Nghiên cứu chuẩn hóa phương pháp phân tích nhóm b agonists bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ tứ cực và ứng dụng để phân tích dư lượng trong thịt lợn ở một số tỉnh miền bắc việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI PHAN THỊ HUỆ NGHIÊN CỨU CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH NHÓM β-AGONISTS BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ TỨ CỰC LC/MS/MS VÀ Ứ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

PHAN THỊ HUỆ

NGHIÊN CỨU CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH NHÓM β-AGONISTS BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ TỨ CỰC (LC/MS/MS) VÀ ỨNG DỤNG ðỂ PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG TRONG THỊT LỢN Ở MỘT SỐ TỈNH

MIỀN BẮC VIỆT NAM

CHUYÊN NGÀNH: THÚ Y

MÃ SỐ: 60.64.01.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1.GS TS ðẬU NGỌC HÀO 2.TS PHẠM HỒNG NGÂN

HÀ NỘI, - 2013

LỜI CAM ðOAN

- Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

- Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Tác giả luận văn

Phan Thị Huệ

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ựối với: GS.TS đậu Ngọc Hào và TS Phạm Hồng Ngân ựã tận tình giúp ựỡ tôi trong quá trình nghiên cứu ựề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Viện đào tạo Sau ựại học và Ban giám hiệu Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã tạo mọi ựiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi trân trọng cảm ơn lãnh ựạo Trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y trung ương

1 - Cục thú y - Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn ựã cho phép triển khai và tạo ựiều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các bạn ựồng nghiệp của Trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y trung ương 1, ựặc biệt là người chồng thân yêu của tôi ựã liên tục ựộng viên, giúp ựỡ và tạo ựiều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện ựề tài này

Xin chân thành cảm ơn Chi cục Thú y các tỉnh Phú Thọ, Hải Phòng, Nam định, Hà Nam, Thái Bình, Quảng Ninh

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Phan Thị Huệ

1.2 Quản lý và sử dụng β-agonists trong sản xuất thực phẩm 14

1.3 Tồn dư β-agonists trong sản phẩm chăn nuôi và ảnh hưởng của

1.3.2 Tác hại của tồn dư nhóm β-agonists trong sản phẩm chăn nuôi 28 1.4 Kỹ thuật phân tích tồn dư β-agonists trong thịt lợn 28 1.4.1 Phương pháp ñịnh tính (phương pháp sàng lọc) 29 1.4.2 Phương pháp ñịnh lượng (phương pháp lý hóa) 30

1.5.1 Chuẩn hóa phương pháp phân tích ñịnh tính β-agonist bằng kỹ

1.5.2 Chuẩn hóa phương pháp phân tích ñịnh lượng β-agonists

Chương 2 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

2.3.1 Thí nghiệm 1: Tạo mẫu thịt âm tính và dương tính với β-agonists 40 2.3.2 Thí nghiệm 2 Thí nghiệm chuẩn hóa phương pháp ñịnh tính

β-agonist trong thịt lợn bằng kỹ thuật ELISA 41 2.3.3 Thí nghiệm 3 Thí nghiệm chuẩn hóa phương pháp ñịnh lượng β-

agonists (clenbuterol, salbutamol) trong thịt lợn bằng kỹ thuật

2.3.4 Ứng dụng phương pháp ñã chuẩn hóa ñể phân tích mẫu thực tế: 46

3.1.1 Kết quả chuẩn hóa phương pháp phân tích ñịnh tính β-agonists

3.2.2 Kết quả phân tích dư lượng β-agonists trong mẫu thịt lợn bằng kỹ

3.2.3 Kết quả phân tích dư lượng β-agonists (salbutamol, clenbuterol)

3.2.4 Xác ñịnh yếu tố nguy cơ liên quan tới tồn dư β-agonists trong

DANH MỤC BẢNG

1.1 Sản lượng thịt lợn của Việt Nam 12

1.2 Tiêu thụ thịt bình quân trên thế giới (Anh Tùng, 2011) 13

1.3 Tiêu thụ thịt bình quân ở Việt Nam 13

1.4 Giới hạn tồn dư tối thiểu cho phép (MRPL) của PTN tham chiếu CRL của ðức 27

1.5 Ngưỡng MRPL của β-agonists trong các loại mẫu tại việt Nam (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2012) 27

1.6 Chương trình chạy gradien 34

1.7 ðiều kiện phân mảnh MS/MS 35

2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc 40

2.2 Số lượng và sự phân bố mẫu theo các tỉnh 47

3.1 Nồng ñộ chất chuẩn và các giá trị ño [µg/kg 51

3.2 Kết quả phân tích 20 mẫu trắng và 20 mẫu thêm chuẩn ở nồng ñộ 1 ppb 52

3.3 Kết quả ñánh giá ñộ chính xác (AC), ñộ ñặc hiệu (SP), ñộ nhạy (SE), ñộ lệch dương (PD) và ñộ lệch âm (ND) của kit 52

3.4 Kết quả xác ñịnh khả năng phát hiện của phương pháp (CCβ) của kít 53

3.5 Kết quả xác ñịnh CCα của phương pháp phân tích clenbuterol và salbutamol trong thịt bằng LC/MS/MS 56

3.6 Kết quả xác ñịnh CCβ của phương pháp phân tích clenbuterol và salbutamol trong thịt bằng LC/MS/MS 57

3.7 ðộ thu hồi, ñộ chụm trung gian của phương pháp phân tích dư lượng clenbuterol trong thịt lợn 60

3.8 ðộ thu hồi, ñộ chụm trung gian của phương pháp phân tích dư

lượng salbutamol trong thịt lợn 60 3.9 ðộ không ñảm bảo ño của phương pháp phân tích dư lượng

salbutamol và clenbuterol trong thịt lợn 61 3.10 Kết quả kiểm tra mẫu mù 63 3.11 Kết quả ñiều tra các yếu tố liên quan ñến thực hành kinh doanh

thịt lợn 65 3.12 Kết quả phân tích dư lượng β-agonists trong mẫu thịt lợn bằng kỹ

thuật ELISA 67 3.13 Kết quả phân tích dư lượng β-agonists (Salbutamol, clenbuterol)

trong mẫu thịt lợn bằng kỹ thuật LCMSMS 68 3.14 Tỷ lệ các mẫu dương tính với salbutamol và clenbuterol phân

chia theo nơi giết mổ 70

Hình 3.4 ðường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng ñộ chuẩn

Biểu ñồ 3.1 Tỷ lệ % mẫu thịt nghi ngờ nhiễm β-agonists bằng Kỹ thuật

Biểu ñồ 3 2 Tỷ lệ % mẫu thịt lợn bị nhiễm salbutamol, clenbuterol 69

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

- ADI: Acceptable Daily Intake

- BNN và PTNN: ộ nông nghiệp và Phát triển nông thôn

- FAO: Food Agricultural Organization

- ISO : Tổ chức tiêu chuẩn thế giới (International Standard

Organization)

- LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

- LOQ: Giới hạn ñịnh lượng (Limit of Quantitation)

- LC/MS/MS : Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography/Mass

Spectrometer)

- ppm : Phần triệu (Parts per million)

- ppb : Phần tỷ (Parts per million)

- VSATTP: Vệ sinh an toàn thực phẩm

ðể kiểm soát dư lượng các chất, Ủy ban Châu Âu ñã ban hành quyết ñịnh số 2377/90/EC quy ñịnh giới hạn cho phép thuốc thú y trong sản phẩm ñộng vật, theo

ñó các sản phẩm có nguồn gốc từ ñộng vật phải ñược kiểm soát dư lượng tuân thủ Chỉ thị số 93/23/EC ðặc biệt các phương pháp phân tích phải ñược công nhận hoặc thừa nhận theo quy ñịnh trong quyết ñịnh số 2002/657/EC Trước sức ép ñó, muốn hàng hóa có nguồn gốc từ ñộng vật ñược phép lưu thông trên thị trường châu Âu, các nước xuất khẩu và các nhà sản xuất phải có chiến lược phân tích kiểm soát dư lượng tốt và cần thiết phải có những nghiên cứu về hệ thống các phương pháp phân tích sử dụng trong chương trình giám sát dư lượng

Những năm gần ñây nhiều nguồn thông tin ñại chúng ñã ñưa các thông tin về

sự lạm dụng kháng sinh và các hóa chất ñể phòng, trị bệnh và kích thích tăng trưởng dẫn tới sự tồn dư trong thực phẩm nguồn gốc từ ñộng vật, gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người tiêu dùng Dư lượng kháng sinh cũng như các chất kích thích tăng trưởng trong thực phẩm gây khó khăn cho việc ñiều trị và khống chế dịch bệnh do

sự xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc, ảnh hưởng tới công nghệ chế biến thực phẩm và ñã gây ra nhiều vụ ngộ ñộc và tai biến do ăn thịt có tồn dư chất β-agonists vì thế chất này ñã bị cấm sử dụng ñể chăn nuôi trên thế giới và ở Việt Nam ðặc biệt, trong thời gian gần ñây, một vấn ñề nhức nhối ñang ñược cả xã hội cũng như các nhà chuyên môn quan tâm, là tình hình sử dụng hoóc môn tăng trưởng ở

dạng bột có nhiều tên gọi khác nhau (super tạo nạc…) ñể trộn trực tiếp vào thức ăn trong các trang trại chăn nuôi và ngay cả các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ nhằm mục ñích rút ngắn thời gian nuôi, kích thích chuyển hóa protein, giảm ñộ mỡ lưng cho lợn, tăng

tỷ lệ thịt nạc, thịt có màu sắc ñỏ tươi hơn việc sử dụng chất kích thích tăng trọng này trong chăn nuôi sẽ gây tồn dư trên thịt, khi người tiêu dùng ăn vào cơ thể sẽ gây nhiều chứng bệnh và tác hại nghiêm trọng như gây kích ñộng, co giật, rối loạn nhịp tim, giảm kali trong máu, nhức ñầu, run tay chân, buồn nôn, làm tăng hoặc hạ huyết

