Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh cây từ phôi non các giống lúa indica phục vụ chuyển gen

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------ NGUYỄN VIẾT THẠCH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY TỪ PHÔI NON CÁC GIỐNG LÚA INDICA PHỤC VỤ CHUYỂN GEN LUẬN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

NGUYỄN VIẾT THẠCH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY

TỪ PHÔI NON CÁC GIỐNG LÚA INDICA

PHỤC VỤ CHUYỂN GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

NGUYỄN VIẾT THẠCH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY

TỪ PHÔI NON CÁC GIỐNG LÚA INDICA

PHỤC VỤ CHUYỂN GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS PHAN HỮU TÔN

TS MAI ðỨC CHUNG

HÀ NỘI – 2013

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

là chính xác và chưa hề ñược sử dụng ñể bảo vệ bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam ñoan tất cả mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này

ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Nguyễn Viết Thạch

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi ñã nhận ñược sự hướng dẫn, giúp ñỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị, các em và các bạn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin ñược bày tỏ lới cảm ơn chân thành tới:

Ban giám hiệu, Phòng ñào tạo sau ñại học, Bộ môn Sinh học phân tử

và Công nghệ sinh học ứng dụng ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Phó giáo sư - Tiến sĩ Phan Hữu Tôn, người thầy kính mến ñã hết lòng

giúp ñỡ, dạy bảo, ñộng viên và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tiến sĩ Mai ðức Chung - phòng Thí nghiệm trọng ñiểm – Viện Di

truyền Nông nghiệp- một người ñáng kính trong công việc cũng như trong cuộc sống Anh ñã ñộng viện giúp ñỡ và chỉ bảo cho tôi rất nhiều ñể tôi có thể hoàn thành ñược luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ Viện Di truyền Nông nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên trong quá trình nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian thực hiện ñề tài

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội ñồng chấm luận văn ñã cho tôi những ñóng góp quý báu ñể hoàn chỉnh luận văn này

Xin chân thành cảm ơn bố mẹ, vợ và anh chị em ñã luôn ở bên cạnh ñộng viên và giúp ñỡ tôi học tập làm việc và hoàn thành luận văn

Từ trái tim mình, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới tất cả mọi người!

Hà Nội, ngày 26 tháng 10 năm 2013

Nguyễn Viết Thạch

3.2 Nội dung nghiên cứu 19

3.4.1 Thắ nghiệm 1: Xác ựịnh ảnh hưởng của tuổi phôi ựến sự hình thành

3.4.2 Thắ nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS và môi

trường N6 ựến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của giống lúa

3.4.3 Thắ nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất 2,4 D ; hàm lượng

3.4.5 Thắ nghiệm 5: đánh giá ựược khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của

các giống lúa Indica trên môi trường và ựiều kiện nuôi cấy tối ưu cho

4.1 Xác ựịnh các pha phát triển của phôi lúa non và tuổi phôi non thắch

4.2.1 Ảnh hưởng của chất ựiều hòa sinh trưởng ựến tạo mô sẹo phôi hóa

4.2.2 Ảnh hưởng của chất ựiều hòa sinh trưởng ựến tái sinh cây giống IR64 31

4.3 đánh giá khả năng tạo mô sẹo phôi hóa và tái sinh cây hoàn chỉnh của

các giống lúa Indica trên môi trường nuôi cấy tối ưu cho giống lúa

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

BAP: Benzylaminopurine

DNA: Deoxyribonucleic acid

MS Môi trường Murashige - Skoog (1962)

N6 Môi trường Chu et al (1975)

SE Sai số chuẩn

α-NAA 1-Naphthaleneacetic Acid

DANH MỤC BẢNG

2.1 Phân biệt hình thái lúa loài phụ indica và loài phụ japonica 6

4.1 Kắch thước phôi non của giống lúa IR64 ở các giai ựoạn tuổi

4.2 Ảnh hưởng của tuổi phôi ựến khả năng tạo mô sẹo và mô sẹo

4.3 Ảnh hưởng của tuổi phôi non ựến khả năng tái sinh cây 28

4.4 Ảnh hưởng của môi trường cơ bản ựến tạo mô sẹo và mô sẹo

4.5 Ảnh hưởng của môi trường ựến tái sinh cây giống IR64 29

4.6 Ảnh hưởng của chất ựiều hòa sinh trưởng ựến tạo mô sẹo phôi

4.7 Ảnh hưởng của chất ựiều hòa sinh trưởng ựến khả năng tái sinh

4.8 đánh giá khả năng tạo mô sẹo và mô sẹo phôi hóa của các giống

4.9 đánh giá khả năng tái sinh cây các giống Indica 35

DANH MỤC HÌNH

4.1 Ảnh phôi non lúa ở các giai ñoạn 8, 12, 16, 20 ngày tuổi (từ trái

qua phải) dưới kính hiển vi của giống lúa indica: IR64 26

4.2 Một số hình ảnh về tạo mô sẹo và tái sinh cây IR64 33

4.3 Hình ảnh mô tả các bước tái sinh cây từ phôi non lúa 8 ngày tuổi

của 5 giống lúa: IR64, VS1, CR 203, C70, phiêu hương 1 37

4.4 Quy trình tái sinh mô sẹo từ mô phôi non các giống lúa indica 39

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, tốc ñộ tăng dân số nhanh tạo nên sức ép lớn cho thế giới ðặc biệt với các nước ñang phát triển như nước ta thì sức ép về an ninh lương thực càng trở nên nặng nề Vì vậy chọn tạo giống lúa là một quá trình liên tục nhằm thỏa mãn nhu cầu cung cấp lương thực cho con người

