hữu cơ và tiếp tục làm tăng sự sinh trưởng của nấm

6/ Bệnh héo Fusarium

Nấm Fusarium spp có mặt ở tất cả các loại đất trồng lạc và tập trung gần mô

cây lạc sống Nhìn chung được phân lập từ mô rễ, từ hạt, trụ dưới của lá mầm và

lá mầm của hạt vừa nảy mầm

Có 17 loài Fusarrium đã được phân lập từ đất xung quanh vùng rễ hoặc củ lạc, cổ rễ, tia…(39) Tuy nhiên tác giả đã xác định 4 loài gây bệnh trên lạc

- Fusarium solani f.sp phaseoli

- Fusarium oxysporium

- Fusarium roseum

- Fusarium tricinctum

Nấm Fusarium spp sống hoại sinh ở trong đất và trên tàn dư cây trồng

Nhiều loài Fusarium sản sinh bào tử hậu (Chlamydospores) và đây cũng chính là nguồn bệnh để lây lan cho vụ sau

Nghiên cứu các biện pháp phòng trừ biện pháp luân canh cây trồng có ý nghĩa làm giảm bệnh Tránh trồng lạc ở đất nghèo axít và nâng cao độ phì của

đất bằng cách bón bổ sung chất hữu cơ có thể làm giảm bệnh Fusarium gây nên

7/ Bệnh thối thân (Charcoal Rot)

Do nấm Macrophomina phaseolina gây hại Nấm bệnh lan truyền qua đất

và hạt giống Sợi nấm ở trong hạt và hạch tồn tại trên tàn dư cây trồng trong đất Hạch nấm có thể duy trì tồn tại trong điều kiện đất khô trong nhiều năm Nhưng chúng cũng mất sức nảy mầm nhanh chóng

8/ Bệnh thối vòng Diplodia (Diplodia collar rot)

Bệnh thối vòng Diplodia xuất hiện rải rác ở khắp các vùng trồng lạc trên

thế giới nhưng ít gây nên thiệt hại quan trọng về kinh tế Tác nhân gây bệnh sống hoại sinh trong đất, có thể ký sinh yếu Tuy nhiên ở những diện tích trồng lạc liên tục hoặc lạc được trồng luân canh với cây trồng khác mà bị nhiễm bệnh này thì tỷ lệ lạc bị bệnh nặng cũng làm giảm năng suất trên 25% (66)

Biện pháp phòng trừ: biện pháp luân canh lạc với những cây chủ không phải là ký chủ của nấm bệnh có thể làm giảm sự gây hại của bệnh và sử dụng giống chống bệnh

9/ Bệnh héo Verticillium (Verticillium Wilt)

Bệnh phát hiện đầu tiên ở châu Á từ năm 1937 Nấm bệnh lan truyền trên đồng ruộng nhờ gió, nước và cả qua công cụ chăm sóc lạc của người nông dân từ những diện tịch bị nhiễm tới những diện tích chưa bị nhiễm (68) Để hạn chế tác hại của bệnh các tác giả cho rằng việc sử dụng hạt giống sạch bệnh là có ý nghĩa, và tạo dòng, giống chống bệnh hại này

10/ Bệnh cháy Botrytis (Botrytis blight)

Bệnh được phát hiện ở hẩu khắp các nước trồng lạc trên thế giới, tuy nhiên tác hại của bệnh thường nhẹ Mặc dù vậy tuỳ từng năm, tuỳ từng điều kiện khí hậu của từng nước mà bệnh trở nên quan trọng và làm giảm năng suất lạc đáng

kể (66) Nấm Botrytis cinecea pers ex fries là nguyên nhân gây bệnh cháy

Botrytis Nhiệt độ dưới 200C, đêm nhiều sương hoặc có mưa nhỏ, mưa phùn là rất thích hợp cho nấm bệnh phát triển và lây lan Nguồn bệnh qua đông ở dạng hạch trong đất (64) Theo Poter, D.M cho rằng trồng lạc sớm cũng tránh được giai đoạn mẫn cảm của bệnh

11/ Bệnh thối vòng (Aspergillus crown rot)

Bệnh phát hiện đầu tiên ở Sumatra 1926 Ngày nay bệnh thối vòng trở thành một đối tượng quan trọng của tất cả các diện tích trồng lạc trên thế giới Nhiều nơi năng suất giảm 50% do sự gây hại của bệnh Nấm gây bệnh được xác

định là Aspergillus niger Chúng tồn tại trong đất và trong hạt giống Dùng thuốc

trừ nấm như: Captan và Thiramin để xử lý hạt giống nhằm tiêu diệt nguồn bệnh trên hạt và bảo vệ sự xâm nhiễm của nấm bệnh từ đất là có hiệu quả

12/ Bệnh mốc vàng (Yellow mold)

Nấm bệnh xâm nhiễm và phát triển trên cây lạc còn non, trên quả lạc và hạt lạc trong đất trước khi thu hoạch và chúng cũng xâm nhập vào củ và hạt lạc

trong giai đoạn thu hoạch và bảo quản (32) Nấm Aspergillus flavus được xác

định là nguyên nhân gây nên bệnh mốc vàng Theo tác giả đây là một loại nấm hoại sinh sống được trong nhiều loại đất và có thể tồn tại trên tàn dư cây trồng Khả năng gây bệnh của chúng liên quan đến thành phần vi sinh vật có trong đất,

mô cây chủ và sự xuất hiện của các điều kiện thuận lợi cho nấm bệnh Nấm có thể sinh trưởng ở trong khoảng nhiệt độ từ 17-420C Tuy nhiên nhiệt độ cho nấm phát triển tốt là 25-350C và ẩm độ thấp Nấm phát triển trên củ và hạt lạc nhanh chóng trong điều kiện khô (độ ẩm không khí là khoảng 70%) Song độ ẩm của hạt lạc từ 7-9% là không thích hợp cho sự xâm nhiễm và phát triển của nấm này (42)

Áp dụng biện pháp luân canh cây trồng và sử dụng phân bón thích hợp để làm giảm sự gây hại của vi sinh vật truyền qua đất, áp dụng việc tưới nước trong lúc khô hạn để tránh cho cây bị hạn bắt buộc Thu hoạch kịp thời khi đa số quả lạc vừa có độ chín tới, phơi lạc đạt độ ẩm dưới 9 % để hạn chế sự xâm nhiễm của nấm vào hạt trong thời gian bảo quản (65) Trồng những giống chống chịu với bệnh thối quả và những nấm sản sinh độc tố khác