áp, gây rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, nếu nặng có thể gây nguy hiểm ñến tính mạng

Gần ñây với sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật sắc ký, áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ ñể phân tích dư lượng β-agonists tồn dư trong thịt tỏ ra có nhiều ưu ñiểm nổi trội vì bằng kỹ thuật này có thể phát hiện và khẳng ñịnh với ñộ tin cậy cao dư lượng β-agonists tồn dư trong thịt Phương pháp áp dụng tại phòng thử nghiệm cần việc xác ñịnh hiệu lực phương pháp thử Khi ñó, kết quả phân tích tại phòng thí nghiệm ñó sẽ ñược các tổ chức khác hoặc các quốc gia khác thừa nhận hoặc công nhận là tương ñương (Văn phòng công nhận chất lượng, 2005) ðể góp phần vào việc bảo ñảm vệ sinh an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu

dùng, trên cơ sở khoa học của các công trình nghiên cứu về β-agonists tồn dư trong

thực phẩm trong và ngoài nước, ñồng thời nhờ sự hỗ trợ về thiết bị, hóa chất của

Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y TƯI, chúng tôi ñã thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu chuẩn hóa phương pháp phân tích nhóm β-agonists bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ tứ cực (LCMSMS) và ứng dụng ñể phân tích dư lượng trong thịt lợn ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam”

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ðỀ TÀI

Chuẩn hóa ñược phương pháp phân tích nhóm β-agonists trong thịt lợn bằng kỹ thuật ELISA và kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ ba lần tứ cực (LC/MS/MS);

Ứng dụng phương pháp ñã chuẩn hóa ñể xác ñịnh và ñánh giá tồn dư

clenbuterol và salbutamol có trong thịt lợn ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Sản xuất và tiêu thụ thịt lợn ở Việt Nam

Chăn nuôi lợn là ngành chăn nuôi lấy thịt chủ yếu ở nước ta Trong cơ cấu sản lượng thịt của Việt Nam, ñại bộ phận là thịt lợn, chiếm khoảng 80% tổng sản lượng thịt hàng năm Cùng với sự phát triển của ngành chăn nuôi nói chung, chăn nuôi lợn cũng liên tục phát triển với tốc ñộ bình quân ñàn lợn giai ñoạn 1990-

1999 là 5%/năm; sau ñó tăng chậm lại, giai ñoạn 2002-2012, ở mức xấp xỉ 2

%/năm Năm 2012, Việt Nam sản xuất khoảng 4,3 triệu tấn thịt hơi, trong ñó thịt lợn là 3,16 triệu tấn Do ñó, cho thấy rằng thịt lợn vẫn chiếm số lượng lớn hơn so với nguồn thịt từ các ñộng vật khác

Bảng 1.1 Sản lượng thịt lợn của Việt Nam

Bảng 1.2 Tiêu thụ thịt bình quân trên thế giới (Anh Tùng, 2011)

Bảng 1.3 Tiêu thụ thịt bình quân ở Việt Nam

Năm Tiêu thụ thịt lợn

(kg/người/năm)

Tiêu thụ thịt bò, trâu (kg/người/năm)

Tiêu thụ thịt gia cầm (kg/người/năm)

Tổng cộng lượng thịt tiêu thụ (kg/người/năm)

Nhìn chung ngành chăn nuôi lợn năm 2012 khá ảm ñạm Do giá các loại thức ăn chăn nuôi liên tục tăng cao, trong khi giá gia súc và giá gia cầm giảm mạnh, việc tiêu dùng thịt lợn bị hạn chế bởi tâm lý lo ngại của người dân về việc thịt lợn có nhiễm chất kích thích tạo nạc, ảnh hưởng xấu ñến sức khỏe con người, ñã làm cho người chăn nuôi gặp nhiều khó khăn Bên cạnh ñó tình hình dịch bệnh trên ñàn gia súc, gia cầm diễn biến phức tạp ñã làm cho nhiều gia trại, trang trại buộc phải giảm ñàn hoặc tạm ngừng chăn nuôi ñể hạn chế thua lỗ (Trần Bá Nhân, 2013)

1.2 Quản lý và sử dụng β-agonists trong sản xuất thực phẩm

1.2.1 Giới thiệu chung về β-agonists

1.2.1.2 Cơ chế tác dụng của β-agonists

Thuốc kích thích tăng tần số tim, giãn ñộng mạch vành, giãn cơ phế quản, cơ

tử cung và kích thích làm giảm insuline và enzyme phân giải glycogen

Tác dụng của β-agonists trên bệnh hen suyễn: nhóm β-agonists làm tăng lượng AMP vòng do ức chế phosphodiesterase làm giãn cơ trơn khí quản ðồng thời ức chế adenosin tại ñiểm tiếp nhận do adenosin gây co thắt khí quản và tăng

phóng thích histamin từ tế bào phổi, làm ổn ñịnh màng tế bào mast nên giảm tiết các chất trung gian, tăng sự vận chuyển nhầy nhờ các lông trên ñường hô hấp

Tác dụng của β-agonists trên tổ chức cơ: sự hoạt ñộng của nhóm β-agonists thông qua các ñiểm tiếp nhận -β nằm trong các loại tế bào trong cơ thể, bao gồm tế

bào thần kinh, ñặc biệt tế bào cơ và tế bào mỡ Theo Beerman và cs (1987),

β-agonists là tác nhân phân phối mỡ, làm giảm sự tăng trưởng của mô mỡ và mô cơ trên gia súc, gia cầm ðể ñạt ñược kết quả này, cần sử dụng liều gấp 5-10 lần so với liều ñiều trị thông thường

Nhiều nghiên cứu khác chỉ ra rằng β-agonists là yếu tố cần thiết trong việc

mở ñầu kích thích sự phát triển của cơ (Maltin và cs., 1987) Dưới tác ñộng của

β-agonists, thì khả năng gia tăng protein trong cơ là do sự giảm thoái biến protein và ñồng thời gia tăng tổng hợp protein Các chất dinh dưỡng thay vì ñi vào mô ñể dự trữ lại phân bố vào mô cơ

Hình 1.1 Quầy thịt không sử dụng β-agonists và quầy thịt có

1.2.1.3 Dược ñộng học của β-agonists

Sự hấp thu của β-agonists: β-agonists hấp thu tốt khi cấp qua ñường uống cho

ñộng vật thí nghiệm, người và các loài khác Ngoài ra, salbutamol còn ñược cấp qua ñường hô hấp khi ñiều trị hen suyễn trên người Và thuốc ñược hấp thu dọc theo dạ dày ruột và một phần tái hấp thu ở thận

Sự phân bố của β-agonists: thuốc ñạt nồng ñộ cao nhất trong máu ở hầu hết các loài sau 2-4 giờ khi cấp qua ñường miệng Thuốc phân bố rộng rãi ñến các mô

và qua nhau thai trên thú mang thai ở một số loài như chuột, chó, khỉ, bò, trên các loài này clenbutrol lưu lại lâu nhất ở gan, thận Bên cạnh ñó, một phần clenbuterol

và salbutamol không chuyển hóa kịp sẽ ñược tích lũy trong một số mô với nhiều mức ñộ khác nhau như mật, mắt và giảm dần theo thời gian khi ngừng sử dụng

Sự bài tiết β-agonists: ở hầu hết các loài, clenbutrol bài tiết qua nước tiểu

chiếm ưu thế ở dạng không biến ñổi Rice và cs (1974) cho rằng trong vòng 96 giờ

có 74% thuốc ñã ñược bài tiết, 30% trong nước tiểu và 44 % trong phân Ở gia súc, uống salbutamol với liều 1mg/kg thể trọng thì sau 8 giờ nó bài thải khoảng 40-70% qua nước tiểu Trong ñó, khoảng 48% liều ở dạng không hoạt tính và 24-33% ở

Ngoài ra, các thuốc β-agonists ñược chia thành hai loại theo thời gian tác dụng của chúng, tác dụng ngắn hay tác dụng lâu dài Các β-agonists ñược ñưa vào bệnh nhân bằng nhiều ñường nhưng phổ biến nhất là ñường thở β -agonists dạng viên, dạng con nhộng và dịch truyền thường ñược sử dụng hơn nhưng cũng có nhiều tác dụng phụ

Theo Dương Thanh Liêm và cs (2002) Trong những chất kể trên thì những chất thường ñược sử dụng trong chăn nuôi là clenbuterol, sabutamol, ractopamine, malbutamol, zilpatrol, cimaterol