Các phương pháp chọn tạo giống truyền thống vẫn là phương pháp phổ biến, Phương pháp này dựa vào sự tái tổ hợp của các kiểu gen và các nhiễm sắc thể thông qua sinh sản hữu tính theo nguyên lý di truyền của Mendel Theo phương pháp này ñể tạo ra dòng thuần phải mất từ 7-8 ñời tự thụ liên tiếp (7-8 năm) Mặt khác, qua nhiều ñời tự thụ một số kiểu gen quý và tốt sẽ

bị quá trình chọn lọc ñào thải, ñồng thời một số kiểu gen không mong muốn lại có cơ hội ñược biểu hiện

Nhìn chung, hầu hết các tác giả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến tạo mô sẹo từ hạt lúa chín và sử dụng ñể biến nạp gen, vì vậy hiệu quả biến nạp gen còn thấp có thể do hiệu quả tái sinh cây thấp Do ñó, ñể thu ñược hiệu quả chuyển gen cao cần thiết nghiên cứu ñể nâng cao khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây Trong số các vật liệu ñược sử dụng ñể tạo mô sẹo

và tái sinh cây, mô phôi non của hạt lúa non có khả năng tạo mô sẹo và tái

sinh cây cao Các nghiên cứu chuyển gen vào các giống lúa Indica gần ñây

trên thế giới tập trung vào xây dựng hệ thống tái sinh cây lúa từ mô phôi lúa non và sử dụng hệ thống tái sinh cây tạo ra ựể phục vụ công tác biến nạp gen

Ở nước ta nghiên cứu về tái sinh mô sẹo từ phôi non lúa và biến nạp gen vào phôi non lúa còn rất ắt ựược quan tâm

Xuất phát từ tầm quan trọng của quy trình tái sinh cây in vitro từ phôi

non ựể ựạt ựược hiệu quả cao trong biến nạp gen lúa, chúng tôi tiến hành ựề tài: ỘNghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh cây từ phôi non các giống lúa

Indica phục vụ chuyển genỢ

1.2 Mục ựắch và yêu cầu

1.2.1 Mục ựắch

Xây dựng ựược quy trình tái sinh cây từ mô phôi non các giống lúa

Indica phục vụ chuyển gen

- đánh giá ựược khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của các giống lúa

Indica trên môi trường và ựiều kiện nuôi cấy tối ưu cho mô phôi non giống

lúa IR64

- Xây dựng ựược quy trình tái sinh cây từ phôi hạt non ở các giống lúa

thuộc loài phụ Indica phục vụ chuyển gen

1.3 Ý nghĩa khoa học

đề tài làm cơ sở khoa học ựể xây dựng quy trình tái sinh cây từ phôi

hạt non ở các giống lúa thuộc loài phụ Indica phục vụ chuyển gen

1.4 Ý nghĩa thực tiễn:

đề tài nhằm xác ựịnh tuổi phôi và môi trường thắch hợp ựể tạo mô sẹo

và tái sinh cây từ phôi non giống lúa IR64 và xây dựng quy trình tái sinh cây

từ phôi hạt non ở các giống lúa thuộc loài phụ Indica phục vụ chuyển gen

Chương II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nghiên cứu mô tế bào thực vật

2.1.1 Lịch sử phát triển

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật ñã ñược các nhà khoa học tiến hành vào

cuối thế kỷ XIX

Quá trình phát triển ñó có thể tạm chia thành 4 giai ñoạn

2.1.1.1 Giai ñoạn khởi xướng (1898-1930)

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật ñã ñược nhà Bác học người ðức Grottied Haberlandt ñề xướng năm 1898 Ông ñã tìm cách nuôi cấy các tế bào thực vật phân lập nhưng không thành công Các công trình về nuôi cấy mô tế bào của các nhà khoa học khác như Winker (1902), Thielman (1924), Kuster (1929), cũng không ñạt ñược mục tiêu nghiên cứu

Năm 1929 Schmacker ñã bước ñầu thành công trong lĩnh vực này Sau

ñó có Schitterer (1931), Pfeiffer (1931), Lanrue (1933) cũng ñã có những thành công bước ñầu trong nuôi cấy ñầu rễ phân lập trong môi trường nhân tạo ðiều ñó giúp cho các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu trên nhiều ñối tượng khác nhau

2.1.1.2 Giai ñoạn nghiên cứu sinh lý (1930 -1950)

Giai ñoạn này ñược bắt ñầu bằng công trình nuôi cấy ñầu rễ cây cà chua trong môi trường nhân tạo, ñược thực hiện bởi nhà bác học White (1934) Bằng thí nghiệm này ông là người ñầu tiên ñã chứng minh ñược rằng

mô phân sinh có thể duy trì thời gian sinh trưởng hơn nữa nếu chúng tiếp tục ñược nuôi cấy bằng môi trường dinh dưỡng mới Cũng trong thời gian này, Gautherets ñã thành công trong nuôi cấy mô tượng tầng và tìm ñược môi trường dinh dưỡng thích hợp cho nhiều loại cây

Năm 1935 Went và Thisnamn ñã khám phá ra auxin IAA có khả năng kích thích sự hình thành mô sẹo

Năm 1941, hai nhà khoa học người Mỹ Overbeek và Steward với thí nghiệm nuôi cấy họ cà Datura, ñã chỉ ra rằng auxin kích thích sinh trưởng có trong nước dừa Cũng trong thời gian này hai ông ñã phát hiện ra tác dụng chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin, ñã ñược nghiên cứu

và tổng hợp thành công như NAA, 2,4 D có ảnh hưởng tích cực trong việc tạo

mô sẹo và gây phân chia tế bào Nhiều nhà khoa học ñã bổ sung các Auxin và các Vitamin vào môi trường nuôi cấy và ñã khẳng ñịnh vai trò của chúng trong môi trường nuôi cấy mô

