CÁC BIỀN ĐỔI VẬT LÝ VÀ HÓA HỌC TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN CA CAO

Các loại đường trong lớp cơm nhầy của hạt ca cao fructose, glucose và saccharose được sử dụng trong quá trình lên men và dẫn đến sự tăng mạnh lượng etanol, acid lactic và acid acetic c

MỤC LỤC

I CÁC BIỀN ĐỔI VẬT LÝ VÀ HÓA HỌC TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN CA CAO:

1 Biến đổi trong quá trình lên men đổ đống:

2 Biến đổi trong quá trình lên men trong hộp:

II QUY LUẬT PHÁT TRIỂN CỦA HỆ VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN CA CAO:

1 Quy luật phát triển chung :

a Nấm men:

b Nấm sợi:

c Vi khuẩn acetic:

d Vi khuẩn lactic:

e Các vi sinh vật khác:

2 Quy luật phát triển của hệ vi sinh vật trong lên men ca cao đổ đống:

a Nấm men:

b Vi khuẩn lactic:

c Vi khuẩn acetic:

d Bacilluc spp:

3 Quy luật phát triển của hệ vi sinh vật trong lên men ca cao trong hộp:

a Nấm men :

b Nấm sợi:

c Vi khuẩn lactic:

d Vi khuẩn acetic:

e Bacillus spp:

f Các vi sinh vật khác:

III CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG :

1 Ảnh hưởng của nguyên liệu:

• Ảnh hưởng của độ chín:

a Ảnh hưởng của độ chín đến pH của khối ca cao :

b Ảnh hưởng của độ chín đến nhiệt độ của khối ca cao:

• Ảnh hưởng của chủng loại ca cao:

2 Ảnh hưởng của phương pháp lên men và sự đảo trộn:

b Lên men ca cao đổ đống, kích thước đống nhỏ, không đảo trộn

c Lên men ca cao đổ đống, kích thước đống lớn, có đảo trộn

d Lên men ca cao trong hộp

I CÁC BIỀN ĐỔI VẬT LÝ VÀ HÓA HỌC TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN CA CAO:

1 Biến đổi trong quá trình lên men đổ đống:

Sau thu hoạch, người ta sẽ bỏ lớp vỏ ngoài và lấy hạt ra, sau đó phủ lên hạt một lớp lá chuối Các đống khác nhau về kích thước, có khối lượng nằm trong khoảng từ 20 đến 1000

kg Cung cấp khí cho các đống này bằng cách đảo trộn chúng sau mỗi 24-72 h trong suốt quá trình lên men, được xem là có lợi cho chất lượng sản phẩm cuối cùng Để thay thế công việc nặng nhọc khi đảo trộn ca cao đống, hệ thống dạng khay được nghiên cứu là sẽ cho chất lượng ca cao tốt hơn và thời gian lên men ngắn hơn Trong hệ thống dạng khay, hạt ca cao được xếp trong những khay sâu 10cm và 8-10 khay hợp lại thàng một khối Không khí được tuần hoàn giữa các khay để đảm bảo cung cấp đủ không khí cho quá trình lên men mà không cần đảo trộn các hạt ca cao

Quá trình lên men thực sự xảy ra ở phần thịt xung quanh hạt ca cao Phần vỏ thịt này giàu glucose, fructose, và saccarose ( hàm lượng chiếm 10-15%) và pH ban đầu thường thấp (pH = 3.3-4.0), chủ yếu do hàm lượng acid citric cao ( 1-3%) Một lượng lớn pectin và các polisaccarit khác ( 1-2%) làm vỏ thịt có tính nhớt, điều này làm ngăn cản quá trình khuếch tán của không khí

Lên men ca cao là một quá trình vi sinh tự phát Hạt ca cao còn trong vỏ thì coi như

vô trùng, nhưng khi đã bỏ lớp vỏ ngoài thì hạt sẽ nhiễm rất nhiều loại vi sinh vật khác nhau từ tay người công nhân, thùng chứa của các phương tiện vận chuyển, dao, bề mặt vỏ,