Sabutamol (ventolin) là một thụ thể agonist β2 tác dụng nhanh tạo Epinephrine, ñược sử dụng ñể làm giảm co thắt phế quản trong các bệnh như hen suyễn, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính Sabutamol ñược bán lần ñầu tiên trên thị

trường vào năm 1968, bởi Allen và Hanburys dưới tên thương phẩm ventolin Thuốc này thành công nhanh chóng và ñược sử dụng ñể ñiều trị hen suyễn từ ñó Salbutamol sulfate thường ñược dùng qua ñường hít có tác dụng trực tiếp ñến cơ trơn phế quản Salbutamol ñược sử dụng chủ yếu ñể ñiều trị co thắc khí quản cũng như bệnh tắc nghẽn phổi mãn tính Ngoài ra, salbutamol cũng ñược sử dụng trong sản khoa, salbutamol dạng dịch truyền có thể ñược sử dụng như là thuốc

ñỡ ñẻ, làm giản cơ mềm tử cung có tác dụng làm chậm sự ñẻ non Salbutamol ñược hấp thụ dễ dàng qua ñường tiêu hóa, là loại thuốc dùng cắt cơn hen, giãn phế quản, giãn cơ trơn

Clenbuterol (spiropent, ventipulmin, clen) là chất ñộc, chất giúp tăng trọng

gia súc, là loại chất kích thích tuyến thượng thận, ñiều tiết sinh trưởng ñộng vật, thúc ñẩy quá trình phát triển cơ bắp, làm tăng lượng thịt nạc và ñẩy nhanh việc phân giải mỡ, giảm tối ña lượng mỡ hình thành trong cơ thể, chỉ ñể lại một lớp rất mỏng Những con lợn ñược trộn thức ăn có chứa clenbuterol sẽ có tỷ lệ thịt nạc nhiều hơn thịt mỡ Clenbuterol trộn vào thức ăn gia súc nhằm tạo ra vật nuôi siêu nạc, mau lớn Clenbuterol có tác dụng ñẩy nhanh quá trình ñốt cháy mỡ, tăng cường phát triển cơ bắp nhưng dùng quá liều sẽ khiến cơ thể vật nuôi mang bệnh và có thể dẫn ñến tử vong

1.2.1.5.Tính chất và cấu trúc hóa học clenbuterol và salbutamol

1.2.2 Tình hình quản lý và sử dụng β-agonists

1.2.2.1 Trong nhân y:

Salbutamol là thuốc chữa bệnh

Salbutamol là thuốc có tác dụng chọn lọc, kích thích các thụ thể beta 2 có ở cơ trơn phế quản, tử cung, mạch máu, ít tác dụng tới các thụ thể beta 1 trên cơ tim nên

có tác dụng làm giãn phế quản, giảm cơn co tử cung và ít tác dụng lên tim Trên thị

trường, các thuốc có hoạt chất sabultamol có rất nhiều dạng bào chế như viên nén, thuốc tiêm, thuốc ñặt trực tràng, hậu môn, thuốc hít (khí dung) Các thuốc có hoạt chất sabultamol ñược chỉ ñịnh dùng trong ñiều trị, hỗ trợ ñiều trị một số bệnh lý ðối với bệnh lý ñường hô hấp, sabultamol ñược dùng trong thăm dò chức năng

hô hấp; ñiều trị cơn hen, cơn hen nặng, cơn hen ác tính, ngăn cơn co thắt phế quản

do gắng sức; ñiều trị tắc nghẽn ñường dẫn khí; ñiều trị viêm phế quản mạn tính, giãn phế nang Bên cạnh ñó, salbutamol còn ñược chỉ ñịnh dùng trong sản khoa, có tác dụng làm giảm cơn co tử cung trong những trường hợp cần thiết Vì vậy, salbutamol có mặt trong hầu hết các bệnh viên và là thuốc cấp cứu hoặc dùng trong ñiều trị

Clenbuterol cũng là chất thuộc nhóm β-agonists ñược dùng trong ngành y tế

làm thuốc trị bệnh hen suyễn Nó là một amin giao cảm ñược sử dụng cho người bị chứng rối loạn hô hấp như là một loại thuốc thông mũi và thuốc giãn phế quản Những người có rối loạn hô hấp mạn tính như hen suyễn sử dụng như một thuốc giãn phế quản ñể làm cho việc thở dễ dàng hơn Liều dùng không ñược vượt quá

200 µg và trong khi ñiều trị phải giữ cho huyết áp luôn dưới 140/90

Clenbuterol ñược sử dụng như là một thuốc cấp cứu trong y tế với quy trình sử dụng có sự kiểm soát chặt chẽ và phải cảnh giác với các tác dụng phụ thường là: run tay, mất ngủ, ñổ mồ hôi, tăng huyết áp, buồn nôn Clenbuterol có thể làm mở rộng tâm thất, gây phì ñại tim và thậm chí có thể gây hoại tử Clenbuterol còn làm tăng thân nhiệt và làm giảm nhanh lượng mỡ trong cơ thể ñộng vật bằng cách giải phóng acid béo tự do từ mô mỡ, tăng khối lượng cơ Thuốc ñược trình bày dưới dạng tiêm, dạng uống (siro, viên và hạt nhỏ)

Do quá nhiều tác dụng phụ nên từ 20 năm nay, tại hầu hết các quốc gia Âu Mỹ như Canada, Hoa Kỳ và Úc, clenbuterol không còn ñược dùng cho người Tuy nhiên, cũng còn có một số quốc gia vẫn sử dụng clenbuterol trong trị liệu cho bệnh nhân hen suyễn

Thực tế cho thấy, clenbuterol thường ñược dùng ngoài chỉ ñịnh trong nhiều trường hợp chẳng hạn như doping trong lĩnh vực thể thao, thể hình thẩm mỹ, giúp

các chị làm ñẹp ñốt mỡ giảm cân, dùng trong chăn nuôi bò, lợn ñể kích thích tăng trưởng, tăng trọng nhanh, cho nhiều thịt ít mỡ

1.2.2.2 Trong thú y:

Trong thú y, việc sử dụng β-agonists chỉ ñược cho phép trong trường hợp của clenbuterol dùng ñể trị bệnh viêm phế quản ở ngựa, bê và cho ñiều trị bệnh sản khoa ở bò cái Tại Mỹ và Canada, clenbuterol chỉ ñược sử dụng trong thú y ñể trị bệnh ñường hô hấp ở ngựa Nó bị cấm sử dụng trong chăn nuôi gia súc ñể lấy thịt (bò, lợn, dê, cừu )

Tuy nhiên, thị trường chợ ñen thuốc clenbuterol vẫn có chiều hướng phát triển β -agonists ñược chứng minh là chất chuyển ñổi khá hiệu quả, làm giảm tỷ lệ

mỡ, tăng tỷ lệ nạc ở gia súc, gia cầm Do ñó, lợi dụng ñặc tính này nên một số người ñã sử dụng β-agonists như chất bổ sung trong thức ăn ñể kích thích cho lợn bung ñùi, nở vai, tạo nạc chỉ trong thời gian rất ngắn ñể bán với giá cao hơn ðể ñạt ñược mục ñích, kích thích sinh trưởng, tạo thịt lợn siêu nạc chủ nuôi thường dùng β-agonists gấp 5-10 lần liều ñiều trị ðây chính là lý do của việc sử dụng trái phép β-agonists trong thức ăn chăn nuôi (ñặc biệt là chăn nuôi lợn) dẫn ñến việc tồn dư các chất này trong sản phẩm ñộng vật Do β-agonists tồn dư trong các sản phẩm ñộng vật ảnh hưởng không tốt cho sức khỏe người tiêu dùng nên từ thập niên 90 của thế kỷ 20, trên thế giới ñã không cho phép sử dụng chúng trong chăn nuôi

Mặt dù β-agonist là các chất hóa học ñược xếp vào loại chất ñộc cấm sử dụng trong chăn nuôi trên toàn thế giới, nhưng người chăn nuôi vẫn lén lút sử dụng các chất cấm trong chăn nuôi Vì lợi nhuận trước mắt, người chăn nuôi

ñã và ñang gây nên những mối nguy hại khôn lường ñối với sức khỏe cộng ñồng và xã hội Ví dụ, với loại lợn siêu nạc giống tốt nhất trong nước hiện nay, người dân phải mất 5 tháng mới ñạt trọng lượng 95-100 kg/con nhưng cho thêm 1 thìa cà phê thần dược β-agonists vào thức (cho 10 con lợn loại 70-80 kg/con), thời gian xuất chuồng rút ngắn chỉ còn ba tháng (Phạm Nho và Huỳnh Hồng Quang, 2012)

Từ những năm của thập niên 80, Mỹ ñã cấm sử dụng clenbuterol vào thức ăn gia súc Cơ quan thuốc và thực phẩm FDA và FSIS (Food Safety and Inspection

