Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý ems đến sinh trưởng phát triển và hàm lượng alkaloid tổng số của cây dừa cạn (catharanthus g don) nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------ TRẦN THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA XỬ LÝ EMS ðẾN SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ HÀM LƯỢNG ALKALOID TỔNG SỐ CỦA CÂY DỪA C

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

-

TRẦN THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA XỬ LÝ EMS ðẾN SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ HÀM LƯỢNG ALKALOID

TỔNG SỐ CỦA CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS

G.DON) NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

-

TRẦN THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA XỬ LÝ EMS ðẾN SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ HÀM LƯỢNG ALKALOID

TỔNG SỐ CỦA CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS

G.DON) NUÔI CẤY IN VITRO

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS NGUYỄN THỊ LÝ ANH

HÀ NỘI – 2013

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực

và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

ñỡ tôi trong quá trình thực tập

- Tập thể cán bộ Viện nghiên cứu Sinh học Nông Nghiệp – Trường ðại học Nông nghiệp ñã tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành tốt ñề tài tốt nghiệp

- Cảm ơn gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp và người thân ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tác giả luận văn

Trần Thị Hiền

MỤC LỤC

1.2.2 Một số hợp chất alkaloid chính có trong cây Dừa cạn 7

1.3.3 Ứng dụng các alkaloid của Dừa cạn trong ñiều trị bệnh 13

1.5 ðột biến di truyền và phương pháp xử lý ñột biến bằng EMS 18

1.5.2 Ethyl methane sulphonate (EMS) – Tác nhân gây ñột biến hóa

2.6 Các nghiên cứu về xử lý EMS trong công tác chọn giống 22 Chương 2 ðỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn 24 2.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, phát triển và sự

biến dị của các dòng Dừa cạn sau xử lý EMS in vitro 28

3.1.1 Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng ñến sự phát sinh hình

3.1.2 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 1,0 mg/l α-NAA ñến sự sinh trưởng

phát triển và hệ số nhân chồi của ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa

3.1.3 Ảnh hưởng của một số chất ñiều tiết sinh trưởng ñến khả năng

3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của phổ ánh sáng và cường ñộ chiếu sáng

ñến sự sinh trưởng và phát triển của chồi Dừa cạn in vitro 53 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của EMS ñến sự sinh trưởng phát triển

3.2.1 Nghiên cứu xử lý ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn trong dung

3.2.2 Nghiên cứu xử lý nuôi cấy ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn

3.2.3 Nghiên cứu xử lý nuôi ñoạn thân không mang mắt ngủ Dừa cạn

3.2.4 Phân tích hàm lượng alkaloid của dòng Dừa cạn ñã xử lý EMS in

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BA : Benzyl adenin

CT : Công thức CTTD : Chỉ tiêu theo dõi CTTN : Công thức thí nghiệm

CV (%) : Sai số thí nghiệm

ðC : ðối chứng ðTST : ðiều tiết sinh trưởng EMS : Ethyl methane sulphonate HSN : Hệ số nhân

IBA : Axit β – indol butyric

Ki : Kinetin LSD0,05 : ðộ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5%

3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp 2.4D và Kinetin ñến sự phát sinh hình thái

3.4 Ảnh hưởng của tổ hợp α-NAA và BA ñến sự phát sinh hình thái

3.5 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và NAA ñến sự sinh trưởng phát triển

3.6 Ảnh hưởng của α - NAA và than hoạt tính ñến sự tạo rễ của

3.7 Ảnh hưởng IBA ñến sự tạo rễ của chồi Dừa cạn in vitro 50 3.8 Ảnh hưởng tổ hợp α - NAA và IBA ñến sự tạo rễ của chồi Dừa

3.9 Ảnh hưởng của phổ ánh sáng và cường ñộ chiếu sáng ñến sự sinh trưởng

và phát triển của chồi Dừa cạn in vitro sau 4 tuần nuôi cấy. 54 3.10 Tỷ lệ sống, bật chồi và biến dị của ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa

ñược xử lý trong dung dịch bổ sung EMS với thời gian và nồng

3.11 Ảnh hưởng của EMS ñến sự sinh trưởng phát triển của ñoạn thân

mang mắt ngủ Dừa cạn ñược xử lý trong dung dịch bổ sung

3.12 Tỷ lệ sống, bật chồi và biến dị của ñoạn thân mang mắt ngủ

ñược nuôi cấy trong môi trường có bổ sung EMS trong 4 tuần 61 3.13 Ảnh hưởng của EMS ñến sự sinh trưởng phát triển cùa ñoạn thân

mang mắt ngủ ñược nuôi cấy trong môi trường có bổ sung EMS 61

3.14 Ảnh hưởng của EMS ñến tỷ lệ sống, tạo callus, tạo chồi và biến

dị của ñoạn thân không mang mắt ngủ ñược nuôi cấy trong môi

3.15 Hàm lượng alkaloid tổng số của 6 mẫu ñem phân tích 65

DANH MỤC HÌNH

3.1 Ảnh hưởng của một số auxin và cytokinin ñến sự phát sinh hình

3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và 2,4D ñến sự phát sinh hình thái

3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA ñến sự phát sinh hình thái

3.4 ðộng thái tạo chồi từ callus Dừa cạn nuôi cấy trên môi trường

phát sinh hình thái tốt nhất (MS+1,0mg/l α-NAA+2,0mg/l BA)

3.5 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và NAA sự sinh trưởng phát triển và

hệ số nhân chồi của ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn in vitro 46

3.6 Ảnh hưởng của α - NAA và than hoạt tính ñến sự tạo rễ từ chồi

3.7 Ảnh hưởng của IBA ñến sự tạo rễ từ chồi Dừa cạn in vitro 51

3.8 So sánh sự tạo rễ của 3 môi trường tạo rễ bổ sung chất ñiều tiết

3.9 Ảnh hưởng của phổ ánh sáng và cường ñộ chiếu sáng ñến sự

3.10 Các dạng biến dị thu ñược trong quá trình nuôi cấy in vitro sau

3.11 Sư sinh trưởng phát triển cùa ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn

ñược nuôi cấy trong môi trường có bổ sung nồng ñộ thấp EMS

3.12 ðoạn thân không mang mắt ngủ nuôi cấy trên môi trường bổ

TÓM TẮT

Dừa cạn là một trong những cây thuốc quý ñã ñược sử dụng từ lâu ñời Các alkaloid chiết xuất từ Dừa cạn là một nhóm chất hữu cơ ñang ñược các nhà nghiên cứu rất quan tâm bởi vì tác dụng chữa bệnh của nó, ñặc biệt là chữa bệnh ung thư

Với mục ñích tìm ra quy trình nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn ñể làm cơ sở cho các

nghiên cứu về tạo giống ñột biến và chuyển gen nâng cao hàm lượng aklaoid sau này, ñồng thời theo dõi, ñánh giá sinh trưởng, phát triển và hàm lượng alkaloid tổng

số ñược tích lũy trong cây Dừa cạn ñã ñược xử lý EMS in vitro Vì vậy chúng tôi tiến

hành ñề tài nghiên cứu: “ Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS ñến sinh trưởng phát

triển và hàm lượng alkaloid tổng số của cây Dừa cạn nuôi cấy in vitro (Catharanthus

roseus G Don)”

Nội dung báo cáo gồm 2 phần chính là: Nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn và ảnh

hưởng của xử lý EMS ñến sinh trưởng phát triển và hàm lượng alkaloid tổng số của

cây Dừa cạn in vitro

Sau khi tiến hành thí nghiệm chúng tôi ñã tìm ra ñược: môi trường phát sinh hình thái tốt nhất cho nuôi cấy mô lá và mô thân Dừa cạn là: MS+1,0mg/l α-NAA+2,0mg/l BA; môi trường nhân nhanh tốt nhất là: MS+1,0mg/l α-NAA+3,0mg/l BA; môi trường tạo rễ tốt nhất là: MS+1,0mg/l IBA; ánh sáng của