Năm 1955 Miller và Skoog trong khi nuôi cấy mô lõi cây thuốc lá ñã xác ñịnh ñược vai trò của Kinetin tới việc kích thích sự phát triển của mô Những phát hiện mới mẻ về vai trò của các chất kích thích sinh trưởng 2,4D, IAA, NAA, kinetin, các vitamin trong giai ñoạn này là bước tiến quan trọng trong lịch sử của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.1.3 Giai ñoạn phát sinh hình thái (1950 - 1960)

Năm 1956 Miller và Skoog ñã thành công trong thí nghiệm tạo chồi từ

mô thuốc lá nuôi cấy Chính Skoog ñã phát hiện ra vai trò của kinetin trong

sự phân hoá các cơ quan của cây thuốc lá

Những năm 1958-1959 Reinert (ðức) và Steward (Mỹ) ñã nuôi cấy tế bào cây cà rôt và thu ñược phôi soma từ mô của chúng

Năm 1956 Nickell ñã nuôi cấy thành công tế bào ñơn Phaseolus vulgais trong dung dịch lỏng

Năm 1960, bằng kỹ thuật gieo tế bào, Bergman ñã tái sinh thành công

tế bào ñơn của cây thuốc lá

2.1.1.4 Giai ñoạn nghiên cứu di truyền (1960 ñến nay)

Các thành tựu của giai ñoạn này ñã chính thức ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật invitro vào công tác giống và nghiên cứu di truyền

Năm 1960 Cooking (Anh) đã dùng men Cellulose để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật và thu được các tế bào khơng cĩ vỏ, cịn gọi là các tế bào trần (protoplast)

Nitsch (1967), Nakata và Tanaka (1968) là những người thành cơng đầu tiên trong việc tạo cây thuốc lá đơn bội bằng kỹ thuật nuơi cấy bao phấn

Takabe (1971) tái sinh được cây thuốc lá hồn chỉnh từ protoplast Melchers(1977) dung hợp protoplast thành cơng giữa khoai tây và cà chua tạo cây “Pomate”

Năm 1985, cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được cơng bố Khái niệm chuyển gen trở thành phổ cập trong thuật ngữ cơng nghệ sinh học thực vật Ledoux cho rằng cĩ thể gây ra biến dị di truyền ở biến dị tế bào, thậm chí ở hạt giống bằng cách cho chúng hấp thụ ADN ngoại lai

Từ năm 1980 đến nay, hàng loạt thành cơng mới trong lĩnh vực cơng nghệ được cơng bố Nuơi cấy mơ tế bào đã trở thành một cơng cụ khơng thể thiếu trong cơng nghệ tạo giống và nhân giống hiện đại

Kỹ thuật nuơi cấy mơ tế bào đã mang lại những cơ sở lý luận mới mẻ cho sinh học hiện đại

2.2 Nguồn gốc và phân loại cây lúa

Cây lúa là một trong những cây cốc cĩ lịch sử trồng trọt lâu đời nhất

Về nguồn gốc thực vật học, cây lúa thuộc họ hịa thảo (Gramineae), chi Oryza Lúa trồng hiện nay là do lúa dại Oryza fatua hình thành thơng qua một quá trình chọn lọc nhân tạo lâu dài Lồi lúa dại này thường gặp ở Ấn độ, Việt Nam, Thái Lan, Trung Quốc Họ hàng với cây lúa trồng là các lồi trong chi Oryza Các cơng trình nghiên cứu cho thấy cĩ 22 lồi trong chi Oryza với 24 hoặc 48 nhiễm sắc thể Trong số 22 lồi của chi Oryza chỉ cĩ 2 lồi là Oryza sativa và Oryza glaberrima là lúa trồng

Kết quả của sự tiến hĩa và ảnh hưởng của hệ thồng chọn lọc giống qua hàng ngàn năm đã hình thành một tập đồn các giống lúa, các loại hình thái

rất ựa dạng phong phú ựể sử dụng có hiệu quả nguồn gen quý giá này rất cần thiết phải phân loại giống lúa Tuy nhiên, có nhiều cách phân loại khác nhau theo các tiêu chắ khác nhau (theo ựiều kiện sinh thái, theo thời gian sinh trưởng, theo nguồn gốc hình thành, theo tắnh trạng ựặc trưng ) Cho ựến nay, phân loại cây lúa theo hệ thống phân loại thực vật học của loài lúa trồng Oryza sativa L ựã ựạt ựược sự thống nhất Theo các tài liệu chắnh thức thì loài Oryza sativa L gồm 3 loài phụ (indica, japonica và javanica), 8 nhóm biến chủng và 284 biến chủng Theo cấu tạo của tinh bột còn phân biệt lúa nếp (glutinosa) và lúa tẻ (utilissima) Tuy nhiên, theo ựịnh luật về dãy biến dị tương ựồng của Vavilov thì cây lúa vẫn tiếp tục tiến hóa và nhiều biến chủng mới vẫn tiếp tục xuất hiện, các nhà khoa học vẫn ựang tiếp tục nghiên cứu, tâp hợp và bổ sung thêm cho hệ thống phân loại này (Nguyễn Văn Hoan, 2006)

Theo tác giả Nguyễn ựình Giao, Nguyễn Thiện Huyên và cộng sự (2001) thì loài phụ indica (lúa tiên) và japonica (lúa cánh) ựược phân loại theo ựiều kiện sinh thái và vĩ ựộ ựịa lý Về mặt phân bố: lúa indica ở vùng vĩ ựộ thấp như: Ấn ựộ, Nam Trung Quốc, Việt Nam, Indonexia Lúa japonica phân

bố ở vùng vĩ ựộ cao như Nhật Bản, Triều Tiên, Bắc Trung Quốc, Châu âu, v.v (Nguyễn đình Giao và cs., 2001) Một số hình thái lúa loài phụ indica và loài phụ japonica ựược thể hiện trong bảng dưới ựây:

Bảng 2.1 : Phân biệt hình thái lúa loài phụ indica và loài phụ japonica

Hình dáng và màu lá Hẹp và xanh ựậm Rộng và xanh nhạt

Ngày nay, do nhu cầu giao lưu, việc phân bố của lúa indica và japonica

không nguyên dạng ban ñầu Mặt khác, do tiến bộ khoa học kỹ thuật, có nhiều phương pháp chọn tạo giống lúa mới cho phép tạo ra nhiều giống lúa mới với những tính năng ưu việt Các phương pháp lai xa nhằm khai thác ưu thế lai, các phương pháp ñột biến, các phương pháp chọn tạo giống sử dụng công nghệ sinh học ñã tạo ra nhiều giống lúa mới khiến cho việc phân loại truyền thống gặp nhiều khó khăn

2.3 Tình hình nuôi cấy mô lúa và tái sinh cây

2.3.1 Trên thế giới

Tái sinh cây từ mô sẹo ñược thông báo lần ñầu tiên ở loài cây ngũ cốc bởi Tamaoki và Ullstrup (năm 1958) Cho ñến nay mô sẹo ñã ñược tạo ra từ các mô lúa khác nhau như nát cắt thân (Furuhashi và Yatazawa, 1964), hoa non, bao phấn, tiểu bào tử, ñỉnh rễ (Visarada và cs., 1998, Mandal và cs., 2003), bao lá mầm (Oinam và Kothari 1995, Chand và Sahrawat 1997, Sahrawat và Chand 2001), trụ dưới lá mầm (Wu và Li, 1971), hạt trưởng thành (Lin và cs., 2005; Rachmawati, 2006)

Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các giống lúa indica có sự khác nhau ñáng kể về phản ứng tạo mô sẹo và tái sinh cây (Khanna, 1999; Amin

M A., 2004) Do ñó, ñể cải thiện hiệu quả tạo mô sẹo và tái sinh cây, cần thiết tối ưu hóa môi trường cho các giống lúa indica

Zhenyu (1999) ñã nghiên cứu và chỉ ra một số nhân tố ảnh hưởng ñến tạo mô sẹo và tái sinh cây ở các giống lúa indica

Lin và Zhang (2005), Ge và Cs., 2006) ñã tối ưu hóa môi trường và các ñiều kiện nuôi cấy phuc vụ biến nạp gen cho hiệu quả cao ở các giống lúa indica

Rachmawati và Anzai (2006) ñã nghiên cứu tối ưu hóa môi trường tạo

mô sẹo và tái sinh cây lúa và sử dụng hệ thống tái sinh ñã ñược tối ưu hóa này

ñể biến nạp gen vào các giống lúa javanica Họ cũng nhận thấy hiệu quả biến

nạp gen phụ thuộc nhiều vào giống (Rachmawati và Anzai, 2006)

Lin và Zhang (2005) ñã chỉ ra rằng nguyên nhân chính thu ñược tỷ lệ biến nạp thành công thấp ở các giống lúa indica (so với các giống lúa japonica) có thể do hiệu quả tái sinh của các giống lúa indica thấp hơn Họ ñã tìm ra ñược 2 môi trường mới ñể cấy chuyển, phân hóa mô sẹo và sử dụng quy trình tái sinh cây ñể biến nạp cho các giống lúa indica (Lin, 2005)

Hiei và cs (2006) ñã tối ưu hóa quy trình biến nạp cho các giống lúa indica bằng Agrobacterium tumefaciens sử dụng phôi non của hạt non sau thu phấn 8-12 ngày Quy trình ñã ñược áp dụng ñể biến nạp thành công với hiệu quả cao (trên 7 dòng/phôi) cho các giống lúa indica IR8, IR24, IR26, IR36, IR54, IR64, IR72, Xin Qing Ai 1, Nan Jin 11 và Suewon 258 (Hiei và Komari, 2006)

2.3.2 Ở Việt Nam

Kế thừa tiến bộ khoa học trên thế giới, nhiều nhà khoa học tâm huyết

và nhiều trung tâm, viện nghiên cứu ở Việt Nam ñã nghiên cứu và áp dụng nuôi cấy mô trong chọn tạo giống lúa Trong ñiều kiện còn nhiều hạn chế về kinh phí, cơ sở vật chất và thiết bị nên các kết quả nghiên cứu chưa làm thỏa mãn các nhà khoa học, cũng như chưa thể ñưa ra giống lúa mới ñáp ứng nhu cầu thực tiễn sản xuất như ñã kì vọng

Nghiêm Thị Như Vân ñã nghiên cứu sự hình thành mô sẹo từ hạt phấn

lúa trong ñiều kiện in vitro Trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung 2 mg/l

2,4D, nuôi cấy trong tối, các kết quả tác giả cho thấy quá trình hình thành mô sẹo, hình thái mô sẹo và mức ñộ ña bội xảy ra trong quá trình nuôi cấy (Nghiêm Thị Như Vân, 1989, tr.27-30)

Hồ Hữu Nhị, Hoàng Thị Yên (1996) nghiên cứu khả năng tái sinh in

vitro của các dòng lúa bất dục phục vụ cho công nghệ sản xuất lúa lai Tác giả

sử dụng môi trường nền Murashige- Skoog (MS, 1962) có bổ sung acid amin (arginin, casein hydrolysate) và các phytohocmon (BAP, NAA) cho nuôi cấy

tái sinh mô phân sinh và hoa non Kết quả nghiên cứu này khẳng ựịnh vai trò

cụ thể của từng yếu tố ảnh hưởng ựến khả năng tái sinh in vitro của mô phân sinh và hoa non lúa (Hồ Hữu Nhị và cs., 1996)

Bùi Bá Bổng ựã sử dụng môi trường có bổ sung thêm kinetine (1mg/l)

trong nuôi cấy túi phấn lúa lai thuộc tổ hợp Japonica x indica Tác giả ựã cho

thấy môi trường nền N6 có hiệu quả trong tạo mô sẹo, tái sinh trên môi trường nền MS Tác giả ựồng thời khẳng ựịnh: Ộcallus không thành lập nếu chỉ bổ sung 2,4D (2mg/l)Ợ (Bùi Bá Bổng, 1997)