13/ Bệnh héo vi khuẩn (Bacterial Wilt)

Bệnh được quan sát từ năm 1950 ở Indonexia Hiện nay bệnh phân bố rộng ở khắp các vùng trồng lạc trên thế giới Song bệnh phát triển tập trung ở

Châu Phi và Châu Á (52) Nguyên nhân gây bệnh được xác định là Ralstonia

solanacearum Đây là loại vi khuẩn háo khí, không hình thành bào tử, hình gậy,

gram âm (1954) Vi khuẩn R.solanacearum được phân bố ở vùng nhiệt đới có

điều kiện ấm và ẩm Vi khuẩn tồn tại trong đất và tiếp tục lây bệnh cho vụ sau và trên cây có cùng ký chủ và cả những cây cỏ dại khác Vì vậy, luân canh lạc với các cây cùng ký chủ như thuốc lá có thể làm tăng mức độ bệnh (56)

Nghiên cứu về sự phân bố địa lý và tầm quan trong kinh tế của bệnh, các tác giả cho thấy rằng bệnh héo xanh vi khuẩn đã gây nên thiệt hại quan trọng về năng suất lạc ở Indonexia (58), Trung Quốc (44, 57, 75) và một phần của

Uganda (70) Có nhiều nước bệnh héo xanh do vi khuẩn R.solanacearum là chưa

quan trọng hoặc tình trạng của bệnh là không chắc chắn Nghiên cứu các dòng vi

khuẩn R.solanacearum trên lạc cho thấy có 3 trong số 5 “biovar” của R

.solanacearum là được đánh giá đối với vi khuẩn gây héo lạc, dựa trên cơ sở

khác nhau của việc sử dụng và oxy hoá hoàn toàn vòng rượu và đường đa (43) Nghiên cứu về độc tính và sức gây bệnh các tác giả Kelman và Person (56) chỉ ra

có sự sai khác rõ ràng về độc tính trong số những dòng vi khuẩn R.solanacearum

trên lạc Bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại nặng trên đất thịt nặng (57) Mặc dù vậy bệnh cũng được phát hiện thấy ở đất đá ong và đất cát mùn trắng Ở Trung Quốc hầu hết các cánh đồng bị bệnh nặng lại là đất cát Nhiều thí nghiệm cho thấy bệnh phát sinh nặng hơn ở đất sét hơn là đất cát (19) Cùng một loại đất, ẩm

độ có ý nghĩa đối với bệnh héo xanh vi khuẩn lạc Ẩm độ càng cao bệnh héo xanh vi khuẩn càng nặng (57) Nhiệt độ đất cao ngay đầu vụ lạc thích hợp cho bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại ở giai đoạn cây con Nhiệt độ đất khoảng 250

C tại độ sâu 5 cm cùng với độ ẩm đất cao thích hợp cho sự phát triển của bệnh (75) Nghiên cứu biện pháp phòng trừ, kết quả ở nhiều nước cho thấy luân canh lạc với những cây trồng khác đặc biệt đối với cây lúa là hiệu quả nhất (75) Luân canh với lúa trong suốt 3 năm hoặc trên 3 năm coi như miễn dịch và thậm chí không thấy bệnh héo xanh vi khuẩn phát sinh Các thử nghiệm dùng xạ khuẩn

đối kháng để phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn đã được áp dụng Hầu hết các

dòng của Streptomyces đã được nuôi cấy nhân tạo, nhưng không có hiệu quả

phòng trừ bệnh héo

1.2.2 Tình hình bệnh hại lạc ở Việt Nam

Những nghiên cứu về bệnh chết héo: Từ những năm 1960, người ta đã phát hiện thấy bệnh chết héo trên đồng ruộng, đặc biệt ở những cánh đồng lạc trồng tập trung và tiếp tục gia tăng ở những nơi mà lạc được trồng liên tiếp Mặc

dù vậy người nông dân vẫn chưa có biện pháp cụ thể để hạn chế sự gây hại của bệnh này Năm 1967-1968, kết quả điều tra ở một số tỉnh trồng lạc chủ yếu thuộc miền Bắc Việt Nam, ban điều tra cơ bản sâu bệnh hại cây trồng của Bộ Nông nghiệp đã công bố có 2 hiện tượng gây bệnh chết héo Nguyên nhân gây héo do

nấm Aspergillus niger và Fusarium solani Những đối tượng bệnh này được ghi

nhận ở các vùng trồng lạc của tỉnh Bắc Thái, Hà Bắc, Nghệ An và Vĩnh Phú (Viện bảo vệ thực vật- Uỷ Ban Nông nghiệp Trung ương, 1968) Cũng trong thời gian này Đặng Thái Thuận và CTV cũng tiến hành nghiên cứu bệnh chết héo hại

lạc Tác giả cho rằng nguyên nhân gây bệnh là do vi khuẩn Ralstonia

solanacearum Tác giả cho thấy bệnh phát sinh và gây hại ở hầu khắp các vùng

trồng lạc thuộc các tỉnh: Nghệ An, Hà Tĩnh đặc biệt ở những diện tích lạc dọc sông Lam, ở Thanh Chương, Hưng Nguyên cũng có bệnh chết héo lạc nhưng ở mức độ nhẹ hơn Những nơi khác bệnh phát sinh và gây hại không đáng kể Bệnh chết héo xuất hiện ở tất cả các loại đất, các loại ruộng, ruộng trên đồi, ruộng trên xoi, ngoài bãi, trong đồng, nơi nào có trồng lạc ít nhiều đều có bệnh

Ở mỗi địa phương diện tích bị hại cũng như mức độ thất thu có khác nhau Các

xã thuộc dọc sông Lam bị hại nhiều nhất (10-30%), những nơi khác bệnh tuy còn nhẹ nhưng đã trở thành một điều đáng chú ý Nghiên cứu ảnh hưởng của bệnh

chết ẻo đến cây lạc một số tác giả cho rằng cây bị bệnh làm ảnh hưởng đế sự phát triển của bộ rễ làm giảm số nốt sần trên rễ, số quả trên cây giảm rõ rệt

