Nghiên cứu sự biểu hiện protein nucleocapsid của vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trên vi khuẩn e coli

Trong 3 protein cấu trúc thì protein N 15kDa là protein cơ bản nhất được phát hiện với lượng lớn trong các tế bào bị nhiễm, chiếm khoảng 20 – 40% lượng protein cĩ trong hạt vi rút Mengel

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

NGUYỄN THỊ VÂN ANH

NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN NUCLEOCAPSID CỦA VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ

HÔ HẤP Ở LỢN TRÊN VI KHUẨN E COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hµ Néi - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

NGUYỄN THỊ VÂN ANH

NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN NUCLEOCAPSID CỦA VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ

HÔ HẤP Ở LỢN TRÊN VI KHUẨN E COLI

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS NGUYỄN THỊ MINH HUYỀN

2 TS NGUYỄN HỮU ðỨC

Hµ Néi - 2013

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất kì công trình nghiên cứu nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ

rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Vân Anh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành ñến TS Nguyễn Thị Minh Huyền

Phòng Công nghệ Tế bào ðộng Vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam và TS Nguyễn Hữu ðức Phó trưởng Khoa Công

nghệ sinh học, Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội ñã tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Với tình cảm sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Quang Huấn

Trưởng phòng Công nghệ Tế bào ðộng Vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng toàn thể cán bộ nghiên cứu trong phòng

ñã ñã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn các Thầy Cô trong khoa Công nghệ sinh học, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã truyền ñạt cho tôi kiến thức trong quá trình học tập

ðể thực hiện ñược nghiên cứu này, tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ từ ñề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam hướng Công nghệ sinh học với mã số ñề tài VAST02.02/12-13

Cuối cùng, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới gia ñình, bạn bè ñã luôn quan tâm, cổ vũ cho tôi vững bước trên con ñường học tập và nghiên cứu

Hà Nội, tháng 9 năm 2013

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Vân Anh

MỤC LỤC

3.2.1 Tạo vector biểu hiện 303.2.2 Khảo sát ñiều kiện biểu hiện gen ORF7 mã hóa protein N của vi

3.2.3 Phương pháp kiểm tra ñộ hòa tan của protein N và tối ưu hóa

3.2.4 Phương pháp tinh sạch protein N tái tổ hợp (Hochuli và cs, 1988) 39

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

E coli Escherichia coli

IPTG Isopropyl β- D- 1- Thiogalactopyranoside

PRRS Porcine Reproductive And Respiratoy Syndrome TBS Tris-buffered saline

DANH MỤC HÌNH

4.4 ðĩa khuẩn lạc biến nạp sản phẩm lai giữa ñoạn gen ORF7 và các

4.5 ðiện di ñồ sản phẩm PCR từ khuẩn lạc sau biến nạp các vector tái tổ

4.6 ðĩa khuẩn lạc khi biến nạp các vector tái tổ hợp vào E coli BL21 47 4.7 ðiện di protein kiểm tra các mẫu biểu hiện trong 5 hệ thống vector tái

4.8 Ảnh hưởng của nồng ñộ IPTG ñến sự biểu hiện của protein tái tổ hợp 50 4.9 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn trước khi cảm ứng ñến sự biểu hiện

4.10 Ảnh hưởng thời gian thu mẫu sau cảm ứng ñến sự biểu hiện của

4.11 ðiện di protein kiểm tra ñộ hòa tan của protein tái tổ hợp trong các hệ

4.12 ðiện di protein kiểm tra ñộ hòa tan của protein tái tổ hợp trong các hệ

4.13 ðiện di protein Nucleocapsid sau khi tinh sạch qua cột Ni-NTA 56 4.14 Biểu ñồ kết quả xác ñịnh khả năng nhận biết và gắn kết của phức hệ

PHẦN 1 ðẶT VẤN ðỀ

Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp trên lợn (Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome – PRRS) lần đầu tiên được phát hiện Bắc Mĩ tại Hoa Kì và Canada năm 1987, vài năm sau đĩ là ở các nước châu Âu, xuất hiện ở châu Á năm

1991 (Kaffaber K, 1999) Năm 1997 vi rút PRRS được phát hiện ở Việt Nam trên đàn lợn nhập từ Mỹ Gần đây các ổ dịch xảy ra tại Thụy ðiển, Nam Phi, Nga, Trung Quốc và Việt Nam với chủng độc lực cao, diễn biến ngày càng phức tạp Năm 2007, dịch PRRS chính thức được cơng bố tại tỉnh Hải Dương của nước ta và từ đĩ đến nay dịch vẫn liên tục xảy ra ở nhiều địa phương trên cả nước Chính vì vậy việc chẩn đốn sớm các ổ dịch là vấn đề quan trọng giúp ngăn cản sự biến chủng và sự lan truyền của vi rút PRRS

Vi rút PRRS được phân lập và định danh vào năm 1991, chuỗi hệ gen đầy đủ được xác lập vào năm 1993 Bộ gen của vi rút PRRS dài khoảng 15kbp bao gồm 9 ORF (Open Reading Frame), trong đĩ ORF1a và ORF1b mã hĩa protein polymerase (GP1a và GP1b), ORF2a, ORF2b, ORF3 và ORF4 mã hĩa các protein chức năng ORF5 mã hĩa protein GP5 (25kDa) là glycoprotein vỏ ngồi, ORF6 mã hĩa protein M (18kDa) là protein vỏ ngồi, ORF7 mã hĩa protein N (15kDa) là protein cấu trúc (Dea và cs, 2000; Mengeling W.L và cs, 1996; Yoon K.J và cs, 1995) Trong 3 protein cấu trúc thì protein N (15kDa) là protein cơ bản nhất được phát hiện với lượng lớn trong các tế bào bị nhiễm, chiếm khoảng 20 – 40% lượng protein cĩ trong hạt vi rút (Mengeling W.L và cs, 1996) và protein N là protein gây đáp ứng kháng thể sớm nhất (Plana-Duran J và cs, 1997), hầu hết những xét nghiệm chẩn đốn bệnh PRRS chủ yếu là phát hiện kháng thể kháng lại protein này (Meteu

E và cs, 2008)

Hiện nay, việc chẩn đốn sớm hội chứng PRRS thường sử dụng Kit ELISA HerdCheck 2XR (IDEXX) của Mỹ, đây được coi là tiêu chuẩn vàng để phát hiện kháng thể kháng vi rút PRRS cĩ độ nhạy cao, đặc hiệu và nhanh chĩng Phương pháp này cĩ thể phát hiện được kháng thể kháng vi rút PRRS trên lợn sau 9 ngày nhiễm , tuy nhiên Kit ELISA này cĩ giá thành khá đắt Ở nước ta việc chẩn đốn

sớm hội chứng PRRS cũng ñang sử dụng Kit này Với mong muốn tạo ra sản phẩm xác ñịnh nhanh PRRS với giá thành phù hợp ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành ñề tài:

“Nghiên cứu sự biểu hiện protein Nucleocapsid của vi rút gây hội chứng rối

loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trên vi khuẩn E coli.”

Mục tiêu:

ðưa ñược gen ORF7 mã hóa protein Nuclecapsid của vi rút PRRS vào các vector biểu hiện, thu nhận sự biểu hiện của các protein tái tổ hợp trong các hệ thống vector và tinh sạch protein tái tổ hợp

Nội dung nghiên cứu:

 Tạo 5 vector tái tổ hợp pET28a/ORF7, pSV278/ORF7, pET30GB1/ORF7,

pGEX4T1/ORF7, pET28TRX/ORF7 mang ñoạn gen ORF7 mã hóa cho protein

Nucleocapsid của vi rút PRRS

 Biểu hiện và khảo sát các ñiều kiện biểu hiện: Nồng ñộ IPTG, mật ñộ vi khuẩn, nhiệt ñộ và thời gian thu mẫu có khả năng ảnh hưởng tới sự biểu hiện ñoạn

gen ORF7 trong vi khuẩn E coli BL21 (DE3)

 Kiểm tra ñộ hòa tan và tinh sạch protein tái tổ hợp

 Kiểm tra hoạt tính kháng nguyên của protein tái tổ hợp

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về PRRS

ñó giải thích cho sự lây lan ồ ạt trong các vùng chăn nuôi lợn có mật ñộ cao

Vi rút PRRS thuộc chi Arterivirus, vi rút này ñược phân lập và ñịnh loại vào năm 1999 Những con vật mang bệnh là vật gieo rắc mầm bệnh nguy hiểm cho môi trường, không khí cũng phát tán vi rút một cách nhanh chóng ñặc biệt khi ñộ ẩm cao, nhiệt ñộ thấp và tốc ñộ gió mạnh Ngoài ra, các loài côn trùng như muỗi, ruồi

và vịt trời… cũng có thể là trung gian truyền bệnh Một ñặc trưng của Arteriviruses

là chúng sao bản sơ cấp, chúng sinh sản trong tế bào chất quanh nhân của các tế bào chủ Những virion mới ñược giải phóng bởi exocytosis từ bề mặt của tế bào Tế bào ñích sơ cấp của vi rút là ñại thực bào túi phôi của lợn, vi rút rất thích hoạt ñộng ở vùng phổi

Hình 2.1 Hình ảnh ñại thực bào khi

Bình thường, ñại thực bào sẽ tiêu diệt tất cả vi khuẩn, vi rút xâm nhập vào cơ thể nhưng riêng ñối với vi rút PRRS nó không những không bị tiêu diệt mà còn có thể nhân lên trong ñại thực bào, sau ñó phá huỷ và giết chết ñại thực bào