Nguyễn Mạnh đôn nuôi cấy bao phấn lúa indica trên môi trường tạo

mô sẹo (G1, Fj và L8) trong tối ở nhiệt ựộ 25 ổ 10C Tái sinh cây trên môi trường MS trong ựiều kiện chiếu sáng có bổ sung chất ựiều hòa sinh trưởng Tác giả bố trắ thắ nghiệm theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên,

số liệu ựược thu thập và xử lý thống kê theo chương trình SAS Tỷ lệ tạo

mô sẹo dao ựộng từ 1,2% (giống VN23) ựến 28,4% (giống VN15) (Nguyễn Mạnh ựôn, 2001)

Nguyễn Thị Hồng Châu và cs ựã thực hiện chuyển gen vào giống lúa C71 thông qua A tumefaciens Nhóm tác giả ựã sử dụng môi trường MS làm nền cho tất cả các giai ựoạn nuôi cấy, chuyển gen và tái sinh Gen ựược chuyển gồm 3 gen là CryIA(b), CryIA(c) (gen mã hóa cho protein ựộc tố trừ sâu của vi khuẩn Bt và gen Xa21 Ờ gen kháng bệnh bạc lá) Vật liệu là giống lúa C71 Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo callus của giống lúa C71 khoảng 92%.Tỷ

lệ biến nạp gen CryIA(c) ựạt 6,6% Tác giả cũng cho rằng khả năng tái sinh của lúa indica là thấp hơn so với lúa japonica Thời gian cho cây chuyển gen mất từ 4,5 ựến 5 tháng (Nguyễn Thị Hồng Châu và cs., 2003)

Nguyễn Thị Thanh Huyền và Cs ựã nghiên cứu và ựánh giá ảnh hưởng của mối tương tác giữa nguồn gen lúa và môi trường nuôi cấy Tác giả sử dụng giống lúa C70 làm ựối chứng ựể ựánh giá cho tập ựoàn các giống lúa ựịa phương; Nghiên cứu này cho rằng ựối với các nguồn gen trong thắ nghiệm,

môi trường N6 tỏ ra thích hợp cho tạo mô sẹo hơn so với L8 và MS (Nguyễn Thị Thanh Huyền và Cs., 2003) Nhóm tác giả ñã sử dụng vật liệu là bao phấn lúa, thí nghiệm bố trí theo phương pháp split-plot với giống là yếu tố chính, môi trường nuôi cấy là yếu tố phụ, số liệu ñược thu thập và xử lý theo chương trình IRRISTAT 3.1 (Nguyễn Thị Thanh Huyền, 2003)

Ngoài kết quả tổng hợp ở trên, còn nhiều công trình khác nghiên cứu về công nghệ nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn Tuy nhiên, các tác giả này hầu như không sử dụng phần mềm xử lý số liệu mà thực hiện thí nghiệm không lặp lại, có xử lý số liệu theo thống kê sinh học (Cao Lệ Quyên, 2008)

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy phôi non và tái sinh cây lúa

2.4.1 Tuổi phôi

Trong chọn tạo giống lúa, vật liệu khởi ñầu ñược sử dụng là mô phân

sinh ñỉnh (Park và CS 1996, Arocliasamy và Ignacimuthu 2007) và mô sẹo là

những mô có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Mô sẹo ñược tạo ra từ lát cắt thân (Furuhashi và Yatazawa, 1964), hoa non, bao phấn, tiểu bào tử,

ñỉnh rễ (Chen và CS 1985, Kawata và Ishihara 1968, Sticklen 1991, Reddy

và CS.1985, Visarada và CS.1998, Mandal và CS 2003), bao lá mầm (Oinam

và Kothari 1995, Chand và Sahrawat 1997), trụ dưới là mầm (Henke và CS

1978), hạt chín (Lin và Zhang 2005, Rachmawati và Anzai 2006), và phôi non

từ hạt lúa non (Lai và Liu, 1982; Koetije và CS.1989; Zeba và CS 1997; Saker và CS (2006); Hiei và CS (2006); Hiei và Komari, 2008) Trong các

mô kể trên, mô sẹo ñược tạo ra từ hạt chín và hạt non ñược sử dụng phổ biến hiện nay ñể tái sinh cây phục vụ chuyển gen

Tuổi phôi từ các hạt non ñóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình tạo mô sẹo, mô sẹo phôi hóa và tái sinh cây Trong ñó, tuổi của phôi non cao thì hiệu quả tái sinh cây thấp Nghiên cứu của Lai và Liu (1982) cho thấy tỷ lệ tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi non giai ñoạn 10 ngày tuổi cao hơn giai

ñoạn 16, 18 ngày tuổi ở giống lúa Tainan No 5 Do ñó, trong các nghiên cứu biến nạp phôi non giai ñoạn 8-12 ngày tuổi thường ñược các nhà nghiên cứu lựa chọn làm vật liệu chuyển gen lúa

2.4.2 Kiểu gen của cây

Kiểu gen của cây ảnh hưởng rất lớn ñến kết quả nuôi cấy phôi non lúa Các

kiểu gen khác nhau có phản ứng rất khác nhau với ñiều kiện nuôi cấy in vitro

Theo Raina và Zapata các giống lúa thuộc loài phụ Japonica dễ nuôi cấy hơn các giống lúa thuộc loài phụ Indica Các giống lúa Japonica có hiệu quả tái sinh cao hơn các giống lúa Indica do ñó hiệu quả biến nạp gen ở các giống lúa Indica thường thấp hơn ở các giống Japonica (Khanna và Raina