Từ những năm 1966-1967, kết quả điều tra bệnh chết ẻo ở Nam Đàn, Hưng Nguyên, Nghi Lộc, Diễn Châu, Yên Thành, Quỳnh Lưu, Thanh Chương,

Đô Lương trên các loại ruộng đất khác nhau Các tác giả có nhận xét như sau: ở đất có hàm lượng kali cao bệnh nhẹ hơn đất nghèo kali Kết quả thu được từ thí nghiệm phân bón cũng cho thấy rằng: Lân, Kali làm tăng sức chống bệnh (4,13) Các biện pháp như: xê dịch thời gian gieo trồng; điều chỉnh mật độ, không ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh Tác giả cũng cho rằng chưa có biện pháp nào khống chế có hiệu quả một khi đã phát sinh bệnh Biện pháp phòng trừ bệnh là biện pháp luân canh Thực tiễn của những vùng trồng lạc như: Thanh Chương, Nam Đàn, Hưng Nguyên cho thấy nơi nào được luân canh với cây mía một, hai

vụ sau đó trở lại trồng lạc thì hầu như không bị bệnh hoặc bị bệnh rất nhẹ

Năm 1977-1978, kết quả điều tra sâu bệnh hại lạc của Viện Bảo vệ thực vật ở một số tỉnh trồng lạc thuộc các tỉnh miền Nam Việt Nam cho thấy, bệnh

chết ẻo do nấm Rhizoctonia và Sclerotium rolfsii gây nên Tuỳ theo từng loại đất

và điều kiện canh tác mà mức độ gây hại của chúng có khác nhau (Viện Bảo vệ thực vật, 1977-1978)

Cuối những năm 1980 phòng Bệnh cây – Viện Bảo vệ thực vật đã tiến hành nghiên cứu bệnh hại lạc Kết quả cho thấy trên cây lạc bị héo do các tác

nhân sau: Nấm A niger, fusarium, Verticillium Rhizoctonia và vi khuẩn R

solanacearum Nhóm tác giả đã tiến hành xử lý hạt giống để phòng trừ nhóm

bệnh hại này Song kết quả thu được chỉ dừng lại ở thí nghiệm trong phòng và thí nghiệm ô nhỏ Ở Việt Nam đã có những kết quả điều tra và nghiên cứu bệnh gây héo trên lạc Song so với tài liệu nước ngoài thì thành phần bệnh vẫn nghèo

nàn Một số bệnh chết héo đã được phát hiện ở Miền Bắc Việt Nam Bệnh gây chết héo lạc chủ yếu do nấm gây nên, chỉ có một bệnh do vi khuẩn (bệnh héo

xanh) Hiện nay bệnh héo xanh (R.solanacearum) là bệnh phổ biến trên cây lạc

Bệnh thường phát sinh trên rễ, thân, tia, củ, vỏ củ và hạt lạc ở nhiều diện tích lạc, đặc biệt ở vùng đất cát ven sông Lam tỉ lệ bệnh héo xanh vi khuẩn lên tới 40-50% Cây bị bệnh gây hiện tượng héo đột ngột của thân và lá Cây lạc chết nhưng bộ lá vẫn giữ xanh song về sau bộ lá chuyển sang màu vàng Những cành riêng rẽ có thể héo và chết hoặc toàn bộ cây chết

Trong thời gian gần đây đã có phân hữu cơ vi sinh đa chức năng có khả năng hạn chế bệnh héo xanh trên lạc từ 15-20 %

Tuy nhiên do bản chất kháng bệnh và sự biến đổi đặc tính độc của các chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên toàn Thế giới, cho nên các biện pháp phòng trừ bệnh này càng trở nên phức tạp và khó khăn Đặc biệt sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học đã không mang lại hiệu quả như mong muốn

mà còn gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới môi trường Ngày nay, các biện pháp phòng chống thay thế bằng phòng trừ sinh học đang thu hút được sự quan tâm của nhiều phòng thí nghiệm trên Thế giới và trong nước, kết quả cho thấy nhiều hứa hẹn và đây cũng sẽ là biện pháp rất cần thiết để thay thế các loại

thuốc bảo vệ thực vật hoá học trong tương lai

1.3 Khái niệm về kiểm soát sinh học

Kiểm soát sinh vật học là sử dụng các sinh vật tự nhiên hoặc sinh vật biến đổi gen, gen hoặc các sản phẩm của gen, để làm giảm bớt sự ảnh hưởng của các sinh vật hại như mầm bệnh thực vật theo hướng có lợi cho các mùa vụ (69) Khái niệm về kiểm soát sinh học rất rộng và nó bao gồm cả sự biến đổi gen của cây chủ Tuy nhiên, tiêu điểm chính của kiểm soát sinh vật học sẽ là sử dụng các sinh

vật tự nhiên và sinh vật biến đổi gen như là những tác nhân kiểm soát bệnh thực vật Tác nhân sinh học được biết đến là những sinh vật đối kháng và những sinh vật đối kháng này sẽ sử dụng các cơ chế đối kháng tự nhiên để làm giảm khả năng sống sót hoặc sự hoạt động của các mầm bệnh thực vật Sự đối kháng nhằm mục đích làm tăng sự chống lại nhau của các sinh vật bao gồm sự kháng sinh, sự cạnh tranh và sự ký sinh Sinh vật đối kháng đã kiểm soát được bệnh thực vật bằng cách tiêu diệt những chất chứa nguồn bệnh, loại trừ mầm bệnh ra khỏi vật

chủ, ngăn cản hoặc chiếm chỗ của mầm bệnh sau khi mầm bệnh xuất hiện (29)

1.4 Tại sao kiểm soát sinh học lại phổ biến ?

Kiểm soát sinh học bệnh cây ngày càng nhận được những sự quan tâm lớn

của các nhà khoa học và nhất là của người dân Vì đây là biện pháp phòng trừ bệnh cây không gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của con người và môi trường như một số loại thuốc trừ sâu hóa học Ngoài ra kiểm soát sinh học còn có khả năng phòng trừ được nhiều loại bệnh khác nhau, trong đó có những bệnh mà hiện nay cây trồng không có khả năng kiểm soát hoặc chỉ kiểm soát được một phần vì cây trồng không có hoặc có rất ít gen kháng bệnh Thậm chí có những bệnh mà ngay cả thuốc hóa học, sự luân canh cây trồng cũng không kiểm soát được hoặc nếu kiểm soát được thì cũng không mang lại hiệu quả kinh tế Ví dụ như bệnh nốt sần, nếu sử dụng thuốc hóa học để phòng trừ thì sẽ không mang lại hiệu quả mà phải sử dụng biện pháp kiểm soát sinh học, cụ thể là sử dụng