Service) thuộc Bộ nông nghiệp Mỹ, cho là clenbuterol hoàn toàn có thể gây chết nếu người ăn phải thịt ngộ ñộc vốn nhạy cảm hay ñang ñược trị liệu bằng một loại thuốc có tác dụng tương tự FDA cũng công bố khả năng gây tác hại cho hệ tim mạch khi vào cơ thể bằng ñường tiêu hóa hơn là ñường hô hấp Từ 2006, clenbuterol ñã bị Cơ quan thuốc và thực phẩm Mỹ cấm sử dụng kể cả trong ñiều trị cho người

Ở Châu Âu ñã cấm dùng clenbuterol trong chăn nuôi từ năm 1988 ðến năm1991, Cơ Quan Quản Lý Thực Phẩm và Dược Phẩm (Food and Drug Administration, FDA) ñã khuyến cáo người dân nên cảnh giác với clenbuterol và tháng 3 năm 1996, cộng ñồng Châu Âu chính thức cấm sử dụng các chất hocmone kích thích tăng trưởng thuộc nhóm β-agonists (chỉ thị 96/22/EC) Ngày 23 tháng 7/2003 Uỷ ban an toàn thực phẩm EU chính thức khẳng ñịnh việc ban bố lệnh cấm

sử dụng tất cả các loại chất kích thích sinh trưởng trong thức ăn chăn nuôi và lệnh cấm này ñã có hiệu lực từ ngày 01/01/2006

Châu Âu cho rằng dù với 1 liều lượng cực nhỏ ( khoa học gọi là trace ) ñi

nữa, hocmone vẫn có thể gây ảnh hưởng không tốt cho sức khỏe Mối liên hệ giữa

sự tiêu thụ thịt ñỏ (thịt bò, lợn, cừu) và ung thư ñã ñược giới khoa học nhìn nhận từ lâu rồi và họ rất nghiêm túc trong việc sử dụng các hcrmone kích thích sinh trưởng

ở trâu và bò, lợn

Năm 1992 - 1993 từ chương trình giám sát β-agonists của khối EU trên các mẫu thịt gia súc ñược lấy một cách ngẫu nhiên, với khoảng 30.000 con Kết quả cho thấy có từ 0 ñến 7% mẫu thịt thu thập từ trại lợn hay từ cơ sở giết mổ có tồn dư

clenbuterol (Kuiper và cs., 1998)

Trong nhiều thập kỷ qua, trên thế giới ñã có nhiều báo cáo về tình hình ngộ

ñộc clenbuterol xảy ra trên người (Van Vyncht và cs., 1996; Peter Batjoens và cs.,

1996 ) Năm 1990, tại Tây Ban Nha người ta nghi ngờ ăn phải gan bò bị nhiễm ñộc làm 135 người nhập viện Năm 1994 hội người tiêu dùng Châu Âu ñã tiến hành phân tích thử nghiệm trên các mẫu gan lợn thì phát hiện các mẫu dương tính với clenbuterol rất cao tại một vài nước trong cộng ñồng EU: Tây Ban Nha 36%, Thụy

Sĩ 25%, Pháp 13%, Hà Lan 10% (Michael và O’Keeffe, 1999)

Ở Italy ựã có 16 người ngộ ựộc thực phẩm khi ăn thịt bò fillet và thịt mông

bò có chứa trên 0.5 ppm clenbuterol (Maistro và cs., 1995)

Tại Pháp, ngày 24-9-1990 có 22 bệnh nhân từ 8 gia ựình tại các khu vực khác nhau sau khi ăn thịt bê bị nhiễm clenbuterol bị các triệu chứng như cơ bắp

run, ựau ựầu, tim ựập nhanh (Pulce và cs., 1991)

Ở Tây Ban Nha, vào năm 1994, 140 người ựã nhập viện sau khi ăn phải thịt lợn bị nhiễm clenbuterol Họ bị chóng mặt, tim ựập nhanh, khó thở, run tay và nhức

ựầu (Lê Quốc Thịnh, 2012) 43 gia ựình ở Tây Ban Nha ựã bị nhiễm clenbuterol và

salbutamol sau khi ăn gan lợn Triệu chứng xảy ra trong vòng 30 - 360 phút Kết quả kiểm tra nước tiểu của các bệnh nhân cho thấy hàm lượng clenbuterol là 160 - 291ppb

Một trường hợp ngộ ựộc clenbuterol khác ựược ghi nhận tại Bồ đào Nha gồm 4 người bị ngộ ựộc cấp tắnh trong số 50 người ăn thịt bò và cừu tồn dư clenbuterol Triệu chứng ựược ghi nhận ở những bệnh nhân này là rung tứ chi, tim ựập nhanh, buồn nôn, ựau ựầu và choáng váng (Taylor và Francis Issue, 2005) Vào năm 1990, Trung Quốc cũng ựã cấm sử dụng clenbuterol trong chăn nuôi gia súc Tuy nhiên, theo Báo Thanh Niên, ngày 2/11/2005: Ở Trung Quốc, hàng nghìn người dân ựã bị ngộ ựộc do ăn thịt lợn có tồn dư clenbuterol Tạp chắ chăn nuôi Trung Quốc kỳ 3, quyển 40 năm 2004 ựã thông tin về "Shoù roù Jing" là chế phẩm tăng nạc, chứa tồn dư clenbuterol trong thịt lợn Tháng 5-1998 ựã có 17 người dân Hong Kong ăn thịt lợn bị trúng ựộc, chân tay run rẩy, ựau ựầu, tim ựập nhanh, miệng khô, mắt bị trợn Trung tâm khống chế và dự phòng Triết Giang ựã lấy mẫu thịt tiến hành kiểm tra, phân tắch và phát hiện "Shoù roù Jing" chứa hàm lượng clenbuterol trong các mẫu từ 80 - 1.020 microgam/kg

Tháng 9/2006, 336 người ở Thượng Hải bị ngộ ựộc do ăn thịt lợn có chứa chất clenbuterol Tháng 2/2009, trên 70 người ở Quảng đông bị ngộ ựộc khi ăn lòng lợn có dư lượng clenbuterol Tháng 3/2011, Bộ Nông nghiệp Trung Quốc mở ựầu một chiến dịch kéo dài 1 năm ựể truy quét thức ăn chăn nuôi có chứa clenbuterol, sau khi một công ty con của tập ựoàn Shuanghui (sản xuất thịt lớn nhất TQ) bị phát hiện clenbuterol trong thịt lợn của công ty Tổng cộng có 72 người bị bắt và bị cảnh

sát giam giữ vì bị cáo buộc sản xuất, bán hoặc sử dụng thịt lợn nhiễm clenbuterol (Lê Tấn Lam Anh, 2012) Ngày 25/7/2011, Trung Quốc xét xử những người sản xuất clenbuterol làm thực phẩm chăn nuôi lợn siêu thịt Kẻ chủ mưu Lưu Tương phải chịu mức án tử hình, ñồng phạm Hề Trung Kiệt bị kết án chung thân, các bị cáo còn lại lãnh án từ 9-15 năm tù giam

Từ tháng 06 năm 2002, ở Việt Nam Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

ñã có văn bản chính thức cấm sử dụng các hoạt chất thuộc nhóm β-agonists trong chăn nuôi (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2002) và thông tư số 57/2012/TT-BNNPTNT quy ñịnh việc kiểm tra, giám sát và sử lý vi phạm các chất cấm thuộc nhóm β-agonists trong chăn nuôi (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2012)

Chất tạo nạc cho lợn tìm thấy ở Việt Nam thường là salbutamol và clenbuterol Tuy nhiên salbutamol, clenbuterol là những chất ñược xếp vào danh mục 18 kháng sinh, hóa chất bị cấm sử dụng trong chăn nuôi ở Việt Nam do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành năm 2002 (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2002)

Vấn ñề sử dụng một số chất tăng trọng thuộc họ β-agonists trong chăn nuôi

ñã từng xuất hiện ở nước ta từ rất lâu, và mới ñây vừa ñược ñưa ra xem xét trong những ngày giáp Tết Tân Mão 2011 khi có thông tin cho rằng "ở Trung Quốc, người chăn nuôi sử dụng clenbuterol (bột thịt nạc) ñể trộn vào thức ăn cho lợn" Theo báo tuổi trẻ ra ngày 30.01.2005 tại trại chăn nuôi của Nguyễn Thị ðẹp

ở quận Cái Răng, Tp Cần Thơ, ñã xảy ra hiện tượng hơn 1000 con gà chết sạch khi

ăn phải thức ăn gia súc New Hope Chị ðẹp ñã ñem mẫu thức ăn gia súc trên tới Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm, qua kiểm tra các mẫu thức ăn trên cho thấy hàm lượng clenbuterol rất cao 149,76µg/kg Cũng theo chi cục thú y Tp Hồ Chí Minh vào ngày 17.06.2006 qua xét nghiệm gần 500 mẫu thịt lợn tại Tp Hồ Chí Minh, chi cục thú y phát hiện gần 30% mẫu dương tính với clenbuterol (Lê Thanh

Hà, 2006) Theo Phạm Thị Kiều Nga (2008) cho thấy không chỉ ở TP.HCM mà một

số tỉnh cũng có tình trạng sử dụng clenbuterol ở lợn, gà, bò Cụ thể, qua phân tích trên 54 mẫu thịt cho thấy tỉ lệ các mẫu thịt có tồn dư clenbuterol khá cao (hơn

