nghiên cứu bảo tồn vốn gen cây ngưu tất (achyranthes bidentata blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHÓ THỊ THUÝ HẰNG NGHIÊN CỨU BẢO TỒN VỐN GEN CÂY NGƯU TẤT ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT LUẬN VĂN T

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHÓ THỊ THUÝ HẰNG

NGHIÊN CỨU BẢO TỒN VỐN GEN CÂY NGƯU TẤT

(ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI

CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, 2010

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHÓ THỊ THUÝ HẰNG

NGHIÊN CỨU BẢO TỒN VỐN GEN CÂY NGƯU TẤT

(ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI

CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ TÂM

Thái Nguyên, 2010

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này Tôi xin trân thành cảm ơn Th.S Vũ Anh Tuấn, KTV Lương Thị Hồng Vân

- bộ môn Hoá hữu cơ - Khoa Hoá học trường Đại học Sư phạm đã tận tình hướng dẫn tôi thực hiện một số thí nghiệm trong luận văn Tôi xin cảm ơn KTV Đào Thu Thuỷ (PTN Công nghệ Tế bào thực vật), KTV Trần Thị Hồng (PTN Di truyền học), đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tiến hành các thí nghiệm

Tôi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm cùng các thầy cô giáo, cán bộ Khoa Sinh - KTNN, Khoa Hoá học - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn này

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố

Tác giả

Phó Thị Thúy Hằng

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Những chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Nội dung nghiên cứu 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu chung về cây Ngưu tất 4

1.1.1 Đặc điểm phân loại 4

1.1.2 Một số đặc điểm nông sinh học của cây Ngưu tất 4

1.1.3 Kĩ thuật trồng, chăm sóc, thu hái và bảo quản sau thu hoạch 5

1.2.Tình hình sản xuất Ngưu tất trên thế giới và ở Việt Nam 6

1.3 Ứng dụng cây Ngưu tất trong y học 8

1.3.1 Cơ sở hoá học tính chữa bệnh của cây Ngưu tất 8

1.3.2 Một số nghiên cứu ứng dụng cây Ngưu tất trong y học 10

1.4 Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực trong công tác nhân giống cây trồng 12

1.4.1 Ưu thế của nhân giống in vitro 12

1.4.2 Các phương thức nhân giống in vitro 14

1.4.3 Một số thành tựu trong nhân giống cây trồng bằng kĩ thuật

nuôi cấy in vitro 15

1.5 Ứng dụng kĩ thuật PCR - RAPD trong phân tích sự đa dạng di truyền 19

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu……… 23

2.1.1 Vật liệu thực vật 23

2.1.2 `Hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro 24

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu hợp chất saponin trong rễ cây Ngưu tất 28

2.2.3 Phương pháp sinh học phân tử 29

2.2.4 Phương pháp xử lí và tính toán số liệu 33

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Nghiên cứu nhân giống cây Ngưu tất và trồng thử nghiệm ngoài đồng ruộng 34

3.1.1 Nghiên cứu khử trùng hạt 34

3.1.2 Ảnh hưởng riêng rẽ của chất KTST đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Ngưu tất trong ống nghiệm 36

3.1.3 Ảnh hưởng của α-NAA tới sự tạo rễ của cây Ngưu tất trong ống nghiệm 42

3.1.4 Ảnh hưởng của tổ hợp chất KTST đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của cây Ngưu tất trong ống nghiệm 44

3.1.5 Kết quả đưa cây ra môi trường tự nhiên

49

3.2 Hàm lượng saponin tổng số trong rễ cây Ngưu tất in vitro trồng

ngoài đồng ruộng và cây trồng bằng hạt

DANH MỤC CÁC BẢNG

trang

Bảng 2.1 Thành phần cơ bản của môi trường MS 23

Bảng 2.2 Trình tự nucleotit của 5 đoạn mồi ngẫu nhiên………… 32

Bảng 3.1 Kết quả khử trùng hạt Ngưu tất 34

Bảng 3.2 Ảnh hưởng riêng rẽ của BAP và kinetin đến khả năng

Bảng 3.3 Ảnh hưởng riêng rẽ của BAP và kinetin đến tốc độ sinh

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của α-NAA đến hình thành rễ của cây Ngưu

tất trong ống nghiệm (sau 30 ngày) 42

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tổ hợp chất KTST đến khả năng nhân

chồi của cây Ngưu tất trong ống nghiệm 44

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tổ hợp chất KTST đến tốc độ sinh trưởng

Bảng 3.7 Kết quả đưa cây Ngưu tất ra môi trường tự nhiên 49

Bảng 3.8 Theo dõi một số chỉ tiêu sau 30 ngày đưa cây ra vườn ươm… 50

Bảng 3.9 Một số chỉ tiêu theo dõi rễ cây in vitro và rễ cây trồng

bằng hạt khi thu hoạch 50

Bảng 3.10 Hàm lượng hợp chất saponin trong rễ cây in vitro và

cây trồng bằng hạt 52

Bảng 3.11 Tổng số phân đoạn ADN xuất hiện của 5 mẫu ngưu tất

Bảng 3.12 Số phân đoạn ADN đa hình thu được từ 5 mẫu Ngưu

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến

Hình 3.2 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nảy mầm

Hình 3.3 Biểu đồ so sánh khả năng nhân chồi giữa BAP và kinetin 39

Hình 3.4 Biểu đồ so sánh tốc độ sinh trưởng giữa BAP và kinetin… 41

Hình 3.5 Ảnh hưởng riêng rẽ của BAP và kinetin đến khả năng

Hình 3.6 Hình ảnh rễ Ngưu tất trong môi trường có α-NAA 43

Hình 3.7 Biểu đồ ảnh hưởng của tổ hợp chất KTST đến khả

Hình 3.8 Biểu đồ ảnh hưởng của tổ hợp chất KTST đến tốc độ

Hình 3.9 Ảnh hưởng của tổ hợp chất KTST đến khả năng nhân chồi

và tốc độ sinh trưởng của cây Ngưu tất trong ống nghiệm 48

Hình 3.10 Một số hình ảnh đưa cây ra môi trường tự nhiên…… 51

Hình 3.11 Một số phản ứng định tính hợp chất saponin……… 53

Hình 3.12 Hình ảnh một số giai đoạn tách chiết hợp chất saponin 53

Hình 3.13 Hình ảnh điện di kiểm tra độ tinh sạch ADN………… 54

Hình 3.14 Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8%

Hình 3.15 Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8%

Hình 3.16 Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% mồi OPF10 58

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Theo báo cáo của Tổng Công ty Dược Việt Nam (năm 2000) cho thấy, Tổng công ty đã nhập khẩu 182 loại dược liệu với tổng khối lượng 18.300 tấn, trong đó có 81 loại nhập với khối lượng trên 100 tấn/loại Trong đó, có 13 loại thuốc đi từ động vật và khoáng vật; 169 loại từ cây thuốc, nhiều loại là thuốc bắc đầu vị, một số không có ở Việt Nam [33]

Hiện nay, dược liệu tự sản xuất trong nước (bao gồm thu hái trong tự nhiên và trồng trọt) không đáp ứng đủ nhu cầu, 60% phải nhập khẩu, có hơn

20 loài cây thuốc đã nhập nội thành công ở nước ta, đã từng sản xuất đạt sản lượng lớn, nay cũng phải nhập khẩu trở lại trong đó có cây Ngưu tất Có nhiều loài vốn là những cây trồng thế mạnh của Việt Nam cũng phải nhập từ nước khác như: Bạch biển đậu, Binh lang (hạt cau), Hoắc hương, Xạ can, Địa liền, Hồng hoa, Xuyên tâm liên, Ý dĩ [32]

Như vậy, trong khi thường xuyên xuất khẩu gần 100 loại dược liệu, bán thành phẩm và thành phẩm, doanh thu khoảng 30-50 triệu USD/năm, thì Việt Nam vẫn phải nhập khẩu dược liệu, chủ yếu từ Trung Quốc Không những thế, còn xuất hiện tình trạng xuất khẩu tiểu ngạch dược liệu qua các cửa khẩu vùng biên dẫn đến nguy cơ tuyệt mẫu nhiều loài cây thuốc quý hiếm [33] Trước thực trạng trên, để thực hiện được phương châm lấy dược liệu làm nền tảng trong chiến lược phát triển của ngành Y tế, cần phải có những chính sách mạnh mẽ, thích hợp, đồng bộ và khoa học dựa trên những điểm chính sau: song song với việc quy hoạch vùng dược liệu, bảo vệ nguồn tài nguyên dược liệu, đẩy mạnh công tác thông tin và nghiên cứu dược liệu Một trong những trọng điểm của định hướng là đẩy mạnh công tác trồng trọt cây thuốc trên quy mô lớn, phát triển nguồn dược liệu hàng hoá phục vụ cho việc điều trị trong nước và xuất khẩu Tuy nhiên, để thực hiện tốt điều đó, bên cạnh việc đẩy mạnh các nghiên cứu cơ bản như thành phần hoá học, tác dụng dược

lí của cây thuốc, các nghiên cứu ứng dụng cũng cần được xem trọng [30]

