Phương pháp định tính và định lượng enzyme Amylase, Celluolase, protease.

>— Môi trường định tính khả năng phân giải các hệ enzym thủy phân amylase, cellulase, pectinase cua cdc ching Trichoderma: ® Môi trường cảm ting téng hop enzym amylase :[6], [22] Chương

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU:

2.1.1 Giống vi sinh vật:

Chúng giống nấm méc Trichoderma sp D13, D14, D16 - do Phong thi nghiệm, Bộ môn Sinh Hoá, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh phân lập trong các loại đất khác nhau thuộc khu vực Miền Đông Nam

Bộ

2.1.2 Nguồn nguyên liệu thu nhận enzym :

Thu nhận các hệ enzym amylase, cellulase, pectinase từ dịch nuôi cấy các

chúng vi nấm Trichoderma sp

2.1.3 Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm:

> Modi trường giữ giống nấm mốc ??richoderma - môi trường PGA (Potato

Glucose Agar) [ 22 }

Hấp khw tring 121°C trong 30 phit

"Cách pha môi trường :

Khoai tây gọt vó, rửa sạch, cắt lát và nấu chín

Chiết dịch nấu khoai tây (nếu dịch có nhiều tỉnh bột thì phải lọc) Cho agar vào từ từ đồng thời khuấy liên tục

Đổ vào ống nghiệm, đậy nút bông, hấp khử trùng

>— Môi trường định tính khả năng phân giải các hệ enzym thủy phân

amylase, cellulase, pectinase cua cdc ching Trichoderma:

® Môi trường cảm ting téng hop enzym amylase :[6], [22]

Chương 2: Phương pháp vật liệu

Chương 2: Phương pháp vật liệu

K HPO, le

Agar 20g

Hấp khử tring 121°C trong 30 phit

- Cdadch pha méi truong :

Dun néng nước, sau đó cho tình bột vào khuấy cho tan hết

Cho hỗn hợp khoáng vào nước, khuấy cho tan Sau khi tính bột tan, trộn hỗn hợp khoáng vào dung dịch tỉnh bột rồi cho agar vào, đồng thời khuấy liên tục đến khi tan hết

Cho 20 mÌ môi trường vào ống nghiệm, hấp khứ trùng, sau đó dé dia petri

đã khứ trùng

8 Môi trường cảm ứng tổng hợp enzym cellulase [6], [22]:

Thanh phan tương tự như môi trường cẩm ứng tổng hợp amylase nhưng thay 10 g tỉnh bột bang 10g CMC

- - Cách pha mdi trong:

Vì CMC tất khó tan trong nước nên cho CMC từ từ và khuấy đều liên tục Có thể dùng máy khuấy từ hay ngâm CMC trong nước qua đêm

thì sẽ tiết kiệm được thời gian

Cho hỗn hợp khoáng vào nước, khuấy tan Sau khi CMC tan, trộn hỗn hợp khoáng vào dung dich CMC, rồi cho agar vào, đồng thời khuấy liên tục đến khi tan hết

Cho 20 mÌ môi trường vào ống nghiệm, hấp khử trùng, sau đó đổ đĩa petri đã khử trùng

-Trang 38-

" Môi trường cảm ứng tổng hop enzym pectinase :|3], [6]

- Cdach pha mdi trường:

Cà rốt gọt vỏ, xay nhỏ, đun với 1000ml nước trong một giờ, thêm một

it CaCO; dé trung hòa môi trường Lọc lấy nước trong, bổ sung agar Hấp khử trùng 121C trong 30 phút

> Môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp các hệ enzym

thủy phân amylase, cellulase, pectinase từ chẳng nấm Trichoderma

" Niôi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym amylase [ 6], [7]

Nước bổ sung để đạt thủy phần là 50-60%

Hấp khử trùng ở 121 °C trong 45 phút

========ễễ

Chương 2: Phương pháp vật liệu

-Trang 39-

" Môi trường bán rắn khảo sát kha nang sinh tong hop enzym cellulase [6], [13], [14]

Tương tự môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym

amylase nhưng thay 5g bột bắp thành 5g bã mía Hấp khử trùng ở 121C

trong 45 phút

= Moi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym pectinase [6], [13 ]

Tương tự môi trường bán rắn khảo sát sinh tổng hợp enzym amylase nhưng thay 5g bột bắp và 5 g bã khoai mỳ thành 10g bột cà rốt Hấp khử trùng ở 121C trong 45 phút