Agrobacterium radiobacter K84 thì mới kiểm soát được (28) Ngoài ra, kiểm

soát sinh học đã được đăng ký nhãn hiệu với số lần tái phát bệnh ít và thời gian được phép sử dụng trước thu hoạch là ngắn hơn so với thuốc trừ sâu hóa học truyền thống Điều này đã đưa ra cho người nông dân những biện pháp canh tác

và quy trình kiểm soát sâu bệnh rất linh hoạt (60)

1.5 Những vấn đề trong kiểm soát sinh học

Mặc dù, có cả một Quỹ gen những vi sinh vật có khả năng bảo vệ cây trồng khỏi bệnh dưới điều kiện thực nghiệm, nhưng sự phát triển thương mại của nhiều chủng sinh vật đối kháng đã làm ảnh hưởng đến những lợi ích được tạo ra

do sự mâu thuẫn giữa vị trí cánh đồng với thời gian canh tác Sự thay đổi trong hoạt động của các tác nhân kiểm soát sinh học được quy cho nhiều yếu tố Trong

đó bao gồm: khả năng tương thích của cây chủ với các tác nhân kiểm soát sinh học được hình thành từ kiểu di truyền của cây chủ, phương pháp canh tác nông nghiệp, sinh vật đối kháng bị đột biến làm mất hoạt tính, sự đề kháng của mầm bệnh với các cơ chế kiểm soát sinh học, tính chất có thể bị tổn thương của tác nhân kiểm soát sinh học do các cơ chế chống đỡ của mầm bệnh, cuối cùng là tác động của môi trường đến sự sống sót và hoạt tính của tác nhân kiểm soát sinh học

Sinh vật đối kháng là những cơ thể sống nên dù được lây nhiễm trực tiếp trên cây chủ, trên đồng ruộng, hoặc trên môi trường giàu dinh dưỡng trong nhà kính thì chúng cũng không có được sự sinh trưởng, phát triển và hoạt lực đối kháng mạnh bằng nếu chúng được sinh ra và lớn lên ngoài tự nhiên Chỉ cần thay đổi một trong những điều kiện ngoại cảnh trong thời gian sinh trưởng có thể có những tác động sâu sắc đến khả năng kiểm soát một mầm bệnh thực vật của một tác nhân kiểm soát sinh học nào đó Nhưng ngược lại, khi thay đổi cùng những điều kiện giống như trên thì chỉ ảnh hưởng rất nhỏ đến khả năng kiểm soát bệnh của một loại thuốc trừ sâu hóa học Sự chuẩn bị và tích lũy chất giữ giống và nuôi cấy các sinh vật đối kháng đòi hỏi nhiều điều kiện tất yếu Những chất nuôi, giữ các tác nhân kiểm soát sinh học thường không thể tích lũy được ở những điều kiện nhiệt độ khắc nghiệt Ngoài ra, thời gian bảo quản của nhiều chất giữ

giống sinh vật đối kháng là không được dài như của thuốc trừ sâu hóa học; Bởi vậy, không thể bảo quản được một số lượng lớn các sinh vật đối kháng trước khi

sử dụng

1.6 Cơ chế đối kháng

Những sinh vật đối kháng được sử dụng để kiểm soát sinh học bệnh thực vật bao gồm vi khuẩn, nấm, giun tròn, động vật đơn bào và virút Với một số ngoại lệ, các sinh vật đối kháng thường không tác động lên một bệnh cụ thể, thay

vào đó chúng tác động lên một mầm bệnh thực vật ngẫu nhiên (29) Ví dụ, một

sinh vật đối kháng nào đó xâm chiếm, định cư ở một vùng rễ và nó có khả năng bảo hộ vùng rễ chống lại các mầm bệnh nhưng hiệu ứng chống lại bất cứ mầm bệnh đặc biệt nào cũng hoàn toàn là ngẫu nhiên Tuy nhiên, có những sinh vật đối kháng có mối quan hệ ký sinh thật sự với sinh vật chủ của chúng Các sinh vật đối kháng gây trở ngại cho các mầm bệnh thực vật theo cơ chế kháng sinh,

sự ký sinh, sự cạnh tranh Những cơ chế này không loại trừ lẫn nhau Một sinh vật đối kháng có thể sử dụng nhiều cơ chế khác nhau để tác động bất lợi tới một tác nhân gây bệnh thực vật hoặc có thể sử dụng một cơ chế để chống lại một kiểu tác nhân gây bệnh và một cơ chế khác chống lại một tác nhân gây bệnh khác Vi

dụ, sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để kiểm soát Botrytis gây bệnh trên cây Nho (Vitus) bằng sự cạnh tranh dinh dưỡng và ký sinh trên màng cứng Cả hai cơ

chế trên đều đóng góp vào sự ngăn chặn khả năng tiềm ẩn và phát sinh bệnh

(33)

1.6.1 Cơ chế kháng sinh

Cơ chế kháng sinh là sự kìm hãm hay phá hủy một sinh vật bởi một chất chuyển hóa được sản xuất ra bởi một sinh vật khác Sinh vật đối kháng có thể sản xuất ra những hợp chất kìm hãm sinh trưởng mạnh có tác dụng chống lại một

mảng lớn những vi sinh vật Những hợp chất như vậy được nhắc đến như là một loại thuốc kháng sinh có phạm vi tác động rộng Mặt khác, một số chất chuyển

hóa như bacteriocins chỉ có hiệu quả chống lại một nhóm vi sinh vật cụ thể nào

đó Từ vi khuẩn đối kháng Agrobacterium radiobacter K84 người ta có thể sản xuất ra agrocin 84 và thuốc kháng sinh agrocin 84 chỉ có tác dụng chống lại những vi khuẩn có quan hệ gần gũi với A radiobacter, như vi khuẩn A

