XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG DIACETYL TRONG CÁC LOẠI BIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ

Bia là loại nước uống đặc biệt có độ cồn thấp, hương thơm, bọt mịn và được rất nhiều người ưa chuộng. Trong quá trình lên mem bia, ngoài các sản phẩm chủ yếu là cồn và CO2 còn tạo rất nhiều sản phẩm phụ khác như rượu bậc cao, este, andehit, glyxerin... trong đó có diacetyl. Diacetyl là chất độc gây kìm hãm sự trao đổi chất, có ảnh hưởng đến sự sinh sản, độ lắng, độ đục… làm cho men tạo ra mùi vị lạ, khó chịu, gây đau đầu và ảnh hưởng đến hệ thần kinh của người tiêu dùng. Phương pháp GCMS kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) và tạo dẫn xuất với 1,2diaminobenzen có giới hạn phát hiện thấp cỡ nồng độ ppb và có độ chính xác cao. Do đó, chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng diacetyl trong các loại bia bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ”

Niên khoá: 2010 - 2012

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG DIACETYL TRONG CÁC LOẠI BIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC

KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ

Chuyên ngành: HÓA HỌC PHÂN TÍCH

Người hướng dẫn khoa học

TS ĐẶNG VĂN KHÁNH

Học viên thực hiện

HỒ THANH TUẤN

1

 Bia là loại nước uống đặc biệt có độ cồn thấp, hương

thơm, bọt mịn và được rất nhiều người ưa chuộng Trong quá trình lên mem bia, ngoài các sản phẩm chủ yếu là cồn và

CO2 còn tạo rất nhiều sản phẩm phụ khác như rượu bậc cao, este, andehit, glyxerin trong đó có diacetyl.

 Diacetyl là chất độc gây kìm hãm sự trao đổi chất, có ảnh

hưởng đến sự sinh sản, độ lắng, độ đục… làm cho men tạo ra mùi vị lạ, khó chịu, gây đau đầu và ảnh hưởng đến hệ thần

kinh của người tiêu dùng.

 Phương pháp GC/MS kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn

(SPE) và tạo dẫn xuất với 1,2-diaminobenzen có giới hạn phát hiện thấp cỡ nồng độ ppb và có độ chính xác cao Do đó,

chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng diacetyl trong các loại bia bằng phương pháp sắc ký khí

ghép khối phổ”

2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN LÝ THUYẾT

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3

1.1 TỔNG QUAN VỀ DIACETYL

Giới thiệu tính chất hóa lý của diacetyl và độc tính của nó

Sự hình thành diacetyl trong quá trình lên men bia

1.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ

Trình bày nguyên lý về GC/MS, một số bộ phận quan trọng

trong máy GC/MS Giới thiệu về khối phổ, cơ chế phân mảnh

1.3 KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN (SPE)

Tổng quan về phương pháp chiết pha rắn SPE, cơ chế hấp phụ

và kỹ thuật tiến hành

4

2.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

(1) Lựa chọn các điều kiện tiến hành sắc ký khối phổ: cột

tách, tốc độ khí mang, nhiệt độ interface, chương trình nhiệt độ

lò, kiểu bơm mẫu.

(2) Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích qua các đại lượng như độ lặp lại, độ đúng, độ thu hồi, giới hạn phát hiện

5

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu

Lấy mẫu ngẫu nhiên ở quầy, nhà hàng, các đại lý… mẫu

được đựng trong chai hoặc lon kín có ngày sản xuất và được

bảo quản nơi thoáng mát

2.2.2 Quy trình xử lý mẫu

Lấy khoảng 10-50 mL mẫu thử cho vào cốc có mỏ có dung tích 125 mL, thêm khoảng 1-5 mL dung dịch 2,3-hexandion và 1-2 mL dung dịch 1,2-diaminobenzen, đun cách thủy 300C

trong khoảng 15 phút, cho qua cột SPE đã được hoạt hóa, sau

đó rửa giải bằng dung môi diclometan Dung dịch sau khi qua cột, được làm làm khô bằng khí N2 tới cạn Hòa tan cắn với

dung môi etylaxetat, lọc qua màng lọc 0,45 µL và tiêm vào

máy GC/MS.