46%) Hàm lượng tồn dư từ 0,13-2,46 ppb (Lê Thanh Hà, 2006)

Theo ðỗ Ngọc Chính – Cục Chăn nuôi (2006) ñã lấy 295 mẫu của 114 ñơn

vị sản xuất thức ăn gia súc trên 25 tỉnh thành trong cả nước ñể kiểm tra và phát hiện

6 công ty có sản phẩm TĂCN cho lợn có chất cấm clenbuterol (chiếm 5%) Nhưng sau 5 năm, theo Nguyễn ðức Cường (2011) tình hình chất cấm bị các doanh nghiệp lạm dụng trộn lẫn vào TĂCN ñể thu lời bất chính không thuyên giảm mà còn tăng lên tới 17% Mặc dù Chính phủ ñã ban hành Nghị ñịnh số 08/2010/Nð-CP về quản

lý TĂCN, trong ñó quy ñịnh rõ trách nhiệm của người sản xuất và kinh doanh TĂCN, sau ñó Bộ NN-PTNT ban hành Thông tư số 57/2012/TT-BNNPTNT quy ñịnh việc kiểm tra, giám sát và sử lý vi phạm các chất cấm thuộc nhóm β-agonists trong chăn nuôi thế nhưng việc thực thi Nghị ñịnh và Thông tư trên còn rất hạn chế

Ở ðồng Nai, ngày 12/3/2011, ðội Quản lý thị trường cơ ñộng (thuộc Chi cục Quản lý thị trường ðồng Nai) kiểm tra ñột xuất Công ty TNHH Nhân Lộc, tại xã Bình Lợi, huyện Vĩnh Cửu (ðồng Nai) và phát hiện gần 2,5 tấn chất tăng trưởng và tạo nạc trong chăn nuôi lợn Lượng hàng này ñược chứa 110 bao nguyên liệu thức

ăn chăn nuôi, loại có trọng lượng 20kg, có nhãn mác HT04, HT02, ghi công dụng tạo nạc, tạo màu nạc ñỏ, giảm mỡ lưng, tăng tiết hocmone tăng trưởng, cải thiện tăng trọng, giảm tiêu tốn thức ăn cho lợn

Trước ñó, ngày 10-3, Quản lý thị trường ðồng Nai kiểm tra phát hiện Cty TNHH và Dịch vụ nông nghiệp Thiên Hưng Phát (xã Thanh Bình, huyện Trảng Bom) có 220kg chất tạo nạc “Super weight 02 và Bcomles-C”, ghi công dụng giúp heo bung ñùi, tạo nạc, kích thích thèm ăn (Hình 1.2)

Hình 1.2 Bao chất tạo nạc Super Weight 02 ñược phát hiện

tại ðồng Nai ngày 10/3/2011

Thơng tin từ sở NN&PTNT TP Hà Nội đã phát hiện 8 mẫu thịt dương tính với chất tạo nạc (gốc β-agonists) trong 227 mẫu gồm thức ăn chăn nuơi, thịt lợn được kiểm nghiệm (VTC News, 2012)

Ngày 11/4/2012, đồn kiểm tra liên ngành của Bộ NN&PTNT đã niêm phong 7,5 tấn bột nghi là chất tạo nạc dùng trong chăn nuơi tại huyện Mỹ Hào, Hưng Yên

Qua kết quả kiểm tra, phân tích 286 mẫu (TACN) lấy tại các tỉnh, thành trên

cả nước phát hiện cĩ 13 mẫu (chiếm tỷ lệ 4,8%) dương tính với nhĩm chất cấm β-agonists Riêng tại khu vực miền Bắc, phát hiện 3/150 mẫu dương tính với nhĩm chất này, trong đĩ cĩ 2 mẫu TACN ở Hịa Bình và Hải Dương, 1 mẫu gan lợn ở Bắc Ninh Cũng theo kết quả này, Cục Chăn nuơi đã phát hiện cĩ 8/179 mẫu thịt, gan lợn dương tính với β-agonists (chiếm 4,4%) Việc xét nghiệm trên nước tiểu lợn cũng được tiến hành với 108 mẫu, trong đĩ cĩ 7 mẫu (6,4%) dương tính với β-agonists (Ngọc Lê, 2012)

Ở miền Nam, chất cấm phát hiện được chủ yếu ở ðồng Nai, Bình Dương, Long An, TP Hồ Chí Minh với tỷ lệ nhiễm dưới 10% (Nguyễn Tâm, 2012) Tại thành phố Hồ Chí Minh, cĩ tới 43% mẫu thịt và 26% mẫu nước tiểu được kiểm nghiệm tại TP Hồ Chí Minh dương tính với β-agonists (Vương Xuân, 2012)

Tại thành phố Nha Trang tuy các ngành chức năng chưa phát hiện được việc buơn bán, sử dụng chất “tạo nạc” trên địa bàn, nhưng những thơng tin xung quanh vấn đề này đã làm chao đảo thị trường mua, bán thịt lợn trong tỉnh những ngày qua Người tiêu dùng quay lưng với thịt lợn sạch, người chăn nuơi và tư thương “dở khĩc dở mếu” vì thị trường ế ẩm, lợn “rớt” giá thảm hại

1.3 Tồn dư β-agonists trong sản phẩm chăn nuơi và ảnh hưởng của chúng đối với sức khỏe con người

1.3.1 Khái niệm về tồn dư

Trong hệ thống chăn nuơi hiện đại, người ta đã sử dụng một lượng lớn hĩa dược để phịng và trị bệnh hoặc kích thích tăng trưởng Hĩa dược sau khi vào cơ thể theo các mục đích khác nhau sẽ vào máu, chịu sự biến đổi ở gan, thận, do cơ thể chủ động giải độc làm thuốc chuyển thành dạng dễ đào thải hơn, chỉ một số ít được đào thải ở dạng nguyên thủy Tuy nhiên, nếu thời gian khai thác thú sản kể từ lần sử dụng kháng sinh, hocmone cuối cùng quá ngắn, lúc đĩ lượng kháng sinh, hocmone

chuyển dạng hoặc nguyên thủy chưa ñược ñào thải hết sẽ còn tích tụ trong sản phẩm ñộng vật khi ñến tay người tiêu dùng (Bộ Y tế, 2002)

Tồn dư hoá học (dù là phức hợp nguyên thuỷ hay chất chuyển hoá) là những chất có khả năng tích luỹ, tồn ñọng hay dự trữ trong tế bào, mô, cơ quan hoặc các sản phẩm có thể tiêu thụ (thịt, trứng, sữa) của vật nuôi sau một quá trình sử dụng ñể kiểm soát hoặc ñiều trị bệnh cho vật nuôi Tồn dư hoá chất hoặc thuốc cũng có thể

là kết quả từ việc sử dụng các chất bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi cung cấp thực phẩm Trong ñó, thuốc tiêm thường có liên quan ñến vấn ñề tồn dư hơn là các chất

bổ sung vào thức ăn Tồn dư cũng có thể có nguồn gốc từ các chất hoá học trong môi trường ô nhiễm (Võ Thị Trà An, 2001) Khái niệm về chất tồn dư (của Codex): bao gồm các hợp chất gốc và/hoặc các chất chuyển hóa của nó trong bất kỳ phần ăn ñược của các sản phẩm ñộng vật, bao gồm cả dư lượng các tạp chất liên quan ñến thuốc thú y

Dư lượng ñược tính bằng µg thuốc có trong 1 kg sản phẩm (ppb)

1.3.1.1 Giới hạn tồn dư

β-agonists bao gồm nhiều chất như salbutamol, clenbuterol, ractopamine, terbutaline, brombuterol… Nhưng 2 chất quan tâm phổ biến là salbutamol, clenbuterol ðây là nhóm chất cấm nên việc phát hiện là quan trọng EU (Nghị ñịnh 96/22/EC và quy ñịnh 2377/90 EEC) cũng như nhiều nước trên thế giới không quy ñịnh giới hạn tồn dư tối ña (MRL) trong thực phẩm vì nó là chất cấm trong chăn nuôi ñộng vật làm thực phẩm ðể kiểm soát chất này trong thực phẩm người ta sử dụng quy ñịnh ngưỡng giới hạn tồn dư ở nồng ñộ tối thiểu có thể phát hiện và khẳng ñịnh ñược hay là ngưỡng giới hạn của thị trường (MRPL).Tùy khả năng của từng quốc gia, tùy từng phòng thí nghiệm mà ngưỡng MRPL là có khác nhau Theo khả năng phát triển của khoa học kỹ thuật, trong tương lai ngưỡng MRPL có thể nhỏ dần Hiện nay, châu Âu ñưa ra ngưỡng MRPL dựa vào phòng thí nghiệm tham chiếu (CRL) Ngưỡng này khác nhau rất nhiều giữa các loại mẫu Bảng 1.4 dưới ñây là tiêu chuẩn MRPL của PTN tham chiếu CRL của ðức

Bảng 1.4 Giới hạn tồn dư tối thiểu cho phép (MRPL) của PTN tham chiếu

CRL của ðức

TT Loại mẫu Clenbuterol

(ppb)

Salbutamol (ppb)

Ractopamin (ppb)