Vi rút PRRS có một ái lực ñặc biệt với ñại thực bào, ñặc biệt là ñại thực bào ở phổi, ñại thực bào này còn gọi là ñại thực bào phế nang Chúng có tác dụng tiêu hoá

và loại bỏ các vi khuẩn và vi rút xâm nhập vào phổi, ngoại trừ trường hợp vi rút PRRS Vi rút PRRS có thể tiêu diệt tới 40% ñại thực bào làm phá huỷ phần lớn hệ thống bảo vệ cơ thể và khiến cho các vi khuẩn và vi rút khác có cơ hội phát triển và gây bệnh Sau khi xâm nhập vào tế bào ñại thực bào, chúng nhân lên và phá huỷ rất nhanh tế bào Lúc ñầu vi rút PRRS kích thích các tế bào này, nhưng sau 2 hoặc 3 ngày vi rút sẽ giết chết chúng, các virion ñược giải phóng ồ ạt rồi xâm nhiễm sang các tế bào khác Ở giai ñoạn ñầu quá trình xâm nhiễm do vi rút PRRS dường như hiệu giá kháng thể kháng lại các loại vi rút và vi khuẩn khác không liên quan trong cơ thể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của ñại thực bào trong hệ thống miễn dịch ðiều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc ñánh giá mức ñộ miễn dịch ñối với các bệnh truyền nhiễm trên cơ thể lợn

Vi rút có vỏ bao với bộ gen là RNA sợi ñơn kích thước hệ gen khoảng 15kb bao gồm ñầu 5’, ñầu 3’ và 9 khung ñọc mở (Open reading frame – ORF) Cấu trúc

vi rút bao gồm 2 gen mã hóa cho các protein không cấu trúc (Nsp – non-structure protein) và bảy gen mã hóa cho các protein cấu trúc và chức năng (structure protein gene) ORF1a và ORF1b là các gen mã hóa protein không cấu trúc – chiếm khoảng 75%, kích thước phân tử nhỏ, có hoạt tính sao chép và polymerase ORF1a ñược dịch trực tiếp trong khi ORF1b ñược dịch bởi một khung dịch chuyển ribosomal Bảy ORF còn lại có kích thước phân tử nhỏ hơn, ñịnh vị ở ñuôi 3’ của hệ gen, mã hóa các protein cấu trúc bao gồm GP1, GP2, GP3, GP4, GP5, M và N

Khi phân tích hệ gen PRRS người ta thấy rằng các khung ñọc mở (ORFs) lồng vào nhau từ 1 – 253 bp Ví dụ: khung ñọc mở 4 (ORF4) và 5 (ORF5) lồng vào nhau bởi 1 bp, ORF3 và ORF4 lồng vào nhau bởi 253 bp Như vậy, vi rút sử dụng một phần gen chung ñể mã hóa cho các protein khác nhau (Hình 2.3.)

Giữa các chủng vi rút PRRS có sự khác biệt di truyền ñáng kể, ñó là 2 chủng gốc nguyên thủy Châu Âu (loại I, ñiển hình là vi rút Lelystad –EU type) và Bắc Mỹ (loại II, vi rút VR-2332 – NA type) – là hai nguyên mẫu của vi rút PRRS (Andreyev

V G và cs, 1997) Hai kiểu gen khác nhau – hai biến chủng vi rút PRRS Bắc Mỹ và châu Âu gây ra các hội chứng lâm sàng tương tự nhau, nhưng chúng thể hiện 2 kiểu gen riêng biệt với ñộ lệch di truyền khoảng 20-50% ở mức ñộ nucleotide Sự tương ñồng giữa 2 chủng trên thể hiện ở sự giống nhau trong trình tự nucleotide giữa các ORF lần lượt là: 57-59% (ORF7), 70-81% (ORF6), 51-59% (ORF5), 68% (ORF4), 58% (ORF3) và 63% (ORF2) (Andreyev V G và cs, 1997; Meng X J và cs, 1994; Meng X J và cs, 1995a; Meng X J và cs, 1995b; Murtaugh M P và cs, 2002)

Và ngay trong cùng một kiểu gen, mức ñộ khác biệt di truyền cao giữa các chủng vi rút thực ñịa (field vi rút) ñang lưu hành tại các vùng ñịa lý cũng ñược xác nhận ðiều này do ñặc tính biến ñổi di truyền cao của các chủng vi rút giúp nó trốn tránh ñược ñáp ứng miễn dịch của vật chủ Gần ñây dịch bệnh xảy ra tại một số nước cho thấy sự biến ñổi của chủng NA tại một số nước châu Á như Trung Quốc, Việt Nam cho thấy ñộc lực vi rút ñã có thay ñổi ñáng kể thể hiện ở việc dịch bệnh xảy ra với tỷ lệ lợn chết cao (Feng Y và cs, 2008)

Hiện nay có 2 kiểu gen của vi rút PRRS chính ñược công nhận là Châu Âu (Nhóm I) có tên gọi là Lelystad và Bắc Mỹ (Nhóm II) có tên gọi là VR2332 Khi so sánh về di truyền ñã thấy sự khác nhau rõ rệt (khoảng 40%) giữa 2 kiểu gen này Ở Châu Á và Nam Mỹ người ta ñã phân lập ñược cả 2 kiểu gen, trong mỗi kiểu gen các chủng khác nhau có mức ñộ tương ñồng khác nhau

Châu Á dịch ñã xuất hiện từ rất sớm ngay từ năm 1989 tại Nhật Bản Tại châu

Âu bệnh bắt ñầu xuất hiện năm 1990 ở ðức, sau ñó lan ra rộng khắp toàn bộ châu

Âu Bệnh xuất hiện lúc ñầu với rất nhiều tên gọi khác nhau như bệnh thần bí ở lợn, bệnh lợn PRRS, hội chứng vô sinh và sảy thai ở lợn, bệnh Heko – Heko, Hội chứng sảy thai và bệnh ñường hô hấp (Porcine epidemic abortion and respiratory syndrome) ðến năm 1991 khi bệnh lây lan ra nhiều nước trên thế giới với triệu chứng hô hấp và sinh sản ñặc trưng, nên tại uỷ ban Châu Âu ñã có tên chính thức là

“Porcine reproductive and respiratory syndrome” - viết tắt là PRRS Năm 1992 Tổ chức thú y thế giới công nhận tên PRRS như một tên gọi quốc tế cho bệnh này Ngày nay tên PRRS ñã ñược sử dụng rộng rãi

Hình 2.3 Sơ ñồ hệ gen của vi rút PRRS

(Nguồn: http://ias-cnsh.org/Portals/0/PRRS virus-structure)

2.1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Wang C và cs (1991) áp dụng ñịnh ñề Koch ñã khẳng ñịnh nguyên nhân của PRRS là do vi rút, khẳng ñịnh có hai dòng vi rút nguyên mẫu là dòng Châu Âu và dòng Bắc Mỹ gây ra PRRS Tác giả ñã ñặt tên cho vi rút gây ra PRRS ở Châu Âu là Lelystad

Benfield (1992) ñã mô tả, ñặt tên cho vi rút gây bệnh ở Bắc Mỹ là VR- 2332

và ñưa ra ñặc tính của PRRSV như sức ñề kháng của PRRSV Tác giả khẳng ñịnh PRRSV thích hợp ở pH từ 6,5- 7,5

Benfield (1992); Saito (1996) ñã khẳng ñịnh vi rút gây PRRS có quan hệ họ hàng gần với vi rút viêm ñộng mạch ngựa, vi rút tăng enzyme lactate dehydrogenase

ở chuột, vi rút gây sốt xuất huyết ở khỉ Cũng như ñưa ra những ñặc tính quan trọng của họ Arteriviridae, bộ Nidovirales

Damrongwatanapokin S và cs (1996) lần ñầu tiên ñã phân lập ñược PRRSV Tuy nhiên, có một số nghiên cứu ñã khẳng ñịnh PRRS lần ñầu tiên xuất hiện ở nước này vào năm 1989 Nguồn gốc PRRS tại Thái Lan là do việc sử dụng tinh lợn nhập nội ñã bị nhiễm vi rút PRRS hoặc là do các ñàn nhập nội mang vi rút PRRS

Mengeling và cs (1996), Mengeling và cs (1998) nghiên cứu về vaccine chống lại PRRS Khẳng ñịnh vi rút vaccine kích thích ñáp ứng miễn dịch chậm, vi rút vaccine có thể truyền qua nhau thai, truyền từ con ñược tiêm vaccine sang con không tiêm vaccine

Vezina và cs (1996), Yoon và cs (1995) ñã nghiên cứu về quá trình ñáp ứng miễn dịch của lợn khi cơ thể lợn nhiễm PRRS Các tác giả ñã khẳng ñịnh kháng thể IgM xuất hiện vào ngày thứ 7 và ngày thứ 14 IgG xuất hiện sau khi nhiễm PRRS Kháng thể trung hoà xuất hiện vào 4-5 tuần sau nhiễm PRRSV và ñạt tối ña vào lúc

10 tuần, miễn dịch kéo dài khoảng 1 năm

Zimmermen và cs (1999) ñã nghiên cứu một cách ñầy ñủ và sâu sắc về Hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn Các tác giả ñã giải thích về nguồn gốc tên gọi PRRS, cũng như cung cấp cho ñộc giả một bảng danh sách tên gọi trước khi

có tên PRRS

Từ năm 2000 ñến 2003, R Thanawongnuwech và cs ñã tiến hành một nghiên cứu quy mô rộng lớn tại Thái Lan và ñưa ra kết quả PRRSV từ 137 mẫu phân lập từ nhiều ñiạ phương thuộc nước này gồm cả chủng dòng Châu Âu và dòng Bắc Mỹ Trong ñó, vi rút thuộc chủng dòng Bắc Mỹ chiếm 33,58%, dòng Châu Âu chiếm 66,42%

