nghiên cứu chẩn đoán lao kháng thuốc isoniazid bằng phương pháp xác định đột biến trên gen katg và gen inha từ các chủng vi khuẩn lao phân lập tại miền trung - việt nam

Kháng thuốc là do xảy ra đột biến trong các khu vực của hệ gen MTB, như: katG, inhA, ahpC, kasA và ndh liên quan đến tính kháng isoniazid INH, ropB kháng rifampicin RIF, embB kháng etha

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC _ 

TRỊNH QUỐC PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC ISONIAZID BẰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN

KATG VÀ GEN INHA TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP

TẠI MIỀN TRUNG – VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

_ 

TRỊNH QUỐC PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC ISONIAZID BẰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN

KATG VÀ GEN INHA TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP

TẠI MIỀN TRUNG – VIỆT NAM

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2011

hệ tuần hoàn dẫn đến bệnh lao kê

Bệnh có thể chữa khỏi mà không để lại di chứng nếu như được phát hiện sớm, điều trị kịp thời Tuy nhiên, nếu người bệnh điều trị không đúng cách (bỏ dở điều trị hoặc dùng thuốc không đúng theo chỉ dẫn của thầy thuốc) sẽ gây hậu quả nghiêm trọng như: Bệnh không khỏi, dễ để lại di chứng hoặc gây tử vong; gây ra hiện tượng kháng thuốc, nguy hiểm nhất là kháng đa thuốc làm cho việc điều trị càng khó khăn

và tốn kém hơn; tiếp tục là nguồn lây nhiễm trong cộng đồng

Việc điều trị lao đa kháng thuốc rất phức tạp và khó khăn Chi phí điều trị cao, thời gian điều trị kéo dài Tỷ lệ khỏi bệnh thấp, tỷ lệ bỏ trị và tử vong của bệnh nhân cao

Hiện nay, để chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc các cơ sở y tế trong nước vẫn phải dựa vào phương pháp nuôi cấy vi khuẩn lao và làm kháng sinh đồ kéo dài

ít nhất 4 - 6 tuần như vậy sẽ gặp khó khăn trong việc điều trị

Sinh học phân tử đang tạo ra những đột phá trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc và khắc phục được những nhược điểm trên Thời gian chẩn đoán có thể rút ngắn xuống còn vài ngày với độ nhạy và độ đặc hiệu cao

Kháng thuốc là do xảy ra đột biến trong các khu vực của hệ gen MTB, như:

katG, inhA, ahpC, kasA và ndh liên quan đến tính kháng isoniazid (INH), ropB

kháng rifampicin (RIF), embB kháng ethambutol (EMB), pncA kháng pyzamid (PZA) và rpsL, rrs liên quan đến tính kháng streptomycin (STR)

Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:

"Nghiên cứu chẩn đoán lao kháng thuốc isoniazid bằng phương pháp xác định đột biến trên gen katG và gen inhA từ các chủng vi khuẩn lao phân lập tại Miền Trung - Việt Nam "

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phát hiện đột biến trên gen katG và gen inhA liên quan đến tính kháng isoniazid

ở các chủng lao nghiên cứu

3 Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết DNA tổng số từ mẫu đờm của các bệnh nhân

- Kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số bằng đo OD260nm / 280nm = 1,8 -

2,2

- Nhân bản đoạn gen katG và gen inhA từ các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu

- Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli

- Tách dòng gen katG và gen inhA

- Giải trình tự gen katG và gen inhA

- Phát hiện, phân tích đột biến trên gen katG và gen inhA liên quan đến tính

kháng thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình bệnh lao

1.1.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới

Như chúng ta đã biết , lao là một trong những bệnh nhiễm trùng mãn tính xuất hiện sớm nhất ở loài người và có khả năng lây truyền trong cộng đồng , là mối

đe dọa lớn với tất cả mọi người trên hành tinh này Nếu không có sự kiểm soát của con người bằng những phương pháp và công cụ hữu hiệu, bệnh lao có thể bùng phát như một bệnh dịch nguy hiểm , làm chết nhiều người và tác động xấu đến sự phát triển kinh tế xã hội

Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3 dân số thế giới ), tỷ lệ điều trị thành công trên 85% bằng hoá trị liệu , nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính Như vậy , còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đa ng tiếp tục lây lan cho cộng đồng và theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG), mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người) [3], [11]

Năm 1993, Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) đã tuyên bố tình trạn g khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm họa của nó trong tương lai là bệnh lao kháng thuốc [3], [11]

Năm 2005, TCYTTG ước tính khu vực Đông Nam Á có 4,8 triệu bệnh nhân lao Trong đó số ca bệnh nhân lao mắc mới là gần 3 triệu, chiếm 34% toàn cầu Số người chết ở Đông Nam Á lá 512000 người, chiếm 1/3 toàn thế giới Châu Phi có số bệnh nhân lao là 3,8 triệu người ; số ca mới mắc là 2,5 triệu; số chết do bệnh lao

là 544000 Hai khu vực này có tình hình mắc lao nặng nề nhất thế giới [15]

WHO dự báo chi phí điều trị cho bệnh nhân lao ở 27 nước có số bệnh nhân đông nhất sẽ lên đến 16 tỷ USD trong vòng 6 năm tới và coi bệnh lao là vấn đề y tế cộng đồng, là một trong những nguyên nhân chính gây tử vong trên thế giới Không những thế, nhiều vấn đề mới nảy sinh , thậm chí được đánh giá là nghiêm trọng trên

toàn cầu làm cho công tác phòng , chống lao gặp khó khăn , đe dọa phá vỡ những thành quả đạt được Báo cáo của WHO được đưa ra dựa trên thông tin thu thập trong thời gian từ 2002-2006 ở 1/2 các nước trên thế giới do các nước còn lại không hợp tác Chẳng hạn tại Châu Phi chỉ có 6 nước cung cấp thông tin về lao kháng thuốc cho WHO Trước tình hình trên, WHO thúc giục các quốc gia và tổ chức từ thiện trên thế giới tập trung đầu tư vào DOTS- một chiến dịch chuẩn hóa cách phát hiện, điều trị được mở rộng Đồng thời tổ chức y tế này cũng vừa đưa ra chương trình DOTS- Plus (chương trình DOTS mở rộng) liên quan đến việc sử dụng thuốc

đa dạng nhằm chống lại các dòng MDR Việc kiểm soát dịch bệnh ở từng nước sẽ không thể ngăn chặn sức kháng thuốc của khuẩn lao, chỉ có sự đầu tư đồng bộ vào các chiến dịch phòng chống bệnh trên toàn thế giới mới phát huy tác dụng [3], [13]

Từ năm 2000 đến năm 2008, cơ quan phát triển quốc tế hoa kỳ (USAID) đã cung cấp gần 900 triệu đô la cho chương trình phòng , chống lao toàn thế giới Trong năm tài khoá 2009, USAID đã cung cấp 15 triệu đô l a cho cơ sở sản xuất thuốc chống lao toàn cầu (DF) Bệnh lao là bệnh của người nghèo , lây lan nhanh trong cộng đồng có điều kiện sống chật chội, thiếu vệ sinh, thông khí và dinh dưỡng kém Mức độ nặng nề của bệnh lao đã ản h hưởng tới thu nhập quốc dân và chỉ số phát triển con người của các quốc gia Các nghiên cứu về kinh tế y tế cho thấy , mỗi bệnh nhân lao sẽ mất trung bình 3-4 tháng lao động , làm giảm 20-30% thu nhập bình quân của gia đình và nó đã tác động tới 70% đối tượng lao động chính của xã hội [3], [6]