Ngưu tất có tên khoa học là Radix Achyranthis Bidentatae, là cây thuốc

Bắc có nguồn gốc từ Trung Quốc di thực vào nước ta từ năm 1960 Sang thập

kỷ 70 của thế kỷ XX, cây Ngưu tất được phát triển đại trà, đáp ứng được nhu cầu trong nước và một phần xuất khẩu Ngoài Ngưu tất chính danh (Ngưu tất Bắc), ngày nay y học dân gian nước ta còn sử dụng khá phổ biến cây Ngưu tất

nam, tên thông dụng là cỏ xước (Achyranthes aspera L.) với công dụng như

Ngưu tất [32]

Cây Ngưu tất được sử dụng rộng rãi, trong y học cổ truyền phương Đông, rễ cây Ngưu tất có tác dụng làm tan máu ứ, bớt sưng tấy, đau nhức, chống co rút, rung giật, làm mạnh gân cốt Ngày này, y học hiện đại còn sử dụng Ngưu tất để hạ huyết áp và giảm cholesterol trong máu [12]

Từ rễ cây Ngưu tất, các nhà khoa học đã tách chiết và xác định được cấu trúc hoá học của 6 saponin với thành phần aglycon là axit oleanolic Các saponin phân lập đã được xác định lần lượt là dimetyl ester của prosapogenin chikusetru – saponin-va, prosapogenin của chikusetru – saponin – Ib, metyl ester của chiksetru-saponin-IVa, ester của chiksetru-saponin-V, meyl ester của Achyrantosid B và trimetyl ester của saponin5 Thành phần saponin của Ngưu tất gồm các glycosid có aglycon là axit oleanolic phù hợp với công dụng của dược liệu này là chống viêm, sưng, trị đau nhức [38]

Hiện nay, ở nước ta Ngưu tất được trồng ở một số tỉnh như: Lạng Sơn, Bắc Ninh, Nghệ An nhưng số lượng rất ít, không đáp ứng đủ nhu cầu dược liệu trong nước Mặc dù đã dùng cây cỏ xước để thay thế nhưng nhu cầu về Ngưu tất vẫn rất lớn

Xuất phát từ giá trị to lớn đó của cây Ngưu tất, nhằm bảo vệ nguồn gen

và tạo ra được một số lượng lớn giống cây Ngưu tất cung cấp cho gieo trồng

Chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu bảo tồn vốn gen cây Ngưu tất

(Achyranthes Bidentata Blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu quy trình nhân giống cây Ngưu tất trong ống nghiệm nhằm bảo tồn nguồn gen và tạo ra số lượng nhất định cây con đồng đều cung cấp cho sản xuất và trồng thử ngoài đồng ruộng

- Khẳng định tính ổn định của cây nuôi cấy in vitro thông qua đánh giá

sự ổn định về hàm lượng hợp chất saponin và genome cây Ngưu tất trồng tự nhiên và cây nuôi cấy trong ống nghiệm

3 Nội dung nghiên cứu

1 Nghiên cứu quy trình nhân giống cây Ngưu tất trong ống nghiệm

- Nghiên cứu khử trùng hạt để có mẫu sạch ban đầu trong ống nghiệm

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng lên sự phát sinh hình thái cây Ngưu tất trong ống nghiệm

- Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh thông qua thăm dò ảnh hưởng của nồng

độ NAA hoặc IBA

- Nghiên cứu đưa cây ra môi trường tự nhiên

2 Định lượng hợp chất saponin trong rễ cây Ngưu tất trồng tự nhiên và cây

nuôi cấy in vitro

3 Sử dụng kĩ thuật RAPD để đánh giá sự ổn định di truyền giữa cây Ngưu tất

trồng tự nhiên và cây Ngưu tất nuôi cấy in vitro

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây Ngưu tất

1.1.1 Đặc điểm phân loại

Ngưu tất có tên khoa học là (Radix Achyranthis Bidentatae).Tên thường gọi: Cyathula officinalis Kuan, Cyathula root, Achyranthes root Ngưu tất

gồm nhiều loài, thường gặp là Hoài Ngưu tất (Achyranthes Bidentata Blume),

Ma Ngưu tất (Cyathula capitata (Wall Moq) và Xuyên Ngưu tất (C.officinalis Kuan) [37]

Ngưu tất thuộc Chi Cúc bách nhật (Gomphrera Globosa L.)

Họ rau Dền (Amaranthaceae)

Bộ Cẩm Chướng (Caryophyllales)

Phân lớp Cẩm Chướng (Caryophyllidae)

Lớp 2 lá mầm hay lớp Ngọc Lan (Dicotyledoneae) [20]

1.1.2 Một số đặc điểm nông sinh học của cây Ngưu tất

Ngưu tất có thân thảo mảnh, hơi vuông, phân thành đốt, phình ra ở hai đầu trông giống như đầu gối con trâu nên có tên là Ngưu tất Cây thường chỉ cao 1m, cũng có khi tới 2m, lá mọc đối, có cuống, dài 5 – 12cm, rộng 2 – 4cm, phiến lá hình trứng, đầu nhọn, mép lá nguyên [12]

Hoa dài 2 – 5cm, mọc thành bông ở đầu cành hoặc kẽ lá Hoa thường gập xuống, sát vào cuống của cụm hoa Hoa không có cánh Đài hoa gồm 5 lá khô xác, dài gần bằng nhau Bộ nhị gồm 5 nhị, chỉ nhị dính với nhau và dính cả với nhị lép Nhị lép có răng rất nhỏ Đầu chỉ nhị mang các bao phấn hình mắt chim Bầu nhụy hình trứng Quả hình bầu dục, có một hạt [38]

Rễ hình trụ tương đối thẳng, dài 20-30 cm, đường kính 0,5-1cm Ðầu trên mang vết tích của cổ rễ, đầu dưới hơi thuộn nhỏ Mặt ngoài màu vàng đất

hay nâu nhạt, có nhiều nếp nhăn dọc nhỏ và vết tích của rễ con Rễ gồm 1 hoặc 2 hoặc 3 rễ cái, chung quanh có các rễ con Rễ cái nạc, lúc đầu hơi giòn, màu trắng ngà, sau khi chế biến có màu hồng, trong và mềm dẻo

Ở nước ta có cây cỏ xước mọc hoang dại, trông rất giống cây Ngưu tất, được các vị lương y dùng thay cho Ngưu tất với tên thông dụng nam Ngưu

tất, tên khoa học Achyranthes Aspera L cùng họ Dền Nhìn bề ngoài, cỏ xước

trông rất giống Ngưu tất tuy nhiên phiến lá Ngưu tất to và tù hơn, còn lá cỏ xước gầy và nhọn hơn Rễ cỏ xước có nhiều rễ con hơn, rễ cái bị hoá gỗ Còn

rễ Ngưu tất ít rễ con hơn, rễ cái nạc và dài như chiếc đũa [12]

1.1.3 Kĩ thuật trồng, chăm sóc, thu hái và bảo quản sau thu hoạch

Kỹ thuật trồng cây Ngưu tất

Chọn đất và làm đất: Ngưu tất ưa đất thịt pha cát, tơi xốp, nhiều mùn

Đất phù sa, cao ráo, thoát nước rất hợp với Ngưu tất Đất nhiều cát sỏi, bạc

màu, đất chua mặn không trồng được Ngưu tất

Ruộng trồng Ngưu tất phải được cày bừa, đập đất kỹ Cày hoặc cuốc sâu

có tác dụng làm cho rễ Ngưu tất dài, ăn sâu, cho năng suất cao Khi lên luống thường bón lót phân chuồng vào lưng chừng luống Lượng phân chuồng, theo tài liệu Trung Quốc phải bón tới 50 hoặc 60 tấn/ha, nghĩa là 2 - 3 tạ một sào Bắc bộ Nhưng ở nước ta ít khi dùng lượng phân nhiều như thế Tuy nhiên không nên trồng chay, năng suất sẽ thấp Luống làm rộng 70 - 80cm cao 30 - 40cm ở Trung Quốc người ta còn cày sâu, đập đất nhỏ và lên luống cao tới 70cm Theo chuyên gia Trung Quốc, làm như vậy sẽ cho củ Ngưu tất dài 70 - 80cm [9]