ñèn HQNN T8-36W NCM 55 và cường ñộ ánh sáng phù hợp nhất cho cây Dừa cạn

in vitro sinh trưởng phát triển là 3 bóng tương ñương 60(µmol/m2/s); xử lý ñoạn

thân mang mắt ngủ Dừa cạn in vitro trong dung dịch EMS ở nồng ñộ 0,05%-1h thì

cây có sức sinh trưởng tốt nhất và ở nồng ñộ 0.15% -2h thì tạo ra tỷ lệ biến dị cao

nhất; xử lý nuôi cấy ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn in vitro trong môi trường có

bổ sung 0,005% EMS thì mẫu cấy sinh trưởng và phát triển tốt nhất và trong môi trường có bổ sung 0,02% EMS thì tạo ra tỷ lệ tạo biến dị cao nhất; nuôi ñoạn thân

không mang mắt ngủ Dừa cạn in vitro trong môi trường có bổ sung EMS trong thời

gian 6 tuần thì mẫu cấy ñược nuôi trên môi trường có bổ sung nồng ñộ 0,005% EMS là có tỷ lệ sống, tạo callus, tạo chồi và tạo biến dị ñều cao nhất; Chồi Dừa cạn phát sinh từ ñoạn thân sống sót sau khi xử lý EMS ở nồng ñộ 0,2%-1h và ñược nuôi

cấy in vitro trong môi trường tạo rễ (MS + 1,5 mg/l IBA) trong 6 tuần là mẫu có hàm

lượng alkaloid tổng số cao nhất

MỞ ðẦU

1 ðặt vấn ñề

Sức khỏe từ lâu vẫn là mối quan tâm hàng ñầu của nhân loại Sự phát triển của khoa học kỹ thuật trở thành công cụ hữu ích giúp con người tìm ra nguyên nhân và cách thức ñể chiến thắng bệnh tật Tuy nhiên, có nhiều căn bệnh hiện vẫn là câu hỏi lớn chưa có lời giải ñáp Ung thư là một trong số ñó Mỗi năm trên toàn cầu có thêm 12,7 triệu người mắc bệnh ung thư và 7,6 triệu người chết vì căn bệnh này Ung thư ñang dần vượt qua bệnh tim mạch trở thành nguyên nhân gây tử vong hàng ñầu thế giới

Trước thực trạng trên, tìm ra phương pháp chữa bệnh ung thư ñã trở thành yêu cầu ngày càng cấp bách Nhiều phương pháp, hóa chất ñã ñược sử dụng nhằm mục ñích ñẩy lùi căn bệnh này Bên cạnh thuốc có nguồn gốc vi sinh vật thì thuốc có nguồn gốc thực vật có vai trò hết sức quan trọng trong việc ñảm bảo nhu cầu chữa bệnh ngày càng tăng

Dừa cạn Catharanthus roseus G Don thuộc họ trúc ñào Apocynaceae là một

trong những loại cây cảnh phổ biến ñồng thời cũng là một loại thảo dược quý

Trong dân gian Dừa cạn có thể ñược dùng như một vị thuốc ñể ñiều trị một

số bệnh như: cao huyết áp, tiểu ñường, tiêu hoá kém, ñi tiểu ñỏ, giun sán…

Những năm gần ñây, các alkaloid chiết xuất từ Dừa cạn là một nhóm chất hữu cơ ñang ñược các nhà nghiên cứu rất quan tâm Năm 1958, Noble và cộng sự ñã chiết ñược một alkaloid từ lá Dừa cạn là: vinblastine Sau ñó 4 năm, Svoboda và cộng