6

2.2.3 Nghiên cứu quy trình phân tích

2.2.4 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích

* Xây dựng đường chuẩn

3.1 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ

in (phút)

Thời gian lưu của pic 2-metyl-

propylquinoxali

3-n-n (phút)

Hệ số tách

1 InertCap 5

8

Hình 3.1 Sắc đồ phân tích hỗn hợp trên cột InertCap 5MS/Sil

Hình 3.2 Sắc đồ phân tích hỗn hợp trên cột DB-5MS

9

3.1.2 Khảo sát tốc độ dòng khí mang

Sau khi lựa chọn cột DB-5MS để tiến hành phân tích và giữ nguyên ĐKTN như hình 3.2 Chúng tôi tiến hành tiêm hỗn hợp chuẩn đã được tạo dẫn xuất 2,3-dimetylquinoxalin và 2-metyl-3- n-propylquinoxalin vào máy sắc ký khí ghép khối phổ với tốc độ khí mang lần lượt là 1,2; 1,5; 1,7 mL/phút Kết quả phân tích

2,3-(phút)

Thời gian lưu của pic

propylquinoxalin

2-metyl-3-n-(phút)

Hệ số tách

10

Hình 3.3 Sắc đồ khảo

sát ở tốc độ dòng 1,7 ml/phút

Hình 3.4 Sắc đồ khảo

sát ở tốc độ dòng 1,5 ml/phút

Hình 3.5 Sắc đồ khảo

sát ở tốc độ dòng 1,2 ml/phút

11

3.1.3 Lựa chọn các điều kiện tiến hành sắc ký để phân tích dẫn xuất của

diaxetyl trong bia

Bảng 3.4 Chương trình nhiệt độ phân tích hỗn hợp 1,2-dimethylquinoxaline và

2-methyl-3-n- propylquinoxaline trên hệ thống GC/MS

Chương

trình

Nhiệt độ

MS interface

( 0 C)

Nhiệt độ buồng tiêm mẩu

( 0 C)

Chương trình nhiệt độ lò Tốc độ

tăng nhiệt

độ ( 0 C/phút)

Nhiệt độ đạt tới

Thời gian giữ (phút)

Tổng thời gian (phút)

Bảng 3.5 Điều kiện sắc kí khí ghép khối phổ xác định diacetyl trong bia

Cột tách DB-5 MS: dài 30m, đường kính 0,25mm, pha tĩnh chứa (5%-phenyl)-metyl polysiloxan với bề dày

điện tử EI với năng lượng 70 eV

Chế độ Full Scan, dải quét 50 ÷ 500 amu

Chương trình nhiệt độ Nhiệt độ đầu 40

0 C (giữ đẳng nhiệt trong 1 phút); tăng 10 0 C phút đến 200 0 C; tăng 20 0 C phút đến

250 0 C (giữ đẳng nhiệt trong 5 phút)

13

Hình 3.8 (a) các mảnh phổ của hợp chất 2,3-dimetylquinoxalin

(b)các mảnh phổ của hợp chất 2-metyl-3-n-propylquinoxalin

Hình 3.7 Phổ Scan

1,2-dimetylquinoxalin

và 3nPropylquinoxaline

2-methyl-14

3.2 KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH DIACETYL VÀ

TẠO DẪN XUẤT SỬ DỤNG CỘT CHIẾT PHA RẮN (SPE)

3.2.1 Quá trình tách chiết

- Hoạt hóa cột chiết : Cột chiết C18 có dung tích 3 mL, chứa

200mg pha rắn C18 đựơc hoạt hóa với 3 mL metanol/nước với tỉ

lệ 9/1 (V/v) tiếp sau là 3 mL nước cất.