Đáng buồn là vào thời điểm hiện tại, đã 129 năm kể từ ngày nhà bác học người Đức Robert Koch công bố tìm ra nguyên nhân gây ra bệnh lao thì căn bệnh này vẫn chưa được khống chế Có nhiều cách lý giải thực trạng này song chúng ta thấy được một số lý do chủ yếu như sau: Sự xuất hiện và mức độ hoành hành ngày càng tràn lan của đại dịch HIV/AIDS; tình hình bệnh lao kháng thuốc; sự xuống cấp của cơ sở y tế điều trị và chăm sóc bệnh nhân lao cũng như sự thiếu quan tâm đến công tác phòng , chống lao tồn tại ở một số quốc gia, đặc biệt là những nước kém hoặc đang phát triển Thêm vào đó là tình trạng di dân giữa các quốc gia, từ những

nước có số người mắc lao cao sang những nước có số người mắc lao thấp; tình trạng

di dân, đô thị hóa trong mỗi quốc gia; tình trạng nghèo đói và đặc biệt là các phương tiện để chẩn đoán và điều trị lao trong nhiều năm qua vẫn chưa có đổi mới đáng kể [38]

1.1.2 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam

Theo Ủy ban điều phối liên minh phòng , chống lao toàn cầu , Việt Nam xếp thứ 12 trong 22 nước có gánh nặng bệnh lao trên toàn cầu , cao hơn nhiều bậc so với nhiều năm trước đó Hàng năm, Việt Nam có khoảng 150.000 bệnh nhân lao các thế hệ xuất hiện và khoảng 12.000 ca đồng nhiễm lao /HIV Việt Nam là nước có nhiều bệnh nhân lao đứng hàng thứ ba ở khu vực Tây Thái Bình Dương , sau Trung Quốc

và Philippin Tỷ lệ dân số Việt Nam mắc lao là 44% Tỷ lệ kháng th uốc là 32,5% khá cao so với trong khu vực Với nguy cơ mắc lao ước tính hàng năm là 1,7% Tỷ lệ chết do lao khá cao : 26/100.000 dân tương đương với 20.000 người chết do lao mỗi năm Như vậy, ở Việt Nam cứ mỗi ngày có gần 400 người mắc bệnh lao và 55 người chết vì bệnh lao Kết quả điều tra dịch tễ cho thấy nguyên nhân bệnh lao vẫn tiếp tục tăng ở Việt Nam do tỷ lệ lao tăng ở nhóm tuổi trẻ và công tác giám sát lao chưa được quan tâm đúng mức, nguồn nhân lực cho công tác phòng, chống lao ngày càng mai một ; 50% số cán bộ y tế phòng, chống lao cấp huyện chưa được đào tạo đang là thử thách lớn với công tác phòng, chống lao tại Việt Nam [11]

Một khảo sát vào năm 2004 của chương trình chống lao quốc gia cho thấy địa phương nào có mật độ và lưu chuyển dân số đông, y tế tư và hiệu thuốc phát triển thì nơi đó có tỷ lệ điều trị thất bại, tái phát, mãn tính của bệnh lao cũng cao nhất Cụ thể số bệnh nhân tái phát và thất bại ở Đà Nẵng là 48, Cần Thơ 195 An Giang 570 và TP.HCM là 1.664 [2]

Nước ta thuộc loại trung bình về dịch tễ trên thế giới Đội ngũ cán bộ chống lao các cấp hiện nay là 15772 (20/100.000 dân) Số cán bộ này tập trung chủ yếu ở các t ỉnh miền Bắc và Bắc Trung bộ Trong khi đó , các tỉnh phía Nam , bao gồm

TP.HCM nơi có số bệnh nhân hàng năm cao nhất cả nước , chỉ đạt 10 cán bộ cho 100.000 dân [3]

Tình hình đồng nhiễm lao/HIV đang là một thách thức lớn và được đánh giá

là rất nghiêm trọng Lao là bệnh nhiễm trùng phổ biến nhất và cũng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở người nhiễm HIV Theo thống kê của chương trình chống lao quốc gia, hiện nay tại tất cả các tỉnh, thành phố trong cả nước đều có người đồng nhiễm lao và HIV Người đồng nhiễm lao/HIV tập trung ở những tỉnh, thành phố có nhiều người nhiễm HIV và mắc lao: TP Hồ Chí Minh, An Giang, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Lạng Sơn Qua khám sàng lọc lao cho 5.114 người nhiễm HIV cho thấy, có 18,6% số nhiễm HIV có mắc lao; khoảng 90% số người nhiễm lao/HIV ở lứa tuổi 18-40 Đáng chú ý, qua giám sát trọng điểm có 5% số người bệnh lao có HIV, tỷ lệ này tăng gấp 10 lần so với năm 1990 Sự gia tăng của đại dịch HIV/AIDS làm cho bệnh nhân lao lại càng thêm trầm trọng vì 50% số người nhiễm HIV sẽ trở thành bệnh lao nếu nhiễm vi khuẩn lao [3]

Theo kết quả điều tra dịch tễ lao toàn quốc 2006-2007, tình hình bệnh lao ở nước ta cao hơn ước tính của Tổ chức Y tế Thế Giới 1,6 lần Đặc biệt, bệnh lao đang có xu hướng giảm ở lứa tuổi già và có xu hướng tăng ở lứa tuổi trẻ Ở lứa tuổi 15-24, tỷ lệ phát hiện lao phổi AFB dương tính mới trên 100.000 dân tăng từ 29,5 (năm 2000) lên 37,5 (năm 2008) đối với nam giới còn ở nữ giới là từ 16,9 lên 22,8 [10]

Năm 2006, Chương trình chống lao quốc gia đã xây dựng kế hoạch phòng , chống lao giai đoạn 2006-2010 Với mục tiêu phát hiện được trên 70% số bệnh nhân lao và điều trị khỏi cho 90% số bệnh nhân lao đã được phát hiện , đến nay , chiến lược DOTS (điều trị lao bằng hoá trị liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp ) đã được triển khai tại 100% số huyện trong cả nước và tiếp tục xây dựng kế hoạch phòng, chống lao giai đoạn 2010-2015 [10], [14]

Việt Nam là một trong 7 quốc gia có tình hình lao nghiêm trọng nhất thế giới (Cambodia, China, Mongolia, Papa New Guinea, Philippines, Vietnam) Đến cuối

2003, Việt Nam là nước duy nhất trên thế giới đã đạt được mục tiêu phát hiện hơn 70% số lao phối AFB(+) mới ước tính và điều trị lành 85% số bệnh nhân lao Đây là mục tiêu tiến đến kiểm soát bệnh lao trên toàn thế giới vào năm 2005 do WHO khởi xướng từ năm 1999 [2]

Cũng như nhiều nước trên thế giới, nước ta cũng đang phải đối mặt với nhiều khó khăn , thách thức nhằm duy trì tính bền vững của các hoạt động chống lao,cũng như thành tựu đã đạt được

Chủ đề Ngày thế giới phòng chống lao năm nay được WHO đưa ra là :"Đổi mới để kiểm soát tốt hơn bệnh lao", trong đó đặc biệt nhấn mạnh tới việc đổi mới về các cộng cụ chẩn đ oán điều trị và phòng bệnh tốt hơn ; đổi mới phương pháp tiếp cận để nhiều người được phát hiện, điều trị và đổi mới về huy động các đối tác cùng tham gia phòng , chống bệnh lao Hưởng ứng chủ đề này , tại Việt Nam , đã tiến hành triển khai chiến dịch truyền thông nhân ngày 24/3: "Đổi mới tư duy của mỗi người để kiểm soát bệnh lao tốt hơn" Thiết nghĩ đây cũng chính là hướng giải pháp thích hợp và hiệu quả nhất trong bối cảnh hiện nay c ủa nước ta để góp phần kiểm soát và khống chế căn bệnh nguy hiểm này Vấn đề cốt lõi cần tiến hành trong thời điểm hiện tại chính là đổi mới tư duy về phòng và chống bệnh lao [13]