Indik và cs (2005) ñã ñưa ra bằng chứng về sự có mặt của chủng PRRSV dòng Bắc Mỹ ở Áo ở mức ñộ phân tử Không giống như nhiều nước khác, chủng vaccine dòng Bắc Mỹ chưa ñược phép nhập vào Áo, vì thế lý do duy nhất ñể giải thích sự có mặt của chủng vi rút PRRS dòng Bắc Mỹ ở Áo là do việc nhập lợn ñã

ñược tiêm vaccine chủng vi rút Bắc Mỹ Nghiên cứu ngày nhấn mạnh tầm quan trọng của các phân tích chi tiết trình tự gen của các biến thể di truyền vi rút PRRS ñang lưu hành ở từng khu vực

Jun Han và cs (2006) ñã khẳng ñịnh về mặt di truyền học và tính kháng nguyên hai loại vi rút Lelystad và VR- 2332 hoàn toàn khác nhau, nếu chúng xuất phát từ một tổ tiên thì chúng ñược tiến hoá theo hai hướng khác nhau Hai vi rút này

ñã trở thành hai dòng vi rút nguyên mẫu, dòng Châu Âu (vi rút Lelystad) và dòng Bắc Mỹ (VR2332)

Tại Trung Quốc, một căn bệnh bí hiểm ñã xảy ra còn ñược gọi là bệnh sốt cao vào năm 2006 và người ta thấy có dấu hiệu của PRRS Căn bệnh này ñã lan rộng ra hơn 10 tỉnh và tấn công 2.000.000 lợn, gây chết 400.000 lợn Không giống với PRRS ñiển hình, căn bệnh bí hiểm này xảy nhiều trên lợn lớn với dấu hiệu sốt cao, và một số triệu chứng như dịch tả lợn Khi phân tích hệ gen, người ta thấy các

vi rút PRRS phân lập ñược thuộc nhóm II và tương ñồng rất cao với chủng HB-1, một chủng PRRS của Trung quốc (96,5%)

Vi rút PRRS có thể tiêu diệt tới 40% ñại thực bào làm phá huỷ phần lớn hệ thống bảo vệ cơ thể và khiến cho các vi khuẩn và vi rút khác có cơ hội phát triển và gây bệnh Sau khi xâm nhập vào tế bào ñại thực bào chúng nhân lên và phá huỷ rất nhanh tế bào bảo vệ cơ thể Vì thế vi rút hấp thụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này và phá huỷ nó Một tỷ lệ lớn tế bào ñại thực bào trong phế nang phổi

bị vi rút xâm nhiễm rất sớm

Lúc ñầu, PRRS có thể kích thích các tế bào này, nhưng sau 2 hoặc 3 ngày vi rút sẽ giết chết chúng, các virion ñược giải phóng ồ ạt rồi xâm nhiễm sang các tế bào khác Ở giai ñoạn ñầu của quá trình xâm nhiễm của PRRS, dường như hiệu giá kháng thể kháng lại các loại vi rút và vi khuẩn khác không liên quan trong cơ thể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của ñại thực bào trong hệ thống miễn dịch ðiều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc ñánh giá mức ñộ miễn dịch ñối với các bệnh truyền nhiễm ở cơ thể lợn

Vi rút tương ñối mẫn cảm và dễ dàng bị tiêu huỷ bởi các yếu tố vật lý và hoá học Cụ thể, vi rút bị tiêu huỷ nhanh chóng khi môi trường có pH<5.5 hoặc pH>6.5

và tính gây bệnh cũng giảm ñi ñến 90% ở những môi trường như vậy; ñối với tác ñộng của nhiệt ñộ, vi rút có thể tồn tại 20 giờ ở nhiệt ñộ 200C, 3 giờ ở nhiệt ñộ 370C

và 6 phút ở nhiệt ñộ 560C Vi rút cũng bị vô hoạt nhanh chóng khi bị tác ñộng bởi các loại hoá chất thông thường như chloroform hoặc ether

Pesente và cs (2006) ñã nhận xét trình tự nucleotide ORF5 và ORF7 của chủng vi rút PRRS phân lập tại các trại lợn ở miền bắc Italia cung cấp các thông tin giá trị cho việc ñánh giá dịch tễ học và phát tán vi rút Kết quả so sánh trình tự nucleotide các dòng vi rút PRRS ñại diện ñang lưu hành cho thấy ña hình di truyền lớn trong trình tự ORF5 và ORF7, và cây phả hệ di truyền cũng bộc lộ khác biệt di truyền lớn giữa các chủng vi rút nghiên cứu Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước ñây của Stadejek và cs vào năm 2002 khi phân tích các vùng biến ñổi trong trình tự axit amin của ORF5 và ORF7

Amonsnin và cs (2009) ñã phân tích trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen của chủng PRRSV thu từ ñợt dịch bệnh năm 2001 tại Thái Lan Kết quả cho thấy kích thước phân tử của hệ gen chủng PRRSV dòng châu Âu (EU) và dòng Bắc Mỹ (NA) tương ứng là 14934 và 15412 nucleotide Cũng giống như các nhà nghiên cứu trước ñây về cấu trúc hệ gen PRRSV, hệ gen của vi rút PRRS Thái bao gồm: 2 vùng không phiên mã (ñầu 5’- và ñuôi 3’-), 8 ORF, trong ñó 2 gen không cấu trúc là ORF1a và ORF1b (Nsp – Nonstructure protein) và ORF2 – 7 là các gen mã hoá protein cấu trúc Dựa trên trình tự hệ gen, cây phả hệ di truyền cho thấy trong 2 chủng PRRSV thì một thuộc về dòng châu Âu và một thuộc về dòng Bắc Mỹ So sánh trình tự toàn bộ hệ gen của 2 chủng vi rút PRRS phân lập tại Thái Lan với các chủng có nguồn gốc châu Âu, Bắc Mỹ cung cấp thông tin quý giá cho việc ñánh giá mức ñộ biến ñổi di truyền và tiến hoá phân tử của các chủng này, cụ thể là: chủng vi rút 0INPI ñược cho là có nguồn gốc từ vaccine nhưng tại thời ñiểm năm 2001 thì vaccine US – MVL (Modified Live Virus) chưa có mặt tại thị trường Thái Lan, vì

thế lý do của việc lưu hành chủng vi rút 0INP1 cĩ thể là do sự cĩ mặt của PRRSV trong lợn giống hoặc tinh trùng nhập khẩu từ Mỹ

Gonin và cs (2009) đã giải trình tự nucleotide GP5 của vi rút PPRS phân lập tại Hàn Quốc năm 2007 – 2008 Kết quả cho thấy sự khác biệt di truyền tương đối cao (1,3 – 12,9%) giữa chủng vi rút đang lưu hành so với chủng vi rút cải vaccine (Modified live virus) Cây phân loại di truyền cũng cho thấy biến đổi di truyền giữa các chủng tăng theo thời gian từ 1997 – 2008 Vì thế tác giả khuyến cáo cần cĩ đề xuất trong việc lựa chọn loại vaccine thích hợp hơn nhằm khống chế bệnh PRRS hiệu quả mặc dù chủng vaccine đang sử dụng đã và vẫn cĩ tác dụng tốt trong việc làm giảm các tín hiệu lâm sàng của bệnh cũng như cải thiện giá trị tăng trọng trung bình ngày của đàn lợn tại các trại nhiễm PRRSV

Shi và cs (2010) đã đựa trên sự phân tích di truyền của 8624 trình tự ORF5

để xây dựng nên một bức tranh tồn diện về sự đa dạng di truyền của PRRSV loại

2, đồng thời phân chia các chủng hiện cĩ thành 9 dịng và các chủng cho mỗi dịng Trong báo cáo này cịn bao gồm cả các dịng chưa từng được cơng bố trước đây Hệ thống phân loại của Shi là một trong những hệ thống đầy đủ và đáng tin cậy nhất, làm cơ sở để so sánh và phân tích cho các nghiên cứu sau này Hơn 85% tất cả các trình tự rơi vào 4 dịng lớn bao gồm dịng số 9 (2800 mẫu), dịng số 1 (2000 mẫu), dịng số 5 (1500 mẫu) và dịng số 8 (1400 mẫu) trong khi các mẫu cịn lại rơi vào 5 dịng với kích thước mẫu gần tương đương khoảng từ 14 cho đến 115 mẫu Chủ yếu các trình tự của các dịng quốc tế rơi vào dịng số 5 Một vài trình tự của Thái Lan

và của Canada thuộc dịng số 1 Dịng độc lực cao của Trung Quốc thuộc dịng số 8 Một vài mẫu từ Ý thuộc về dịng số 8 và số 9 Các chủng vacccine đang sử dụng hiện nay cũng được phân tích Vaccine MLV (Boehringer Ingelheim, Germany) và chủng gốc VR – 2332 thuộc chủng số 5.1 tương tự như phần lớn các mẫu của các trình tự trên thế giới Vaccine dịng ATP (Boehringer Ingelheim, Germany) thuộc

về chủng 8.9 Vaccine dịng PrimePac và Neb-1 thuộc về dịng số 7 Chủng cĩ độc lực cao ở Trung Quốc thuộc vào chủng số 8.7 Madsen cũng đã đưa ra dự đốn các chủng cĩ độc lực cao này khơng bắt nguồn từ một dịng chưa được biết trước đĩ mà

bắt nguồn từ dịng số 8 đã lưu hành ở Trung Quốc 10 năm trước khi bùng nổ dịch vào năm 2006 Thêm vào đĩ, dựa trên phân tích chủng PRRSV ở các bang của Mỹ

và các chủng khác trên thế giới, Madsen K G và cs đã khẳng định lại chắc chắn kết luận của một số nhà nghiên cứu trước về sự lây truyền của PRRSV khơng bị hạn chế bởi khoảng cách địa lý