Tại Việt Nam theo thông tư số 57/2012/TT-BNNPTNT (Bộ Nông nghiệp

và PTNT, 2012) Mẫu ñược coi là dương tính khi có kết quả phân tích ñịnh lượng cao hơn hoặc bằng một trong các giá trị (tính bằng ppb) nêu tại bảng 1.5 dưới ñây:

Bảng 1.5 Ngưỡng MRPL của β-agonists trong các loại mẫu

tại việt Nam (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2012)

1.3.1.2 Thời gian ngưng thuốc

Thời gian ngưng thuốc là thời gian cần thiết (ñược quy ñịnh bởi pháp luật) tính từ thời ñiểm cung cấp thuốc cho vật nuôi lần cuối cùng ñến thời ñiểm thu hoạch các sản phẩm từ vật nuôi (thịt, trứng, sữa, mật) Thời gian ngưng thuốc này ñảm bảo cho nồng ñộ thuốc tồn dư trong các mô giảm ñến mức không gây hại cho con người (BANRC, 1999)

Sau khi cung cấp cho vật nuôi ở liều dùng ựể kắch thắch tăng trưởng, agonists sẽ vẫn còn tồn dư trong nước tiểu của vật nuôi sau 5 ngày ngưng cung cấp thuốc, trong gan, thịt là 25-30 ngày và ựặc biệt là trong võng mạc của mắt, chất này lưu lại ựến 140 ngày sau khi ngưng thuốc (Lã văn Kắnh, 2010)

ư-1.3.2 Tác hại của tồn dư nhóm β-agonists trong sản phẩm chăn nuôi

Khi ựộng vật ăn phải thức ăn gia súc có chứa β-agonists thì chúng sẽ tắch tụ tại các mô bào gồm gan và thịt Theo một số nghiên cứu trên một số gia súc cho biết 100% dư lượng của thuốc này tồn dư ở trong cơ không biến ựổi và 60% dư lượng tồn dư ở gan ở dạng không biến ựổi, thời gian tồn ở gan và thịt cơ khoảng từ 25 Ờ

30 ngày (Gianfranco Brambilla và cs., 2000)

Những năm cuối của thập kỷ 1980 và thập kỷ 1990, người ta phát hiện ra sự tồn

dư clenbuterol trong thịt và phủ tạng, ựặc biệt là gan, của những thú ựược nuôi bằng thực phẩm có chứa clenbuterol ựã ảnh hưởng ựến sức khỏe người tiêu thụ Khi ựó, nhiều bệnh tật như: gây biến chứng ung thư, run cơ, ựau tim, tim ựập nhanh, tăng huyết

áp, choáng váng, gây tổn hại hệ thần kinh và hệ tuần hoàn của con người (Witkamp, 1996) và gây hiện tượng stress đôi khi có thể gây ngộ ựộc cấp tắnh đã có nhiều báo cáo về các trường hợp ngộ ựộc trên người sau khi tiêu thụ thực phẩm có chứa chất tồn

dư như clenbuterol Cụ thể:

Năm 1994, ở Tây Ban Nha có 140 người bị ngộ ựộc với triệu chứng ựiển hình kéo dài từ 90 phút ựến 6 ngày, hàm lượng clenbuterol trong máu nạn nhân rất thấp, trong khi mức ựộ trong nước tiểu rất cao

Ngày 2/11/2005 hàng nghìn người dân Trung Quốc ựã bị ngộ ựộc do ăn thịt lợn do tồn dư Trong năm này, có 50 người dân Bồ đào Nha bị ngộ ựộc do

ăn thịt cừu và thịt bò có chứa chất tồn dư clenbuterol (Barbosa và cs., 2005) 43

gia ựình ở Tây Ban Nha ựã bị nhiễm clenbuterol và salbutamol sau khi ăn gan lợn Triệu chứng xảy ra trong vòng 30 - 360 phút Kết quả kiểm tra nước tiểu của các bệnh nhân cho thấy hàm lượng clenbuterol là 160 - 291ppb

1.4 Kỹ thuật phân tắch tồn dư β-agonists trong thịt lợn

Dựa vào cấu trúc và tắnh chất hóa học của nhóm β-agonists có rất nhiều phương pháp xác ựịnh trong các nhiễu nền: thức ăn gia súc (Gianfranco Brambilla

và cs , 2001; Limin He và cs., 2006; Bioo Scientific, 2013), thịt (Girault và

Fourtillan, 1990; Kootstra và cs., 2005; ; Jing-Fang Huang, 2007; Bioo Scientific,

2013), gan (Boyd và cs., 1992; James và cs., 1997; Crescenzi và cs., 2001; Andrzej Posyniak và cs., 2003; Adrian c e Fesser và cs., 2005; Jose Blanca và cs., 2005) dùng các phương pháp như: Kít thử nhanh, Miễn dịch enzym (ELISA),

Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Koole và cs., 1999; Anders Blomgren

và cs., 2002; Trần Quang Thủy và cs., 2012), Kỹ thuật sắc ký khí (Girault và Fourtillan, 1990; Lucia Damasceno và cs., 2000; Maurizio Fiori và cs., 2002;

Limin He và cs., 2006;), Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với khối phổ

(LC-MS) (James Lawrence và Cathie Menard, 1997; Crescenzi và cs., 2001; Adrian c e Fesser và cs., 2005; Jose Blanca và cs., 2005; Kootstra và cs., 2005;

Nguyễn Thị Thu Thủy, 2011) Trong nghiên cứu này, sử dụng kỹ thuật ELISA ñể phân tích sàng lọc và kỹ thuật sắc ký lỏng ba tứ cực LCMSMS ñể khẳng ñịnh và

ñịnh lượng

1.4.1 Phương pháp ñịnh tính (phương pháp sàng lọc)

Phương pháp miễn dịch enzym ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent

Assay) (Guy Degand và Anne Bernes-Duyckaerts, 1993; Bucknall và cs., 1993; Andrzej Posyniak và cs., 2003; ðoàn Thị Khang và cs., 2008; Bioo Scientific,

2013), là một kỹ thuật sinh hóa ñể phát hiện kháng thể hay kháng nguyên dựa trên nguyên tắc miễn dịch học, ñược dùng rất phổ biến trong lĩnh vực kiểm nghiệm thực phẩm… Phương pháp này dựa trên phản ứng enzym màu cạnh tranh Các giếng trong khay ñược phủ sẵn một lớp chất β -agonists-proterin có khả năng bắt giữ

kháng thể kháng agonists Trong quá trình phân tích, mẫu và kháng thể kháng agonists (kháng thể 1) cùng ñược thêm vào Nếu mẫu có β-agonists nó sẽ phản ứng

β-cạnh tranh với kháng thể kháng β-agonists, vì vậy nó sẽ ngăn cản sự gắn kháng thể kháng β-agonists với β-agonists ñã phủ sẵn ở ñáy giếng Tiếp theo kháng thể gắn enzym (kháng thể 2) ñược nhỏ vào Kháng thể này sẽ gắn với kháng thể 1 và tạo ra một phức hợp với β-agonists ñã gắn trên bề mặt giếng Màu sắc của giếng sau khi thêm chất tạo nền vào có tỷ lệ nghịch với nồng ñộ β-agonists có trong mẫu khi ñọc

ở bước sóng 450 nm

Hệ thống ELISA bao gồm máy ñọc, máy ủ, máy rửa, máy tính (bao gồm phần mềm và máy in) các thiết bị phụ trợ khác như bình ñựng dung dịch rửa, bình thải…)

Bộ kít thương mại của hầu hết các hãng cung cấp các hóa chất cần thiết, kèm 96 giếng, kiểm tra ñược 42 mẫu lặp lại 2 lần Việc chuẩn bị mẫu theo protocol của hãng sản xuất

Ưu ñiểm: ña số rất nhạy, tương ñối nhanh, phân tích nhiều mẫu cùng lúc, thích

hợp dùng sàng lọc ñể loại bỏ mẫu cho kết quả âm tính

Nhược ñiểm: Kit rất nhạy cảm với nhiệt ñộ và ánh sáng, cần kỹ thuật viên ñược

ñào tạo, ñộ ñặc hiệu không cao, dẫn tới phản ứng chéo cao nên kỹ thuật này thường chỉ cung cấp kết quả gần ñúng nồng ñộ của chất phân tích giả ñịnh Kết quả này không ñưa vào báo cáo ñịnh lượng mà nó là tiền ñề cho phân tích khẳng ñịnh và ñịnh lượng

Quyết ñịnh 657/EC/2002 quy ñịnh phương pháp ELISA là phương pháp sàng lọc trong phân tích dư lượng các hóa chất kháng sinh, hocmone tăng trưởng trong

nhiều loại thực phẩm có nguồn gốc ñộng vật Phương pháp phải ñược chuẩn hóa về

các thông số như tính ổn ñịnh của bộ kit, khả năng phát hiện, tỷ lệ dương tính giả và