Khi lên luống đã hoàn chỉnh, rạch 2 hàng dọc trên mặt luống cách nhau 20cm Rắc phân chuồng bột trộn với tro khô

Gieo hạt: Trồng Ngưu tất bằng cách gieo hạt Hạt được ngâm nước ấm

vài giờ, xong trộn với cát khô và tro khô để dễ gieo Gieo rất thưa trên rạch

luống Gieo xong đậy rơm hoặc rạ Nếu có nhiều rạ thì đậy cả mặt luống nếu

không, ít nhất cũng phải đậy ở rạch luống

Thời vụ gieo: ở miền núi tháng 2 và 3, ở đồng bằng tháng 10 và 11 (cuối thu đầu đông)

Chăm sóc: Gieo hạt xong, quan trọng nhất là tưới ẩm hàng ngày cho hạt

mau nẩy mầm Khi hạt đã mọc thì bỏ rạ và tưới bằng thùng tưới có hoa sen để cho cây khỏi bết xuống đất Khi cây có 4 - 5 đôi lá thật thì tưới thêm phân đạm pha loãng hoặc nước tiểu pha loãng để cho cây mau kín luống Tuyệt đối không được tưới bằng nước phân chuồng tươi sẽ không đảm bảo về an toàn dược liệu Nếu có cỏ phải làm cỏ, xới xáo, phá váng Khi cây đã giao tán, kín luống, nhổ tỉa bớt những chỗ quá mau, để cây cách cây 15cm Có thể tưới bằng cách tát nước vào ruộng, ngập rãnh luống rồi té nước lên mặt luống, làm như vậy sẽ giữ được độ ẩm cho cây Tiếp đó tháo nước cho rút hết khỏi ruộng

Thu hoạch và chế biến sơ bộ: Thời gian thu hoạch ở miền núi vào cuối

năm từ cuối tháng 10 đến tháng 12, ở đồng bằng vào tháng 4 đến tháng 5 năm

sau [9]

Khi cây đã xuất hiện nhiều lá vàng, ở gốc lá đã rụng dần, đào thử thấy rễ Ngưu tất mập, dài 20 - 30cm là có thể thu hoạch Trước hết cắt bỏ phần lá, thu gọn vào một chỗ Dùng thuổng hoặc sà beng đào sâu bẩy đất lên để rễ khỏi bị đứt Rũ sạch đất ở rễ, đem về rửa sạch, phơi ráo nước Cắt bỏ rễ con, xông lưu huỳnh từ một đến hai đêm Phơi âm can, hay nắng nhẹ, không nên phơi nắng

to trên sân gạch, Ngưu tất sẽ bị khô xác [21]

1.2 Tình hình sản xuất Ngưu tất trên thế giới và ở Việt Nam

Từ thời nguyên thuỷ, con người trong lúc tìm kiếm thức ăn, có khi ăn phải chất độc phát sinh nôn mửa hoặc đi ỉa lỏng, hoặc hôn mê có khi chết người, do đó dần dần có nhận thức phân biệt được vị nào ăn được, vị nào có

độc Kinh nghiệm dần được tích luỹ không những giúp cho loài người biết lợi dụng tính chất của cỏ cây làm thức ăn mà còn biết dùng làm thuốc chữa bệnh, hay dùng các vị có chất độc làm tên thuốc độc dùng trong săn bắn và chống ngoại sâm Cây thuốc Ngưu tất cũng được tìm ra bằng con đường đó [12] Ngưu tất là một loại cây dược liệu thu hoạch củ được trồng rộng rãi ở một số nước trên thế giới như Trung Quốc, Ấn Độ, Campuchia, Lào Trong

đó Trung Quốc là nước có diện tích cũng như sản lượng Ngưu tất nhiều nhất thế giới

Năm 1960, cây Ngưu tất bắt đầu được trồng ở nước ta, trong những năm của thập kỉ 70 được phát triển đại trà, đáp ứng nhu cầu trong nước và một phần xuất khẩu Thời gian sau đó, diện tích cây Ngưu tất giảm trầm trọng, chỉ còn trồng rải rác ở một số tỉnh chuyên canh về dược liệu như Lào Cai, Lai Châu, Hưng Yên, Thanh Hoá và một số vườn dược liệu của các bệnh viện, Viện Nghiên cứu hoặc còn mọc hoang ở thung lũng các tỉnh miền núi phía Bắc như Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Giang Hiện nay, sản lượng Ngưu tất trong nước rất ít, chỉ đáp ứng được 60% nhu cầu, số còn lại phải nhập khẩu chủ yếu từ Trung Quốc [31]

Theo tinh thần “Định hướng chiến lược ngành y tế” và “Chính sách quốc gia về thuốc của Việt Nam” Chính phủ đã có những chính sách cũng như những quy định pháp luật cụ thể cho việc phát triển dược liệu Hiện nay, các vùng dược liệu mới đang được quy hoạch ở các tỉnh như: Lào Cai, Mèo Vạc-

Hà Giang, Chí Linh-Hải Dương, Hương Sơn – Hà Tĩnh Viện Dược Liệu được chọn làm cơ quan tham gia chương trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng miền núi, chương trình trồng rừng phủ xanh đất trống, đồi núi trọc, góp phần xoá đói giảm nghèo cho nhân dân miền núi Viện đang xây dựng dự án trồng khảo nghiệm một số cây thuốc quý tại Quản Bạ, Đồng Văn – Hà Giang như Đương quy, Bạch truật, Ngưu tất [30]

Bên cạnh việc mở rộng diện tích gieo trồng, các nghiên cứu khoa học cũng được đẩy mạnh Năm 2005, Phạm Văn Hiển và CS đã xây dựng thành

công quy trình nhân nhanh in vitro cây Ngưu tất từ đốt thân và ngọn chồi với

tỷ lệ ra bầu 70% – 90% tuỳ thời vụ, tỷ lệ ra rễ in vitro đạt 90% Đã tạo được

mô sẹo cây Ngưu tất từ gốc thân và trục dưới lá mầm [8] Năm 2000, Ngô Thị Xuyên đã tiến hành đề tài nghiên cứu tuyến trùng nốt sưng gây hại cây Ngưu tất ở một số tỉnh như: Thanh Trì, Gia Lâm – Hà Nội; Bình Minh, Nghĩa Trai – Hưng Yên, Hà Trung – Thanh Hoá; Tam Đảo – Vĩnh Yên và Sa Pa – Lào Cai Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ nhiễm tuyến trùng nốt sưng khác nhau Bệnh hại nặng ở vụ mùa xuân và đất trồng cây dược liệu liên tục quanh năm [29] Năm 2005, Mai Đăng Đẩu đã nghiên cứu thiết kế, chế tạo hệ thống thiết

bị chiết xuất dược liệu và hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất saponin

từ Ngưu tất Thành công của đề tài đã góp phần quan trọng trong việc tạo ra các thuốc mới từ Ngưu tất [5];[36]

1.3 Ứng dụng cây Ngưu tất trong y học

1.3.1 Cơ sở hoá học tính chữa bệnh của cây Ngưu tất

Rễ Ngưu tất có chứa axit oleanolic 0,096%, saponin toàn phần 4,04% và axit oleanolic α -L-rhamnopyranosyl - β - D- galactopyranoxit Rễ còn chứa

Rễ Ngưu tất chứa một xaccarit là fructan mạch ngắn với mức độ trùng hợp trung bình là 8 Chất này có tác dụng cải thiện hệ miễn dịch Rễ Ngưu tất còn có một peptitpolyxaccarit trong đó 24,1% là peptit bao gồm glycin, serin, axit glutamic và axit aspartic Chất peptitpolyxaccarit có tác dụng miễn dịch Betain có trong rễ với hàm lượng 0,93-1,029% đã được chứng minh là ổn định trong quá trình chế biến Rễ khô còn có emodin và physcion [38]

Saponin là một glicozit tự nhiên thường gặp trong nhiều loài thực vật

Tiền tố sapo có nghĩa là xà phòng; và thực tế thường gặp từ "saponification"

có nghĩa là sự xà phòng hóa trong cả tiếng Anh và tiếng Pháp Chất saponin của Ngưu tất có tác dụng phá huyết và làm vón albumin Ecdysteron và

inokostenon có tác dụng kìm hãm sự phát triển của một số sâu bọ [34]