sự cũng tìm thêm một alkaloid nữa là vincristine ðây là hai trong số các alkaloid ñã ñược khẳng ñịnh có hiệu quả lâm sàng trên ung thư Tuy nhiên hàm lượng các alkaloid này trong Dừa cạn rất nhỏ (khoảng 1 phần vạn trong lá Dừa cạn khô ñối với vinblastine, còn ñối với vincristine thì ít hơn 10 lần nữa ) Cho nên quá trình tách chiết hai alkaloid này từ cây Dừa cạn phải trải qua khá nhiều công ñoạn phức tạp vì vậy giá thành thuốc chữa bệnh ung thư có nguồn gốc từ cây này khá cao

ðến nay, người ta ñã xác ñịnh ñược trong Catharanthus roseus có hơn 150

alkaloid từ các bộ phận khác nhau và có rất nhiều alkaloid khối lượng phân tử nhỏ

có tác dụng chữa bệnh Một số alkaloid ñiển hình có thể kể ñến như: Vindoline và Catharanthine ñược sử dụng trong ñiều trị bí tiểu, hạ lượng ñường trong máu và là hai tiền chất ñể bán tổng hợp lên vinblastine và vincristine; Ajmalicine là chất có biệt tính dược học mạnh dùng trong ñiều trị bệnh cao huyết áp, dùng làm thuốc giảm ñau và ñiều trị các bệnh về thần kinh; Serpentine dùng ñiều trị bệnh cao huyết

áp và an thần.… (Cao Thị Thanh Loan, 2007)

Trong khi nhu cầu về alkaloid Dừa cạn rất lớn và giá của chúng rất cao, nhưng hàm lượng alkaloid trong nguyên liệu thô thu nhận từ cây Dừa cạn trong tự nhiên lại rất thấp, nhiều nơi trên thế giới không có ñiều kiện tự nhiên phù hợp ñể Dừa cạn có thể sinh trưởng phát triển tốt Do ñó, việc nuôi cấy thu sinh khối lớn Dừa cạn

in vitro và cải thiện hàm lượng alkaloid là hướng ñi mới ñược các nhà khoa học rất

quan tâm Trên thế giới và Việt Nam ñã có những công bố về ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng giúp cải thiện hàm lượng alkaloid chứa trong mô cơ quan Dừa

cạn in vitro nhưng chưa có nghiên cứu nào về ảnh hưởng của hóa chất gây ñột biến

tới sự sinh trưởng, phát triển và hàm lượng alkaloid có trong cây này

EMS (Ethyl methane sulphonate) là hợp chất hóa học nằm trong nhóm các

hợp chất alkyl hóa, có thể gây nên những ñột biến ñiểm và mất ñoạn nhỏ DNA Hóa chất này ñã ñược sử dụng hiệu quả trong công tác chọn tạo giống mới của một số loại cây: cẩm chướng, cúc…

Với mục ñích tìm ra quy trình nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn ñể làm cơ sở cho

các nghiên cứu về tạo giống ñột biến và chuyển gen nâng cao hàm lượng aklaoid sau này, ñồng thời theo dõi, ñánh giá sinh trưởng, phát triển và hàm lượng alkaloid

tổng số ñược tích lũy trong cây Dừa cạn ñã ñược xử lý EMS in vitro Vì vậy chúng tôi

tiến hành ñề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS ñến sinh trưởng

phát triển và hàm lượng alkaloid tổng số của cây Dừa cạn(Catharanthus roseu G Don) nuôi cấy in vitro”

2 Mục ựắch và yêu cầu của ựề tài

2.1 Mục ựắch

- Nuôi cấy ựược cây Dừa cạn in vitro ựể làm cơ sở cho các nghiên cứu về tạo

giống ựột biến và chuyển gen sau này

- Bước ựầu xác ựịnh ảnh hưởng của xử lý EMS in vitro ựến sinh trưởng, phát triển và hàm lượng alkaloid tổng số của cây Dừa cạn in vitro