âm tính giả của xét nghiệm

1.4.2 Phương pháp ñịnh lượng (phương pháp lý hóa)

Crescenzi và cs., (2001); Jose Blanca (2005); Kootstra và cs., (2005); Adrian và

cs., (2005); Nguyễn Thị Thu Thủy (2011), ñã xác ñịnh dư lượng β-agonists trong

thịt bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ Về cơ bản, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ là sự kết nối phần HPLC với với phần ñầu dò có dòng ñiện ion hóa (mass spectrometry - MS) ba tứ cực Hệ thống này ñược trang bị với bộ nguồn ion hoá phun ñiện tử (ESI) hoặc APCI, cho phép lựa chọn kỹ thuật Full Scan MS, SIM (Selected Ion Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring) Trên cơ sở ñó lựa chọn kỹ thuật có ñộ chọn lọc (selectivity) và ñộ nhạy (sensitivity) cao ñể ñịnh tính và ñịnh lượng Kỹ thuật phù hợp cả những chất có phân tử khối lớn hoặc nhỏ

và có khả năng nhận hoặc mất nhiều proton Chất phân tích ñược tách trong hệ thống sắc ký lỏng, ñi qua một ống dẫn ñến ñầu dò MS Tại ñây diễn ra quá trình ion

hóa trong buồng API với kiểu ESI, APCI hoặc APPI Ion sinh ra ựược tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion ựể ựưa vào bộ phân tắch khối Tại bộ phân tắch khối,

tứ cực thứ nhất sẽ chọn ion mẹ có m/z xác ựịnh, các phân mảnh của ion này ựược tạo ra tại buồng va chạm (collision cell) nhờ tương tác với khắ trơ và ựược phân tắch nhờ tứ cực thứ ba, tạo ra tắn hiệu ựặc trưng tại bộ phận phát hiện ion Như thế là sự ion hóa các phân tử hóa chất tạo nên khối phổ MS của chất ựó, tách và cô lập một loại ion nhất ựịnh Sau ựó phân mảnh ion bị cô lập ựó rồi ựưa các mảnh ion ựó vào ựầu dò Detector ựể tạo ra khối phổ MS của loại ion ựã cô lập đó là khối phổ full MSMS của chất ựó Nếu lựa chọn một số ắt mảnh ion nhất ựịnh ựể ựưa vào ựầu dò,

ta sẽ có phổ SRM hay MRM Phương pháp có nhiều ưu ựiểm như ựộ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tắch nhanh, có thể ựịnh lượng ựồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau mà phương pháp sắc kắ lỏng hiệu năng cao thường không làm ựược

1.5 Chuẩn hóa phương pháp thử nghiệm

Theo quyết ựịnh 657/2002/EU, chuẩn hóa phương pháp thử là yêu cầu bắt buộc của phép thử áp dụng tại phòng thử nghiệm đó là việc khẳng ựịnh bằng kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan các yêu cầu xác ựịnh cho việc áp dụng phương pháp thử Việc lựa chọn thông số ựể chuẩn hóa phương pháp thử như sau:

1.5.1 Chuẩn hóa phương pháp phân tắch ựịnh tắnh β-agonist bằng kỹ thuật ELISA

Quy trình phân tắch: Theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất kit ELISA, tóm

tắt quy trình chuẩn bị mẫu thử cho phân tắch ựịnh tắnh β-agonists trong thịt bằng kắt ELISA β-agonists (MaxSignalTM, hãng BIO-OSCIENTIFIC, mã 1009) như sau: Chuẩn bị mẫu thử

Mẫu thịt ựược xay nhuyễn và ựồng nhất Cân 3g mẫu vào ống nghiệm ly tâm 50ml Thêm vào ống nghiệm 8ml acetonitril và 1ml ethyl acetate Sau ựó khuấy trong 3 phút bằng vortex ở tốc ựộ tối ựa và ựem ly tâm tốc ựộ 4000 vòng/ phút trong

5 phút ở nhiệt ựộ 20-25oC Hút 6ml phần nước trong bên trên vào ống nghiệm mới Làm khô mẫu bằng khắ Nitrơ ở nhiệt ựộ 60oC Thêm 1ml n-hexan và 1ml 1xPBS trộn ựều bằng vortex trong 1 phút ở tốc tối ựa Ly tâm mẫu trong 5 phút ở tốc ựộ

4000 vòng/phút ở nhiệt ñộ 20-25oC Dùng micropipette hút 50µl phần dịch trong ở ñáy ñể tiến hành ELISA

Tiến hành phản ứng ELISA

Cho 50 µl mỗi chất chuẩn khác nhau vào các giếng khác nhau và mỗi nồng

ñộ nhỏ 2 giếng Cần nhỏ vào khay theo thứ tự từ nồng ñộ thấp ñến nồng ñộ cao Nhỏ 50 µl mỗi mẫu vào các giếng khác nhau, mỗi mẫu nhỏ 2 giếng

Tiếp tục thêm 100µl antiboby 1 và trộn ñều bằng cách lắc nhẹ ñĩa theo mặt phẳng ngang trong 1 phút Ủ ñĩa trong 30 phút ở nhiệt ñộ phòng, 20-25oC Rửa ñĩa

3 lần với 250ml dung dịch Wash Solution (WS) Sau lần rửa cuối, lật ngược ñĩa và

vỗ nhẹ ñĩa cho khô trên giấy thấm

Thêm 150µl Antibody 2 vào mỗi giếng Ủ ñĩa 30 phút ở nhiệt ñộ phòng,

20-25oC Rửa ñĩa 3 lần với 250ml WS và sau lần rửa cuối, lật ngược ñĩa và vỗ nhẹ ñĩa cho khô trên giấy thấm

Thêm tiếp 100µl dung dịch Substrate vào các giếng Trộn trong 1 phút, sau

ñó ủ 15phút ở nhiệt ñộ 20-25oC và thêm vào mỗi giếng 100µl Stop Buffer ñể dừng phản ứng

ðưa ñĩa vào máy ñọc ELISA, ñọc kết quả ở bước sóng 450nm Mẫu trắng ở giếng A1 có màu vàng ñậm nhất, các β-agonists chuẩn ở các giếng từ B1 ñến H1 có nồng ñộ từ thấp ñến cao Quan sát các giếng có màu vàng nhạt hơn giếng chuẩn là các mẫu dương tính, ngược lại các mẫu có màu vàng ñậm hơn giếng chuẩn là mẫu

âm tính Dưới ñây là Mictoplates phân tích tồn dư β-agonists bằng kỹ thuật ELISA (Hình 1.3)

Hình 1.3 Mictoplates phân tích tồn dư β-agonists bằng kỹ thuật ELISA

Các thông số cần xác dịnh:

- Tính ổn ñịnh của kít: Khả năng biến ñổi về chất lượng;

- ðộ chính xác (AC) là mức ñộ giống nhau giữa kết quả phân tích ñược với giá

trị tham chiếu

- ðộ ñặc hiệu (SP) là khả năng phân biệt

- ðộ nhạy (SE) là nồng ñộ của chất có thể ñược phát hiện

- ðộ lệch dương (PD): Dương tính giả (Mẫu chứng âm tính, kết quả phân tích

cho kết quả dương tính)

- ðộ lệch âm (ND): Âm tính giả (Mẫu chứng dương tính, kết quả phân tích

cho kết quả âm tính)

- Khả năng phát hiện (CCβ) là nồng ñộ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu mà phương pháp có thể phát hiện ñược khi xác suất lỗi âm tính giả β =

5%

1.5.2 Chuẩn hóa phương pháp phân tích ñịnh lượng β-agonists (phương pháp LCMSMS)

Quy trình chuẩn bị mẫu tóm tắt như sau:

Tóm tắt qui trình chuẩn bị mẫu thử cho phân tích β-agonists (clenbuterol, salbutamol) trong thịt lợn bằng kỹ thuật LC/MS/MS như sau:

- Giai ñoạn chuẩn bị mẫu:

Mẫu thịt ñược xay nhuyễn và ñồng nhất Cân 5g mẫu vào ống nghiệm ly tâm 50ml Thêm 5ml methanol và 10 ml natri acetate 0,2M (pH 5,2) Sau ñó khuấy trong 3 phút bằng vortex ở tốc ñộ tối ña và ñem ly tâm tốc ñộ 4500 vòng/ phút trong 15 phút Chuyển dung dịch sang ống mới, cô quay tới còn 2/3 Thêm 5ml natri acetate 0,2M, ly tâm Cho lên cột C18 ( Hoạt hóa cột bằng: 3ml metanol, 3ml mước cất Chuyển tất cả dung dịch mẫu vào cột Rửa cột bằng: 4ml nước, 4ml acid acetic, 4ml methanol ðể khô cột trong 6 phút Rửa giải cột bằng: 6ml ethylacetate/acetonitril/ammonium hydroxyde 32% (90/10/5) Thổi khô bằng khí nitrơ ở nhiệt ñộ 50oC sau ñó rửa bằng 0,25ml dung dịch pha ñộng nước/acetonitril (90/10) Cho vào lọ ñể phân tích sắc ký (LC/MS/MS)

- Phân tích sắc ký:

ðiều kiện sắc ký:

Pha ñộng A: Acetonitrile + 0,1% axit formic

Pha ñộng B: Nước cất tinh khiết + 0,1% axit formic

Bảng 1.6 Chương trình chạy gradien Thời gian

(phút) 0-1,5 1,5-6,5 6,5-7,0 7,0-8,0 8,0-10,0

ðiều kiện phân mảnh MS/MS:

Bảng 1.7: ðiều kiện phân mảnh MS/MS Thành phần Ion sơ cấp

(m/z)

Ion thứ cấp (m/z) Cone (V) Coll (eV)

• Tính ñặc hiệu/chọn lọc là khả năng phân biệt chất cần phân tích với các

chất khác Trong kỹ thuật sắc ký khối phổ, yêu cầu ñiểm nhận dạng (IP) phải ≥ 4 (tối thiểu phải có ion mẹ là 1 ñiểm, 2 ion con, mỗi ion là 1,5 ñiểm)

• Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn ñịnh lượng (LOQ)

Thêm dung dịch chuẩn salbutamol, clenbuterol vào mẫu thịt (mẫu trắng) sao cho hàm lượng các chất có trong mẫu khá nhỏ

Giới hạn ñịnh lượng (LoQ) ñược tính theo công thức: LoQ = 3 x LoD

• Giới hạn quyết ñịnh (CCα) và khả năng phát hiện (CCβ)

Giới hạn quyết ñịnh (CCα) là nồng ñộ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu

mà phương pháp ñưa ra kết luận là mẫu dương tính khi xác suất lỗi dương tính giả α

= 1%

Khả năng phát hiện (CCβ) là nồng ñộ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu

mà phương pháp có thể phát hiện ñược khi xác suất lỗi âm tính giả β = 5%

• Xác ñịnh ñộ tuyến tính

ðộ tuyến tính của phương pháp phân tích là khoảng nồng ñộ chất phân tích

có trong mẫu mà phương pháp phân tích có thể ñạt ñược kết quả thử nghiệm tỷ lệ thuận với nồng ñộ chất phân tích có trong mẫu

Chuẩn bị mẫu trắng thêm chuẩn ở ắt nhất 5 nồng ựộ khác nhau, trong khoảng tuyến tắnh ước lượng ở trên Chuẩn bị mẫu theo quy trình phân tắch và ựo trên thiết

bị LCMSMS Chương trình phần mềm của thiết bị sẽ tự lập phương trình tuyến tắnh

y = ax + b Tiêu chắ chấp nhận: hệ số hồi quy 0,99 ≤ R2 ≤1

Ớ độ thu hồi (%): Tắnh bằng tỷ lệ % hàm lượng chất phân tắch ựo ựược thực

tế từ mẫu trắng thêm chuẩn so với nồng ựộ cho vào

Ớ độ chụm: Biểu thị sự biến ựộng giữa các phép thử lập lại, ựược ựo bằng

ựộ lệch chuẩn (EUROCHEM) (EU, 2002 ; European Commission, 2003) độ chụm bao gồm:

+ độ lập lại: độ lập lại ựánh giá mức ựộ biến ựộng của kết quả thử nghiệm

ựược thực hiện bởi cùng một người trong cùng phòng thử nghiệm đánh giá ựộ lặp lại của phép thử thường thực hiện trên mẫu trắng thêm chuẩn vào ở 3 ngưỡng nồng

ựộ 1x, 1,5x, 2x MRPL, mỗi nồng ựộ ựược kiểm nghiệm lập lại 6 lần

+ độ chụm trung gian (S R ): độ chụm trung gian diễn tả mức ựộ biến ựộng

trong phạm vi phòng thử nghiệm thực hiện trong các ngày/ người phân tắch khác nhau Tuy nhiên, không cần thiết nghiên cứu riêng rẽ sự ảnh hưởng của từng nhân

tố để ựánh giá ựộ chụm trung gian của phép thử, phép thử ựược thực hiện trên mẫu trắng thêm chất chuẩn ở 3 nồng ựộ khác nhau (1x, 1,5x, 2x MRPL), mỗi nồng ựộ ựược kiểm nghiệm 6 lần, thực hiện 3 ngày khác nhau Tắnh giá trị ựộ lệch chuẩn tương ựối tổng RSDR ở mỗi nồng ựộ phân tắch; so sánh với quy ựịnh trong quyết ựịnh 657/2002/EC ựể ựánh giá

Ghi chú: Trong các phòng thắ nghiệm, thường kết hợp các thắ nghiệm ựể xác ựịnh

ựộ thu hồi, ựộ lập lại, ựộ chụm trung gian (SR) Trên cơ sở số liệu chuẩn hóa ựể xác ựịnh ựộ thu hồi, ựộ chụm có thể bố trắ ở 3 nồng ựộ khác nhau không nhất thiết là 1x, 1,5x, 2x MRPL

+ độ không ựảm bảo ựo của phương pháp:

Là thông số gắn với kết quả của phép ựo, thông số này ựặc trưng cho mức ựộ phân tán của các giá trị có thể chấp nhận ựược quy cho ựại lượng ựo của phép ựo Dựa vào số liệu chuẩn hóa, tắnh giá trị trung bình, ựộ lệch chuẩn và hệ số biến

thiên ở mỗi nồng ñộ phân tích; Tính hệ số biến thiên ở các nồng ñộ phân tích ðộ không ñảm bảo ño ñược tính theo công thức sau: uR (%) =tα,k x CVR(%)

Trong ñó: UR : ðộ không ñảm bảo ño tổng

CVR : Hệ số biến thiên

tα,k : giá trị-student tra bảng với mức ý nghĩa α= 0,05

k : Bậc tự do (k = n -1)

n : Số phép thử nghiệm

Chương 2 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Vật liệu nghiên cứu

2.1.1.ðối tượng nghiên cứu

Chất kích thích tăng trưởng β-agonists (clenbuterol và salbutamol) ô nhiễm trong thịt lợn

2.1.2 ðịa ñiểm nghiên cứu

- ðịa ñiểm thí nghiệm: Phòng thí nghiệm của Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú

y TƯ1 - Cục Thú y (VILAS 059, ISO 17025: 2005)

- ðịa ñiểm ñiều tra và lấy mẫu: Thịt lợn bày bán tại chợ ở 06 tỉnh miền Bắc (Phú Thọ, Hải Phòng, Nam ðịnh, Hà Nam, Thái Bình, Quảng Ninh)

2.1.3 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 10 năm 2012 ñến tháng 10 năm 2013

2.1.4 Hóa chất và thuốc thử:

2.1.4.1 Hóa chất và thuốc thử dùng cho phân tích ñịnh tính

- Bộ kít β-agonists (MaxSignalTM, hãng BIOO-SCIENTIFIC, mã 1009)

2.1.4.2 Hóa chất và thuốc thử dùng cho phân tích ñịnh lượng

Hoá chất và thuốc thử phải ñạt tiêu chuẩn tinh khiết cấp ñộ LCMS, bao gồm:

• Dung dịch và dung môi:

- Chuẩn bị dung dịch Natri acetate 0,2M: Cân 2,722 g natri acetate hòa tan

vào trong 100ml nước cất

-Chuẩn bị dung dịch amonium hydroxyde 5% amoniac/ acetonitril:

- Chuẩn bị dung dịch: ethylacetate : acetonitril : amonium hydroxyde 32% (90:10:5)

- Chuẩn bị dung dịch: Nước cất / acetonitril (90/10)

- Acid acetic 1 M: Hút 5,7 ml acid acetic hòa tan vào 100 ml nước cất

- Chuẩn bị dung môi pha ñộng:

Pha ñộng A: Acetonitrile + 0,1% formic acid

Pha ñộng B: Nước cất tinh khiết + 0,1% formic acid

• Chuẩn bị dung dịch chuẩn và nội chuẩn

* Chuẩn bị dung dịch chuẩn salbutamol, clenbuterol:

- Dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/mL: Cân chính xác 10 mg chuẩn mỗi loại salbutamol, clenbuterol, hoà tan và ñịnh mức tới 10 mL bằng methanol Dung dịch chuẩn ñược bảo quản trong tủ lạnh 3 tháng

- Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 1 µg/mL: 50 µl dung dịch chuẩn gốc

1000 µg/mL mỗi loại, ñịnh mức tới 50 mL bằng methanol Dung dịch chuẩn ñược bảo quản trong tủ lạnh 1 tháng

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp cho vào mẫu 100 ng/mL: 100 µL dung dịch chuẩn trung gian 10 µg/mL mỗi loại, ñịnh mức tới 10 mL bằng methanol Dung dịch này ñược chuẩn bị hàng ngày

* Chuẩn bị dung dịch nội chuẩn: clenbuterol –d9 và salbutamol –d3

- Dung dịch nội chuẩn gốc 100 µg/mL;

- Dung dịch nội chuẩn trung gian hỗn hợp 1 µg/mL: 100 µL dung dịch chuẩn gốc 100 µg/mL mỗi loại, ñịnh mức tới 10 ml bằng methanol Dung dịch ñược bảo quản trong tủ lạnh 1 tháng;

- Dung dịch nội chuẩn làm việc hỗn hợp 10 ng/mL: 100 µL dung dịch chuẩn trung gian 1µg/mL mỗi loại, ñịnh mức tới 10 mL bằng methanol Dung dịch này ñược ñược chuẩn bị hàng tuần

Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc tinh khiết: Dung dịch chuẩn làm việc tinh khiết, chuẩn bị hàng tuần (bảng 2.1):