Saponin có tính chất chung là khi hoà tan vào nước có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch tạo nhiều bọt, có tính chất phá huyết, độc đối với động vật máu lạnh nhất là đối với cá, tạo thành phức với cholesterol, có vị hắc và làm hắt hơi mạnh Một vài động vật cũng có saponin như các loài hải sâm, cá sao Các saponin đều là các chất hoạt quang Thường các steroit saponin thì tả truyền, còn triterpenoit saponin thì hữu truyền Điểm nóng chảy của các sapogenin thường rất cao Dưới tác dụng của enzym có trong thực vật hay vi khuẩn hoặc do axit loãng, saponin bị thuỷ phân thành các phần gồm genin gọi là sapogenin và phần đường gồm một hoặc nhiều phân tử đường Các đường phổ biến là D-glucoza, D-galactoza, L-arabinoza, axit galactunoic, axit D-glucuronic Phần genin có thể có cấu trúc cholan như sapogeninsteroi hoặc sapogenintritecpen dạng β-amirin (axit olenoic), dạng α-amirin (axit asiatic), dạng lupol (axit buletinic) hoặc tritecpen bốn vòng [35]

Dựa vào cấu trúc của phần sapogenin, người ta chia saponin ra làm 3 nhóm lớn là triterpenoit saponin, steroit saponin và glicoancaloit dạng steroit Saponin có loại axit, trung tính hoặc kiềm Trong đó, triterpenoit saponin thường là trung tính hoặc axit (phân tử có nhóm –COOH) Steroit saponin nhóm spirostan và furostan thuộc loại trung tính còn nhóm glicoancaloit thuộc loại kiềm [35]

Theo Đông y, Ngưu tất có vị chua, hơi đắng, tính bình không độc, vào 2 kinh can và thận, có tác dụng làm tan máu ứ đọng, bớt sưng tấy, đau nhức, chống co rút, rung giật, làm mạnh gân cốt Trong nhân dân, Ngưu tất được dùng trong bệnh viêm khớp, đau người, sau khi đẻ máu hôi tanh không sạch, đau bụng, kinh nguyệt khó khăn Nghiên cứu của các nhà khoa học gần đây

cho thấy Ngưu tất có tác dụng làm hạ mỡ máu tốt Đã được áp dụng tại Việt Nam dưới dạng cao lỏng Ngưu tất để chữa bệnh mỡ máu cao [12]

1.3.2 Một số nghiên cứu ứng dụng cây Ngưu tất trong y học

Ngưu tất có tác dụng chống viêm rõ rệt đối với giai đoạn cấp tính và mạn tính của phản ứng viêm thực nghiệm Rễ Ngưu tất có tác dụng mạnh hơn khoảng 4 lần so với rễ cỏ xước Dịch chiết rễ Ngưu tất có khả năng gây thu teo tuyến ức chuột cống đực non Tác dụng gây thu teo tuyến ức là một trong những đặc tính của thuốc ức chế miễn dịch Rễ Ngưu tất có tác dụng làm giảm cholesterol máu ở thỏ đã gây tăng cholesterol từ ngoài vào và gây ức chế sự tổng hợp cholesterol trong cơ thể thỏ; gây hạ huyết áp rõ rệt trên mèo, mức độ hạ áp từ từ, thời gian tác dụng kéo dài [33]

Ngưu tất tươi chữa cổ họng sưng đau, mụn nhọt, đái rát buốt, đái ra máu hoặc sỏi, bế kinh, bụng dưới kết hòn cục, đẻ khó hoặc khi đẻ rau thai không

ra, sau khi đẻ ứ huyết gây đau bụng, chấn thương, ứ máu bầm, đầu gối nhức mỏi Ngưu tất sao tẩm chữa can thận hư, ù tai, đau lưng, mỏi gối, tay chân co quắp hoặc bại liệt [31]

Trong y học Trung Quốc, rễ Ngưu tất với liều 5 - 12g dưới dạng nước sắc được sử dụng làm thuốc phục hồi sức lực, lợi tiểu, chữa bế kinh, đau kinh, tăng huyết áp, thấp khớp, sỏi đường tiết niệu, viêm họng, viêm amidan Ngoài

ra, nó còn được dùng làm thuốc kích thích tình dục, tráng dương, chữa liệt dương, gây sảy thai Hạt Ngưu tất phối hợp với một số dược liệu khác được dùng làm thuốc chống độc, chữa thấp khớp, hen phế quản Ngoài ra, nước sắc 20% Ngưu tất chữa các bệnh về da và móng (bệnh nấm biểu bì) [37]

Trương Diệu Đức, Trương Phát Sơ và Lưu Thiện Quang (1935, Trung Hoa tạp chí) đã dùng cao lỏng Ngưu tất tiến hành 90 thí nghiệm trên tử cung

cô lập của thỏ, chuột bạch, mèo và chó đã đi tới một số kết luận sau: cao lỏng Ngưu tất có tác dụng làm dịu sức căng của tử cung chuột bạch, làm phát sinh

tác dụng co bóp ở tử cung của thỏ, có tác dụng co bóp mạnh đối với tử cung của mèo có chửa, có tác dụng làm dịu tử cung mèo không có chửa

Theo Kinh Lợi Bân (Viện nghiên cứu Quốc lập Bắc Kinh - sở nghiên cứu sinh lí học (1937) thì Ngưu tất có tác dụng như sau: đối với động vật đã gây mê, Ngưu tất có thể gây giảm huyết áp tạm thời, làm yếu sức bóp của tim ếch, ức chế sự co bóp của khúc tá tràng, ngoài ra Ngưu tất có tác dụng lợi tiểu [12]

Lương y Lê Trần Đức đã thử nghiệm và có hiệu quả tốt 4 bài thuốc sử dụng Ngưu tất như sau: (1) Ngưu tất dùng vị độc ngày 40 – 60 g sắc uống nhiều lần chống co giật, bại liệt, phong thấp, teo cơ, xơ vữa mạch máu (2) Rượu thuốc Ngưu tất (100g) và một số dược liệu khác uống 1-2 lần/ngày, trong 10 ngày chữa các chứng bị thương máu tụ ở ngoài hay máu ứ ở trong (3) Thang an thần: Ngưu tất 30g và hạt muồng sao 20g uống mỗi ngày chữa nhức đầu, chóng mặt, ù tai, rối loạn tiền đình (4) Thang tiết niệu: Ngưu tất 30g và một số dược liệu sắc uống chữa bệnh phù thũng, viêm cầu thận cấp, viêm gan virut, viêm bàng quang, đái ra máu [32]

Những năm gần đây, Giáo sư Đoàn Thị Nhu - Viện dược liệu đã nghiên cứu về dược lí thấy cao toàn phần của Ngưu tất có tác dụng làm hạ huyết áp

và giảm cholesterol trong máu Viện dược liệu cũng sản xuất thử thuốc Bidentind chiết xuất từ Ngưu tất Bắc Bidentind được đưa ra thử lâm sàng rộng rãi và có kết quả rất tốt Nhiều xí nghiệp dược phẩm TW và địa phương sản xuất Bidentin Bidentin đã trở thành thuốc thông dụng, quen thuộc và được dùng nhiều trong khoa tim mạch hiện nay [31]

Phan Hải Nam (2005), nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc hạ huyết áp Ngưu tất, Hoè hoa, Linh Chi (NHL) trên chỉ số cholesterol và triglycerit máu

ở bệnh nhân tăng huyết áp có rối loạn lipit máu Tác giả nghiên cứu sự thay đổi nồng độ cholesterol toàn phần, triglicerit huyết tương ở 39 bệnh nhân có

rối loạn lipit máu được điều trị bằng thuốc hạ huyết áp NHL Kết quả điều trị cho thấy, thuốc NHL có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol toàn phần (8,6%), triglicerit huyết tương giảm 9,94% (p<0,001) [19] Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Bay (2007) đã tiến hành nghiên cứu tác dụng của trà hạ mỡ Ngưu tất trên bệnh nhân rối loạn lipit máu Kết quả nghiên cứu cho thấy trà hạ mỡ Ngưu tất có tác dụng làm giảm Cholesterol toàn phần và LDL-C sau thời gian

8 tuần điều trị liên tục với liều 20g/ngày [22]