1.1.3.Tình hình lao kháng thuốc

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cảnh báo là bệnh lao kháng thuốc (drug- reisistant tuberculosis) đang lan nhanh hơn là các nhà chuyên gia y tế dự đoán Tại một số quốc gia tỉ lệ bệnh nhân mắc bệnh lao kháng thuốc đã lên tới con số chưa từng có là 20% Bác sĩ Mario Raviglione, giám đốc WHO nói "Cách đây 10 năm, không ai nghĩ tới con số cao như vậy Điều này chứng tỏ là chúng ta tiếp tục phạm sai lầm trong việc điều trị bệnh lao" [3]

Cho tới mãi 50 năm trước loài người mới tìm ra thuốc chữa lao Giờ đây

các dòng lao kháng thuốc đã xuất hiện và có 1,7% số ca mắc bệnh trên thế giới là các ca kháng đa thuốc (MDR) Năm 2006, dòng lao kháng thuốc cực mạnh (XDR) bắt đầu xuất hiện Chủng lao XDR này không chỉ kháng những thuốc ở tuyến đầu

mà còn kháng ít nhất 3 loại thuốc ở tuyến 2- tuyến phòng thủ cuối cùng chống vi trùng lao, vốn gây độc hại nhiều hơn cho bệnh nhân cùng với thời gian điều trị và chi phí đắt đỏ Sự lây lan của lao kháng thuốc cực mạnh được tiếp sức bởi đại dich HIV, hệ thống chăm sóc sức khỏe cộng đồng yếu kém, và sự sao lãng biện pháp kiểm soát lây nhiễm [7]

Theo ước tính của WHO, trên thế giới có khoảng 424.203 người bị mắc MDR, chiếm số lượng lớn nhất là khu vực Tây Thái Bình Dương 152.203 trường hợp, kế đến là khu vực Đông Nam Á và sau là khu vực Đông Âu và Châu Phi Một

số nước có tỷ lệ MDR ở những bệnh nhân lao mới rất cao là: Cộng hòa Dominica, Ecuador, Bờ biển Ngà, Latvia, Uzbekistan, Trung quốc, Iran, Israel [6]

Từ nhiều năm nay, Tổ chức Y tế Thế giới đã định nghĩa bệnh lao kháng đa thuốc (MDR-TB: Multi Drug Resistace- Tuberculosis) là vi khuẩn lao đã kháng lại isoniazid (rimifon) và rifampicin (đây là những thuốc trong số các thuốc chống lao hàng đầu gồm: isoniazid (H), rifampicin (R), ethamintol (E) và streptomicin (S) Giờ đây WHO lại đưa ra khái niệm bệnh lao cực kháng thuốc (XDR-TB: Extreme Drug Resistance- Tuberculosis) là vi khuẩn đã kháng lại isoniazid, rifampicin và từ

3 thuốc thuốc chống lao hàng thứ 2 trở nên gồm : kanamycin, ofloxacin, cycloserin, PAS có nghĩa là XDR-TB = MDR-TB > 3 thuốc hàng thứ 2 [14]

Trước tình hình XDR ngày càng trầm trọng, do vậy từ tháng 11/2004 đến 11/2005, WHO và trung tâm kiểm soát bệnh Hoa Kỳ đã tiến hành phân tích 17.690 mẫu đàm được gửi từ 40 quốc gia trên toàn thế giới Kết quả phân tích cho thấy có 20% trường hợp là MDR và 2% là XDR Khu vực Tây Thái Bình Dương (trong đó

có Việt Nam) thì MDR là 4,2% ở bệnh nhân lao mới và 26% các trường hợp có tiền căn trị lao [6]

Năm 1998, TCYTTG đã công bố kết quả khảo sát tình hình vi khuẩn lao kháng thuốc ở 35 nước và khu vực trên thế giới, theo công bố này tỷ lệ kháng thuốc tiền phát trung bình với riêng từng loại thuốc có khác nhau, cụ thể là: kháng isoniazid 3,2%, rifampicin 0,2%, ethambutol 0,3%, streptomycin 2,5% Tỷ lệ kháng

thuốc tiền phát trung bình là 9,9% trong đó kháng 1 thuốc chiếm 6,6%, kháng 2 thuốc chiếm 2,5%, kháng 3 thuốc chiếm 0.6%, 4 thuốc là 0,2% kháng đa thuốc trung bình là 1,4% [11], [14]

Tình hình kháng thuốc mắc phải với từng loại thuốc cũng khác nhau: Kháng isoniazid trung bình là 6,3%, rifampicin 0,7%, Ethambutol 0,4%, strtomycin 2,6%.Tỷ lệ kháng thuốc trung bình trên thế giới là 36%, trong đó kháng 1 loại thuốc 12,2%, 2 loại thuốc là 9,7%, 3 loại thuốc là 5,4%, 4 loại thuốc là 4,4% Lao kháng

đa thuốc mắc phải có tỷ lệ trung bình là 13% [11], [14]

Tổ chức Y tế Thế giới ngày 19.3.2010 cảnh báo tình trạng bệnh lao kháng thuốc đã lan rộng đến mức kỷ lục trong thời gian qua, với khoảng 440.000 bệnh nhân năm 2008 và 1/3 trong số này đã tử vong Hiện 27 nước trên thế giới có số bệnh nhân lao kháng thuốc (MDR-TB) cao nhất, dự báo chi phí điều trị bệnh nhân lao MDR-TB ở 27 nước này sẽ mất khoảng 3 tỉ USD/năm Mức độ phổ biến kháng thuốc qua con đường lây truyền là rất cao - tới 99% - so với kháng thuốc mắc phải

do thất bại trong điều trị "Các kết quả của chúng tôi dự báo rằng các dòng lao kháng thuốc sẽ trở nên rất phổ biến trong một vài thập kỉ tới", tiến sĩ Fabio Luciani đến từ đại học New South Wales, trưởng nhóm nghiên cứu, cho biết "Kết quả cũng cho thấy hạn chế lây truyền bệnh chính là cách làm hiệu quả để giảm thiểu tác động của kháng thuốc" [6], [37]

Việc nghiên cứu lao kháng thuốc ở Việt Nam được tiến hành khá sớm Năm

1958 Phạm Ngọc Thạch và cộng sự đã công bố tỷ lệ kháng thuốc mắc phải với isoniazid là 53%, với paraminosacylic acid là 26%, với streptomycin là 59% [11]

Theo chương trình chống lao quốc gia, điều tra tình hình kháng thuốc năm 2001-2002 cho thấy, 3% bệnh nhân mới và 23,5% bệnh nhân cũ đã kháng thuốc chính vì điều này mà nước ta bị xếp là một trong những điểm nóng về bệnh lao trên thế giới Tình trạng thuốc lao lưu hành tràn lan trên thị trường với nhiều xuất xứ, nhà nước không kiểm soát được giá cả và chất lượng thuốc, sự thực hiện điều trị DOTS lỏng lẻo và không đến nơi đến chốn ở một số tỉnh, đã dẫn tới tỷ lệ kháng

thuốc lao: SM là 24,1%; INH 20,0%; RIF 3,6%; EMB 1,1%; INH+RIF 0,5%; INH+SM 10,9%; MDR 2,3% [3], [11]