Ngồi ra, báo cáo cũng đồng thời chỉ ra rằng trong suốt 30 năm quá trình phát triển, tiến hĩa của mình PRRSV ORF5 đã đạt tới sự khác biệt trung bình về mặt di truyền là 12,5% với khoảng cách các cặp lớn nhất là 27,8% Shi và cs, (2010) đã khuyến cáo sự phát triển nhanh chĩng như vậy cĩ thể gây ra những khĩ khăn trong chẩn đốn vi rút và hiệu quả của vắc-xin và vì vậy các cơng trình nghiên cứu tốc độ phát triển của vi rút, giải trình tự của các mẫu nên được tiến hành thường xuyên

2.1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước

Cho đến nay ở Việt Nam chưa cĩ nhiều nghiên cứu về Hội chứng rối loạn và sinh sản ở lợn, đặc biệt là nghiên cứu sâu về mầm bệnh, tính chất kháng nguyên cũng như độc lực của vi rút gây bệnh Việc điều tra sự lưu hành của vi rút PRRS cũng chưa được tiến hành một cách rộng rãi

Năm 1997 Việt Nam nhập 51 lợn giống từ Mỹ khi kiểm tra cĩ 10/ 51 con cĩ huyết thanh dương tính với PRRS Từ năm 1997 đến 2006 cĩ rất nhiều tác giả trong nước nghiên cứu về hội chứng PRRS nhưng chỉ dừng lại ở điều tra, giám sát tỷ lệ lưu hành huyết thanh

Từ năm 1999 – 2002 một số nhà khoa học Nhật Bản kết hợp với Trường ðại học Cần Thơ cũng đã tiến hành điều tra một số trường hợp bệnh ở lợn cĩ hiện tượng lợn con chết và lợn nái sảy thai và điều trị kháng sinh khơng hiệu quả Trong nghiên cứu này, người ta điều tra một số nguyên nhân gây bệnh trong đĩ cĩ hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn ðiều tra được tiến hành ở các đàn lợn gia đình, một

số trại giống của Nhà nước và một số lị mổ Các nhà khoa học đã phát hiện thấy kháng thể PRRS trong huyết thanh ở các đàn lợn nuơi gia đình và cĩ tỷ lệ lưu hành

cao ở các trại lợn của Nhà nước cùng với hiện tượng tỷ lệ lợn con chết cao Ngồi

ra, cũng phát hiện thấy vi rút giả dại và vi rút Dịch tả lợn

Bắt đầu từ tháng 3 năm 2007, khi các ổ dịch lâm sàng PRRS bùng nổ thì việc nghiên cứu về bệnh ở Việt Nam mới được triển khai tồn diện trên cả nước dưới nhiều hình thức cả về dịch tễ học và các biện pháp chẩn đốn xét nghiệm, phịng chống dịch bệnh

Từ tháng 3 năm 2007, một căn bệnh lạ đã xuất hiện trên nhiều đàn lợn ở một số tỉnh như Hưng Yên, Hải Dương, Thái Bình, Hà Nội, Quảng Nam Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung ương đã xác định được nguyên nhân chính gây bệnh là Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn (PRRS) Căn bệnh này cĩ đặc điểm là xảy ra ở tất cả các lứa tuổi lợn và khác biệt với vi rút PRRS thể cổ điển chủ yếu tấn cơng lợn nái và lợn con Các mẫu vi rút PRRS phân lập được từ các ổ dịch đã được gửi đi giám định tại Phịng thí nghiệm Chẩn đốn Thú y quốc gia của Hoa Kỳ (USDA-NVSL) và tại Trung tâm Kiểm sốt và phịng chống dịch bệnh Trung Quốc Kết quả giám định cho thấy các mẫu vi rút của Việt Nam thuộc dịng Bắc Mỹ và cĩ độ tương đồng cao (98,7-99,8%) với vi rút PRRS gây bệnh tại Trung Quốc năm 2006 Phân tích cấu trúc gen NSP2 của vi rút PRRS phân lập ở Việt Nam cũng thấy cĩ 2 đoạn mất khơng liên tiếp của axit amin tại vị trí 481

và 532-560 Theo các nhà khoa học Trung Quốc vi rút PRRS phát hiện được ở Việt Nam

cĩ sự mất đoạn giống với PRRS chủng độc lực cao ở Trung Quốc

Tơ Long Thành (2007) đã trình bày một cách tổng hợp về hội chứng PRRS nĩi chung, khẳng định lợn các lứa tuổi đều mắc, nhưng nặng nhất ở lợn nái và lợn con Tác giả đã đưa ra biện pháp phịng hội chứng PRRS, trong đĩ nhấn mạnh việc phịng bệnh PRRS bằng vaccine

Khi lợn mắc PRRS khơng chỉ cĩ những bệnh tích đặc trưng nhất của PRRS

là ở phổi mà cịn cĩ những bệnh tích khác do vi khuẩn kế phát gây ra Những vi khuẩn kế phát ở đường phổi thường gặp là Mycoplasma hyopneumoniae (suyễn lợn), Pasteurella multocida (Tụ huyết trùng), Streptococcus suis type 2 (liên cầu khuẩn type 2), Bordetella bronchiseptica (viêm teo mũi) và Haemophilus parasuis (viêm đường hơ hấp)… Theo kết quả nghiên cứu của Viện Thú y Quốc gia do tác

giả Cù Hữu Phú thực hiện cho thấy, các bệnh nhiễm trùng kế phát thường gặp ở lợn mắc bệnh Tai xanh gồm: Tụ huyết trùng, Liên cầu khuẩn và Viêm phổi do vi khuẩn

ở lợn

Phạm Ngọc Thạch và cs (2007) nghiên cứu về một số chỉ tiêu lâm sàng và chỉ tiêu máu của lợn mắc PRRS tại Hải Dương và Hưng Yên đã cho thấy, khi lợn mắc PRRS tần số hơ hấp, tim mạch, thân nhiệt đều cao hơn sinh lý bình thường, chỉ tiêu sinh

lý, sinh hố máu thay đổi đặc biệt là số lượng bạch cầu, độ dự trữ kiềm trong máu tăng cao Trong khi hàm lượng protêin tổng số, hàm lượng đường huyết lại giảm rõ rệt

Lê Văn Năm (2007) khi khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể

ở lợn mắc PRRS tại một số địa phương thuộc ðồng bằng Bắc Bộ- Việt Nam đã thấy rằng các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn mắc PRRS tương tự như các tài liệu trong và ngồi nước cơng bố Nhưng điểm khác đĩ là tỷ lệ tiêu chảy, lạc giọng của lợn con theo mẹ cũng như tỷ lệ táo bĩn ở lợn lớn hơn

Nguyễn Ngọc Hải và cs (2007) đã sử dụng kỹ thuật RT- PCR để phát hiện vi rút PRRS trong các mẫu huyết thanh, tinh dịch, mơ của lợn cĩ kết quả dương tính

và âm tính với kháng thể PRRS khi dùng phương pháp ELISA Tác giả đã khơng ghi nhận được mối tương quan giữa sự liên hệ của kháng thể kháng PRRS và kết quả dương tính với vi rút PRRS chẩn đốn bằng kỹ thuật RT- PCR

Tơ Long Thành và cs (2008) đã cho biết năm 2008 số lượng bệnh phẩm lợn mắc PRRS gửi đến Trung tâm chẩn đốn thú y TW nhiều hơn năm 2007, khẳng định những mẫu bệnh phẩm dương tính với PRRS cĩ sự bội nhiễm vi khuẩn Chủng vi rút độc lực cao của Việt Nam cĩ sự tương đồng về cấu trúc gen với chủng vi rút độc lực cao của Trung Quốc đến 99% Khi sử dụng vi rút PRRS gây bệnh tại Việt Nam tiêm cho lợn thí nghiệm lợn khơng chết, huyễn dịch bệnh phẩm lấy tại ổ dịch của Việt Nam gây chết 100% lợn trong 72h ðiều này cho thấy vai trị của vi khuẩn bội nhiễm

Trần Thị Bích Liên (2008) đã tổng quát về tình hình dịch PRRS cả Việt Nam

và thế giới cũng như những đặc điểm cơ bản về PRRSV ðặc biệt tác giả đưa ra

phương pháp chẩn đốn PRRS như phân lập vi rút bằng phương pháp IPMA kết hợp với PCR, phương pháp phát hiện kháng nguyên, kháng thể Tác giả chỉ rõ để phát hiện kháng nguyên sử dụng phương pháp RT- PCR là hiệu quả nhất, phát hiện kháng thể cĩ hai phương pháp cĩ độ chính xác cao là IPMA và ELISA

Youjun Feng và cs (2009) đã chỉ rõ các biến chủng của PRRSV của Trung Quốc và Việt Nam cĩ bộ gen tương đồng tới 99% Phân tích di truyền đã cho thấy các chủng vi rút này đều cĩ sự đứt đoạn acid amin trên protein khơng cấu trúc NSP2 Nhĩm tác giả khẳng định các biến chủng của PRRSV tại Việt Nam và Trung Quốc là đồng nhất