tumefaciens gây bệnh sưng rễ Những vi sinh vật sinh kháng sinh có một lợi thế

cạnh tranh trong việc chiếm lĩnh một nơi ở riêng biệt và nguồn thức ăn bởi vì chất kháng sinh của chúng đã ngăn chặn sự sinh trưởng và phát triển của những

vi sinh vật khác

Cơ chế kháng sinh có thể là một cơ chế có hiệu quả để bảo vệ cho hạt

giống nảy mầm Ví dụ như vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens Q2–87

có thể bảo vệ vùng rễ của lúa mì chống lại mọi tác nhân gây bệnh,

Gaeumannomyces graminis var tritici, khi được phủ lên trên hạt giống Cũng ở

những hạt nảy mầm, vi khuẩn nhân lên trong vùng rễ và chúng sử dụng những chất được tiết ra từ rễ làm nguồn thức ăn Vùng rễ là lớp đất mỏng dính chặt vào gốc, sau khi loại bỏ phần đất rời ra khỏi vùng rễ bằng cách lắc mạnh sẽ làm ảnh hưởng trực tiếp đến những chất được tiết ra từ rễ và hòa tan vào đất Chất kháng

sinh 2,4-diacetylphloroglucinol được tạo ra bởi P fluorescens Q2–87 có tác

dụng chống lại bệnh “take-all” trong thời gian được tính bằng phút và có thể phân lập được nó từ vùng rễ cây lúa mì (24) Tuy nhiên, hiệu lực của những chất kháng sinh này ở trong đất có thể bị biến đổi như là chúng có thể trở thành một phần tử của đất sét Chúng được chọn lọc qua sự hoạt động của vi sinh vật, hoặc được tách từ đất ở vùng rễ bằng các phương pháp lọc khác nhau

Có rất nhiều loại thuốc kháng sinh được sản sinh ra bởi các sinh vật đối

kháng nhưng không nhằm ức chế đến một mầm bệnh cụ thể nào Không một sinh vật đối kháng nào có thể sản xuất ra được những thuốc kháng sinh tương tự nhau dưới những điều kiện môi trường khác nhau Một số vi sinh vật đối kháng

có thể sản xuất ra những hợp chất sinh học có tác dụng chống lại được nhiều

mầm bệnh thực vật khác nhau Ví dụ từ chủng vi khuẩn đối kháng P fluorescens

Pf-5 người ta có thể sản xuất ra nhiều loại hợp chất chất kháng sinh k hác

nhau, bao gồm pyoluteorin, pyrrolnitrin 2,4 diacetylphloroglucinol và

Pyoluteorin ức chế được Pythium ultimum, một nguồn bệnh phổ biến ở trên cây

bông non (Gossypium hirsutum) Tuy nhiên, nó cũng có những tác động nhất định nào đó lên những mầm bệnh khác ở trên cây bông non, như là Rhizoctonia

solani, Thielaviopsis basicola vàVerticillium dahliae (49) Pyrrolnitrin ngăn

chặn R solani, T basicola và V dahliae, nhưng không có tác dụng chống lại

P.ultimum (48) Một số loài vi khuẩn đối kháng có khả năng sản sinh ra chất

kháng sinh bao gồm: Bacillus, Pseudomonas và Streptomyces Một số loài nấm đối kháng có khả năng sản sinh ra chất kháng sinh gồm Gliocladium và

Trichoderma…

1.6.2 Những hợp chất dễ bay hơi và enzyme

Có một số hợp chất dễ bay hơi đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm

soát bệnh thực vật, bao gồm Amoniac (sản phẩm của vi khuẩn đối kháng

Enterobacter cloacae có tác dụng chống lại các mầm bệnh thực vật như P ultimum, R solani, và V dahliae), Ankyl mạch vòng (sản phẩm của T harzianum có tác dụng chống lại R solani) và Hydro xyanua (sản phẩm của P fluorescens để chống lại T basicola gây bệnh thối rễ) Mặc dù, cơ chế kiểm soát

sinh học của sự ký sinh liên quan đến nhiều loại Enzyme, những loại enzyme đó

lại chỉ liên quan đến sự kháng sinh Ví dụ, nấm đối kháng Talaromyces flavus

Tf1 ngăn chặn bệnh héo xanh của cây Cà (Solanum melongena) Talaromyces

flavus được sản xuất bởi enzyme glucose oxidase; hydrogen peroxide là một sản

phẩm được tạo ra do sự hoạt động của glucose oxidase và hydrogen peroxide tấn công vào kết cấu sợi của Verticillium ở trong đất (38) Nếu chỉ có một

enzyme thì không thể phá hủy được kết cấu sợi nấm

1.6.3 Sự cạnh tranh

Sự cạnh tranh là kết quả của hai hay nhiều sinh vật cố gắng sử dụng nguồn thức ăn (carbon và nitrogen) hoặc nguồn khoáng giống nhau, chiếm lĩnh nơi sinh sống và nơi xâm nhiễm giống nhau Những sinh vật ức chế được những sinh vật khác thì chúng sẽ sinh trưởng phát triển nhanh, sinh sản mạnh, hoặc

chúng có khả năng giành được chất dinh dưỡng từ nguồn thức ăn Pseudomonas

fluorescens sinh ra siderophore, pseudobactin Những chất này có khả năng lấy

đi những chất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của các sinh vật gây

bệnh, ví dụ như Fusarium oxysporum sẽ lấy đi chất sắt Siderophore là những

hợp chất ngoại bào, có phân tử lượng thấp, có nguồn gốc từ vi khuẩn, có sức hút

các chất sắt mạnh Hậu bào tử của F oxysporum đòi hỏi phải có nguồn sắt ngoại sinh để nảy mầm Mặc dù, F oxysporum cũng sản sinh ra Siderophore, nhưng

Siderophore của P fluorescens liên kết với sắt tốt hơn Nên P fluorescens có thể

sinh trưởng, phát triển tốt ở điều kiện môi trường đất có hàm lượng sắt thấp, còn

hậu bào tử của F oxysporum sẽ rơi vào trạng thái nghỉ và không thể nảy mầm

Kiểm soát sinh học bệnh thối rễ những cây họ Cà và những cây lá Kim là giống nhau, ví dụ như sử dụng sự cạnh tranh trong kiểm soát bệnh thực vật

Bệnh thối rễ những cây họ Cà là do nấm Heterobasidion annosum, nấm này có

thể sống được nhiều năm trong gốc và thân những cây đã bị chặt, nó là nguyên nhân gây hại lớn trong việc quản lý và trồng rừng Qua sự kiểm soát bệnh thối rễ