Các bằng chứng mới nhất về bệnh lao siêu kháng thuốc đã được xác định ở nhiều nơi trên toàn cầu Ở Mỹ 4% các bệnh nhân lao đa kháng thuốc lâm vào tình trạng siêu kháng thuốc Còn ở Latvia tỷ lệ bệnh lao siêu kháng thuốc là 19% Tại tỉnh Kwazulu Natal của Nam phi, trong số 554 bệnh nhân tử vong có 221 người mắc bệnh lao đa kháng thuốc, trong đó có 53 ca bệnh lao siêu kháng thuốc [12]

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2009, tỷ lệ kháng thuốc của Việt Nam là 2,7% Việt Nam đã có mặt trên bản đồ lao siêu kháng của thế giới Thế giới có hơn 50 triệu người nhiễm vi trùng lao kháng thuốc và hơn 400.000 là lao đa kháng Dựa trên những con số thu thập được ở những bệnh nhân thuộc 82 nước và khu vực, tỷ lệ trung bình lao kháng nhiều thuốc lên đến 5,3% trong tổng số những trường hợp bệnh lao mới phát hiện Trong một số vùng trên thế giới, hầu như cứ 4 trường hợp thì có một trường hợp kháng nhiều thuốc, chẳng hạn như ở khu vực Bakou, thủ đô của Azerbaidjan, tỷ lệ kháng nhiều thuốc lên đến 22,3% Ở Moldovia, tỷ lệ này là 19%.WHO cũng bày tỏ lo ngại sâu sắc về những trường hợp bệnh lao gây nên bởi các vi khuẩn có sức đề kháng mạnh, một dạng hầu như không thể điều trị được hiện nay [13]

Hiện có tới 27.000 trường hợp siêu kháng thuốc chống lao trong 45 trên 81 nước và khu vực được nghiên cứu, và đó cũng chỉ là phần nổi của tảng băng Hầu hết bệnh nhân lao kháng thuốc đều phải tự túc điều trị, rất tốn kém, gấp 200 lần so với chi phí điều trị lao thông thường Do vậy, chỉ có một số ít bệnh nhân có điều kiện mới có thể điều trị đến nơi, đến chốn, số còn lại hầu hết điều trị dang dở và trở thành gánh nặng cho gia đình và xã hội Sự xuất hiện của lao kháng thuốc đang và sẽ là mối đe dọa lớn cho sức khỏe của con người Do đó việc phát hiện, ngăn chặn sự phát triển tràn lan của các chủng lao kháng thuốc là việc làm cấp bách hiện nay [13]

1.2 Vi khuẩn lao

1.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn lao

Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ Actinomycetales,

phân bộ, họ Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium [1]

Tên khoa học của vi khuẩn lao là: Mycobacterium tuberculosis

Các chủng vi khuẩn lao được chia làm 2 nhóm: Mycobacterium tuberculosis

complex gồm bốn loài có khả năng gây bệnh ở người, và nhóm Mycobacteria other than tuberculosis gồm nhiều loài không gây bệnh ở người [16]

Vi khuẩn lao có hình trực khuẩn, có kích thước từ 2 - 4µm, rộng 0,3 - 1,5µm Trực khuẩn thanh mảnh đứng riêng lẻ hoặc xếp thành hình chữ N, Y, V hoặc thành dãy phân nhánh như cành cây Vi khuẩn lao không di động, không sinh bào tử, khó bắt mầu với các thuốc nhuộm thông thường do có lớp xốp ở thành tế bào [4], [16]

Vi khuẩn lao sống hiếu khí, phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 370

C và áp suất của

O2 là 100mmHg Đỉnh phổi và vùng phổi dưới xương đòn thường hay mắc lao nhất

vì có áp suất O2 từ 120 - 130 mmHg (khi đứng) rồi đến thân xương và đầu xương vì

áp suất O2 ở đây là 100mmHg Lách, gan, dạ dày, thực quản ít mắc lao hơn và áp suất O2 thấp Chúng phân chia rất chậm từ 16 - 20 giờ, so với các vi khuẩn khác

thời gian chỉ tính bằng phút, như E.coli thời gian phân chia 20 phút Tốc độ phân

chia của vi khuẩn lao chậm có thể do tính thẩm thấu của thành tế bào hạn chế trong việc hấp thụ chất dinh dưỡng và liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome Thành tế

bào của vi khuẩn lao có chứa peptidoglycan nhưng chúng không được phân loại

Gram dương hay âm vì chúng không có đặc tính hóa học này và cấu trúc của các vi

khuẩn lao là các lipit gắn với thành tế bào chứ không phải các protein hay

polysacharide do đó chúng không giữ lại những tinh thể màu tím xuất hiện trong nhuộm Gram [4], [9], [36]

Vi khuẩn lao được xác định dưới kính hiển vi bằng đặc tính nhuộm Ziehl - Neelsen, nó vẫn giữ màu nhuộm sau khi xử lí với dung dịch axit, nên được phân

loại là " trực khuẩn kháng axit " (acid fast bacillus, viết tắt AFB), AFB sẽ có màu

đỏ tươi trên nền xanh (Hình 1.1) Đặc điểm này rất quan trọng để phát hiện vi khuẩn lao trong các bệnh phẩm Ngoài ra, vi khuẩn lao cũng có thể được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang hoặc nhuộm arylmethane như auramine [18], [41]

Hình 1.1 Vi khuẩn lao dưới kính hiển vi với đặc tính nhuộm Ziehl - Neelsen

1.2.2 Cấu tạo của vi khuẩn lao

Vi khuẩn lao có cấu tạo rất phúc tạp nhưng hoàn hảo, ít vi sinh vật nào có được Nhìn dưới kính hiển vi vi khuẩn lao gồm các lớp (Hình 1.2)

Hình 1.2 Cấu tạo thành tế bào của M tuberculosis

(http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis/Research/basicResearch/biology

cell.htm)

- Lớp trong cùng có cấu trúc màng, có thành phần chủ yếu là các phospholipids gồm 2 nhóm: nhóm ưa nước hướng vào bên trong, nhóm kị nước quay

ra ngoài Cấu trúc này tạo nên màng sinh học có tác dụng giúp trực khuẩn điều hòa sự thẩm thấu của vỏ ngoài trực khuẩn, màng còn chứa các protein chức năng khác như các protein truyền tín hiệu đến bộ máy trao đổi chất và di truyền trong nguyên sinh chất, các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng lượng, các chất mang làm trung gian cho quá trình vận chuyển các chất dinh dưỡng và ion Các enzyme xuyên màng và tổng hợp màng, tạo thành vách ngăn trong phân chia tế bào, tập hợp và tiết một số enzyme ngoại bào, sao chép DNA [1], [32]

- Lớp tiếp theo là peptidoglucan liên kết với đường arabinose và các phân tử mycolic acid tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vi khuẩn

có độ cứng nhất định Thành tế bào của mycobacteria là cấu trúc phức tạp nhất

được biết ở prokaryot, có một số thành phần hóa học và liên kết chéo bất thường,

mức độ liên kết giữa peptidoglucan ở thành tế bào M tuberculosis là 70 - 80% trong khi ở vi khuẩn E coli là 20 - 30% [4]

- Lớp ngoài là lớp được tạo nên bởi sự liên kết giữa các mycolic acid và các chất lipid phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấu trúc phức tạp làm tăng khả năng chống thấm nước của thành tế bào vi khuẩn giúp trực khuẩn tồn tại lâu với môi trường bên ngoài, chống khả năng bị hủy diệt bởi đại thực bào và các tế bào miễn dịch [41]

- Lớp vỏ ngoài cùng có vai trò rất quan trọng, có cấu trúc peptidoglylipid Nó đảm bảo sự tồn tại của trực khuẩn, làm cho trực khuẩn bền vững với hiện tượng thực bào, giúp bảo vệ khỏi áp suất thẩm thấu nên khi vào cơ thể trực khuẩn khó bị tiêu diệt [4], [33]