2 Biến đổi trong quá trình lên men trong hộp:

Hạt ca cao được lên men theo quy mô công nghiệp với 3 hạng A, B, C ở Đông Java Hạt ca cao được thu hoạch từ các đồn điền bằng phương pháp truyền thống và được cho lên men trong vòng 6 giờ sau thu hoạch Quả ca cao được thu hoạch từ trên cây và được tách hạt trong vòng 30 phút Quả được cắt bằng dao bởi các công nhân đồn điền và hạt được lấy ra, đặt trên thảm nhựa Sau đó chuyển sang các bao tải bằng vải bố rồi chuyển đến nhà máy để lên men Hạt ca cao Forastero được dùng là hạng A, Trinitario là hạng B và C Mỗi quá trình lên men, khoảng 1000 kg hạt được cho vào trong những hộp bằng gỗ ( dài x rộng x cao = 150-200x 100x 75-100 cm) mà ở đó quá trình lên men tự nhiên sẽ được diễn ra Sau 12-16 h , hạt ca cao

sẽ được trộn lẫn với các hộp khác Quá trình trộn lẫn như vậy cứ lặp đi lặp lại cứ sau mỗi

20-24 h cho đến khi quá trình lên men kết thúc, thường là 6 ngày cho loại A và 4 ngày cho loại B

và C Hộp gỗ không được làm sạch giữa các lần hoạt động, có thể được đục các lỗ để dịch lên men thoát ra ngoài

Hạt ca cao mới thu hoạch được bao bọc trong một lớp cơm nhầy màu trắng sữa Lớp cơm này chiếm ½ khối lượng chất khô ở hạt Forastero và khoảng 1/3 ở hạt Trinitario Lớp cơm này được hòa tan trong quá trình lên men cho ra một chất lỏng mà sau đó được cho thoát ra khỏi khối hạt lên men qua các lỗ trong hộp lên men Nhiệt độ của lớp cơm này trong hạt ca cao dần dần tăng lên trong quá trình lên men, từ giá trị đầu 20-250C ( tùy thuộc vào từng loại

ca cao) cho đến khi quá trình lên men chấm dứt là nhiệt độ khoảng 48-500C pH của lớp vỏ thịt ca cao trước lên men là 3.7-3.9 và sau đó tăng lên đến 4.8-4.9 khi kết thúc lên men, trong khi đó pH của hạt giảm từ 6.3-6.5 xuống còn 5.0-5.1, ta có thể thấy điều đó trong bảng sau:

Bảng : Sự thay đổi thành phần hóa học trong vỏ thịt và hạt ca cao trong quá trình lên men hạt

ca cao

Các loại đường trong lớp cơm nhầy của hạt ca cao ( fructose, glucose và saccharose) được sử dụng trong quá trình lên men và dẫn đến sự tăng mạnh lượng etanol, acid lactic và acid acetic ( có thể thấy điều đó trong bảng số liệu trên) Hàm lượng etanol là lớn nhất (5-6

%) sau 24-36h, sau thời gian này hàm lượng etanol giảm xuống Acid citric trong vỏ thịt giảm xuống khoảng 55% Saccharose là đường chính trong hạt, giảm xuống đến giới hạn không còn có khả năng phát hiện Hàm lượng etanol, acid lactic, acid acetic trong hạt tăng lên trong quá trình lên men, đáng chú ý là acid acetic Hàm lượng acid citric trong hạt giảm xuống

50-60 %

II QUY LUẬT PHÁT TRIỂN CỦA HỆ VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN CA CAO:

3 Quy luật phát triển chung :

a Nấm men:

Nấm men phát triển trong thời gian lên men kị khí, tổng hợp ethanol, sinh enzyme pectinase thủy phân pectin, sử dụng citric làn cơ chất, sau 48h giảm cơ chất, cạnh trang và ức chế bởi ethanol

Bảng Hình thái, đặc điểm khuẩn lạc nấm men phân lập từ mẫu hạt cacao

lên men tự nhiên

Thời gian

ủ, h

Nhiệt độ trung bình khối hạt, 0C

Mật độ tế bào, CFU/g Đặc điểm khuẩn lạc trên hộp petri

-24 30 5.107

Tròn, màu trắng ngà, đục nhầy, bề mặt trơn, không tạo răng cưa ở mép

Tròn, to, màu trắng xốp, mép có răng cưa, bề mặt khô, xù xì

72 45 13.107 Tròn, to, màu trắng xốp, mép có

răng cưa, khô, xù xì

Màu trắng ngà, tròn, mép không tạo răng cưa, trơn, ướt

-Nhận xét:

Qua bảng trên thấy:

- Nấm men xuất hiện ngay từ đầu của quá trình ủ hạt

- Số lượng khuẩn lạc nấm men phân lập được tăng dần từ ngày ủ thứ 1 đến ngày ủ thứ

3 và giảm dần từ ngày ủ thứ 4 đến ngày ủ thứ 6

- Ở nhiệt độ khối hạt từ 30 (45oC), số lượng khuẩn lạc phân lập được tăng dần và mật

độ tế bào đạt cao nhất ở 45oC (13.107 tế bào/g)

- Ở nhiệt độ khối hạt 500C, số lượng khuẩn lạc phân lập được giảm xuống và mật độ

tế bào chỉ còn 2.107 tế bào/g chứng tỏ nấm men khó phát triển được ở nhiệt độ này Vả lại lúc

đó môi trường dinh dưỡng gần cạn lại có sự cạnh tranh dinh dưỡng và sinh tồn với các loài vi sinh vật khác, môi trường ủ ngày càng thông thoáng hơn nên mặc dù nhiệt độ có giảm xuống trong 2 ngày sau nhưng nấm men đã không còn phát -triển được

Các mẫu khuẩn lạc nấm men phân lập được ở trên theo thời gian ủ tự nhiên 24h, 48h, 72h, 96h được chúng tôi kí hiệu lần lượt là MTN24, MTN48, MTN72, MTN96 Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu hình thái tế bào nấm men trên kính hiển vi (kết quả thể hiện trên bảng 2)

và chụp ảnh tế bào khuẩn lạc (các hình 1, 2, 3, 4)

Bảng Hình thái tế bào nấm men phát triển trên môi trường thạch đĩa (petri)

Tên khuẩn lạc Đặc điểm hình thái tế bào nấm men

MTN24 Hình bầu dục, nhỏ, đều, ít tế bào sinh sản lưỡng cực

MTN48 Dạng hình trụ không đều

MTN72 Dạng hình bầu dục nhỏ, không đều

MTN96 Dạng hình cầu liên kết với nhau thành cụm (kết tụ)

Hình 1 Ảnh hiển vi điện tử

tế bào khuẩn lạc MTN 24

Hình 2 Ảnh hiển vi điện tử

tế bào khuẩn lạc MTN 48

Hình 3 Ảnh hiển vi điện tử

tế bào khuẩn lạc MTN 72

Hình 4 Ảnh hiển vi điện tử

tế bào khuẩn lạc MTN 96

- Đối với khuẩn lạc MTN24, nòi nấm men có tên là Hansenia spora uvarum.

- Đối với khuẩn lạc MTN48, nòi nấm men có tên là Galactomyces reessii.

- Đối với khuẩn lạc MTN72, nòi nấm men có tên là Candida Sorboxylosa.

- Đối với khuẩn lạc MTN96, nòi nấm men có tên là Candida fructus.

b Nấm sợi:

Hệ nấm sợi: tổn thương phôi nhũ, tạo mùi không mong muốn, tạo lipase

c Vi khuẩn acetic:

Vi khuẩn acetic: t=24h +O2

Rượu  acid acetic +Q  500C: hạt chết

d Vi khuẩn lactic:

Vi khuẩn lactic: Lactobacillus: t = 4896h, +O2, pH cao hơn

Đường + 1 vài acid hữu cơ (citric, malic)  a.lactic( a.acetic, ethanol, và CO2)

e Các vi sinh vật khác:

Những VSV khác hiện diện tăng vọt khi +O2 vàpH = 6-7 VK có bào tử , VSV tạo mùi hôi cho hạt (Bacillus)

4 Quy luật phát triển của hệ vi sinh vật trong lên men ca cao đổ đống:

a Nấm men:

Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men , sự phát triển của nấm men là chiến ưu thế

do hàm lượng đường cao, pH thấp và lượng O2 giới hạn trong phần thịt quả Hoạt động chính của nấm men là chuyển hóa đường thành cồn và các hoạt động khác như chuyển hóa acid citric, cắt mạch pectin cũng được xem là những hoạt động quan trọng của nấm men Đối với

lên men đổ đống người ta thấy có những loai nấm men sau: Hansenula, Kloeckra, Tonilopsis, Saccharomyces, Candida, Pichia và Schizosaccharomyces Lên men hộp thì thấy có các loại nấm men sau : Candida, Kloeckra, Pichia, Saccharomyces spp Gần đây , Jespersen và cộng

sự (2005) khi nghiên cứu về sự xuất hiện và phân tán của nấm men trong 2 phương pháp lên

men đổ đống và lên men dạng khay của ca cao đã phát hiện ra :Candida Krusei, Pichia membranifaciens và Hanseniaspora là những chủng nấm men chính trong quá trình lên men