- Nạp mẩu vào cột : Mẩu được nạp vào cột với tốc độ được

điều chỉnh bằng áp suất của bơm hút chân không đảm bảo tốc độ dòng khoảng 1mL/phút.

15

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát thể tích dung môi diclometan rửa giải qua cột C18

Lượng diacetyl thu hồi

(µg/L )(n = 3)

Lần 1 151,5 181.2 190.5 184.4 Lần 2 162.2 195.6 191.4 180.2 Lần 3 148,4 182.5 189.5 200.5

Tỷ lệ diện tích pic ± SD) STT

Nồng

độ nghiên cứu

Tỷ lệ diện tích pic ± SD) 1

20 µg/L

0,37

0,37 ± 0,01 RSD% = 1,71

13

100 µg/L

0,69

0,69 ± 0,01 RSD% = 1,09

19

200 µg/L

1,07

1,06 ± 0,01 RSD% = 1,39

3.3.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Thêm dung dịch diacetyl chuẩn 16,5 µg/L; 32,0 µg/L; 64,0 µg/L vào mẩu trắng

Xử lý mẩu và tiến hành chạy sắc ký Tính trung bình của tỷ số chiều cao ứng với pic của hợp chất 2,3-dimetylquinoxalin so với chiều cao nhiễu đường nền của 3 lần làm song song tại mỗi nồng độ khảo sát Tại nồng độ có tỷ số S/N khoảng bằng 10 với RSD khoảng 20%, độ đúng nằm trong khoảng 80- 110% là LOQ của phương pháp và tỷ số S/N bằng 3 là LOD của phương pháp.

Tiến hành thí nghiệm lặp lại 3 lần ở nồng độ 16,5 µg/L, từ kết quả thu được ở hình 3.10 và phụ lục 2 Chúng tôi xác định được LOD và LOQ của phương pháp là:

LOQ = 16,5 µg/L và LOD = 5,0 µg/L

PHỤ LỤC 2 Bảng số liệu phân tích giá trị S/N tại nồng độ 5 ppb

18

3.3.3 Khoảng nồng độ tuyến tính

Kết quả được trình bày ở bảng 3.8 và hình 3.11

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của diacetyl trong bia

STT Nồng độ diacetyl (µg/L) (2,3-dimetylquinoxalin/2-metyl-3-n- Tỷ lệ diện tích pic

propylquinoxalin) Phương trình hồi quy

2,3-dimetylquinoxalin/2-metyl-3-n-19

3.4 XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÂN TÍCH

Từ các kết quả khảo sát đã nghiên cứu, chúng tôi xây dựng quy trình phân tích để định lượng diacetyl trong bia bằng phương pháp GC/MS như hình

3.12

20 mL mẫu bia 1 mL dung dịch 2,3-hexandion 1ppm

Tạo dẫn xuất với 1,2-diaminobenzen

SPE Cắn

1 mL dung dịch GC/MS

- Dải quét: 50÷500 amu

3.5 ÁP DỤNG THỰC TẾ

3.5.1 Kiểm soát chất lượng qui trình

3.5.1.1 Độ lặp lại và độ thu hồi

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn diacetyl cho vào mẩu trắng với 3 nồng độ

380 µg/L; 470 µg/L; 550 µg/L và dung dịch nội chuẩn 2,3-hexandion nồng

độ 1000 µg/L Mỗi nồng độ làm song song 3 mẩu Tiến hành phân tích theo qui trình đã xây dựng Kết quả đuợc trình bày ở bảng 3.9.