Chế phẩm Solamin trong thành phần có Ngưu tất và một số dược liệu khác đã được áp dụng để điều trị thấp khớp với kết quả là có tác dụng chống viêm và giảm đau rõ rệt trên lâm sàng Kết quả tốt nhất và tương đối nhanh đối với đau lưng cấp do lạnh và sang chấn Ðối với viêm đa khớp dạng thấp, chưa có biến dạng về khớp và đối với chứng đau nhức đơn thuần, tác dụng điều trị tương đối tốt Khi đã có biến dạng về xương, cơ, khớp, kết quả kém Thuốc không gây tác dụng phụ đáng kể Ngày nay, rất nhiều loại thuốc có thành phần chiết xuất từ Ngưu tất được bán trên thị trường như thuốc Dentonin chữa viêm lợi, viêm quanh răng Thuốc Rumatin chữa thấp khớp Thuốc tăng tuần hoàn não Ligustan [34]

1.4 Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật trong công tác nhân giống cây trồng

1.4.1 Ưu thế của nhân giống in vitro

Kĩ thuật nhân giống in vitro (vi nhân giống) phát triển và mở rộng trong

những năm gần đây, do yêu cầu về lượng giống cây trồng tăng lên nhanh chóng nhằm phục vụ dự án trồng lại rừng, sản xuất lương thực, thực phẩm,

thức ăn gia súc, nông nghiệp và bảo vệ môi trường Vi nhân giống in vitro có

những ưu điểm lớn mà không một loại hình nhân giống nào có được, đó là:

Từ một cây trong vòng 1 – 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây Tốc độ

nhân của phương pháp vi nhân giống khoảng 36

– 1012 lần/năm, chẳng hạn khoai tây từ 50 ống giống của ngân hàng giống thế giới sau 6 tháng nhân giống được 10 vạn cây khoai tây

lớn trong một diện tích nhỏ, trong 1m2

diện tích có thể được 18000 cây

nghệ nhân dòng Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây

mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp

phương pháp hữu hiệu để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã bị nhiễm bệnh Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng kĩ thuật nuôi cấy mô thường tăng năng suất 15 – 30% so với giống gốc

tây chỉ nặng 15kg), việc bảo quản cây giống cũng được thuận tiện, các cây giống giữ ở nhiệt độ 40C trong hàng tháng vẫn cho tỷ lệ sống trên 95% Các dạng sản phẩm của vi nhân giống như cây con in vitro hoặc trong bầu đất Các cây giống có thể bán ở dạng củ bi hoặc cây hoặc thân củ

xuất có thể được vận hành trong bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm và bất cứ tình hình thời tiết có thuận lợi hay không

Nhân nhanh trong nuôi cấy mô cho phép thu được một số lượng lớn các cá thể trong thời gian ngắn, bảo đảm giữ được các đặc điểm di truyền tốt và gữ được tính trẻ hoá Đây là phương pháp tốt nhất để giải quyết nhu cầu cây con cho sản xuất đặc biệt phục vụ trồng rừng trên quy mô lớn với

độ đồng đều cao [27]

1.4.2 Các phương thức nhân giống in vitro

* Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng

Theo Đỗ Năng Vịnh (2005), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu vật nuôi cấy được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước 0,1mm tính từ chóp của chóp đỉnh sinh trưởng Nhưng trong thực tế việc nuôi cấy các mẫu vật như vậy rất khó thành công, người ta chỉ tiến hành nuôi cấy đỉnh sinh trưởng với mục đích làm sạch virus cho cây trồng Trong thực tế đỉnh sinh trưởng thường được tách với kích thước từ 5mm – 10mm [27]

Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng cần chú ý tới tương quan giữa độ lớn chồi, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi Thông thường khi độ lớn của chồi tăng thì tỷ lệ sống của chồi tăng và tính ổn định tăng và ngược lại Nhưng xét hiệu quả kinh tế nuôi cấy thì khi độ lớn của chồi tăng hiệu quả kinh tế sẽ giảm và khi độ lớn của chồi giảm, hiệu quả kinh tế sẽ tăng Do vậy phải kết hợp các yếu tố để tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu

Căn cứ về nguồn gốc của các cây tái sinh từ mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng thì có ba khả năng: cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn), cây phát triển từ chồi nách phá ngủ, cây phát triển từ chồi nách mới phát sinh Tuy nhiên trong thực tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh

Có hai phương thức hình thành cây tái sinh từ nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng

Cây tái sinh trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách phá ngủ Phương thức này chủ yếu gặp ở các đối tượng 2 lá mầm như khoai tây, thuốc lá, chanh, cam, hoa cúc, và một số cây 1 lá mầm như dứa, sợi, mía Cây tái sinh qua giai đoạn hình thành dẻ hành (protocom), chủ yếu gặp ở các đối tượng 1 lá mầm như phong lan, hoa huệ Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo thành hàng loạt protocom và các protocom này có thể tiếp tục phân chia thành các

protocom mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh Bằng phương pháp này, trong một thời gian ngắn có thể thu được hàng triệu cá thể, do đó đem lại hiệu quả nuôi cấy lớn Gần đây phương thức này đã bắt đầu được áp dụng có kết quả ở các cây ăn quả và cây lâm nghiệp, trong đó có các loại cây quý như cà phê, táo, lê, thông, bồ đề Tổng số có trên 30 chi khác nhau đã được nuôi cấy thành công [27]

* Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây

Tế bào thực vật có tính toàn năng nên ngoài mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng các bộ phận còn lại của cây đều có thể được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy in vitro Ở thuốc lá, cam, chanh người ta thường sử dụng đoạn thân, mảnh lá của thuốc lá, cà chua, bắp cải , cuống lá ở Nacissus, các bộ phận của hoa như súp lơ, lúa mì và nhánh củ ở hành, tỏi

* Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo

Phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ mẫu vật ban đầu không những nhanh chóng thu được cây mà khá đồng đều về mặt di truyền Tuy nhiên trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh ngay mà phát triển thành khối mô sẹo Tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền Do đó nhất thiết phải sử dụng mô sẹo vừa mới phát sinh (mô sẹo sơ cấp) thì mới thu được cây đồng nhất Vì vậy, người ta chỉ tiến hành nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đối với những đối tượng khó tái sinh cây trực tiếp Thông qua giai đoạn mô sẹo có thể thu được những cây sạch virus [27]

1.4.3 Một số thành tựu trong nhân giống cây trồng bằng kĩ thuật nuôi

cellulase để phân hủy cellulose của tế bào thực vật và đã thu được các tế bào trần (protoplast) Đến năm 1971 Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh

từ protoplast thuốc lá giống xanthi Do các protoplast có khả năng dung hợp

với nhau trong các điều kiện nhất định và hấp thụ các phân tử lớn hoặc thậm chí các cơ quan tử bên ngoài, nên các nhà nuôi cấy mô thực vật đặt hy vọng lớn vào kĩ thuật protoplast để chọn giống có hiệu quả hơn Hy vọng này hoàn toàn được thực tế xác nhận khi Melchers (1977) lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây [27]

Nuôi cấy mô tế bào được xem là phương pháp hiệu quả nhất để tạo củ giống chất lượng cao với số lượng lớn, ổn định, đồng nhất về mặt di truyền,

đáp ứng mục đích sản xuất củ trên quy mô thương mại ở nhiều giống lilium Năm 2001, Nhut và CS đã tiến hành nhân giống tạo củ nhỏ Lily từ lát cắt

mỏng mẫu ban đầu, có thể là củ, lá, đoạn thân non, chồi và các thành phần

1961; Nickell, 1967) đã xây dựng quy trình nhân nhanh chồi mía in vitro

Nghiên cứu tạo mô sẹo từ mô lá non và mô rễ non của cây mía kết quả cho thấy mô lá non và thân non có khả năng tạo mô sẹo và tái sinh thành cụm chồi tốt hơn so với mô rễ (Sauvaire và Galzy, 1980) [27]

Theo Murashige (1974), có khoảng 300 loại cây có thể nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào Khoảng 600 công ty trên thế giới áp dụng công nghệ này để nhân trên 500 triệu cây con trồng 1 năm Chủ yếu là các giống hoa, cây cảnh, cây ăn quả, cây công nghiệp, cây lâm nghiệp và một số rau Trung Quốc là nước có công nghệ nuôi cấy mô phát triển rất nhanh ở thập kỉ 70 – 80 của thế kỷ XX Hàng năm nhân nhanh khoảng 100 loài cây trồng quan trọng như đào, lê, mận, táo Tạo các giống cây tam bội không hạt