1.2.3 Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn lao vào cơ thể qua nhiều đường, thường là qua hô hấp, bên cạnh đó

là các đường tiêu hóa, da, kết mạc mắt Sau khi gây tổn thương tiên phát, vi khuẩn

lao có thể theo đường bạch huyết hoặc đường máu tới cơ quan khác gây tổn thương thứ phát Nhiều cơ quan: phổi, thận, màng não, xương, hạch, da đều có thể bị vi khuẩn lao xâm nhập, nhưng thường bị hơn cả là phổi và vị trí gặp nhiều nhất là đỉnh phổi, nơi có phân áp oxy 120 mmHg [12]

Độc lực của vi khuẩn lao có liên quan đến "Cord factor" (trehalose - 6,6 - dimycolate) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu, gây nên những u hạt mãn tính Vi khuẩn lao khi xâm nhập vào cơ thể sẽ xuất hiện đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào Đáp ứng miễn dịch sẽ làm chậm quá trình nhân lên của vi khuẩn lao, gây hạn chế tràn lan của vi khuẩn lao dẫn tới phá hủy tế bào vi khuẩn Lúc này, đại thực bào, các tế bào lympho B, lympho T và các nguyên bào sợi kết tập lại tạo thành các u hạt, với các tế bào lympho vây quanh đại thực bào Chức

năng của các u hạt không chỉ ngăn cản sự lan tỏa của các tế bào M tuberculosis mà

còn tạo môi trường tại chỗ cho các tế bào của hệ miễn dịch trao đổi thông tin Bên trong các u hạt, tế bào lympho T tiết ra các cytokine, như interferron, hoạt hóa đại thực bào khiến chúng diệt khuẩn tốt hơn Tế bào bào lympho T cũng tiêu diệt trực tiếp các tế bào bị nhiễm Nhưng điều quan trọng là vi khuẩn không bị u hạt loại trừ hoàn toàn mà trở nên bất hoạt tạo dạng nhiễm khuẩn "tiềm ẩn" [23]

1.3 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao

Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn lao xảy ra trước hoặc sau khi xâm nhập cơ thể người bệnh [1] Trường hợp kháng thuốc xảy ra trước khi xâm nhập vào

cơ thể người bệnh gọi là kháng thuốc tiên phát, là hiện tượng lây nhiễm bởi một chủng đã kháng thuốc mà vi khuẩn này đã có sự đề kháng tự nhiên Vì vậy, bệnh nhân mắc lao do sự lây nhiễm này, ngay từ đầu vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể

đã có sự đề kháng với thuốc đang sử dụng Còn hiện tượng kháng thuốc xảy ra sau khi xâm nhập vào cơ thể còn gọi là kháng thuốc thứ phát xảy ra đối với các chủng

vi khuẩn lao ở bệnh nhân nào đó dùng thuốc chống lao không đúng quy định, không đúng liều lượng, thời gian sử dụng thuốc Người ta cho rằng đây là hiện tượng đa kháng thuốc của vi khuẩn lao do đột biến một bước ở nhiều gen [31], [33]

Các nguyên nhân gây ra kháng thuốc là:

+ Thuốc hoặc gen đích trong các chủng kháng thuốc bị biến đổi do đó không còn khả năng diệt khuẩn

+ Sản phẩm gen, mà hoạt tính của nó bị ức chế bởi thuốc chống lao được vi khuẩn lao sản xuất thừa ra

+ Những thay đổi xảy ra ở mức độ phân tử và cơ chế xâm nhập của thuốc vào bên trong tế bào vi khuẩn làm cho nồng độ thuốc bên trong tế bào không đạt

nồng độ tối thiểu để có thể diệt khuẩn

1.4 Các phương pháp chẩn đoán lao kháng thuốc

Chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc trong các phòng thí nghiệm trên thế giới hiện nay gồm có 2 phương pháp đó là phương pháp xác định kiểu hình và phương páp xác định kiểu gen

1.4.1 Các phương pháp xác định kiểu hình

Các phương pháp xác định kiểu hình thông thường có thể là: Phương pháp xác định tương quan, phương pháp xác định tỷ lệ kháng, phương pháp nồng độ tuyệt đối

Các phương pháp mới trong xác định kiểu hình gồm có: Sử dụng phage (phase-base methods), phương pháp đo màu (colorimetric methods), phương pháp khử nitrat (the nitrate reductase assay), phương pháp lớp thạch mỏng (the thin - layer ager method) [19], [33]

Các phương pháp này đều xác định khả năng phát triển của vi khuẩn lao trong môi trường nuôi cấy có kháng sinh Từ đó có thể kết luận về sự kháng thuốc của chủng vi khuẩn nghiên cứu Nhược điểm của phương pháp này là thời gian nuôi cấy

để chẩn đoán quá dài, ít nhất mất 2 - 4 tuần Điều này làm cho công tác điều trị và kiểm soát tình hình bệnh lao kháng thuốc còn gặp nhiều khó khăn [21]

1.4.2 Các phương pháp xác định kiểu gen

Hiện nay có nhiều phương pháp xác định kiểu gen được ứng dụng để chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc, các phương pháp đó bao gồm:

- Giải trình tự gen (Sequencing) [9]

- Lai trên pha rắn (Solid-phase hybridization techniques) gồm: tets LiPa, kỹ thuật PLH (PCR - reverse lineblot hybridization) hay kỹ thuật Spoligotyping…[31]

- Real-time PCR [19]

- Microarrays [18]

Các phương pháp chẩn đoán kiểu gen đều dựa trên cơ sở xác định đột biến ở các gen có liên quan đến kháng thuốc tương ứng [40] Phương pháp sử dụng các kỹ thuật cao đòi hỏi trang thiết bị máy móc hiện đại, tốn kém và cần nhân lực có trình

độ chuyên sâu Nhưng thời gian chẩn đoán bằng các phương pháp này nhanh hơn,

có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Các phương pháp xác định kiểu gen vì vậy có ý nghĩa rất lớn, đã tạo bước đột phá cho công tác điều trị và kiểm soát bệnh lao

1.5 Chẩn đoán vi khuẩn lao kháng Isoniazid

Isonaizid có tên khoa học là isonicotinic acid hydrazide, công thức hóa học là

C8H7N3O và là một trong các loại thuốc kháng lao mạnh nhất, nó ở dạng bột màu trắng dễ hòa tan trong nước Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 0,02 - 0,2 mg/L

Hình 1.3 Công thức cấu tạo isoniazid [37]

Vi khuẩn lao kháng isoniazid được xác định theo phương pháp chẩn đoán kiểu gen Các phương pháp chẩn đoán kiểu gen đều dựa trên cơ sở xác định đột biến

ở các gen có liên quan kháng thuốc tương ứng

Để xác định đột biến trên gen katG và gen inhA hiện có nhiều phương pháp,

song giải trình tự gen vẫn là phương pháp cơ bản, chính xác, rõ ràng nhất [35]

Để giải trình tự gen katG và gen inhA, hiện nay có thể thực hiện trực tiếp từ

sản phẩm PCR Khi sản phẩm PCR là đơn nhất và có độ dài thích hợp cho việc phân tích kết quả thì có thể thực hiện giải trình tự trực tiếp [10] Cũng có thể giải

trình tự thông qua tách dòng, gắn đoạn gen katG hoặc inhA cần nghiên cứu vào vector Đoạn gen cùng với vector tái tổ hợp được nhân lên trong tế bào E coli Khi giải trình tự gen, cả đoạn gen katG hoặc đoạn gen inhA và một phần vector đều

được xác định trình tự Giải trình tự thông qua tách dòng được ứng dụng khi sản phẩm PCR không được tốt, đặc biệt là trong các trường hợp gây đột biến nhân tạo kiểm chứng kháng thuốc và trong nghiên cứu biểu hiện gen [39]