Lê Thanh Hịa và cs (2009) đã phân tích gen M mã hĩa protein màng của vi rút PRRS gây dịch tại tỉnh Quảng Nam chỉ ra vi rút cĩ chuỗi gen M dài 525pb, thuộc type II dịng Bắc Mỹ, cĩ thành phần nucleotide và axit amin tương đồng từ 99 – 100% các chủng của Trung Quốc, từ đĩ cho thấy cĩ thể chủng vi rút ở Việt Nam

cĩ cùng nguồn gốc phát sinh các chủng của Trung Quốc

Lê Thanh Hồ và cộng sự (2009) đã phân tích trình tự gen M (ORF6) cho thấy chủng vi rút PRRS thu trong đại dịch tại Quảng Nam năm 2007 cĩ trình tự nucleotide tương đồng rất cao (99%) so với các chủng độc lực cao đang lưu hành tại Trung Quốc, thuộc kiểu gen Bắc Mỹ (với 96% tương đồng với chủng nguyên thuỷ VR2332), nhưng lại chỉ cĩ 76% trình tự tương đồng với chủng cổ điển châu Âu – Lelystad

Võ Khánh Hưng và cs (2010) khi phân tích trình tự gen N (ORF7) của các chủng PRRSV phân lập tại ðồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu và Tp HCM đã xác nhận các chủng vi rút PRRS đang lưu hành tại địa phương thuộc dịng châu Mỹ, cùng nhĩm với chủng vi rút độc lực cao của Trung Quốc (tương đồng 98,4 – 99,5% nucleotide) ðặc biệt, hai chủng phân lập từ Bà Rịa – Vũng Tàu cĩ sự biến đổi di truyền lớn so với các chủng thực địa khác tại các tỉnh thành được nghiên cứu (89,5 – 90,3% nucleotide tương đồng) và so với chủng vaccine BSL – PS100 (mức tương đồng 91,1% nucleotide), và tách riêng biệt so với các chủng khác xuất hiện trước đây Kết quả này cho thấy đang cĩ xu hướng biến đổi di truyền của vi

rút PRRS tại một số tỉnh miền Nam Việt Nam cụ thể là ở Bà Rịa – Vũng Tàu ðiều này đĩng gĩp vào hiểu biết về dịch tễ học cũng như xu hướng biến đổi di truyền của các chủng vi rút PRRS tại thực địa và hiệu quả của việc sử dụng vaccine hiện tại ở các tỉnh nĩi trên

Võ Khánh Hưng và cộng sự (2012a) đã phân tích và so sánh trình tự GP5 của

6 chủng vi rút PRRS phân lập tại Tp HCM và ðồng Nai trong năm 2009 cho thấy các chủng vi rút PRRS lưu hành tại ðồng Nai và Tp HCM thuộc dịng châu Mỹ, cùng nhĩm với các chủng vi rút PRRS độc lực cao của Trung Quốc (98,5 – 99,7%),

và tương đồng 87,9 – 88,6% so với chủng vaccine đang khuyến cáo sử dụng tại Việt Nam, BSL – PS100 của Bestam Singapo

Nguyễn Ngọc Hải và cs (2012) đã sử dụng kỹ thuật nested RT-PCR để xác định kiểu gen của PRRSV nhiễm trên 46 mẫu bệnh phẩm thu được từ các trại chăn nuơi lợn ở TP Hồ Chí Minh, ðồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Bắc Giang và Hà Nội Kết quả ghi nhận PRRSV nhiễm trên đàn lợn Việt Nam thuộc kiểu gen Bắc Mỹ với 100% mẫu dương tính Kiểu gen Châu Âu của PRRSV chỉ chiếm 2,18% (1/46 mẫu) mẫu xét nghiệm

Nguyễn Thị Lan và cộng sự (2012) khi chẩn đốn bằng kỹ thuật bệnh lý cho thấy các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn sau cai sữa mắc PRRS bao gồm: sốt,

bỏ ăn, khĩ thở, tím tái Bệnh tích đại thể tập trung chủ yếu ở phổi và hạch lâm ba với hiện tượng viêm là phổ biến Các biến đổi vi thể phổ biến ở phổi với hiện tượng thâm nhiễm tế bào viêm, các cơ quan khác như hạch, lạch, thận cũng xuất hiện các tổn thương vi thể Bằng kỹ thuật RT-PCR, đã xác định được chính xác được lợn sau cai sữa mắc PRRS

Nguyễn ðức Hiền (2012) đã nghiên cứu tình hình nhiễm PRRS trong đàn lợn

ở Cần Thơ Xét nghiệm cho thấy 290 mẫu huyết thanh heo chưa tiêm phịng vaccine PRRS bằng phương pháp ELISA cho thấy tỷ lệ nhiễm PRRSV ở heo nuơi tại thành phố Cần Thơ là 16,90% Trong đĩ, tỷ lệ nhiễm PRRS ở heo của những trại chăn nuơi tập trung cao hơn heo nuơi ở các nơng hộ (64,0 % so với 38,12%) Tỷ lệ nhiễm PRRSV cao nhất được tìm thấy trên heo nái (69,57%), kế đến trên heo con (33,33%) và thấp nhất trên heo thịt (12,16%) Xét nghiệm 194 mẫu huyết thanh heo

ựã tiêm 04 loại vacxin phòng bệnh PRRS cho thấy tỉ lệ heo có kháng thể sau tiêm chủng là 59,79%

Nguyễn Bá Hiên (2013) nghiên cứu trên 50 mẫu bệnh phẩm của lợn nghi bệnh thu thập ựược, bằng kỹ thuật RT-PCR, ựã chẩn ựoán chắnh xác 15 lợn mắc PRRS Các mẫu dương tắnh này ựược dùng cho phân lập virut trên môi trường tế bào Marc 145 và ựã phân lập thành công đã khảo sát ựặc tắnh sinh học và sinh học phân tử của 15 chủng virut PRRS phân lập ựược, chọn ra 5 chủng có ựặc tắnh sinh học và sinh học phân tử khá ổn ựịnh, có hiệu giá virut cao ựể phục vụ cho việc nghiên cứu sản xuất vacxin phòng hội chứng PRRS

2.1.4 Tình hình dịch Tai xanh ở Việt Nam

Tại Việt Nam, bằng chứng của vi rút PRRS lần ựầu tiên ựược phát hiện ở ựàn lợn giống nhập khẩu từ Hoa Kỳ vào năm 1997 Sau ựó, một số nghiên cứu giám sát khẳng ựịnh có sự lưu hành của vi rút PRRS tại các tỉnh miền Nam ở các mức ựộ khác nhau tùy theo từng ựịa phương và trại chăn nuôi Tuy nhiên, ựến trước tháng 3/2007 không có ổ dịch PRRS nào ựược báo cáo từ các ựịa phương trong cả nước

Tháng 3/2007, lần ựầu tiên dịch bệnh trên lợn xuất hiện tại Hải Dương 5 tỉnh khác của miền Bắc Sau ựó, với sự hỗ trợ của Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO), nguyên nhân gây bệnh ựã ựược khẳng ựịnh là do vi rút PRRS chủng Bắc

Mỹ gây ra Vi rút này ựã ựược xác ựịnh là có tương ựồng ở mức ựộ cao về kháng nguyên so với vi rút PRRS gây bệnh trầm trọng tại Trung Quốc vào năm 2006 Tuy nhiên, những ựặc ựiểm dịch tễ của bệnh PRRS tại Việt Nam chưa ựược hiểu rõ ràng, các giải pháp xử lý lợn mắc bệnh và lợn trong vùng dịch vào thời ựiểm ựó còn gặp nhiều khó khăn

Kết quả ựiều tra ổ dịch tại các tỉnh miền Bắc (Hưng Yên, Hải Dương và Thái Bình), các tỉnh miền Bắc Trung bộ và miền Trung (Thanh Hóa, Quảng Nam) và các tỉnh miền Nam (Long An, Vĩnh Long và Bạc Liêu) cho thấy:

- Nguyên nhân phát dịch PRRS tại Việt Nam có thể liên quan ựến tình hình dịch ở các nước láng giềng, cụ thể: nguồn bệnh có thể từ Trung Quốc vào Việt Nam

qua cửa khẩu Quảng Ninh, Lạng Sơn Việc buôn bán, vận chuyển lợn ốm không ñược kiểm soát triệt ñể nên nguồn bệnh ñã xâm nhập vào nước ta và sau ñó ñã lây lan theo ñường vận chuyển, gây ra dịch tại các tỉnh Hải Dương, Bắc Giang, Hưng Yên, Thái Bình ở ñợt dịch ñầu năm 2007 Nhận ñịnh này tương ñồng với thông báo của Tổ chức Thú y thế giới (OIE) là trong năm 2006, dịch xảy ra nghiêm trọng ở một số nước trong khu vực, ñặc biệt dịch ñã ñồng loạt xảy ra ở nhiều nơi trên toàn lãnh thổ Trung Quốc Ngoài ra, kết quả phân tích cấu trúc gen của vi rút PRRS do phía Trung Quốc và Mỹ thực hiện cho thấy, vi rút PRRS gây dịch tại Việt Nam ñều

có mức tương ñồng về amino acid từ 99-99,7% so với chủng vi rút PRRS thể ñộc lực cao gây dịch ở Trung Quốc

- Việc giám sát và sớm phát hiện dịch bệnh chưa ñược ñịa phương thực hiện ñầy ñủ do nhiều nguyên nhân khác nhau, dẫn ñến nhiều nơi dịch ñã xảy ra và nhiều ngày sau thú y cơ sở mới báo dịch (ví dụ như ở Quảng Nam, Hà Tĩnh, ở Thanh Hóa dịch xuất hiện tại hơn 40 xã, phường trong vòng một ngày,…); và chưa thực hiện triệt ñể các biện pháp chống dịch, tiêu huỷ lợn bệnh ngay từ khi dịch còn ở phạm vi nhỏ Nghiên cứu tại 11 tỉnh cho thấy: Tỷ lệ hộ chăn nuôi không thông báo cho thú y

cơ sở hoặc chính quyền mà tự xử lý là tương ñối cao (31.94%)