đổ đống Còn trong quá trình lên men hộp thì Saccharomyces cerevisiae đóng vai trò chính.

b Vi khuẩn lactic:

Nấm men nhanh chóng tiêu thụ O2 có trong khối lên men, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic sẽ lên men đường và chuyển hóa đường thành acid lactic, đồng thời cũng đồng hóa acid citric Trong quá trình lên men đổ đống, người ta đã

phân lập được các chủng sau :Lactobscillus colonides, Lb Fermentum, Lb Mali và Lb Plantarum

c Vi khuẩn acetic:

Sự thủy phân pectin của nấm men làm phân hủy thịt quả, làm tăng sự khuếch tán không khí trong khối lên men và sự đồng hóa acid citric bởi nấm men và LAB làm cho pH tăng lên Điều này có lợi cho sự phát triển của vi khuẩn acetic (AAB) Vi khuẩn acetic chuyển hóa etanol thành acid acetic và tỏa nhiệt Etanol và acid acetic khuếch tán trong khối hạt, điều này kết hợp với nhiệt sinh ra làm hạt chết, diệt phôi và dẫn đến những biến đổi sinh hóa Carr

và cộng sự(1979) phát biểu rằng AAB đóng vai trò quang trọng trong hệ vi sinh vật, đặc biệt

là trong phần có nhiều không khí của khối lên men Một số chủng AAB phân lập

được :Glucononbacter oxydans, Acetobacter aceti và Acetobacter pasteurianus.

Sự chuyển hóa etanol thành acid acetic bởi AAB là một quá trình tỏa nhiệt Điều này được xác nhận đúng ở quá trình lên men đổ đống nhỏ , ở phần đầu của lên men đống lớn Sự tăng nhiệt độ liên quan mật thiết đến số lượng AAB

d Bacilluc spp:

Do hoạt động của AAB, nhiệt độ của khối hạt lên men tăng lên đến 45-50 độ C , làm hạn chế sự phát triển của nhiều vi sinh vật Sự tăng nhiệt độ kết hợp với tăng pH và sự thoáng

khí tạo thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí sinh bào tử Bacillus spp Vai trò

của vi khuẩn Bacillus trong quá trình lên men ca cao còn chưa rõ ràng Tuy nhiên, do hoạt tính enzym mạnh và sự tạo thành của các acid béo mạch ngắn, pyrazin và 2,3-butandiol Sự phát triển và hoạt động của Bacillus spp cho thể gây nên sự mất mùi

5 Quy luật phát triển của hệ vi sinh vật trong lên men ca cao trong hộp:

a Nấm men :

Nấm men ( 104-105 cfu/g) xuất hiện trong khối ca cao khi bắt đầu quá trình lên men,

và phát triển đến số lượng cực đại là 107-108 cfu/g sau 24-36h đầu của quá trình lên men Sau đó số lượng của nấm men giảm xuống

Đối với mỗi loại ca cao, Kloeckera apis là chủng nấm men chiếm ưu thế trong suốt 24-36h

đầu tiên, sau đó giảm xuống đến giới hạn không thể phát hiện Loại nấm men này chiếm 70-90% số lượng nấm men trong pha đầu tiên

Kloeckera javanica và Kloeckera africana cũng đóng góp vào quá trình lên men của ca cao hạng B Sau đó, Kloeckera apis , Saccharomyces cerevisiae và Candida tropicalis là những

nấm men quan trọng nhất trong quá trính lên men của cả 3 hạng ca cao Những loại nấm men này phát triển đến số lượng 106-107 cfu/g trong suốt 24-36h đầu tiên trước khi giảm xuống mức số lượng thấp hơn và duy trì cho đến khi quá trình lên men kết thúc Vì sự sống sót này, chúng là những nấm men chiếm ưu thế trong pha tiếp theo (48-120 h) của quá trình lên men