Giải trình tự (DNA squencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotide trong phân tử DNA Nguyên lý của phương pháp này là: Tổng hợp các mạch đơn DNA mới có độ ngắn hơn mạch khuôn, nhờ kĩ thuật đánh dấu và ngắt đoạn trong quá trình tổng hợp mạch DNA, thu được các mạch đơn hơn kém nhau một base từ đó có được sơ đồ trật tự mạch DNA khuôn mẫu So sánh trật tự của mẫu thí nghiệm với trật tự DNA chuẩn ta biết được vị trí sai lệch (đột biến) [17], [21]

Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử đã xác định được các chủng khuẩn lao

kháng isoniazid là do có đột biến ở gen katG và gen inhA Codon xảy ra đột biến là

codon 315 [20]

Sự đột biến xảy ra là do thay thế nucleotide ở codon 315 (AGC → ACC hoặc AGC → ACA) [20]

1.5.1 Đặc điểm của hệ gen vi khuẩn lao

Hệ gen của vi khuẩn lao đã được đọc trình tự, có chiều dài 4.411.522.cặp base trong đó có 3.924 trình tự được dự đoán là mã hóa protein, tỷ lệ G + C chiếm đến 65,6% Genome của vi khuẩn lao có chứa tới 90,8% trình tự mã hóa protein và

chỉ có 6 gen giả [20], [28]

1.5.2 Gen katG với cơ chế kháng thuốc isoniazid ở vi khuẩn lao

Gen katG là một đoạn DNA có kích thước 2223 bp, nằm trên nhiễm sắc của

vi khuẩn lao và chịu trách nhiệm mã hóa cho enzyme catalase - peroxidase Người

ta nhận thấy có khoảng 95% các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid có đột biến

trên gen này [20]

Gen katG mã hóa cho enzyme catalase - peroxidase Enzyme này hoạt hóa

isoniazid bằng cách kết hợp axyl isonicotinic với NADH để tạo thành phức hệ axyl isonicotinic - NADH Phức hệ này liên kết chặt chẽ với enzyme katoenoylreductese

(mã hóa bởi gen inhA), theo đó làm ngăn cản cơ chất enoyl - AcpM Quá trình này

làm ức chế sự tổng hợp acid mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao [20] Cơ chế phân tử của tính kháng isoniazid chủ yếu có liên quan đến đột biến thêm/mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/vô nghĩa, trong đó chủ yếu diễn ra tại codon 315 và

463 của gen katG mã hóa catalase - peroxidase Nếu có sự biến dạng hay đột biến ở base thứ 2 trên codon 315 của gen katG (AGC biến thành ACC hay ACA) sẽ dẫn

đến làm giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của enzyme catalase - peroxidase do đó

M.tuberculosis sẽ trở thành kháng thuốc isoniazid [39] Do đó phát hiện sự thay đổi

di truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc nhanh và chính xác cho việc phát hiện các chủng M tuberculosis kháng isoniazid

1.5.3 Gen inhA với cơ chế kháng thuốc isoniazid ở vi khuẩn lao

Gen inhA là một đoạn DNA có kích thước 810 bp, nằm trên nhiễm sắc thể

của vi khuẩn lao Người ta nhận thấy có khoảng 70 - 80% các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid có đột biến trên gen này [24], [29]

InhA cũng là một enzyme enoyl - acyl reductase Enzyme này hoạt hóa

isoniazid gây ảnh hưởng đến phức INH - NAD làm ức chế quá trình sinh tổng hợp

acid mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao [26] Cơ chế được đề xuất là

isoniazid hoạt động nhờ vào sự hoạt hóa của các peroxidase catalase katG tạo thành

một isonicotinoyl liên kết với NAD (NAD*) kết quả là tạo phức INH - NAD và

phức này bị ức chế bởi enzyme anoyl - acyl reductase inhA Quá trình ức chế này

làm tích lũy acid béo chuỗi dài, ức chế quá trình tổng hợp acid mycolic, và cuối cùng là tế bào chết [29]

Theo Leung và các đồng tác giả năm 2006, đã phát hiện một đột biến mới có liên quan tới cơ chế kháng isoniazid Đó là đột biến diễn ra tại vị trí 581 bp trên gen

inhA làm thay đổi acid amin Ile194Thr (ATC ACC) dẫn đến enzyme enoyl - acyl

reductase bị mất hoạt tính hoặc làm giảm liên kết ái lực của gen inhA và NADH, do

đó enzyme này sẽ không hoạt hóa isoniazid mà tạo ra acid mycolic vì vậy tế bào vi khuẩn lao sẽ kháng thuốc isoniazid (Hình 1.4).Vì vậy, việc phát hiện sự thay đổi di

truyền trên gen inhA có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc nhanh và chính xác cho việc phát hiện các chủng M.tuberculosis kháng isoniazid [29]

Ứng dụng phương pháp SHPT để xác định đột biến trên gen inhA Vị trí xảy

ra đột biến là 581 bp trên gen inhA do có sự thay thế nucleotide ATC → ACC

Hình 1.4 Cơ chế kháng thuốc isoniazid của gen inhA [37]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn lao này được phân lập từ mẫu đờm của các bệnh nhân lao ở bệnh viện Trung ương Huế (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Đặc điểm kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn lao

2.2 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu

Sigma (Mỹ) Sigma (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ)

Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ)

3 Hóa chất phục vụ giải trình tự gene

Big Dye Terminator V3.1

HiDi Formamid

Applied BioSciences (Mỹ) Applied BioSciences (Mỹ)

2.2.2 Máy và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Tủ ấm ổn nhiệt (hãng Sanyo - Nhật Bản)

Máy PCR (hãng Applied BioSciences - Mỹ)

Máy ly tâm (hãng Heraeus - Mỹ)

Máy đo pH (hãng Thommas Scientific - Mỹ)

Máy chụp ảnh Gel-Doc (hãng Dolphin - Mỹ)

Máy lắc Gyromax 737R (hãng Amerex Instrument - Đức)

Máy quang phổ tử ngoại khả biến Nano Drop (hãng Analitika - Đức)

Máy phân tích trình tự DNA ABI 3100 - Avant (hãng Applied BioSciences-Mỹ)

2.2.3 Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu

Dựa vào trình tự gen của chủng chuẩn Mycobacterium tuberculosis đã đƣợc

công bố trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế NCBI, cặp mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế

để khuếch đại vùng đột biến tại codon 315 của gen katG, và tại vị trí 518 bp của gen

inhA Trên cơ sở đó, các cặp mồi đặc hiệu đƣợc kiết kế tại vùng có độ bảo thủ cao

nhất và phải chứa vị trí đột biến

Cặp mồi sử dụng cho nhân trình tự gen katG và gen inhA là: (Bảng 2.3)

Bảng 2.3 Bảng đặc điểm cặp mồi sử dụng nghiên cứu

katG-R 5'- ACA AGC TGA TCC ACC GAG AC - 3'

katG-F 5' - GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG - 3'

inhA-R 5' - TTC CGC TCC GCC GAA CGA CAG - 3'

inhA-F 5' - CCA CAT CTC GGC GTA TTC G - 3'

2.2.4 Vector tách dòng được sử dụng trong nghiên cứu

Vector tách dòng được sử dụng trong nghiên cứu này là plasmid pBT [8]