1998, Amin và CS 2004) Chen và CS (2004) Hơn nữa các ñặc trưng di

truyền trong phản ứng tạo mô sẹo và tái sinh cây xanh là vấn ñề nan giải ñối với các giống lúa thuộc loài phụ Indica Hiệu suất tái sinh cây xanh rất thấp ñối vơi loài phụ này Theo nghiên cứu của Phan Hữu Tôn (2005), nuôi cấy bao phấn lúa các giống thuộc loài phụ Japonica cho tỷ lệ thành công cao hơn

so với nuôi cấy bao phấn lúa các giống thuộc loài phụ Indica

Theo Yamaghishi và CS cũng nhận thấy các giống lúa thuộc loài phụ Indica và các dòng lúa lai giữa Japonica và Indica nói chung cho khả năng nuôi cấy thấp so với các giống thuộc loài phụ Japonica Ông cũng phát hiện ra một vùng NST số 1 kiểm soát sự hình thành mô sẹo và vùng NST số 10 kiểm soát tỷ lệ tái sinh cây xanh và cây bạch tạng

Như vậy có thể thấy rằng kiểu gen của cây là yếu tố quyết ñịnh trong sự hình thành mô sẹo và tái sinh cây xanh từ nuôi cấy bao phấn lúa

2.4.3 Thành phần môi trường

Trong nuôi cấy mô lúa, môi trường nuôi cấy là ñiều kiện tối cần thiết, ñóng vai trò quan trọng ảnh hưởng ñến kết quả nuôi cấy vì mỗi môi trường có chứa các thành phần dinh dưỡng khác nhau quyết ñịnh sự phân hoá tế bào và

cơ quan trong nuôi cấy Hiện nay, môi trường ñược dùng ñể nuôi cấy mô bao

là N6, MS, L8, He5, B5 (Niizeki, 1999) Các môi trường này ñều ñược cải tiến từ môi trường cơ bản MS (Murashinge và Skoog, 1962) bằng cách thay ñổi nồng ñộ các chất dinh dưỡng khoáng ñặc biệt là Nitơ và bổ sung nguồn dinh dưỡng hữu cơ ñã làm tăng rõ rệt kết quả tạo phôi từ nuôi cấy bao phấn Nuôi cấy bao phấn trải qua hai giai ñoạn là giai ñoạn tạo mô sẹo và tái sinh cây Mỗi giai ñoạn yêu cầu về môi trường và ñiều kiện nuôi cấy khác nhau

Môi trường thích hợp nhất ñối với giai ñoạn tạo mô sẹo là môi trường N6 ñối với hầu hết các kiểu gen (Phan Hữu Tôn, 2004) cao hơn gấp hai lần so với môi trường MS Theo Hoang và CS (1978) thì môi trường He5 thích hợp nhất với các kiểu gen loài phụ Indica Môi trường SK3 (Chen và CS, 1978) thích hợp cho con lai giữa Indica và Japonica

Môi trường MS ñược coi là môi trường thích hợp nhất ở giai ñoạn tái sinh và nhân nhanh cây ñối với các kiểu gen

Hàm lượng, số lượng các chất ñiều tiết sinh trưởng, các nguồn cacbon, nitơ cũng ảnh hưởng ñến kết quả nuôi cấy bao phấn

a Nguồn cacbon

Mô tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng mặc dù nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng Vì vậy, cung cấp nguồn cacbon là thành phần bắt buộc của môi trường Trong số các thành phần môi trường thì nguồn và hàm lượng ñường là yếu tố quan trọng vì

nó làm tăng áp suất thẩm thấu trong môi trường và bổ sung năng lượng cho hoạt ñộng tế bào.Theo Trigiane và Gray (2000): Hydratcacbon ñóng góp 50-70% vào khả năng thẩm thấu của môi trường, phần còn lại là do các muối và các thành phần khác gây ra vì thế có thể thay ñổi khả năng thẩm thấu của môi trường qua thành phần hydratcacbon ðối với lúa, nông ñộ ñường tối ưu theo các tác giả có khác nhau Theo kết quả nghiên cứu của Phan Hữu Tôn (2004) cho thấy trên môi trường N6 dạng ñường Lactoza cho tỷ lệ tạo callus cao nhất (8,39%), tiếp ñến là ñường Sucrose (6,82%) khi nghiên cứu trên 9 giống lúa

Kết quả này hơi khác với Chaleff (1982) và Zapata (1986) cho rằng ñường Saccharose tốt hơn lactose Nồng ñộ ñường cũng ảnh hưởng ñến kết quả nuôi cấy, nồng ñộ sucrose cao làm tăng tái sinh cây xanh từ callus nhưng cũng nhiều cây bạch tạng hơn Ouyang và CS (1973) cho rằng: trong nuôi cấy bao phấn lúa mỳ, tỷ lệ tạo callus tăng khi nồng ñộ sucrose tăng, ñồng thời kìm hãm callus từ tế bào xoma, nhưng khi lượng sucrose quá cao sẽ có tác dụng

âm tính ñối với quá trình hình thành callus từ bao phấn Nồng ñộ ñường sucrose 3% tốt hơn 6% ở hầu hết các giống (Phan Hữu Tôn, 2004) Một số tác giả khác cho rằng 6% ñường là hơi cao nên giảm xuống còn 4%-5% Niizeki cho rằng nồng ñộ ñường 3% ñược sử dụng thông thường hơn vì tỷ lệ tạo callus ở trường hợp này là cao hơn