ở những cây họ cà, người ta áp dụng để kiểm soát nấm H annosum gây bệnh trên những cây lá Kim bằng cách tẩm các chủng nấm đối kháng Phlebia gigantea vào những gốc cây mới bị chặt Hệ sợi của Phlebia gigantea sẽ ngăn chặn H

annosum theo bản năng tự nhiên từ gốc cây đó, nó sẽ sử dụng như là nguồn thức

ăn cơ bản thay cho việc tấn công vào các cây Thông non (pinus) (29)

1.6.4 Sự ký sinh

Sự ký sinh là sự nuôi lớn một sinh vật này trên một sinh vật khác Nó cũng

là một cơ chế của kiểm soát sinh học, sự ký sinh có thể được sử dụng hoàn toàn trong việc làm giảm bớt chất hình thành vách nấm hoặc ngăn chặn bệnh thối rễ, nhưng có thể có hiệu lực kém trong việc bảo vệ sự nảy mầm của hạt bởi vì sẽ hình thành một mối quan hệ ký sinh giữa sinh vật đối kháng và sinh vật gây bệnh

và có thể thời gian cần cho sự hình thành mối quan hệ này sẽ nhiều hơn thời gian hạt cần để không bị nhiễm bệnh Nấm sống ký sinh trên nấm khác được gọi là ký

sinh nấm Sự ký sinh bởi nấm đối kháng Trichoderma thường bắt đầu bằng sự nhận ra nấm chủ (cây chủ) từ khoảng cách xa Sợi nấm của Trichoderma sẽ phát

triển hướng về một chất kích thích có sẵn của mầm bệnh Sự nhận ra tiếp theo là

những vật chất hoặc hóa chất trong tự nhiên và sự gắn sợi của Trichoderma vào nấm chủ Sợi của Trichoderma sẽ cuộn xung quanh sợi của nấm bệnh

Trichoderma sẽ sản sinh ra các enzyme sinh tan (lytic enzymes) làm tan thành tế

bào nấm Trong một vài trường hợp, enzyme phá hủy thành tế bào và thuốc kháng sinh có những tác động hỗ trợ nhau trong quá trình kiểm soát sinh học

(27, 30) Một số ký sinh nấm đã được biết đến là: T hamatum, T harzianum, T

koningii, T virens, T viride, Pythium nunn và P oligandrum

1.6.5 Sự giảm độc tính

Kiểm soát sinh học bằng sự giảm hoạt tính thường xảy ra khi một chủng

nấm bệnh có độc tính yếu liên kết với một chủng nấm bệnh có độc tính mạnh và truyền các điều kiện làm giảm độc tính từ chủng có độc tính yếu sang chủng có độc tính mạnh Hiện tượng truyền các độc tính yếu từ loài này sang loài khác có được là do sự làm nhiễm độc của nguồn bệnh cùng với một hoặc nhiều dsRNA (ARN sợ kép) có nguồn gốc từ virút Ví dụ điển hình của sự giảm hoạt tính là sự

kiểm soát sinh học bệnh tàn lụi cây hạt Dẻ (Castanea) gây ra bởi nấm

Cryphonectria parasitica bằng các chủng nấm có độc tính yếu Ở châu Âu,

nó đã nhận được nhiều sự quan tâm trong việc phòng và chữa bệnh loét

cây hạt Dẻ Những chủng không điển hình của C parasitica được phân lập

từ những vết bệnh đang lành lại của cây Chúng giảm bớt sự hình thành sắc tố và

sự hình thành bào tử Những chủng không điển hình này có độc tố thấp hơn những chủng được phân lập từ những vết bệnh chưa lành Ngoài ra, khi sợi của những chủng có độc tính cao chấp nhận liên kết với sợi của chủng không điển hình được phân lập từ những vết bệnh đang lành thì chủng có độc tính cao sẽ bị giảm độc tính Về cơ bản, những chủng có độc tính thấp đã cải tạo những chủng

có độc tính cao thành những chủng có độc tính thấp bằng cách chuyển dsRNA

qua các sợi nấm đã được nối với nhau (45)

ISR là một cơ chế kiểm soát gián tiếp các tác nhân gây hại thực vật Theo

đó, hệ thống bảo vệ thực vật được kích thích và cây trồng sẽ được bảo vệ có hệ thống Mức độ phản ứng của cây chủ trước các tác nhân gây kích thích được

điều chỉnh bằng mức độ hiện axit jasmonic và ethylene (74) Do các tác nhân gây kích kháng thường tạo ra nhiều loại hoạt chất khác nhau như: kháng sinh, siderophores, enzyme trình tan, hay khả năng gây cảm ứng của hệ thống để ngăn chặn bệnh có thể bao gồm nhiều hơn một cơ chế PGPR có thể làm trung gian kiểm soát dịch bệnh sinh học, thúc đẩy tăng trưởng thực vật hoặc cả hai Một số chủng hoặc tổ hợp của các chủng có sẵn như sản phẩm thương mại để bảo vệ cây trồng (59)

1.7.Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng trong và ngoài nước

1.7.1 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng ở ngoài nước

Vi sinh vật đối kháng với một số bệnh cây trồng đã được các nhà khoa học trên Thế giới nghiên cứu và ứng dụng từ những năm đầu của thế kỷ XX (5, 6, 9,

28, 36, 71, 72, 75, 76)

- Năm 1924, Porter đã xử lý hạt lúa mì với những thể vi khuẩn đối kháng,

rồi nhiễm với nấm Helminthosporium Kết quả những hạt đã nảy mầm bình

thường hoặc không bị nhiễm bệnh, hoặc bị nhiễm rất nhẹ

- Năm 1939, Cholonyi quan sát thấy độc tính của dịch chiết khoai tây có khả năng giết chết vi khuẩn và tính độc của dịch chiết tăng khi củ đã nẩy mầm