Plasmid này có kích thước 2705 bp, bao gồm bla (gen kháng Carbenicilin) giúp tế bào vi khuẩn E coli có thể sinh trưởng trên môi trường chứa kháng sinh Carbenicilin, gen rep (replicon) có tác dụng giúp cho quá trình nhân lên của plasmid trong tế bào vi khuẩn E coli xảy ra nhanh chóng và dễ dàng, gen lacZ mã hóa cho

enzyme β - galactosidase, enzyme này có tác dụng phân hủy chỉ thị X - gal thành chất có tên gọi là 4-Cl-3-Br-indigo (có màu xanh) giúp cho việc chọn lọc khuẩn lạc

mang plasmid tái tổ hợp dễ dàng hơn Trên gen lacZ này có một đoạn polylinker

chứa nhiều vị trí nhận biết bởi enzyme cắt giới hạn khác nhau Sơ đồ của plasmid pBT được trình bày ở hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ plasmid pBT

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ phương pháp nghiên cứu (Hình 2.2)

Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Kỹ thuật tách chiết DNA từ các chủng vi khuẩn lao

Các bước tiến hành được thực hiện tại Học viện Quân Y: DNA từ mẫu đờm của bệnh nhân được tách chiết phỏng theo phương pháp của Chomezynski Sacchi (1987) [15]

DNA vi khuẩn lao

PCR

gen katG

Gắn gen katG vào plasmid pBT

Xác định vị trí đột biến

Các bước được thực hiện theo sơ đồ sau:

Cụ thể:

- Bệnh phẩm được xử lý bằng dung dịch Natri dichcloroisocyanurate 50% hoặc N-Acetyl L-Systein để đảm bảo tính an toàn Sau đó được ly tâm 6000 vòng/

30 phút để thu cặn (bệnh phẩm là đờm thì phải thêm 5ml dung dịch làm tan đờm, để

ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, lắc kỹ trước khi ly tâm.)

- Rửa cặn thu được bằng cách thêm 5ml dung dịch PBS (phosphat Buffer Saline 1X,ly tâm 6000 vòng/15 phút

Mẫu bệnh phẩm có chứa tế bào vi khuẩn lao

Phá vỡ tế bào vi khuẩn, loại bỏ các thành

phần không mong muốn

Ly tâm lấy dịch tế bào

Tủa DNA

Tinh sạch DNA

Cô đặc DNA và bảo quản

- Thêm vào ống eppendorf có chứa cặn vi khuẩn 1000µl lysis buffer HCl 1M, pH: 8,5 lấy 10ml, EDTA 0.5M: 1ml, SDS 10%: 2ml, NaCl 5M: 4ml, nước khử ion vừa đủ 100ml) và 20µl lysozyme (25mg/ml)

(Tris Ủ trong nước đá 30 phút

- Thêm 20µl proteinase K (10mg/ml), lắc kỹ

- Ủ ở 560C trên bàn ủ có lắc trong 2 giờ (hoặc qua đêm)

- Thêm vào mỗi ống 1000µl phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (tỷ lệ 1/1 với lysis buffer), lắc kỹ

- Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút Lấy nước nổi, bỏ ống chứa cặn sau ly tâm

- Chuẩn bị trước ống eppendorf có chứa 1000µl Ethanol 100% và 100µl

CH3COONa 3M (đặt trong nước đá)

- Hút nổi sau ly tâm sang ống eppendorf chuẩn bị ở trên, rồi lắc nhẹ ống vài lần, tiếp tục giữ trong lạnh ít nhất 3 giờ

- Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút, hút bỏ nước nổi, lấy cặn

- Rửa sạch bằng ethanol 70%, làm khô trong vaccumm dry 2-3 phút

- Hòa cặn DNA trong 100µl nước khử ion/ống để chuẩn bị chạy PCR và đo

OD

- Bảo quản ở 40C qua đêm, sau đó cất vào tủ -700C nếu chưa dùng ngay

2.3.2 Kỹ thuật PCR - Nhân dòng đoạn gen katG và gen inhA

1 DNA sau khi được tách chiết sẽ đo nồng độ DNA khuôn của các mẫu và

sử dụng 100 ng/ thể tích 25µl phản ứng

2 Trên cơ sở đó tính được thể tích của các thành phần khác trong hỗn hợp mix:

Hình 2.3 Sơ đồ chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

4 Điện di kiểm tra kết quả trên gel 1%

5 Nhuộm Ethidium bromide và chụp kết quả trên máy Gel - DOC

2.3.3 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit của hãng AccuPrep @

Gel purification kit - Bioneer

Sau khi nhân bản thành công đọan gen nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành làm sạch (thôi gel) bằng Kit - Bioneer theo quy trình của hãng sản xuất:

32 chu kỳ

Bước 1: Xác định thể tích mẫu

Bước 2: Cho dung dịch Binding Buffer vào ống eppendorf chứa mẫu với lượng gấp 5 lần thể tích mẫu

Bước 3: Lắp cột tinh sạch vào ống eppendorf 2ml

Bước 4: Dùng pipet hút dịch chứa mẫu thực hiện ở bước 2 vào cột tinh sạch (thể tích tối đa cho mỗi lần hút là 750µl)

Bước 5: Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 1 phút Đổ bỏ dịch chảy qua cột, DNA được giữ lại trên cột tinh sạch

Bước 6: Cho 500µl dung dịch Washing Buffer để rửa sạch DNA Ly tâm

12000 vòng/phút trong vòng 1 phút Đổ bỏ dịch chảy qua cột, giữ lại cột và ống

Bước 7: Lặp lại bước 6

Bước 8: Ly tâm khô với tốc độ 12000 vòng/phút trong 2 phút

Bước 9: Chuyển cột tinh sạch sang ống eppendorf 1,5ml

Cho 30µl dung dich Elution Buffer vào cột tinh sạch, để yên 1 phút

Bước 10: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút

2.3.4 Kỹ thuật tách dòng gen (cloning)

2.3.4.1 Ligase: Gắn đoạn gen quan tâm vào vector tách dòng pBT

- Thành phần phản ứng gắn đoạn gen vào vector tách dòng:

2.3.4.2 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5α

Bước 1: Tế bào khả biến lấy từ tủ âm - 830C đã được rã đông trên đá trong thời gian 30 phút

Bước 2: Bổ sung 10µl vector tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến và đảo nhẹ Bước 3: Giữ trên đá 30 phút

Bước 4: Sốc nhiệt ở 420

C trong vòng 1 phút 30 giây

Bước 5: Để ở trong đá 1 - 2 phút

Bước 6: Bổ sung 150µl môi trường LB lỏng

Bước 7: Nuôi lắc ở 370C, lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ

Bước 8: Cấy trải trên đĩa chứa môi trường LB đặc có bổ sung cabenicilin Thành phần môi trường trong một đĩa gồm:

Bước 9: Ủ ở 370

C trong vòng 16 - 18 giờ

- Khi bề mặt đĩa thạch xuất hiện các tế bào xanh, trắng, lựa chọn các khuẩn lạc trắng chấm vào 3ml LB lỏng có chứa kháng sinh cabenicilin với nồng độ 100µg/ml

- Lấy 1μl dịch khuẩn làm phản ứng PCR để kiểm tra đoạn gen đã biến nạp thành công hay chưa (thực hiện giống phản ứng PCR nhân dòng gen) Sau đó điện

di kiểm tra kết quả PCR, nếu xuất hiện vạch tương ứng với đoạnh gen biến nạp

(katG và inhA) thì tiến hành tách plasmid các mẫu đó

2.3.4.3 Tách chiết plasmid tái tổ hợp bằng Kit

Bước 1: Lấy 2ml dịch khuẩn đã nuôi lỏng qua đêm vào ống eppendorf 2ml Bước 2: Ly tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút, đổ dịch thu cặn