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình phân tích

21

3.5.1.2 So sánh phương pháp nghiên cứu với phương pháp hiện hành theo TCVN 6058-1995 (UV-Vis)

Tiến hành phân tích hàm lượng diacetyl trong mẩu bia Hue beer Export (chi tiết về mẩu nêu ở bảng 3.11) bằng hai phương pháp: phương pháp sắc

ký khí ghép khối phổ GC/MS và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis Kết quả phân tích được trình bày ở bảng 3.10X X1 2

Bảng 3.10 Kết quả phân tích diacetyl trong bia bằng phương pháp GC/MS và

UV-Vis trong mẩu bia B30

Mẩu

Hàm lượng diacetyl (ppb) Số liệu thống kê diacetyl (ppb) Hàm lượng Số liệu thống kê

= 48,5

S1 = 0,32 (n = 5)

47,7

= 49,0

S2 = 1,04 (n = 5)

2 2 2

1

1,04 0,32

- Xét ttính = = 1,03 và khi đó bậc tự do f được tính lại

Do ttính = 1,03 < t (p = 0,05; f= 5) = 2,57 Nên kết quả trung bình của hai phương pháp tương đương nhau

(p < 0,05)

= 10,56 > F (p = 0,05; f1= f2=4)= 6,39

23

3.5.2 Áp dụng thực tế

Áp dụng qui trình đã được xây dựng và thẩm định được để tiến hành định lượng một số mẩu bia đang lưu hành trên thị trường thành phố Huế (Chi tiết

về mẩu nêu ở bảng 3.11) thu được kết quả ở bảng 3.12.

Bảng 3.11 Thông tin chi tiết về các mẩu bia

2 B26 Huda beer extra 4,9% 06/02/2012

3 B27 Biere Larue export 4,5% 01/08/2012/SV

5 B29 Corona extra (Mexico) 4,6% 05/03/2012

7 B31 Tiger crystal 4,6% 26/07/2012/AE

24

Bảng 3.12 Kết quả phân tích một số mẩu bia thực tế bằng GC/MS

diacetyl (ppb) theo QCVN 6-3: 2010/BYT So sánh với mức qui định

Qua quá trình nghiên cứu và khảo sát Chúng tôi đã đạt được một số kết quả sau:

1 Đã khảo sát và xây dựng qui trình phân tích diacetyl trong bia bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) Trong đó:

- Xử lý mẩu bằng phương pháp chiết pha rắn SPE sử dụng cột C18 với thể tích rửa giải là 5 mL diclometan.

- Điều kiện chạy sắc ký cụ thể như sau: Cột mao quản DB-5MS: chiều dài 30 m, đường kính trong 0,25 mm, pha tĩnh chứa (5%-phenyl)-metyl

polysiloxan với bề dày 0,25 µm; khí mang Heli tinh khiết 99,99999%, tốc

độ dòng 1,5 mL/phút, kỹ thuật bơm: Splitless với thể tích tiêm mẩu 1µl, nhiệt độ MS interface: 2500C, nhiệt độ injector: 2500C Chương trình

nhiệt độ: nhiệt độ đầu 400C (giữ đẳng nhiệt trong 1 phút); tăng 100C

phút đến 2000C; tăng 200C phút đến 250 0C (giữ đẳng nhiệt trong 5

phút) Chế độ ion hóa va đập điện tử: EI với năng lượng 70 eV Chế độ

Full Scan, dải quét: 50 ÷ 500 amu.

26

- Với các điều kiện thí nghiệm trên, qui trình đạt được

độ ổn định tốt, độ lặp lại cao với RSD < 2,06% (n = 3), độ

đúng tốt với độ thu hồi Rev từ 85,5% - 95,4% Phương pháp đạt được giới hạn phát hiện thấp (5 ppb) và khoảng tuyến

tính rộng (20 – 500 ppb) với R2 = 0,9994 Kết quả phân tích

đã được so sánh với phương pháp hiện hành theo TCVN

6058:1995 cho kết quả phù hợp

2 Đã áp dụng thành công quy trình xây dựng được để

phân tích hàm lượng diacetyl trong 09 mẩu bia đang lưu

hành trên thị trường Thừa Thiên Huế Các kết quả cho thấy, hàm lượng diacetyl trong các loại bia trên đều đạt yêu cầu so với quy định hiện hành của Bộ Y Tế

27

TRÂN TRỌNG CẢM ƠN HỘI ĐỒNG KHOA HỌC VÀ CÁC BẠN

ĐÃ THEO DÕI