Ở Ấn Độ, năm 1989 cả nước chỉ có 4 cơ sở nuôi cấy mô với công suất 5 triệu cây con/năm, đến năm 1996 đã tăng lên 75 công ty và sản xuất khoảng

190 triệu cây giống/năm Nhiều công ty đã chuyên môn hoá trong việc sản xuất giống cây trồng có giá trị kinh tế như cây gia vị (sa nhân, gừng, hạt tiêu), cây công nghiệp (cà phê, chè, mía), cây lâm nghiệp (tếch, bạch đàn), cây lương thực (khoai tây, lúa mì, lúa lai) [18]

Ngày nay, ở Việt Nam, các sở khoa học công nghệ của hầu hết các tỉnh đều đã có phòng nuôi cấy mô tế bào để sản xuất cây trồng có lợi ích kinh tế cao, đáp ứng nhu cầu sản xuất của địa phương Hầu hết các trường Đại học, Viện nghiên cứu Sinh học đều có phòng thí nghiệm nuôi cấy mô với mục đích xây dựng và phát triển các phương pháp nghiên cứu phù hợp với điều kiện trang thiết bị ở Việt Nam Tuy ngành nuôi cấy mô tế bào ở nước ta còn non trẻ song cũng đã thu được nhiều kết quả quan trọng như vi nhân giống dứa, chuối, phong lan, hoa hồng, cúc, cẩm chướng và nhiều thành công khác trong chọn dòng tế bào, nuôi cấy bao phấn để tạo dòng thuần Thành công đầu tiên là nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá của Lê Thị Muội và CS (thập niên 80 của thế kỷ XX) Sau đó, tại Phân viện khoa học Việt Nam ở thành phố Hồ Chí Minh, Đại học Nông Nghiệp I - Hà Nội, Viện Khoa học kĩ thuật Nông nghiệp Việt Nam sử dụng phương pháp vi nhân giống đã tạo ra giống khoai tây củ

bi Phương pháp vi nhân giống này đã khắc phục được khó khăn về giống trong sản xuất, làm giảm chi phí sản xuất khoai tây [18]

Rừng Việt Nam chiếm diện tích lớn nhưng hiện đang bị chặt phá do nhiều nguyên nhân khác nhau Góp phần cung cấp nguồn giống cây rừng phục vụ cho công tác phủ xanh đất trống, đồi núi trọc của nước ta, hàng loạt

quy trình nhân giống in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu nhằm tạo số

lượng lớn cây giống có chất lượng tốt Nguyễn Thế Anh, Trần Văn Minh (2007) sử dụng chồi đỉnh lấy từ cây 1,0 – 1,5 tuổi nuôi cấy trên môi trường

WPM, ½ WPM, ½ MS bổ sung BAP, IAA, IBA, kinetin, Rib và nước dừa Kết quả cho thấy, môi trường WPM là khoáng cơ bản thích hợp nhất cho nuôi cấy chồi đỉnh; tỷ lệ phát sinh chồi cao nhất ở môi trường WPM bổ sung tổ hợp BAP 0,1mg/l + IBA 0,3mg/l [2] Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm mục tiêu bảo tồn và phát triển cây thông đỏ, tác giả Trần Văn Định, Trần Văn Minh (2007) đã sử dụng chồi đỉnh và chồi bên làm vật liệu nuôi cấy Chồi non sau khi được vô trùng bằng natri hypochlorit được nuôi cấy trên môi trường MS, WPM, B5, WV3 có bổ sung BAP Kết quả thu được, chồi thông đỏ phát sinh cao nhất từ ngọn chính, tuổi mẫu 18 tháng Môi

nhân chồi Cây thông đỏ ra rễ tốt nhất sau 75 ngày nuôi cấy trên môi trường WPM có bổ sung NAA 1mg/l kết hợp với Rhizopon 50mg/l [7] Vi nhân giống cây trai Nam Bộ được tác giả Khưu Hoàng Minh, Trần Văn Minh (2007) nghiên cứu nhằm bảo tồn nguồn gen quý và tạo giống cây sạch bệnh phục vụ công tác tái sinh rừng Khả năng tạo cụm chồi tốt nhất ở môi trường WPM có bổ sung BAP 1mg/l, môi trường WPM bổ sung BAP 0,5mg/l là thích hợp nhất với nhân cụm chồi Cây ra rễ tốt nhất trên môi trường có bổ sung IBA 0,3mg/l [17] Năm 2009, Nguyễn Thị Tâm và CS đã nghiên cứu

quy trình nhân giống cây dẻ Trùng Khánh bằng kỹ thuật in vitro Đề tài đã

góp phần bảo tồn nguồn gen quý của giống dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng [23] Việt Nam có hàng ngàn cây thuốc quý hiếm được ghi trong sách đỏ Nhiều loài cây thuốc đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng do khai thác quá mức Để bảo tồn nguồn gen những cây thuốc quý, quy trình nhân giống cây dược liệu được nhiều tác giả quan tâm như: nhân giống dòng Kava có hoạt tính sinh học cao của Đinh Đoàn Long và CS (2004) [11] Lê Xuân Đắc,

Lê Thị Xuân, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình và CS (2004) tiến hành nhân

nhanh và bảo tồn cây màng tang (Litsea verticiliata) được tìm thấy ở vườn

Quốc gia Cúc Phương bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật [6] Năm

2006, Nguyễn Phú Lịch, Nguyễn Thị Tâm, Lê Ngọc Công đã tiến hành đề tài

"Bước đầu nghiên cứu nhân giống Thanh hao hoa vàng (Artemisia annual L.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro" Đề tài đã xác định có thể sử dụng môi trường

MS cơ bản hoặc môi trường MS bổ sung BAP 1,5mg/l hay kinetin 1,5mg/l để nhân giống cây Thanh hao hoa vàng, môi trường bổ sung α-NAA 0,3mg/l là

(Artemisia annua L.) in vitro tác giả Nguyễn Thị Kim Uyên, Trần Văn Minh

(2007) đã nhân giống trên môi trường LV Kết quả cho thấy môi trường LV

có bổ sung BAP 0,3mg/l chồi phát triển tốt nhất Khi bổ sung BAP, NAA và 2,4-D riêng rẽ không kích thích phát sinh phôi soma nhưng khi bổ sung NAA

và 2,4-D riêng rẽ lại kích thích tạo rễ Môi trường LV bổ sung tổ hợp BAP 0,5mg/l + NAA 2,4-D 0,5mg/l là môi trường thích hợp nhất cho nuôi cấy tăng sinh tế bào soma [28] Hiện nay, Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu và bước đầu hoàn thiện nhiều quy trình nhân giống như : nhân nhanh giống hoa đồng tiền nhập nội từ Thái Lan, Trung quốc; tạo củ trực tiếp

từ lát cắt vảy củ in vitro ở giống hoa lilium, nhân nhanh các cây trồng lâm

nghiệp, cây ăn quả như: tếch, bạch đàn, mía, cam, quýt [27]

1.5 Ứng dụng kĩ thuật RAPD trong phân tích sự đa dạng di truyền

RAPD (Random Amplyfied Polymorphysm ADN) là kỹ thuật mới được

ứng dụng trong những năm gần đây ở Việt Nam RAPD có nhiều ưu điểm nổi bật như: có khả năng phát hiện hiện tượng đa hình ADN trên một phạm vi rộng, thao tác đơn giản, nhanh gọn, ít tốn kém, không cần biết trước trình tự gen của đối tượng cần nghiên cứu, chất lượng ADN không cần độ tinh sạch cao…[40] Nhiều nghiên cứu cho thấy, RAPD là kỹ thuật đem lại hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và đa dạng di truyền, nghiên cứu nguồn gốc loài và lập bản đồ di truyền thực vật Vì vậy, kỹ thuật RAPD

thường được sử dụng kết hợp với nhiều kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao

Kĩ thuật RAPD là kĩ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên do hai nhóm nghiên cứu của Williams và CS (1990) và Welsh và McClelland (1991) đồng thời xây dựng Đây là một kĩ thuật phát hiện chỉ thị di truyền dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

[41];[42]