Bước 3: Thêm 150µl buffer 1, votex nhẹ cho tan hết cạn tế bào

Bước 4: Thêm 150µl buffer 2

Bước 5: Thêm 300µl buffer 3, đảo nhẹ và nhanh

Bước 6: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút ở 40

C Bước 7: Chuyển dịch thu được vào cột tách plasmid

Bước 8: Thêm 500µl buffer 4

Bước 9: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ở 40

C

Bước 10: Loại bỏ dịch qua cột, chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml

Bước 11: Thêm 50µl buffer 5, đợi khoảng 1 - 2 phút cho nước thấm hết màng lọc

Bước 12: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ở 40

C

Bước 13: Bỏ cột, điện di kiểm tra

2.3.4.4 Tách chiết plasmid tái tổ hợp bằng Sol

Bước 1: Hút 1800µl dịch khuẩn lỏng sang ống eppendorf 2ml, ly tâm 8000 vòng/phút trong 3 phút ở 40C rồi đổ dịch thu cặn khuẩn lạc

Bước 2: Thêm 100µl sol 1, làm tan cặn khuẩn bằng máy vontex

Bước 3: Thêm 200µl sol 2, đảo nhẹ lên xuống 3 - 4 lần Giữ trên đá 1 phút Bước 4: Thêm 150µl sol 3, đảo nhanh ngay sau khi cho sol 3 vào để tránh kết tủa cục bộ, giữ ở 00

C trong vòng 2 - 5 phút

Bước 5 : Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C hút dịch chuyển sang ống eppendorf 2ml bỏ cặn

Bước 6: Thêm một lượng chloroform : isoamyl tỉ lệ 24 : 1 Lắc mạnh rồi ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút ở 40C Hỗn hợp sẽ chia thành 2 pha, ta hút pha trên sang ống eppendorf 1,5ml

Bước 7: Tủa acid nucleic bằng cách bổ sung một lượng đương isopropanol đảo đều ủ ở - 200C trong 30 phút hoặc 2 lần thể tích ethanol 98%, đảo đều và ủ ở - 200C trong 3 giờ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 40

C

Bước 8: Rửa bằng cồn 70% với một lượng tương đương Ly tâm 13000 vòng/phút trong 8 phút ở 40C Đổ dịch thu cặn và làm khô

Bước 9: Thêm 50µl nước deion có chứa RNAase hoặc dung dịch TE pH8

2.3.4.5 Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chèn vào plasmid

Sử dụng enzyme cắt giới hạn BamHI để cắt plasmid Theo như sơ đồ vector

pBT thì chỉ cần một enzyme này là có thể cắt ở cả hai đầu phía trước vị trí của đoạn gen chèn vào Kết quả thực hiện phản ứng cắt sẽ thu được hai phần: Tạo một vạch

trên hình ảnh điện di có kích thước 684bp (đối với gen katG) và 501bp (đối với gen

inhA) và một vạch là phần còn lại của plasmid khoảng 2705bp

mẫu nào có vạch tương ứng với vị trí 684bp (đối với gen katG) và 501bp (đối với gen inhA) thì có thể sử dụng để đọc trình tự

Sau khi xác định được mẫu plasmid đi đọc trình tự, pha loãng plasmid 50 lần rồi hút 10µl mẫu đó cho vào Eppendorf, bổ sung thêm 5µl RNAase Sản phẩm được tiến hành ở bể ổn nhiệt 370

C trong vòng 120 phút để khử RNA

2.3.4.6 Phương pháp đọc trình tự DNA theo Sanger

Trình tự nucleotide được xác định trên máy đọc trình tự, tự động tại phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về Công nghệ gen - Viện Công nghệ Sinh học

+ Phân tích kết quả:

- Kiểm tra kết quả thu được bằng phần mềm máy tính ABI3130

- Khai thác dữ liệu từ ngân hàng gen, thiết lập chủng wild type để so sánh

- Xử lý, phân tích các trình tự gen katG và gen inhA có kích thước khoảng

684bp và 501bp của các chủng vi khuẩn lao bằng chương trình phân tích chuỗi BioEdit So sánh đối chiếu với các dữ liệu ở ngân hàng gen để có kết quả các vị trí đột biến của từng chủng nghiên cứu

Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê, sử dụng chương trình phân tích sinh học Star View v5.0 để xác định các mối liên quan kháng thuốc

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số

Chúng tôi đã tiến hành tách DNA tổng số từ các mẫu đờm của bệnh nhân theo phương pháp Chomczynsk & Sacchi năm 1987 sử dụng hóa chất Trizol của hãng Invitrogene

Sau khi tách, DNA tổng số được rửa bằng cồn 70% và làm khô, sau đó hòa tan với 100µl nước deion Muốn chắc chắn sản phẩm tách DNA tổng số đủ tiêu chuẩn sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi đã kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA

3.2 Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số

Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số được kiểm tra theo phương pháp quang phổ kế (phương pháp đo OD)

Phương pháp này dựa vào sự hấp thụ cực đại tia tử ngoại ở bước sóng 260nm (A260nm) đối với acid nucleic và bước sóng 280nm (A280nm) đối với protein Để xác định nồng độ DNA ta dựa vào chỉ số A260, một đơn vị A260nm ứng với nồng độ của acid nucleic sợi kép đạt 50µg/ml Dựa vào tỉ lệ giữa A260nm / A280nm ta có thể xác định được độ tinh sạch của sản phẩm tách DNA Một sản phẩm tách DNA được coi

là tinh sạch khi tỉ lệ A260nm / A280nm nằm trong khoảng 1,8 - 2,0 [5]

Nồng độ DNA (µg/ml) được tính theo công thức:

CDNA = A260nm x 50 x d (d: là độ pha loãng mẫu) Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số từ các mẫu bệnh phẩm được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả đo OD của các mẫu nghiên cứu

độ tinh sạch không đồng đều Tuy nhiên, với nồng độ cũng nhƣ độ tinh sạch của các

mẫu DNA này vẫn đủ điều kiện để nhân dòng đoạn gen katG và gen inhA bằng kỹ

thuật PCR

3.3 Kết quả nhân dòng đoạn gen inhA và gen katG

Sử dụng sản phẩm DNA tổng số từ các mẫu bệnh phẩm đã được tách chiết làm khuôn mẫu, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu

để khuếch đại đoạn gen có chứa vùng đột biến của vi khuẩn lao

Thành phần phản ứng PCR và chu kì nhiệt đã được trình bày ở mục 2.3.2 Kết quả của phản ứng PCR được kiểm tra trên gel agarose 1%

3.3.1 Kết quả nhân dòng đoạn gen inhA

Sử dụng cặp mồi inhA-R và inhA-F, chúng tôi đã tiến hành nhân đoạn gen

inhA từ 17 mẫu bệnh phẩm DNA của vi khuẩn lao bằng kỹ thuật PCR Kết quả

được trình bày ở hình 3.1

Hình 3.1 Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen inhA M: Marker 1kb, ĐA1-ĐA3-ĐA4-ĐA5-ĐA6-ĐA7-ĐA10-ĐA11-ĐA13-ĐA15-ĐO1-ĐO2-

ĐO8-ĐO9-ĐO10-ĐO11-ĐO12 Chủng kháng thuốc, ĐC: Đối chứng âm

+ Kết quả từ hình 3.1 cho thấy cả 17 chủng vi khuẩn lao đều xuất hiện băng DNA có chiều dài khoảng 501bp Các vạch DNA đặc hiệu rõ dàng, không có vạch phụ kèm theo và có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết Điều này chứng tỏ đoạn gen

inhA đã được nhân đặc hiệu

3.3.2 Kết quả nhân dòng đoạn gen katG

Tương tự với gen inhA, với cặp mồi katG-R và katG-F, chúng tôi đã nhân được đoạn DNA đặc hiệu có kích thước khoảng 684bp của gen katG, đúng với tính

500bp

250bp

501bp 501bp

500bp 250bp

700 bp

700 bp