- Dịch lây lan rất nhanh (giữa các tỉnh phía Bắc hoặc từ Bắc vào miền Trung năm 2007) do không quản lý ñược việc vận chuyển lợn ốm Cụ thể, tại 11 tỉnh nghiên cứu tỷ lệ các hộ chăn nuôi lợn bị bệnh có thương lái ñến thăm ñàn lợn trong vòng 1 tháng chiếm 34,29%; hoặc có thú y cơ sở ñến thăm khám, tiêm phòng tại 42% số hộ chăn nuôi lợn trong vòng 1 tháng trước khi xảy ra Ngoài ra, 70/70 (100%) số hộ chăn nuôi có dịch PRRS ñều mua thịt lợn từ nơi khác ñể ăn thịt và cho lợn ăn nước rửa hoặc các chất phụ phẩm khác mà chưa qua xử lý; sử dụng lợn ñực giống từ các cơ sở khác (chiếm 51,43%), mua lợn giống từ các xã, huyện khác (chiếm 57,14%)

- Dịch ñã xuất hiện tại trại chăn nuôi lợn giống của một số tỉnh (Hải Dương, Vĩnh Long và Gia Lai), sau ñó lây lan sang các ñịa phương xung quanh do việc bán lợn giống, tinh dịch (Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn, 2008)

* Tổng hợp các ñợt dịch bệnh PRRS ở Việt Nam từ 2007 ñến 2011

Năm 2007: Vào ngày 12/3/2007 lần ñầu tiên dịch PRRS xuất hiện ở nước ta

trên ñàn lợn của tỉnh Hải Dương làm cho 8.179 con lợn mắc bệnh, 844 lợn chết ðến hết ñợt dịch thứ nhất (ñến ngày 15/5/2007), dịch PRRS xảy ra tại 172 xã, phường, thuộc 30 huyện, thị xã của 09 tỉnh Sau ñó vào tháng 6/2007, dịch xuất hiện tại Quảng Nam và lây lan sang các tỉnh miền Trung và miền Nam tại 233 xã, phường thuộc 45 huyện, thị của 14 tỉnh, thành phố Trong năm 2007, toàn quốc có

324 xã, phường của 65 huyện, quận thuộc 18 tỉnh, thành phố có dịch Số lợn mắc bệnh là 70.577 con (chiếm 0,26% tổng ñàn, toàn quốc có 26.560.651 con), số lợn chết và phải tiêu huỷ là 20.366 (chiếm gần 0,08%) (Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn, 2007)

Năm 2008: Dịch Tai xanh ñã xảy ra thành hai ñợt chính tại 956 xã, phường

thuộc 103 huyện của 26 tỉnh, thành phố Tổng số lợn mắc bệnh là 309.586 con trong

ñó số lợn chết và buộc phải tiêu huỷ là 300.906 con Từ ngày 20/3 - 25/5/2008 (67 ngày) xuất hiện tại 821 xã, phường và thị trấn, 59 huyện, thị và thành phố của 10 tỉnh Nặng nhất là Thanh Hóa với 187.436 lợn mắc bệnh, 37.159 lợn chết và có ngày trên 40 xã, phường báo cáo có dịch PRRS, tiếp ñến là Hà Tĩnh với 29.875 lợn mắc bệnh, 296 lợn chết (Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn, 2008)

Năm 2009: Dịch tai xanh xảy ra ở 69 xã thuộc 26 huyện của 13 tỉnh thành là

BR Vũng Tàu, Bạc Liêu, Bến Tre, Bắc Giang, Bình Dương, ðắc Lắc, ðồng Nai, Gia Lai, Hưng Yên, Quảng Ninh, Quảng Nam, Tiền Giang và Vĩnh Long với 7.030 lợn mắc bệnh và 5.847 lợn buộc phải tiêu hủy (Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn, 2009)

Lạng Sơn, Hà Nội, Nam ðịnh, Hà Nam, Nghệ An, Quảng Ninh, Hòa Bình, Cao Bằng, Sơn La Tổng số lợn mắc bệnh là 146.051 con trong ñó số tiêu hủy là 65.911 con

ðợt 2/2010 tại miền Nam: Theo kết quả ñiều tra, ñợt dịch này bắt ñầu từ ngày 11/6/2010 tại Sóc Trăng Sau ñó dịch xuất hiện tại Tiền Giang (ngày 19/6), Bình Dương (ngày 27/6), Long An (ngày 15/7), Lào Cai (11/7), Quảng Trị (01/7) Tổng số lợn trong ñàn mắc bệnh là 926.333 con, số mắc bệnh là 621.086 con, trong ñó số chết, tiêu hủy là 336.975 con (Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn, 2010)

ðợt 2: Dịch lợn tai xanh ñã xảy ra từ ngày 30/8/2011 tại tỉnh Tây Ninh, ñến nay toàn quốc ghi nhận các ổ dịch tai xanh tại 137 xã, phường, thị trấn của 29 quận, huyện thuộc 8 tỉnh là Tây Ninh, Long An, Tiền Giang, Sóc Trăng, Quảng Nam, Cần Thơ, Khánh Hòa và Hà Nội Tổng số lợn mắc bệnh là 27.558 con lợn trên tổng ñàn 46.328 con; tổng số lợn phải tiêu hủy là 12.361con

Tình hình dịch PRRS năm 2011 ñã giảm so với cùng kỳ năm 2010 cả về phạm vi, quy mô dịch và số lượng gia súc phải tiêu hủy (Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn, 2011)

Tính từ ñầu năm ñến 25 tháng 12 năm 2012 toàn quốc ghi nhận các ổ dịch tai xanh tại 453 xã/ phường, thị trấn của 95 quận/ huyện thuộc 28 tỉnh Tổng số lợn mắc bệnh là 90.688, tổng số chết là 14.065 con, tổng số lợn phải tiêu hủy là 51.761

con Qua giám sát diễn biến của từng ổ dịch theo từng tháng của năm, có thể thấy rằng dịch bắt ñầu xuất hiện lẻ tẻ vào ñầu tháng 1 ñến cuối tháng 3, sau ñó phát triển lây lan trên diện rộng trong giai ñoạn tháng 4 ñến cuối tháng 7 (Bộ Nông Nghiệp

Và Phát Triển Nông Thôn, 2012)

2.3 Biểu hiện gen ở vi khuẩn E coli

2.3.1 Biểu hiện gen ở vi khuẩn E coli

Vào những năm 1970, các thí nghiệm sản xuất protein tái tổ hợp ñầu tiên ñã thành công ở vi khuẩn như hormon somatostatin, sau ñó là insulin ñều có giá trị cao ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và công nghệ sinh học Hiện nay,

Escherichia coli là chủng chủ ñang ñược sử dụng phổ biến nhất trong sản xuất

protein tái tổ hợp do có những ưu thế nổi bật về tốc ñộ tăng trưởng, ñạt ñược mật

ñộ tế bào cao, phát triển trên môi trường ñơn giản, rẻ tiền, các ñặc tính di truyền ñược hiểu biết rõ, sản lượng protein sản xuất cao (có thể lên ñến 50%), có nhiều chủng ñột biến, nhiều vector tạo dòng thích hợp và thao tác di truyền dễ dàng

Protein tái tổ hợp ñược sản xuất ở E coli có thể thực hiện theo ba hướng:

sản xuất nội bào (tế bào chất), trong chu chất và sản xuất ngoại bào Trong ñó, sản xuất protein tái tổ hợp trong nội bào là chiến lược ñược sử dụng phổ biến nhất Protein tái tổ hợp tạo ra có thể ở dạng tan hay không tan (thể vùi), do ñó khuyết ñiểm chủ yếu của chiến lược này là hình thành protein ở dạng thể vùi không có hoạt tính, ñặc biệt là khi biểu hiện vượt mức Protein mục tiêu sau khi thu nhận phải ñược tái gấp cuộn ñể có hoạt tính Nhiều cải tiến ñã ñược tiến hành như nuôi cấy vi sinh vật ở nhiệt ñộ thấp, thay thế các acid amin, sử dụng các

chủng E coli khác nhau, ñồng biểu hiện với chaperone gấp cuộn, thay ñổi

pH, nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện ở ñiều kiện stress

Biểu hiện ở tế bào chất

Hầu hết protein ñược biểu hiện ở E coli ñều ñược thiết kế biểu hiện ở tế bào chất của tế bào Việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E coli

gặp nhiều khó khăn như protein thường ñược tạo ra ở dạng không tan, không có

hoạt tính sinh học gọi là thể vùi (inclusion body), tế bào chất của E coli không

có cơ chế thúc ñẩy sự hình thành cầu nối disulfide… Tuy nhiên, hiện nay việc

biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E coli vẫn là phương án ñược

sử dụng phổ biến nhất do mức ñộ biểu hiện cao hơn so với các vị trí khác trong tế bào, việc thiết kế plasmid cũng ñơn giản hơn Ngoài ra, hiện nay người

ta cũng phát triển nhiều phương pháp nhằm cải thiện tính tan của protein trong

tể bào chất như ñồng biểu hiện các phân tử chapreron; sử dụng các chủng E.coli ñột biến gen trx