Các yếu tố cần thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm: ADN khuôn

mẫu; đoạn mồi (primer) có chiều dài khoảng 10 base, Taq polymerase (enzyme chịu nhiệt được tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus); Bốn loại

dung dịch đệm

Từ khi ra đời, kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rộng rãi cho nhiều đối tượng khác nhau như: đậu xanh, đậu tương, đu đủ, lạc, lúa, chuối…trong việc đánh giá đa dạng di truyền giữa các giống trong phạm vi một loài, phân tích

và đánh giá bộ genome thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức phân tử Để đánh giá sự thay đổi di truyền của các dòng lúa tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước, Đinh Thị Phòng đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để chỉ ra sự sai khác ở mức độ phân tử giữa các đối tượng này Nhóm tác giả này cũng đã sử dụng 11 đoạn mồi ngẫu nhiên để đánh giá tính đa dạng của một số giống lạc trong tập đoàn giống ICRISAT chống chịu bệnh gỉ sắt, kết quả thu được 109 phân đoạn ADN trong đó có 66 phân đoạn đa hình, chiếm 60,6% [24]

Việt Nam là nước nông nghiệp với sản lượng xuất khẩu lương thực, thực phẩm cao trên thế giới nên cây lương thực, thực phẩm được nhiều nhà khoa học quan tâm Với mục đích nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số

giống lạc trồng (Archis hypogaea L.), Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Hoa Lan

(2003) đã phân tích sự đa dạng di truyền giữa 12 giống lạc là L02, L03, L05, L08, L12, L15, L16, LVT, Sen Nghệ An, Đỏ Bắc Giang, Phú Thọ Phân tích

hệ gen 12 giống lạc với 5 mồi phản ứng ngẫu nhiên nhận được 32 phân đoạn ADN, trong đó có 15 phân đoạn đa hình chiếm 46,9%, 4 mồi cho kết quả đa hình là RA31, RA36, RA46, RA142 Kết quả phân tích RAPD cho thấy ADN của 12 giống lạc có cấu trúc khác nhau, giữa các giống lạc có sự sai khác di truyền với hệ số từ 0,03 – 0,13 [15] Với mục đích nghiên cứu sự đa dạng kiểu gen và kiểu hình chịu hạn của một số giống lúa cạn địa phương miền núi, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Vân Anh (2007) đã nghiên cứu trên 12 giống lúa cạn ở 3 tỉnh Sơn La, Bắc Kạn, Cao Bằng Kết quả phân tích đã chia các giống lúa thành 4 nhóm với khoảng cách di truyền giữa các giống lúa cạn là 7,69 – 34,00% và hệ số đa

năng chịu hạn của một số giống lúa cạn, Lò Thị Mai Thu, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Bình (2008) tiếp tục xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa cạn ở mức phân tử ADN bằng kỹ thuật RAPD Kết quả đã nhân bản được 182 phân đoạn ADN từ hệ gen của 7 giống lúa cạn Năm mồi sử dụng đều thể hiện tính đa hình, trong đó mồi M13 cho tính đa hình cao nhất (100% phân đoạn đa hình) [25]

Ứng dụng chỉ thị phân tử (RAPD và ADN lục lạp) trong nghiên cứu đa hình di truyền và xây dựng vườn giống cây cóc hành, Nguyễn Việt Cường, Phạm Đức Tuấn (2007) đã tiến hành nghiên cứu 49 dòng cây trội cóc hành

(Azadirachta excalsa) được tuyển chọn trong rừng khộp tự nhiên khô hạn ở 6

xã của 2 huyện Ninh Sơn và Bắc Ái thuộc tỉnh Ninh Thuận Sử dụng 6 mồi trong nhân bản ADN là các mồi 0PC10, OPC13, OPC14, 0PC18, 0PC20, OPB17 và 2 mồi lục lạp gồm rnH-ttrnK và atpB-rbcL Kết quả, các dòng cóc hành được nghiên cứu có mức độ đa dạng di truyền thấp mặc dù các cây trội

được chọn đều ở rừng tự nhiên và có khoảng cách về không gian khá xa Có 6 cặp cóc hành có hệ số tương đồng gần bằng 1 từ 0,978 đến 0,981 là các cặp X32 và X35, X8 và X11, X34 và X50, X13 và X22, X19 và X37 Các dòng cóc hành có quan hệ di truyền gần gũi phải loại bỏ khi xây dựng vườn giống

là X11, X22, X35, X37, X43, X50 [4] Nhiều tác giả đã sử dụng kĩ thuật RAPD để phân biệt các loài phụ và thiết lập sơ đồ hình cây biểu thị mối quan

hệ giữa các đối tượng nghiên cứu đối với lúa và các loại cây trồng như ngô,

đu đủ, hành tây, xoài, cỏ đinh lăng

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu thực vật

tại vườn Đông y của Học viện Quân Y

2.1.2 Hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu

Hoá chất

Các thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào được tiến hành trên nền môi trường

cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) [27]

Bảng 2.1 Thành phần cơ bản của môi trường MS

petroleum ether, SDS 10%, Taq – polymerase, CTAB, Tris, đệm PCR, MgCl2, dNTPs,

Thiết bị

Thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào: Bình tam giác 250ml, pipet, cốc thuỷ tinh định mức, bông, giấy làm nút, giấy thấm Bộ đồ cấy: dao cấy, que cấy, đĩa cấy, Buồng cấy vô trùng (Biological Safety Cabinets) của hãng Nuarie (Mĩ), nồi khử trùng (Auto Clave) của hãng Tomy (Nhật), tủ sấy

(Carbolite, Anh), máy đo pH

Thiết bị dùng trong phương pháp phân tích phân tử: Máy li tâm lạnh (Hettich, Đức), máy quang phổ UV – Visible spectrometer cintra 40 (Úc), tủ lạnh sâu, cân điện tử của Đức, máy điện di đứng và bộ nguồn powerpac 300 (Bio-Rad, Mĩ), máy PCR

Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 3 năm 2009 đến tháng 8 năm 2010 tại phòng thí nghiệm Di truyền học, phòng thí nghiệm Công nghệ gen, phòng Công nghệ tế bào thực vật thuộc khoa Sinh – KTNN, phòng Hoá hữu cơ -

Khoa Hoá học - Trường Đại học Sư Phạm - Đại học Thái Nguyên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro

2.2.1.1 Phương pháp pha môi trường nuôi cấy

Nguyên tắc: pha môi trường nuôi cấy có thành phần và nồng độ các chất phù hợp với đối tượng và mục đích nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường MS có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin tất cả các hoá chất phải được hoà tan đều không kết tủa Tuỳ theo đối tượng và mục đích nuôi cấy mà bổ sung vào môi trường MS các chất kích thích sinh trưởng phù hợp Môi trường có thể được bổ sung thêm các chất độn làm giá đỡ thì không quá rắn hoặc quá mềm để khi nuôi

cấy mẫu vật được dễ dàng Khử trùng môi trường theo phương pháp Pasteur [27]

Các bước tiến hành pha môi trường

Sau khi xác định được công thức môi trường cần pha, tính thể tích các hoá chất cần sử dụng trong môi trường nuôi cấy

Ví dụ: pha 1 lit môi trường nhân nhanh Ngưu tất có công thức sau:

MS + 30g saccharose + 9g aga + 2g than hoạt tính + 200ml nước dừa + BAP 2,0mg được tiến hành như sau:

- Chuẩn bị: dụng cụ (cốc đong, bình tam giác, pipet ) rửa sạch, sấy khô, dùng ống đong để lấy các hoá chất cần thiết Thạch aga, đường, than hoạt tính cho vào giấy thấm để cân

- Đong 0,5 lit nước cất + 200ml nước dừa đặt lên bếp đun

- Khi hỗn hợp gần sôi cho từ từ 9g thạch aga vào, vừa cho vừa khuấy đều cho thạch tan hết Sau đó bổ sung 2g than hoạt tính, 30g đường

- Khi thạch aga, than hoạt tính, đường tan hết thì bổ sung dung dịch MS và chất kích thích sinh trưởng đã chuẩn bị Khuấy đều

- Định lượng hỗn hợp dung dịch trên bằng nước cất cho đủ 1 lit

- Đo pH (pH môi trường nuôi cấy thường là 5,8)

- Chia đều hỗn hợp nuôi cấy vào các bình tam giác, mỗi bình khoảng 50 ml môi trường Sau đó nút nút bông và nắp giấy (nút bông không nên quá chặt hoặc quá lỏng vì quá lỏng dễ bị nhiễm, nếu quá chặt không khí không được lưu thông sẽ ảnh hưởng đến quá trình hô hấp của cây)

thời gian 22 phút Khi lấy môi trường ra khỏi nồi hấp thì lắc nhẹ bình tam giác để các chất tan đều trong môi trường nuôi cấy Để môi trường sau khi hấp khử trùng 2 – 3 ngày để ổn định mới sử dụng để cấy mẫu