Những chủng nấm men khác như Candida pelliculosa và Candida humicola được phát hiện trong suốt quá trình lên men nhưng chúng chỉ chiếm 5% số lượng vi sinh vật Rhodotorula rubra (ca cao hạng A) và Rhodotorula glutinis ( loại ca cao hạng B) cũng phát triển đến số

lượng 105-106 cfu/g , nhưng sau 36h chúng không còn phát triển

b Nấm sợi:

Nấm sợi ( 102-103 cfu/g ) được phát hiện trong hạt khi bắt đầu quá trình lên men và phát triển lên đến số lượng 106-107 cfu/g

Penicillium ctrinum và môt loài nấm đảm chưa xác định được , là những loài chiếm ưu thế, sau đó đến Aspergillus versicolor và Aspergillus wentii Loài nấm đảm chưa xác định

được phát triển thành những khuẩn lạc màu trắng trên thạch có chất chiết malt ở 250C ( đường

kính khuẩn lạc 50-60 mm trong 3 ngày) Penicillium purpurogenum và các chủng khác gần

giống với Penicillium ochrocholoron cũng xuất hiện trong quá trình lên men ở loại ca cao hạng B Tất cả nấm phân lập được phát triển ở 370C nhưng không phát triển ở 40 0C ,trừ

Aspergillus versicolor phát triển được ở 400C nhưng không phát triển được ở 50 0C Không

có loài nào thể hiện hoạt tính thủy phân pectate hay hoạt tính cellulase Những phản ứng

poligalacturonase mạnh được tìm thấy ở loài nấm đảm chưa định tên và Penicillium ctrinum,

và những phản ứng này yếu hơn ở Aspergillus wentii và Aspergillus versicolor Tất cả các

chủng phân lập được đều thể hiện phản ứng thủy phân amilo(trừ những loài thuộc nấm đảm)

và phản ứng thủy phân protein Không có giống nào là thủy phân lipid , trừ Aspergillus versicolor.

c Vi khuẩn lactic:

Vi khuẩn lactic phát triển trong suốt quá trình lên men và đạt đến số lượng cực đại là

108-109 cfu/g sau 36h lên men

Lactobacillus cellulobiosus là chủng vi khuẩn lactic chiếm ưu thế ở mọi hạng ca cao

và chiếm 60-85 % số lượng của các loại vi khuẩn lactic trong 36-48h lên men

Lactobacillus plantarum cũng là vi khuẩn lactic quan trọng, đặc biệt là trong 24h lên men đầu tiên của ca cao hạng A và hạng C Lactobacillus hilgardii phát triển trong suốt quá

trình lên men ở hạng A nhưng nó bị chết sau 48h Tại giá trị số lượng cực đại (36h) nó chiếm < 2% vi khuẩn lactic

d Vi khuẩn acetic:

Cả Acetobacter pasteurianus và Acetobacter aceti đều đóng góp vào quá trình lên men

trong suốt 24h đầu tiên của hạng B và C và đạt đến số lượng cực đại là 10̀̀̀̀̀5-106 cfu/g trước khi giảm xuống một cách nhanh chóng

e Bacillus spp:

Các chủng Bacillus phát triển trong suốt quá trình lên men và trở thành quần thể vi sinh vật chiếm ưu thế (107- 108 cfu/g) sau 48-72h ,khi những chủng vi sinh vật khác chết đi

Bacillus vẫn duy trì được số lượng cao cho đến khi quá trình lên men kết thúc Bốn chủng : Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis và Bacillus cereus là những chủng quan trọng trong quá trình lên men ở hạng A với Bacillus pumilus chiếm ưu thế cuối cùng Sự lên men ở hạng B có sự chiếm ưu thế của Bacillus licheniformis và Bacillus pumilus,

và có sự đóng góp nhỏ của Bacillus sphaericus Bacillus coaglans chiếm ưu thế trong suốt quá trình lên men ở hạng C và có sự đóng góp nhỏ của Bacillus pumilus

f Các vi sinh vật khác:

Một dãy các loại vi khuẩn khác trong suốt quá trình lên men , nhưng với số lượng không vượt quá 105- 106 cfu/g Tiêu biểu trong số chúng là : Staphylococcus capitis, Staphylococcus aureus và Micrococcus kristinae ( ca cao hạng A); S.capitis, S.hominii,M.kristinae và Pseudomonas cepacea ( ca cao hạng B); S.aureus, M.kritinae và P.cepacea (ca cao hạng A).