Biểu hiện ở chu chất

Khoang chu chất của tế bào E coli là nơi có tính oxi hóa cao do có chứa

các enzyme xúc tác cho việc hình thành liên kết disulfide Tuy nhiên trong khoang chu chất lượng protein thường ñược biểu hiện với hiệu suất thấp Mặt khác, ñể protein có thể chuyển từ màng trong ra ngoài khoang chu chất là ñoạn peptide

tín hiệu Không phải peptide tín hiệu nào cũng hoạt ñộng tốt trong tế bào E

coli Khi tăng sự tổng hợp peptide tín hiệu sẽ làm giảm mức ñộ biểu hiện của

protein ñể tránh tình trạng ùn tắc hệ thống vận chuyển qua màng, làm tăng sự tổng hợp protein ñóng vai trò chuyển màng Bên cạnh ñó khi biểu hiện ở chu chất,

protein cũng có thể tồn tại ở dạng thể vùi

Hình 2.4 Sơ ñồ Sự hình thành cầu nối disuldide trong chu chất ở E coli

Tiết ra môi trường

E coli tiết rất ít (hầu như không có) protein ra ngoài môi trường nuôi

cấy Protein ñược ñịnh hướng tiết ra ngoài môi trường sẽ phải qua hai màng: màng

trong và màng ngoài của E coli Cơ chế chuyển qua màng là rất ñặc hiệu Người ta

cho rằng có hai cách ñể ñịnh hướng protein ñược tiết ra ngoài môi trường ñó là sử dụng con ñường tiết sẵn thông qua việc sử dụng các ñoạn peptide tín hiệu; cách thứ hai là sử dụng các yếu tố thẩm thấu ảnh hưởng tới việc tiết protein có lựa chọn nhưng lại hạn chế ñược tính thấm của màng ngoài Nhìn chung protein tạo

ra bằng những phương pháp này là rất hiếm gặp

2.3.2 Vector biểu hiện

Vectơ dùng ñể biểu hiện gen ở Prokaryot ñược thiết kế ñầy ñủ bao gồm tập hợp các nhân tố di truyền ñược sắp xếp hợp lý nhằm ñiều khiển tối ưu cả quá trình phiên mã, dịch mã ñể tổng hợp nên protein từ gen ngoại lai Ngoài ra, vectơ còn

phải chứa gen mã hóa cho protein có chức năng dùng làm dấu hiệu chọn lọc Gen thường ñược sử dụng trong vectơ biểu hiện là gen kháng chất kháng sinh Gen này tạo ñiều kiện thuận lợi cho việc nhận biết các dòng tế bào mang plasmit ðối với plasmit tự sao chép, một trình tự không thể thiếu ñó là tâm sao chép Tâm sao chép quyết ñịnh số lượng bản copy của plasmit trong một tế bào ðể tạo ñiều kiện thuận lợi cho việc ñưa các ñoạn gen vào vectơ biểu hiện theo ñúng chiều của promotơ, trên vectơ luôn phải chứa vùng ña nối (polylinker region) mang các trình tự của enzym hạn chế có tần số xuất hiện thấp trên các gen cấu trúc

Promotơ (vùng khởi ñầu phiên mã - Promotơ)

Có nhiều loại promotơ khác nhau ảnh hướng tới mức ñộ biểu hiện gen ở

E.coli Các promotơ có khả năng biểu hiện gen cao có những ñặc ñiểm chung như

sau : (1) promotơ phải là promotơ mạnh có khả năng tạo protein ngoại lai lớn hơn

10 ñến 30% protein tổng số của tế bào; (2) promotơ chỉ hoạt ñộng phiên mã gen ở mức ñộ cơ sở (phiên mã khi không cảm ứng) với mức ñộ nhỏ tối ña Promotơ bị ức chế cao khi không ñược cảm ứng là ñiều kiện quan trọng ñể biểu hiện các protein ñộc hoặc có hại ñối với sự sinh trưởng của tế bào; (3) promotơ ñược cảm ứng theo cách ñơn giản nhưng lại hiệu quả cao

Quá trình dừng phiên mã không ñặc hiệu có thể xuất hiện trong bất kỳ một quá trình phiên mã nào ñó do có chứa trình tự trên ARN thông tin giống với trình

tự của terminatơ một cách ngẫu nhiên Các yếu tố chống lại sự dừng phiên mã cũng

ñược ñưa vào vectơ biểu hiện ñể chắc chắn ñoạn ARN thông tin ñược tổng hợp có

ñộ dài ñầy ñủ Nói chung, ñể quá trình này diễn ra thì cần phải có nhân tố khác của

chủng chủ (ví dụ protein Q, N của Bacteriophagơ £, Protein NusA của E coli) và

một vị trí ñặc hiệu tại ñó polimerase bị thay ñổi Quá trình dừng phiên mã có sự tham gia của nhiều yếu tố như trình tự ADN, cấu trúc bậc 2 của ARN vừa ñược tổng hợp và một số nhân tố trong tế bào chủ như P, Nus A, Nus B

Peptit tín hiệu (signal peptite)

Các protein ngoại lai ñược tổng hợp trong tế bào E coli cần thiết phải ñược tiết ra ngoài vì : (1) E coli tiết rất ít protein ra ngoài môi trường nên protein ngoại

lai nếu ñược tiết ra sẽ có ñộ tinh sạch cao, vì vậy tiện cho quá trình tinh sạch sau này (2) Protein tiết ra ngoài khoang chu chất có khả năng hình thành cấu trúc bậc 4 ñúng ñể trở thành protein có hoạt tính sinh học Quá trình cuộn xoắn và hình thành cầu disulfit của protein nằm trong tế bào thường bị hạn chế và dẫn ñến sai hỏng trong cấu trúc protein (3) Protein khi ñược tiết ra ngoài sẽ tránh bị phân cắt bởi một số Protease có trong tế bào

ðể ñược tiết ra khỏi màng trong tế bào, các chuỗi polipeptit bắt buộc phải

có trình tự peptit tín hiệu nằm ở tận cùng ñầu N Thông thường chuỗi peptit tín hiệu ñược cấu tạo gồm 3 vùng: vùng tận cùng ñầu N, vùng tận cùng ñầu C và vùng kỵ nước Mỗi vùng có tối ña 20 axit amin và tối thiểu là 2 axit amin ñối với vùng N, 8 axit amin ñối với vùng kỵ nước và 6 axit amin ñối với vùng C

Thường thì peptit tín hiệu của protein có nguồn gốc từ các chủng khác sẽ

không ñược nhận biết tốt bởi các nhân tố trong hệ tiết của E coli Vì vậy, trên

vectơ biểu hiện, người ta thiết kế chuỗi peptit tín hiệu nằm ngay sau vùng SD và tiếp ñó là trình tự vùng ña nối ñể ñưa gen quan tâm vào vectơ

Hiện nay, trong các vectơ biểu hiện các ñoạn peptide tín hiệu ñược sử dụng rộng rãi ñể vận chuyển hiệu quả các protein ngoại lai qua màng trong tế bào có

nguồn gốc từ các protein tiết của E coli như OpmA, OmpA, OpmT, PelB,

ß-lactamase, alkaline photphatase Thông thường peptide tín hiệu ñược thiết kế sẵn

trong vectơ biểu hiện nhằm ñảm bảo cho nó ñược gắn với ñầu N của protein quan tâm Tuy nhiên, trong một số trường hợp vẫn xảy ra hiện tượng chuỗi polipeptit bị mắc trong khi vận chuyển qua màng và bị protease thủy phân

Một trong những vectơ hệ pET hay ñược sử dụng là vecơ pETT22b(+) chứa peptit tín hiệu pelB có ñộ dài 33 axit amin và nó có tác dụng hướng protein vừa ñược tổng hợp tới màng Sau khi protein ra khỏi màng trong, peptit tín hiệu bị cắt

bỏ bởi protease tại một vị trí xác ñịnh

Tâm sao chép (Ori)

Số lượng bản sao của plasmit trong tế bào phụ thuộc vào nhân tố khởi ñầu

sự sao chép ADN tại một vị trí ñặc hiệu gọi là tâm sao chép (Ori) ðối với các

plasmit sao chép tự do trong tế bào chủ, số lượng bản sao ít nhất cũng bị ảnh hưởng

bởi tốc ñộ sinh trưởng của tế bào E co1i có khả năng tạo 10-12 bản sao/tế bào

Những plasmit ña phiên bản thường bị mất ñi qua các thế hệ tế bào (10-5 - 10-6 trên một thế hệ) khi tế bào mang plasmit ñược nuôi cấy trong môi trường không có áp lực chọn lọc hoặc gen trên plasmit mã hóa cho protein gây ñộc cho tế bào

Dấu chuẩn chọn lọc

ðể tiện lợi cho việc nhận ra các tế bào biến nạp có mang plasmit, thông thường người ta sử dụng môi trường nuôi cấy mà ở ñó chỉ có tế bào có tính trạng chọn lọc nhất ñịnh mới có thể sinh trưởng ñược Có một cách giúp dễ dàng nhận biết các thể biến nạp mang plasmit biến nạp ñó là ñưa các ñoạn gen kháng kháng sinh vào plasmit ñó Sự có mặt của plasmit trong tế bào giúp cho tế bào sống sót trên môi trường có chất kháng sinh Vì vậy, gen kháng kháng sinh có mặt ở hầu hết các vectơ tách dòng hiện ñang ñược sử dụng như dấu chuẩn chọn lọc

Vùng ña nối (Polylinker region)

Vùng ña nối bao gồm trình tự nhận biết ñặc hiệu của các enzim hạn chế hay ñược sử dụng giúp cho quá trình ñưa ñoạn gen ngoại lai vào vectơ biểu hiện trở nên

dễ dàng Hầu hết trình tự của các enzim hạn chế trong vectơ biểu hiện ñều ñược ñặt theo ñúng khung ñọc và nằm sau ñoạn peptit tín hiệu (Signal peptit) ðể tiện cho

việc ghép nối các ñoạn gen cần biểu hiện, các ñiểm nhận biết của các enzym hạn chế trong vùng ña nối ñược thiết kế sao cho chúng chỉ tồn tại như những vị trí duy nhất trên toàn bộ phân tử plasmit (Lê Quang Huấn và Lã Thị Huyền, 2009)