- Năm 1940, 1948, Weindling đã sử dụng nấm Trichoderma lignorum để bảo vệ những cây cam con khỏi bệnh do Rhizoctonia gây ra Theo nhiều tác giả

loài nấm này cũng bảo vệ cả dưa chuột và quả lê

- Năm 1952, Gregory nuôi cấy Bacillus sp B-6, Actinomycetes No 67, nấm

Pecillium patulum và quan sát sự hình thành những chất kháng khuẩn trong đất

- Năm 1953, Petrusheva sử dụng dịch nuôi cấy của Actinomycetes như là một chất đối kháng với bệnh thối hạt thuốc lá gây nên bởi nấm Thielaviopsis

basicola Khi đất được xử lý với dịch vi khuẩn đối kháng thì cây phát triển bình

thường, khi không có dịch đối kháng trong đất thì tỉ lệ cây chết là 70%

- Năm 1953, Gurinovich đã sử dụng dịch nuôi cấy của Actinomycetes và

những thể đối kháng vi khuẩn để chống lại bệnh thối của bắp cải, gây nên bởi vi

khuẩn không hình thành bào tử Pseudomonas campestris khi những thể đối

kháng được đưa vào đất thì cây vẫn phát triển bình thường

- Năm 1955, Kuzina sử dụng vi khuẩn đối kháng bệnh héo của bông gây

nên bởi Verticillum Tác giả đã xử lý hạt bông với vi khuẩn trước khi gieo Kết

quả tỉ lệ cây chết ở phần đối chứng là 54%, sau khi được xử lý với vi khuẩn đối kháng tỉ lệ này là 8% - 9%

- Năm 1978, Cuppels và cs đã kết luận rằng, nhiều chủng vi khuẩn có khả

năng sản sinh bacteriocin và một số chủng sinh bacteriocin không độc có khả

năng giảm bệnh héo xanh của cà chua

- Năm 1986, Aspiras R.B và Cruz A R cho rằng Bacillus polymyxa và P

fluorescens có khả năng giảm bệnh héo xanh cà chua ở điều kiện nhà kính

- Năm 1990, Tanaka và cs đã phát hiện được các thực khuẩn thể không độc

có vai trò tiềm tàng trong phòng trừ sinh học đối với R solanacearum

- Năm 1993, Hsu đã cho rằng cải tạo đất bằng một hỗn hợp theo công thức ammonium sulphat, bột xương, bột hải ly, cua, glixerin, sỉ silic và valin đã làm

tăng tần xuất tạo khuẩn lạc của các chủng P fluorescens ở đầu rễ, chính vì vậy

đã làm tăng khả năng phòng chống bệnh héo xanh cho cây trồng ở các thực nghiệm trong chậu

- Năm 1993, Elphinstone và Aley đã chỉ ra một loài khác là P cepacia được

phân lập từ rễ ngô có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh héo xanh trong phòng thí nghiệm và trong chậu

- Jaime R Montealegre đã sử dụng chủng vi khuẩn đối kháng trong kiểm

soát bệnh do Rhizoctonia solani gây ở cà chua

- Karden Mulya đã công bố kết quả việc sử dụng phương pháp nhúng rễ cây

cà chua non trong dung dịch nuôi cấy P fluorescens PfG32 trước khi trồng, P

fluorescens PfG32 được phân lập từ vùng rễ cây hành

- A Muslim đã công bố khả năng kiểm soát bệnh do nấm Fusarium

oxysporum f spp spinaciae (FOS) của 4 chủng Rhizoctonia (G1, L2, W1 và

W7) đạt 77% - 97%

- Nobutaka đã công bố chủng Serratia marcescens B2 được phân lập từ vùng

rễ cây cà chua, có khả năng ức chế sự phát triển của một vài loại nấm gây bệnh

và mốc xám ở cây hoa anh thảo gây nên bởi Botrytis cinerea và Fusarium

oxysporum f.spp cyclaminis S marcescens B2 có tạo ra enzym phân giải như

mì, thuốc lá, vải, trà, rau và cỏ

- Ciampi-Panno đã tách được chủng P fluorescens BC8 có thể ức chế mạnh

vi khuẩn gây bệnh héo xanh ở khoai tây, đặc biệt khi hạt được bao bọc một lớp

vỏ vi khuẩn P fluorescens BC8 Dường như vi khuẩn này có thể xâm nhập được

vào cây chủ qua hệ thống rễ, song hiệu quả kháng bệnh chưa cao, thực tế sự nhiễm bệnh ở củ vẫn xảy ra

- Hiện nay, nhiều loại chế phẩm phòng trừ sinh học có nguồn gốc sinh học khác nhau đã được lưu hành trên Thế giới như: Xentari 35 WDG là sản phẩm

của hãng Abbott, thành phần chính gồm Bacillus thuringensis var aizawai 3500

BIU/mg Delfin WG 32 BIU là sản phẩm của hãng Sandoz Agro, Thụy Sĩ, thành

phần chính gồm Bacillus thuringensis var kurstaki 32 BIU/kg

- MVP 10 FS là sản phẩm của Mỹ MVP 10 FS được đặc chế bằng công

nghệ biến nạp gen cao cấp của Mỹ, chứa độc tố Bacillus thuringensis var kurstaki, được bảo quản bằng màng tế bào cứng của vi khuẩn Pseudomonas

fluorescens, thành phần gồm độc tố delta-endotoxin của Bacillus thuringensis

var kurstaki, nước và các phụ gia VBt là sản phẩm của Viện Công nghệ Sinh học Hải Nam- Trung Quốc Aztron 7000DBMU là sản phẩm của hãng Abbott,

Mỹ Tập kỳ 1.8EC là sản phẩm của xạ khuẩn Streptomyces avermitilis v v

- Một số tác giả đã phát hiện được một số chủng vi sinh vật có khả năng

đối kháng với R solanacearum như: Pseudomonas fluorescens; Pseudomonas

glumae; Pseudomonas cepacia; Bacillus sp.; Erwinia sp và các thể đột biến của

R solanacearum không độc

Theo nhà nghiên cứu bệnh học thực vật David Schisler thuộc sở Nông nghiệp Hoa Kỳ (ARS), vi khuẩn phát sinh tự nhiên có thể cạnh tranh với vi nấm