" Cách pha môt trường

Lần lượt cho các chất khoáng hoà tan trong nước cất trước khi trộn chung nếu không sẽ tạo kết tủa không tan Trộn đều hỗn hợp với nhau, cho

thêm nước sao cho độ ẩm là 50 - 60%

Cho 15g môi trường đã trộn vào các erlen 100ml, hấp khử trùng ở 121C, trong 45 phút

2.2 DUNG CU, THIET BỊ

2.2.1 Dụng cụ :

Các dụng cụ thủy tinh thông dụng dùng trong phòng thí nghiệm như sau :

Erlen, ống nghiệm becher, bình định mức, đũa khuấy, phễu, ống đong

2.2.2 Thiết bị :

Chương 2: Phương pháp vật liệu

2.3 PHƯƠNG PHÁP

2.3.1 Phương pháp cấy chuyển và giữ giống nấm mốc Tricboderma [L1], [HỊ, LTI:

Môi trường PGA sau khi pha chế và đã hấp khử trùng, lấy ra và để

nghiêng 45° cho đến khi thạch đông cứng lại Sử dụng que cấy móc đã thanh

tràng cấy chuyền theo từng điểm hay gõ vào thành ống cho bào tử bung ra khắp

bể mặt thạch

Giống sau khi cấy, nuôi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong thời gian 7 ngày,

sau đó bảo quản ở 4°C Sau thời gian 2 tháng cấy chuyên giữ giống một lần để bảo đâm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vat

2.3.2 Phương pháp đo đường kính vòng phân giải amylase, cellulase, pectinase

[6], (45 |:

Chuẩn bị môi trường cảm ứng của các hệ enzym cần định hoạt độ và sơ bộ

định lượng Cho vào mỗi ống nghiệm 20ml môi trường mục 2.1.3, hấp khử trùng

121 C trong 30 phút Để nguội ở 45-50C

Sử dụng các đĩa petri vô trùng, kích thước bằng nhau Cho 20ml môi trường

trên từ ống nghiệm vào đĩa

Cấy chấm mỗi chúng Tríchoderma vào giữa đĩa Petri

Ủ nhiệt độ phòng (25-302) trong 2- 3 ngày

Cho thuốc thứ Lugol và đo đường kính vòng phân giải Sau đó kết luận chúng 7Trichoderma có tạo các hệ enzym thủy phân hay không, nhiều hay ít

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma [6], [1Š ]:

Sau khi hấp khử trùng, các erlen chứa môi trường bán rắn ở mục 2.1.3

được để nguội

Giống nấm Trichoderma được giữ trong ống thạch nghiêng được cấy vào

trong các erlen Cho 1Ôml nước cất vô trùng vào ống thạch nghiêng, hòa đều Dùng que cấy móc cà nhẹ lên bể mặt thạch để lấy hết bào tử, đánh nhẹ cho bào tử ở

Chương 2: Phương pháp vật liệu

dang huyén phù Tiến hành đếm bào tử bằng phòng đếm hồng cầu Cho vào các

erlen chứa l5g môi trường một thể tích dịch huyển phù sao cho đạt mật độ bào tử

là 10- 10” bào tử / 1g môi trường ( 2mÙ) Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng 28 °- 32 9 C,

độ ẩm 50 - 60 %

Canh trường nuôi cấy được thu nhận sau từng khoảng thời gian nhất định 2.3.4 Phương pháp tách chiết dịch enzym thô từ canh trường nuôi cấy [10], [11], [15]:

Sau thời gian nuôi cấy nấm mốc, dịch chứa enzym amylase, cellulase,

pectinase thô được tách chiết bằng phương pháp sau:

Cho vào mỗi erlen (chứa 15g canh trường) 100 ml nước cất Lắc 1gid, dem

loc qua vai, dich loc ly tam 5000 vòng/phút trong 10 phút Thu lấy dịch ly tâm rỗi

định mức 1Ö0Öml Ta thu được địch enzym thô và đem xác định hoạt độ amylase,

cellulase, pectinase

2.3.5 Phương pháp xác định hoạt độ của enzym amylase: Phuong phap HENKEIL [5], [24]:

> Nguyên tắc :

Xác định lượng tình bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp phần ting vdi dung dich iod

Đơn vị hoạt độ của enzym là lượng enzym có khả năng thủy phân Img tinh

bột sau 30 phút ở 30C, pH = 6,0

> Hod chất:

- Dung dich NaCl 0,1% : hoa tan 0,1 g NaCl trong nudc thanh 100ml

- Dung dich iod (1, ): hoa tan 1 g tod vao Smi dung dich co chifa 2g KI,

thêm nước cất đến 100ml, Khi dùng pha loãng dung dich nay 500 lần

- Dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH = 6,0

- Dung dịch HCI 0,1N

Chương 2: Phương pháp vật liệu

-Trang 42 -

- Dung dich tinh bột 1,0% : hoa tan Ig tinh bét trong dung dich dém Phosphat 0,05M, pH = 6,0

- Dung dich tinh bét tiéu chudn 1,0% : hda tan 1g tinh bét trong nudc cat

thanh 100m]

»> _ Cách tiến hành :

Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch tỉnh bột 1,0%, 1ml dung dich NaCl

0,1% và 2ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH = 6,0 Lắc đều dé & 30°C trong

vòng l5 - 20 phút để dung dịch đạt đến 30”, thêm vào hỗn hợp Iml dung dich

enzym đã đạt đến 30°C, ldc déu va giit 6 30° C trong vong 30 phit Lay ống

nghiém ra khdi ti 4m cho ngay vao 5ml dung dich HC] 0,1N dé lam ngifng phan

2

ứng

Song song với mẫu thật, làm mẫu không cũng tương tự như trên nhưng cho

dung dich HC] 0,1N vao trước rồi mới cho enzym vào sau

Lấy 1ml của mẫu thử thật cũng như mẫu không cho vào ống nghiệm, thêm vào 9ml dung dịch iod đã pha lõang 500 lần Lắc đều rồi so mầu ở bước sóng 560nm Lấy hiệu số đọc được trên máy giữa mẫu không và mẫu thật, đối chiếu

với đường cong tiêu chuẩn tính số mg tình bột bị phân giải

» _ Đường chuẩn tỉnh bột:

Từ dung địch tỉnh bột 1,0%, xây dựng đường chuẩn với dung dịch tỉnh bột

có nỗng độ từ 0 -10 mg/ml

Chương 2: Phương pháp vật liệu

Bảng 2.1 ; Xây dựng đường chuẩn tính bột (me/m)

Ống số 0 1 2 3 4 5

Vẽ đề thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (AOD) theo nồng độ tình bột

(mg/ml) d bude séng 560nm

> Tinh két qua

x.n.10.V

Hổ ¿muase (Ul/g) =

Trong do:

Hdamylase : hoat d6 enzym amylase

X : số mg tịnh bột bi thiy phan (mg/ml)

n : độ pha loãng

V : thể tích enzym ban đầu (ml)

10 : thể tích của hỗn hợp phan ting (m) m: khối lượng canh trường (g)

2.3.6 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử: phương pháp MILLER [l4],

[24], [34]

> Nguyén tic:

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử

Chương 2: Phương pháp vật liệu

44 -

-Trang

Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tỉnh khiết với thuốc thử acid đimtrosalisylc sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

> Hoá chất:

Thuốc thử DNS: cân 1g DNS pha trong 20ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối sodium potassium tartrate Dun nhe cho tan réi định mức tới 10Ôml

Đung dịch glucose mẫu (500 H/m]): cân 0,5g Ð - glucose pha trong nước cất thành 1 lít

> _ Cách tiến hành:

Dung dé thi chudn glucose

TY dung dich glucose 500 (j/ml) chudn, pha cdc dung dich glucose chuẩn

có nồng độ từ 50 - 250 (ml)

Bảng 2.2 : Xây dựng đường chudn Glucose

Néng dé glucose (y/ml) | 0 50 | 100 | 150 | 200 | 250

Thé tich dung dich glucose

mâu (mỹ)

Cho 0,5ml dung dich glucose chuẩn vào các ống nghiệm sạch và khô, thêm vào 0,5ml thuốc thy DNS Dun cách thủy trong 3 phút, lầm lạnh đến nhiệt độ

phòng Thêm vào mỗi ống 5ml nước cất và đo mật độ quang ở bước sóng 530nm với ống đối chứng là nước cất,

Vẽ đường chuẩn là glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là

nồng độ glucose

Chương 2: Phương pháp vật liệu

-Trang 45 -

Mẫu thí nghiệm:

Phần ứng của dung dịch đường cần phân tích với thuốc thử DNS được tiến

hành như trong phần xây dựng đồ thị chuẩn

Nông độ đường trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đã dựng

2.3.7 Phương pháp xác định hoạt độ hệ enzym cellulase:[ 3],[5],[14],[15 ]

> Nguyên tắc:

Để xác định hoạt tính enzym cellulase, ta cần sử dụng CMC như cơ chất, ủ dịch chiết enzym với CMC trong 60 phút pH = 5,0 Hệ enzym celiulase sẽ tác dụng lên CMC, phóng thích các phân tứ glucose, dựa vào hàm lượng glucose xác

định hoạt độ cellulase

> _ Hoá chất:

Dung dịch CH:COONa 0,IN: cân chính xác 8,2g CH;COONa, thêm nước

cất và định tới mức 1000ml

Dung dich CH,COOH 0,1N: Hut 5,77 ml CH,COOH, thêm nước cất và

định tới mức 1000m1

Dung dịch đệm acetat 0,ÍN pH 5: Cho từ từ dung dịch CH:COONa 0,1N

vao dung dich CH;COOH 0,1N, điều chỉnh pH = 5,0 bằng máy đo pH

Dung dịch cơ chất 0,3%: cân chính xác 3g CMC, hoà tan trong dung dịch đệm acetat 0,1N, pH = 5, khuấy trong 2 giờ ở 45°C để hoà tan cơ chất, thêm dung

dịch đệm cho đủ 1000ml

Dung dịch enzym thô sau khi thu từ ly tâm (100ml), lấy khoảng 20 ml đem

đi đun sôi ở 10OĐC, sau đó làm lạnh nhanh

»> Cách tiến hành:

Chương 2: Phương pháp vật liệu

Bảng 2.3 : Bảng xác định hoạt dé cellulase

Dung dich enzym iml Iml (đã bất hoạt)

Giữ ổn dinh 6 40°C trong 1h

Dun sdi cach thuy trong 10 phút

Lam 3 ống nghiệm thử thật và 3 ống nghiệm thử không

Hút 0,5ml dung dịch từ các ống nghiệm, thêm vào 0,5mi DNS Dun séi

cách thủy trong 3 phút,

Thêm vào 5ml nước cat Do OD tại bước sóng 530nm

> Cach tinh:

Đơn vị hoạt độ của enzym cellulase được xác định như sau: một đơn vị

hoạt độ tương ứng với Ì ug glucose trong thời gian thủy phân cơ chất CMC | gid

ở nhiệt độ 50 °“C

HG cettulase (UUg) =

Trong do:

Hdcettulase | hOat d6 enzym cellulase

a: ham luong glucose (ug/ml)

5: thể tích của hỗn hợp phan ting (ml)

n: hệ số pha loãng

V: thể tích enzym ban dau (ml)

Chương 2: Phương pháp vậi liệu

m: khối lượng canh trường ()

2.3.8 Phương pháp xác định hoạt độ của enzym pectinase : Phương pháp so

màu với thuốc thứ DNS [10],(28]

>_ Phương pháp so màu:

Phương pháp so màu là phương pháp phần tích dựa trên việc so sánh cường

độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường d6 mau cha dung dịch tiêu chuẩn có

nông độ xác định Dùng phương pháp so màu chủ yếu để xác định lượng nhỏ các chất Phân tích bằng phương pháp này mất ít thời gian so với các phương pháp

hóa học khác

> Nguyên tắc :

Cho enzym tác dụng với cơ chất là pectin, sắn phẩm tạo thành là acid D - galacturonic được hiện màu với thuốc thử DNS và đem đo mật độ quang ở bước sóng 575nm

Một đơn vị hoạt độ pectinase là lượng enzym cần thiết để giải phóng một

lmg acid Ð - galacturonic từ pectin trong một giờ Ở 37°C, pH = 4,2

> Hóa chất:

- - Dung dịch đệm acetat 0,1M, pH=4,2

- Thuốc thy DNS:

+ Dung dich A: Héa tan 300g muối Na- K tartrat kép vào 500 ml

nước cất

+ Dung dich B: Héa tan 10g acid 3,5- dinitrosalicylic vao 200ml dung dich NaOH 2N

+ Thuốc thử DNS dùng cho phản ứng: Trộn dung dich A véi dung

dịch B, thêm nước cất cho đủ 1 lít Chỉ pha chế dung dịch thuốc thử

DNA dùng cho phan ứng trước khi sử dụng Giữ dụng dịch trong chai

nâu,

Chương 2: Phương pháp vật liệu