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp

trong E coli Gold L (1990) ñã chỉ ra một trong những yếu tố ảnh hường ñến sự

biểu hiện của protein tái tổ hợp ñó là các protein dung hợp (protein fusion) Protein fusion có chức năng : Cải thiện ñộ hòa tan của protein tái tổ hợp, giúp tinh sạch protein tái tổ hợp một cách dễ dàng, nhận diện các phân tử protein mục tiêu và làm tăng khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bốn protein fusion: Maltose Binding Protein (MBP), G protein Domain B1 (GB1), Thioredoxin (Trx) và

Glutathione-S -Transferase (GST)

Maltose Binding Protein (MBP) là một protein thuộc họ maltose của

Escherichia coli, có nhiệm vụ cho sự hấp thu và dị hóa hiệu quả của maltodextrins

MBP có khối lượng phân tử xấp xỉ 42,5 kDa MBP ñược sử dụng ñể làm tăng ñộ tan

của protein tái tổ hợp biểu hiện trong E coli Ngoài ra, MBP có thể tự ñược sử dụng

ñể tinh sạch protein tái tổ hợp MBP liên kết với cột amylose trong khi tất cả các protein khác chảy qua Phức hợp MBP-protein mục tiêu có thể ñược thôi ra bằng tách rửa cột với maltose Khi protein tái tổ hợp thu ñược trong dạng tinh khiết, các

protein mục tiêu sẽ ñược cắt khỏi MBP bằng enzyme Thrombin (hình 2.5)(

http://en.wikipedia.org/wiki/Maltose-binding_protein)

Glutathione S-transferase (GST) là một protein fusion với khối lượng phân

tử 26kDa GST cuộn gấp nhanh, ổn ñịnh và hòa tan cao do vậy chuỗi ADN thường ñược tích hợp vào vector biểu hiện ñể sản xuất protein tái tổ hợp Kết quả của quá trình biểu hiện từ vector này là một protein dung hợp GST gắn với protein mục tiêu Trong ñó protein GST ñược hợp nhất vào ñầu N của protein tái tổ hợp Ngoài ra, protein fusion GST có thể ñược tinh sạch hoặc phát hiện dựa vào ái lực với glutathione (http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=4A8ADF29-5056-8A76-4EC6-63375BA024E7)

Thioredoxin (TRX) là một loại protein oxi hóa khử ñược biết ñến trong tất

cả các sinh vật Nó ñóng vai trò trong nhiều quá trình sinh học quan trọng, bao gồm

cả tín hiệu oxi hóa khử Ở người, nó ñược mã hóa bởi gen TXN ðột biến ở gen TXN gây tử vong ở giai ñoạn bốn tế bào của phôi thai ñang phát triển Thioredoxin

có khối lượng phân tử 19,5kDa (http://en.wikipedia.org/wiki/Thioredoxin)

Protein G là một protein miễn dịch với khối lượng phân tử 65kDa biểu hiện

trong nhóm C và G vi khuẩn Streptococcus giống như Protein A nhưng với ñặc

ñiểm khác nhau Protein G miền B1 có khối lượng phân tử 6,2kDa, nhiều protein

khi biểu hiện trong E.coli không hòa tan ñã trở nên hòa tan khi hợp nhất với miền

GB1 (http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_G)

Hình 2.5 Sơ ñồ quá trình cắt protein fusion ra khỏi protein mục tiêu

(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Maltose-binding_protein)

2.3.3 Cơ chế cảm ứng biểu hiện bằng IPTG

Ở hệ thống biểu hiện ñược cảm ứng bằng IPTG, tế bào chủ ñược biến ñổi

di truyền ñể có gen mã hóa cho T7 polymerase trong bộ gen Gen này ñược ñặt

dưới sự kiểm soát của lac promoter Ngoài ra, gen lacI cũng ñược chèn vào bộ gen ñể tạo lac repressor Khi không có sự hiện diện của IPTG trong môi trường,

lac repressor tạo thành gắn với lac operator làm promoter lac bị bất hoạt,

gen mã hóa cho T7 polymerase không ñược biểu hiện

Hình 2.6 Sơ ñồ cơ chế ñiều hòa của T7 promotor

Vector pET ñược thiết kế có T7 promoter và vùng MCS nằm sau T7

promoter Gen mục tiêu sẽ ñược thiết kế chèn vào vector ở vùng MCS ñể ñược

kiểm soát biểu hiện bởi T7 promoter Ngoài ra, trên vector pET cũng có vị trí lac operator và gen lacI mã hóa cho lac repressor ñể kiểm soát sự biểu hiện của T7

promoter

Khi có sự hiện diện của IPTG, IPTG sẽ gắn vào lac repressor ở vị trí allosteric, làm protein này thay ñổi cấu hình và không thể gắn vào lac operator Nhờ

ñó lac promoter ñược hoạt hóa, gen mã hóa cho T7 polymerase ñược biểu hiện tạo

T7 polymerase IPTG cũng giải phóng T7 promoter trên vector pET khỏi sự kiểm soát

của lac repressor Enzyme T7 polymerase tạo thành sẽ gắn vào T7 promoter ñã ñược

hoạt hóa giúp biểu hiện gen mục tiêu ñã ñược tạo dòng vào vector (Lê Trần Bình và

cs, 2003)

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu

3.1.1 Sinh phẩm

ðoạn gen ORF7 mã hóa protein N của vi rút PRRS trong vector tách dòng

pUC57 và 5 vector biểu hiện pET28a, pSV278, pET30GB1, pGEX4T1, pET28TRX

ñược phòng công nghệ Tế bào ñộng vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp

Chủng E coli DH5α ñược sử dụng làm vật chủ ñể chọn lọc vector tái tổ hợp

Chủng E coli BL21 ñược sử dụng làm vật chủ ñể biểu hiện protein tái tổ hợp

Các hóa chất và Enzyme ñược dùng trong thí nghiệm có ñộ tinh khiết cao, ñược ñặt của các hãng như Sigma-Aldrich, Biobasic, NEB

3.1.4 Kháng sinh và các môi trường sử dụng

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các loại kháng sinh Ampicilline (Amp) với nồng ñộ cuối cùng trong nuôi cấy 100µg/ml và Kannamycine (Kan) nồng ñộ 50µg/ml Và một số môi trường nuôi cấy có thành phần như sau:

LB lỏng (g/l): 5g NaCl; 10g Trypton; 5g Yeast Extract

LB ñặc (g/l): 5g NaCl; 10g Trypton; 5g Yeast Extract; 15g Agar

3.1.5 ðệm và dung dịch

Các loại ñệm ñược sử dụng: TBS 1X, TAE 1X, SDS-PAGE 1X và một số dung dịch như: Sol I, Sol II, Sol III, CaCl2.

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Tạo vector biểu hiện

ðoạn gen mã hóa protein N (ORF7) của vi rút PRRS ñã ñược gắn vào

vector tách dòng pUC57 và thiết kế có hai ñầu dính với 2 enzyme giới hạn BamHI

và XhoI ðoạn gen này ñược cắt với hai enzyme trên sau ñó ñược gắn vào các vector biểu hiện pET28a, pSV278, pET30GB1, pGEX4T1, pET28TRX ñã ñược

cắt mở vòng cùng 2 enzyme ñó theo phương pháp gắn gen truyền thống với

enzyme T4 ligase

Các vector tái tổ hợp sẽ ñược biến nạp và chọn dòng trong tế bào E coli

DH5α Kết quả chọn dòng ñược khẳng ñịnh bằng phương pháp ñọc trình tự (gửi tại công ty M acrogen, Hàn Quốc) Các vector biểu hiện ñã chọn lọc ñược biến nạp vào

tế bào E coli BL21 ñể biểu hiện gen

3.2.1.1 Phương pháp cắt DNA (Scheller và cs, 1997)

Nguyên tắc:

Phương pháp cắt DNA dựa vào khả năng nhận biết và cắt các trình tự ñặc hiệu từ 4 - 8 bp của các enzyme cắt giới hạn ñể cắt các ñoạn DNA ở vị trí xác ñịnh, tạo thành những ñoạn DNA có ñầu bằng hoặc ñầu dính, có kích thước xác ñịnh ñể làm nguyên liệu và kiểm tra trong phản ứng gắn

Cách tiến hành:

Trong ñề tài sử dụng các enzyme cắt: BamHI, XhoI Chế phẩm enzyme

thường ñược pha trong dung dịch ñệm với thành phần và pH môi trường thích hợp cho hoạt ñộng của enzyme

Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt DNA trong plasmid pUC57 và phản ứng

cắt mở vòng 5 vector biểu hiện bằng enzyme giới hạn BamHI và XhoI Toàn bộ hỗn

hợp ñược giữ ở 37oC trong vòng 4h

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn

10.000 bp có thể ñược phân tách trên gel agarose 0,8%

DNA trên gel agarose ñược phát hiện bằng cách nhuộm với Ethidium Bromide (EtBr) và quan sát dưới tia UV

Cách tiến hành:

Chuẩn bị gel agarose 0,8%: cân 0,8g bột agarose hòa vào dung dịch ñệm TAE 1X ðun nóng cho agarose tan hoàn toàn ðể nguội xuống khoảng 500C, ñổ vào khuôn ñã ñặt sẵn răng lược với ñộ dày thích hợp ðể bản gel ñông lại và ổn ñịnh hoàn toàn Gỡ lược ra, ñặt bản gel vào bể ñiện di chứa sẵn dung dịch ñệm TAE