Mannitol ở nồng ñộ 50mM tăng hình thành callus lên 34,5% (Li, Ni, Chen, 1984) tiến hành làm thí nghiệm với mannitol ñã nhận thấy sự hình thành callus tăng lên 1,5% so với môi trường ñối chứng Glucose ở nồng ñộ 5g/l tăng hình thành callus và phần trăm cây bạch tạng, ñồng thời giảm sự tái sinh cây xanh

b Nguồn nitơ

Nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy nồng ñộ ion NH4+ trong môi trường cao sẽ làm ức chế hình thành callus trong nuôi cấy bao phấn Theo Niizeki (2001) thì dùng môi trường N6 với nồng ñộ NH4+ cao hơn sẽ giảm nhiều sự hình thành callus Ông cho biết kết quả tốt nhất khi phối hợp 28 mM KNO3 và 35mM (NH4) 2SO4 Chu và CS lại ñề xuất nên dùng môi trường N6 với nồng

ñộ (NH4) 2SO4 thấp và KNO3 cao khi nuôi cấy bao phấn Theo kết quả nghiên cứu của Chung (1988) cho thấy khi bổ sung nguồn ñạm hữu cơ vào môi trường tạo callus thì thấy có ảnh hưởng tốt rõ rệt ñến kết quả tái tạo callus Các nguồn nitơ hữu cơ như: Glutamin, Alanin, Casein hydrolysate, Glutathion cũng ñược sử dụng trong nuôi cấy bao phấn lúa Khi nghiên cứu ảnh hưởng của việc thay thế nguồn ñạm vô cơ bằng nguồn ñạm hữu cơ dạng

Glutamic acid của tác giả Phan Hữu Tôn (2004) thì thấy ở môi trường N6 + 3% ñường có chứa Glutamic acid kích thích tái tạo callus ðây là tài liệu quý báu cho sinh viên và các nhà khoa học ñang nuôi cấy về nuôi cấy bao phấn cây trồng và cây lúa tham khảo, ñóng góp vào việc hoàn thiện quy trình nuôi cấy bao phấn lúa Indica của Việt Nam

c Chất ñiều hoà sinh trưởng

Chất ñiều tiết sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, nó có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro Hiệu quả tác ñộng của chất ñiều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào nồng ñộ sử dụng, hoạt tính vốn có của chất ñiều hoà sinh trưởng, mẫu nuôi cấy ðối với nuôi cấy bao phấn lúa, trong môi trường cần thiết phải trải qua hai bước với sự có mặt của auxin và cytokinin Mặc dù các bao phấn ñược biết là rất giàu các chất ñiều hoà sinh trưởng thực vật như Auxin và Giberellin nhưng số lượng và chất lượng của các hormon và sự cân bằng giữa Auxin - Cytokinin ñược xem là rất quan trọng ñể xác ñịnh phản ứng giữa bao phấn với môi trường và sự thay ñổi sự biểu hiện di truyền (Evan, 1981) Auxin cao và Cytokinin thấp sẽ xúc tiến quá trình phát sinh callus, ngược lại

sẽ thích hợp cho sự hình thành chồi và cây con Trong một vài trường hợp lại không cần thiết cho sự có mặt của Auxin

Auxin ñược ñưa vào môi trường nhằm thúc ñẩy sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình tổng hợp và trao ñổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính (Epstein và CS, 1989) Những Auxin dùng phổ biến là 2,4- D, IAA, α- NAA trong ñó 2,4- D

ở nồng ñộ 2mg/l ñược coi là thích hợp nhất cho sự tái sinh callus (Niizeki; Nguyễn Văn Uyển; Phan Hữu Tôn) Tuy nhiên, (Chaleff, 1982) (Chung, 1988) lại cho rằng thay thế 2,4-D bằng α - NAA ở nồng ñộ 1-2mg/l ñược coi

là hiệu quả hơn so với các Auxin ñơn lẻ hoặc kết hợp chúng với nhau Theo Chu và CS (1976) callus từ mô có thể tái sinh ngay trên môi trường có auxin

ở nồng ñộ thấp, nhưng tốt hơn là ở môi trường không có auxin

Trong môi trường tạo callus, nồng ñộ IAA cao kết hợp với 2,4-D làm tăng tái sinh cây xanh và làm giảm sự sinh trưởng không kiểm soát ñược của callus (Datta, 1990) Nồng ñộ cao của 2,4-D làm tăng các dạng cây bạch tạng (Wang, 1974) ðiều này có lẽ do ảnh hưởng bất lợi của 2,4-D ñến các ñặc tính di truyền hình thái Gần ñây, Bjornstad A và CS (1993) khẳng ñịnh rằng mỗi kiểu gen cần những nồng ñộ khác nhau của 2,4-D và 2,4,5- T ñể tạo callus dạng phôi

Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và phát triển

của chồi in vitro (Miller, 1961) Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ

và sự sinh trưởng của mô sẹo, nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt ñến phát sinh phôi vô tính của mẫu nghiên cứu

Cytokinin gồm Zeatin, Kinetin, BA ở nồng ñộ cao ñược coi là có lợi cho sự tái sinh cây

Sự kết hợp các hormon trong môi trường nuôi cấy ñã ñược nghiên cứu rất nhiều nhưng sự kết hợp tối thích cần phải ñược thiết lập cho từng kiểu gen bởi vì không có môi trường ñơn lẻ nào biểu hiện tốt nhất cho nhiều kiểu gen (Karim và CS, 1987) Theo Nguyễn Thị Lang (2002), kết hợp 0,5mg/l 2,4- D + 1mg/l a - NAA + 0,5mg/l BA cho tỷ lệ tạo callus cao Còn theo Huang, Wu, Chen sử dụng kết hợp 2mg/l α- NAA + 1mg/l Kinetin trên môi trường N6 cho chất lượng callus tốt có tỷ lệ tái sinh cây cao Môi trường tái sinh cây là MS + 2mg/l α- NAA +1mg/l Kinetin là thích hợp (Phan Hữu Tôn, 2005)