Các môi trường nuôi cấy khác cũng được tiến hành theo các bước trên

2.2.1.2 Khử trùng hạt

Hạt được bỏ vỏ, loại bỏ những hạt thối, sâu, mốc

Trước khi tiến hành nuôi cấy cần khử trùng box cấy và buồng cấy bằng đèn UV trong khoảng thời gian 45 – 60 phút, khử trùng bộ đồ cấy bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn

Hạt được đưa vào trong box cấy để khử trùng Hạt được tráng sạch 5 lần bằng nước cất khử trùng, sau đó ngâm hạt trong dung dịch ethanol 70% trong khoảng thời gian 45 giây Tiếp tục cho hạt ngâm trong dung dịch javen 60%, lắc đều trong khoảng thời gian 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 phút Sau đó rửa sạch hạt 5 lần bằng nước cất khử trùng

Sau khi khử trùng, hạt được cấy lên môi trường MS cơ bản, 30 hạt/1bình Đánh giá kết quả sau 1 tuần nuôi cấy Theo dõi các chỉ số sau:

+ Tỷ lệ bình không bị nhiễm/tổng lượng bình nuôi cấy

+ Tỷ lệ hạt nảy mầm/tổng lượng hạt nuôi cấy

+ Kích thước, hình thái mầm

2.2.1.3 Nhân chồi

Các đoạn thân thu được từ bước khử trùng nói trên được cấy lên môi trường nhân chồi có bổ sung BAP có nồng độ từ 0,5mg; 1,0mg; 1,5mg; 2,0mg; 2,5mg; 3,0mg; 3,0mg cho 1 lit môi trường hoặc kinetin với nồng độ 0,5mg; 1,0mg; 1,5mg; 2,0mg, 2,5mg cho 1 lit môi trường hoặc cấy lên môi trường tạo đa chồi (môi trường tổ hợp chất KTST BAP + α-NAA và kinetin + α-NAA) Bình nuôi cấy được đặt trong phòng cây với cường độ ánh sáng đèn

2000 lux, thời gian chiếu sáng 10giờ/ngày, nhiệt độ 250

C – 270C [27] Kết quả đánh giá sau 15 ngày, 30 ngày nuôi cấy Theo dõi các chỉ số sau:

+ Màu sắc, hình dạng chồi

+ Số lượng chồi/đoạn thân

+ Kích thước trung bình chồi

+ Hệ số nhân chồi

2.2.1.4 Tạo cây hoàn chỉnh

Những chồi tạo ra trên môi trường nhân nhanh có kích thước 1 – 1,5cm, được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ có bổ sung chất kích thích sinh trưởng α – NAA với nồng độ 0,1mg; 0,2mg; 0,3mg; 0,4mg; 0,5mg trong 1 lit môi trường Kết quả nuôi cấy được đánh giá sau 15 ngày, 30 ngày Theo dõi các chỉ số sau:

+ Tỷ lệ tạo rễ

+ Số rễ trung bình/chồi

+ Kích thước trung bình rễ

2.2.1.5 Đưa cây ra môi trường tự nhiên

Các cây được cấy vào môi trường ra rễ 3 – 4 tuần, khi đã có bộ rễ dài, khoẻ, lá xanh, đẹp, đang thời kì sung sức thì đưa ra môi trường tự nhiên

Các bình cây mở nắp, đổ nước vào ngâm 15 phút, sau đó lắc nhẹ để thạch rời ra khỏi rễ, dùng panh gắp nhẹ các cây ra khỏi bình không để dập nát Ngâm cây trong chậu nước sạch, sau đó rửa dưới vòi nước cho hết thạch bám vào rễ Cắt tỉa bớt rễ

Ngưu tất là cây ưa đất thịt pha cát, tơi xốp, nhiều mùn Trồng cây trên giá thể đất trộn chấu hun theo tỷ lệ đất:cát:trấu là 1:1:1 Giá thể được đựng vào khay với bề dày 10cm Trồng cây con vào khay sau đó tưới nước nhẹ nhàng cho chặt gốc cây

Trong 2 – 3 ngày đầu tưới nước lã bằng cách phun sương 3 giờ/lần Trời rét phải che nilon tránh rét và tránh thoát nước nhanh Nilon phải đục lỗ thoáng khí Sau 3 ngày có thể bỏ nilon che, để khay nơi đủ ánh sáng, thoáng khí, tránh nắng, mưa trực tiếp Tưới nước bằng bình phun 2 – 3 lần/ngày Sau

10 ngày tưới cây bằng dung dịch MS pha loãng với tỷ lệ 1/10, ngày 1 lần Sau

3 – 4 tuần cây sống, ra rễ mới, lá mới là có thể đưa ra vườn ươm

Đánh giá kết quả sau khi ra cây 3 – 4 tuần, cho đến khi cây sống được và

ra rễ mới, lá mới là ta có thể đánh giá được kết quả ra cây bằng cách tính tỷ lệ

% số cây sống [27]

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu hợp chất saponin trong rễ cây Ngưu tất

Trong quá trình nuôi cấy in vitro, do ảnh hưởng của các chất kích thích

sinh trưởng có thể xảy ra sự biến đổi trong các quá trình sinh lý, sinh hóa dẫn đến biến đổi tổng hợp các chất trong cây Saponin là hợp chất quan trọng nhất trong rễ cây Ngưu tất, vì vậy sau khi thu hoạch rễ, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu và đánh giá sự ổn định hợp chất saponin trong rễ cây in vitro và cây trồng

bằng hạt

2.2.2.1 Phương pháp định tính hợp chất saponin bằng các phản ứng màu

Sử dụng các phản ứng màu nhằm khẳng định sự có mặt của hợp chất saponin, đồng thời bước đầu đánh giá chất lượng saponin toàn phần trong rễ

cây Ngưu tất in vitro và rễ cây trồng bằng hạt

- Xác định sự có mặt của saponin bằng phản ứng Liebermann -

để lạnh ở 00C vào ống nghiệm Sau đó, thêm 1 giọt H2SO4 vào ống nghiệm Bột Ngưu tất được hoà tan trong CHCl3 và cho vào hỗn hợp trên Nếu xuất hiện các như màu xanh da trời, lục, hồng, cam, đỏ, và bền vững trong một thời gian là phản ứng dương tính Chứng tỏ có saponin

- Định tính saponin toàn phần trong rễ cây Ngưu tất bằng phản ứng với dung dịch NaCl 1%: Hòa tan 0,5mg bột Ngưu tất trong 3ml dung dịch NaCl 1%, sau đó đun sôi nhẹ, lọc, cho dịch lọc vào ống nghiệm, lắc đều Nếu thấy xuất hiện nhiều bọt màu vàng bền vững chứng tỏ có saponin Mức độ tạo bọt càng nhiều chứng tỏ hàm lượng saponin toàn phần càng lớn [1]

2.2.2.2 Phương pháp tách chiết và định lượng hợp chất saponin

thành bột mịn Cân 20(g) bột Ngưu tất cho vào túi giấy lọc rồi cho vào dụng

cụ Soxhlet, thêm ether dầu hoả, đem chiết cách thuỷ trong 8 giờ để loại bỏ chất béo, chất màu Sau đó lấy túi bột Ngưu tất ra cho bay hơi hết dầu hoả, tiếp tục chiết saponin trong cồn 700

bằng dụng cụ Soxhlet, chiết đến khi dịch chiết cuối cùng không còn phản ứng của saponin Dịch chiết cồn thu được

15 - 20ml nước cất nóng, để nguội Lắc nhiều lần với n-butanol cho đến kiệt saponin Cất thu hồi dung môi Cắn chứa saponin toàn phần hoà vào một lượng nhỏ cồn 800, sau đó thêm hỗn hợp aceton : ether (4:1) với thể tích gấp 2

- 3 lần thể tích hỗn hợp saponin trong cồn thấy xuất hiện tủa, lọc lấy tủa Dịch lọc tiếp tục thêm hỗn hợp aceton : ether (4:1) để tủa hết saponin Tủa thu

C đến khối lượng không đổi, đem cân [1]

Hàm lượng saponin toàn phần trong rễ cây Ngưu tất được tính như sau:

% 100

*

p b

m X





Trong đó: X: hàm lượng saponin toàn phần (%)

2.2.3 Phương pháp sinh học phân tử

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, khi tiến hành nuôi cấy in vitro

trong thời gian dài thường làm giảm khả năng sinh trưởng, phát triển của cây, thậm chí còn tạo nên một số đột biến do sử dụng các chất kích thích sinh