F graminearum về chất dinh dưỡng tiết ra từ các bao phấn của cây lúa mì

Trong các cuộc thử nghiệm, các công thức phun xịt vi khuẩn có lợi trên các miếng đất trồng hai loại cây lúa thương mại đã làm giảm đi tính khắc nghiệt của bệnh vảy nấm được 63% Kết quả là các dòng trao đổi chất choline (CM) có thể tham gia vào các vi khuẩn đối kháng chống bệnh vảy nấm khác mà nhóm của Schisler đã nghiên cứu được, trong đó có men và vi khuẩn tiết chất kháng sinh Schisler hình dung sẽ kết hợp các vi khuẩn đối kháng này lại trong một công

thức trừ sâu sinh học để các nông dân có thể xịt lên lúa mì, bổ sung vào phương pháp bảo đảm chống lại bệnh vảy nấm

Tóm lại, vi sinh vật đối kháng đã được nhiều nhà khoa học trên Thế giới nghiên cứu và đã đưa vào sản xuất nhiều loại chế phẩm Tuy nhiên, hiệu quả trong lĩnh vực phòng chống bệnh héo xanh cây trồng nói chung, lạc và vừng nói riêng còn nhiều hạn chế, vì phải phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: kỹ thuật thâm canh, tiểu vùng khí hậu, giống cây trồng, nhiệt độ, thời vụ canh tác và chính bản thân của chế phẩm .v v

1.7.2 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng trong nước

Xuất phát từ thực tế về bệnh héo xanh cây trồng ở Việt Nam, các biện pháp phòng trừ sinh học bệnh này đã và đang được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học cũng như nhiều phòng thí nghiệm ở nước ta trong nhiều thập kỷ qua

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nghiên cứu khả năng sinh kháng

sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh của Streptomyces arabicuss 112 và chế phẩm sinh học Fluorecent từ Pseudomonas fluorescens Sản phẩm có khả năng

phòng trừ bệnh thối thân, thối rễ và vàng lá ở một số loài cây nhất định

Trường Đại học Sư phạm I - Hà Nội đã nghiên cứu chủng xạ khuẩn

Streptomyces V6 có khả năng sinh kháng sinh chống nấm và vi khuẩn R solanacearum [1]

Viện Công nghệ Sinh học cũng đã sản xuất các chế phẩm Bt và một số chế phẩm sinh học khác có nguồn gốc từ vi khuẩn, xạ khuẩn và vi nấm v v… Các chế phẩm này đã có tác dụng trong phòng chống một số sâu và bệnh hại cây trồng

Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam (cũ) đã nghiên cứu tạo chế phẩm phân bón vi sinh trên cơ sở một tập hợp đa chủng vi sinh vật, trong đó

có vi khuẩn đối kháng, sản phẩm được sử dụng trong trồng trọt vừa có tác dụng kích thích sinh trưởng của cây, vừa có khả năng ức chế một số bệnh thực vật gây

ra bởi vi khuẩn hoặc nấm [14]

Viện Bảo vệ thực vật cũng đã sử dụng một số chế phẩm sinh học có nguồn

gốc từ nấm Metarhizium ansopliae có độc tính cao đối với bọ dừa, Bt (Bacillus

thuringensis) và NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) có tác dụng trong phòng trừ

một số sâu hại rau Nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm gây bệnh

cây trồng

Bacterin BT là chế phẩm của Liên hiệp Khoa học sản xuất hoá chất, Tổng công ty Hoá chất công nghiệp và tiêu dùng, Bộ Công nghiệp nặng, thành phần

chính gồm Bacillus thuringensis var kurstaki

Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt

đới đã cho thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng

ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và Đông Nam Bộ Các nghiên cứu cho thấy nấm

Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên

cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác

như Sclerotium rolfsii, F.oxysporum, Rhizoctonia solani

Bộ môn Vi sinh vật – Viện Thổ nhưỡng Nông hoá và phòng Di truyền và Công nghệ Vi sinh - Viện Di truyền Nông nghiệp đã phân lập được một số chủng

vi khuẩn đối kháng có khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của R

solanacearum (5, 6)

CHƯƠNG II.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

Mẫu đất, cây được thu từ đất trồng lạc, và các cây lạc, cỏ, ớt, hành và cà

chua khỏe để phân lập vi sinh vật đối kháng

2.1.2 Các môi trường phân lập vi khuẩn

+ Môi trường TTC: Để nghiên cứu hình thái khuẩn lạc R solanacearum

(54): pepton 10g; cazein hydrolyzat 1g; glucoza 5 g; thạch 20 g; nước cất 1 lần 1000ml; pH = 7,0 Khử trùng ở 0,5 at, 1210C, 20 phút, làm lạnh đến 600

C và thêm 5 ml 2-3-5 Triphenyl Tetrazolium Chloride 1 %

+ Môi trường King B (KB): Để phân lập và thu sinh khối vi khuẩn đối kháng: Yeast extract 5 g; pepton 20 g; glyxerin 5 ml; K2HPO4 (12,5 %) 12 ml; MgS04.7H20 (6,25 %) 25 ml; nước cất 1000 ml; pH = 7,0

+ Môi trường LB: Để nuôi cấy vi khuẩn đối kháng (Luria Broth: Difco Bacto): tryptone 10 g; yeast extract 5 g; NaCl 5 g; nước cất 1000 ml; pH = 7,0

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu

01 Tủ cấy vi sinh vật (AVC4-D1) ESCO-Singarpore 2008

03 Tủ ấm lắc ổn nhiệt (JSSI 200CL) JS Research-Hàn Quốc 2009

04 Tủ ấm lắc nước ổn nhiệt (JSSI 30T) JS Research-Hàn Quốc 2009

06 Máy quang phổ tử ngoại khả biến

07 Máy chu trình nhiệt (MultiGene II) Labnet- Mỹ,2009

08 Tủ Thao tác PCR (PCR - 4A1) ESCO – Singapore, 2009

09 Bộ giữ lạnh để bàn (IC25) Torrey - Mỹ, 2009

10 Máy ly tâm thường (380R) Hettich Zentrifugen – Đức, 2008

11 Máy li tâm lạnh (Prism R) Labnet- Mỹ, 2008

12 Máy phá vỡ màng tế bào kèm lắc

15 Máy cô ADN (UNIVAPO 100 ECH) Uniequip- Đức, 2007

16 Nồi khử trùng(JSAC-100) JS Research-Hàn Quốc 2009

17 Máy lắc rung (Vortex) (MS 3

18 Máy lắc ống nghiệm (Wizard) Velp – Italy, 2009

22 Tên gọi máy: Máy đo pH (pH 211) Hanna Instrument-Italy, 2008