Các chất chuyển hoá và các chất ñiều tiết sinh trưởng khác nhau như ABA, DDT, actinomicyn- D và 2-deoxyglucose cũng ñược nghiên cứu ABA

và DDT ñược coi là chất ngăn cản sự phân chia tế bào và kích thích sự hình thành chồi xanh trong nuôi cấy bao phấn Trong khi ñó, actinomicyn- D và 2-deoxyglucose lại tăng cường sự hình thành callus ở lúa mì và lúa gạo ABA làm tăng sự tái sinh cây xanh nhưng mức tối thích lại tuỳ theo kiểu gen (Zapata và Torizo, 1986)

d Các thành phần khác

Ngoài ra, một số chất thường ñược bổ sung vào môi trường nuôi cấy

mô lúa nhưng không phải là thành phần bắt buộc Chúng làm gia tăng thành phần dinh dưỡng và chất có hoạt tính sinh lý cho môi trường nên kích thích sự sinh trưởng và phân hoá tế bào Các chất này thường là nước dừa, dịch chiết nấm men, pepton, than hoạt tính Than hoạt tính có tác dụng kích thích phát sinh phôi vô tính cũng như thúc ñẩy sự khởi ñầu tạo phôi từ mô bao phấn ñơn bội Hiệu quả tích cực của than ñã ñược chứng minh trong nuôi cấy bao phấn lúa mạch ñen ( wenzel, Hoffman và Thomas, 1977) Tác giả Nguyễn Văn Uyển (1984) cũng cho rằng: việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng làm tăng tỷ lệ tạo callus Nhưng tác giả Phan Hữu Tôn (2004) lại cho rằng khi bổ sung than hoạt tính vào môi trường sẽ không tốt cho quá trình nuôi cấy bao phấn lúa

Môi trường nuôi cấy ñược ñưa vào 100g dịch chiết khoai tây ñã cho hiệu quả tốt trong nuôi cấy bao phấn lúa và lúa mỳ (Anonymous, 1976, 1977) Nước dừa cũng có hiệu quả tốt trong nuôi cấy bao phấn lúa, làm tăng tỷ lệ tạo callus

Trong cám gạo có thành phần dinh dưỡng rất cao, theo (http:// ww.ricebranoil.info) thì 65% chất dinh dưỡng của gạo tập trung ở cám Trong thành phần của cám có nhiều loại vitamin và chất béo chưa bão hoà, có nhiều chất

xơ Hàm lượng chất béo chưa bão hoà cao, vitamin nhóm E, nhóm B, phylate, kẽm, caxi, kali dều khá cao Ngoài ra trong cám có chức chất béo omega 3 khá cao Trên cơ sở này, tiến hành thử ñánh giá ảnh hưởng của phôi nhũ và vỏ cám ñến quá trình nuôi cấy bằng cách bổ sung cám gạo vào môi trường tái sinh cây

PH môi trường ña số ñược ñiều chỉnh trong phạm vi 5,5-6,0 Tốt nhất

là PH= 5,8

Nói chung, sự cân ñối giữa ñường và các chất kích thích sinh trưởng là yếu tố quan trọng nhất trong nuôi cấy mô lúa nói chung và phôi non lúa nói riêng bởi thành phấn khoáng và vitamin tuy quan trọng nhưng khá ổn ñịnh

Từ kết quả tổng hợp trên, chúng tôi rút ra một số nhận ñịnh sau:

- Về vật liệu nuôi cấy: Có thể sử dụng nhiều loại vật liệu cho nghiên

cứu tạo mô sẹo và tái sinh cây lúa (hạt non, phôi non, ñỉnh chồi, bao phấn…) Tuy nhiên, vật liệu hạt lúa chín già, có thể linh ñộng trong sử dụng lại chưa ñược dùng nhiều trong nghiên cứu tạo mô sẹo và chuyển gen lúa

- Về khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây lúa: có nhiều yếu tố ảnh

hưởng ñến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây Trong các yếu tố ñó, ñặc thù giống, sức sống của phôi, thành phần môi trường và ñiều kiện nuôi cấy in vitro là có ảnh hưởng rõ rệt nhất Thành phần môi trường tạo mô sẹo có thể sử dụng nhiều môi trường nền (MS, B5, N6…) với yếu tố quan trọng nhất là 2,4

D Môi trường tái sinh phải bổ sung các chất phytohocmon (BAP, NAA, Kinetine…) ñiều kiện nuôi cấy có thể trong tối hoặc trong sáng ñều có tác dụng tạo mô sẹo Tỷ lệ tạo mô sẹo ñối với các giống indica của các tác giả nói chung còn thấp Các giống lúa japonica thường cho tỷ lệ tạo mô sẹo và tái sinh cao hơn các giống indica

Các giống lúa Indica ñóng vai trò chủ ñạo trong sản xuất lúa ở nước ta,

do vậy chúng tôi lựa chọn vật liệu nghiên cứu tập trung vào một số giống lúa thuần năng suất cao trong loài phụ Indica ñang ñược trồng ở nước ta hiện nay như IR64, HT 1, khang dân 18, khang dân ñột biến, ðT36, ðT37, ðT42, Phiêu hương 1, VH1, N50, Tám xoan, C70, Bắc thơm số 7, CR 203, Xi-23, QR1, VS1, DT 112

ðể nâng cao khả năng tái sinh cây lúa in vitro, chúng tôi ñã sử dụng

phôi hạt non làm vật liệu cho nghiên cứu tái sinh Các nghiên cứu ñã chỉ ra rằng hiệu quả tạo mô sẹo và tái sinh cây lúa từ phôi hạt non phụ thuộc nhiều yếu tố như tuổi phôi non, môi trường nuôi cấy, chất ñiều hòa sinh trưởng, giống hay kiểu gen lúa, ñiều kiện nuôi cấy, v.v Do ñó, trong nghiên cứu hiện tại chúng tôi ñã xác ñịnh hình thái, kích thước phôi ở các giai ñoạn sinh trưởng khác nhau của một số giống lúa Sau ñó chúng tôi ñã nghiên cứu ảnh hưởng