2.2 Yêu cầu

- đánh giá ựược sự phát sinh hình thái của mô lá và ựoạn thân không mang mắt

ngủ Dừa cạn in vitro

- Xác ựịnh ựược môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng phát triển của ựoạn thân

mang mắt ngủ Dừa cạn in vitro

- Xác ựịnh ựược môi trường tối ưu cho tạo rễ cây Dừa cạn in vitro

- đánh giá khả năng sinh trưởng và sự biến dị của các dòng Dừa cạn sau xử

lý EMS in vitro

- đánh giá ựược hàm lượng alkaloid tổng số của Dừa cạn in vitro và cây Dừa cạn in vitro ựã ựược xử lý EMS

2.2 Ý nghĩa thực tiễn và khoa học của ựề tài

Xây dựng ựược quy trình nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn và xác ựịnh ựược ảnh

hưởng của các nồng ựộ EMS xử lý ựến sinh trưởng phát triển và hàm lượng alkaloid của cây Dừa cạn Từ ựó, xác ựịnh ựược nồng ựộ xử lý EMS thắch hợp tạo tiền ựề cho công tác chọn tạo giống cây Dừa cạn bằng phương pháp xử lý ựột biến bằng hóa chất EMS

Kết quả nghiên cứu của ựề tài chắnh là cơ sở ựể tiếp tục nghiên cứu tạo dòng ựột biến, nguồn nguyên liệu cho việc chọn tạo giống Dừa cạn mới đồng thời kết quả cũng là tư liệu giảng dạy có giá trị cho lĩnh vực công nghệ sinh học và chọn tạo giống cây trồng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây Dừa cạn

1.1.1 Tên gọi

Tên khoa học: Catharanthus roseus (L) G Don; Vinca rosea L; Lochnera rosea

Reich

Tên khác: Dừa cạn, Bông dừa, Hoa hải ñằng, Trường xuân hoa, Phjắc pót

ñông (Tày), Dương giác, Madagascar periwinkle

1.1.3 Phân loại

Chi Catharanthus (thuộc họ trúc ñào Apocynaceae) gồm có 8 loài, hầu hết là cây thân thảo lâu năm Trong số ñó chỉ có loài Catharanthus pusillus có nguồn gốc từ Ấn

ðộ, còn tất cả các loài còn lại có nguồn gốc từ Madagascar Số lượng nhiễm sắc thể

cho tất cả các loài Catharanthus ñều là 2n=16 Tám loài thuộc giống này ñó là:

• Catharanthus coriaceus

•Catharanthus lanceus

• Catharanthus longifolius

Loài Catharanthus roseus khá phổ biến và chứa nhiều alkaloid nhất ñược

phân bố rộng rãi trên nhiều nước nhiệt ñới kể cả Việt Nam Ở các nước Phương

Tây, cây này thường ñược biết dưới tên gọi Madagaska periwinkle hoặc Vinca

- Hoa: Hoa có màu từ trắng tới hồng sẫm với phần tâm có màu ñỏ, ống tràng dài 2,5-3cm và tràng hoa ñường kính 2-5cm, có mùi thơm Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn

- Quả: Quả là 1 cặp quả ñại, dài 2-4cm, rộng 2-3mm, mọc thẳng ñứng, hơi ngả sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, ñầu quả hơi tù, trong quả chứa 12-20 hạt

- Hạt: Hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng

1.1.5 Trồng trọt và thu hoạch

Dừa cạn là loại cây ưa sáng, ưa ẩm và có khả năng chịu ñược hạn Trong ñiều kiện trồng trọt, khi ñược cung cấp ñầy ñủ ñiều kiện cần thiết, cây sinh trưởng phát triển mạnh, khối lượng chất xanh thu ñược có thể cao gấp ñôi cây mọc từ thiên nhiên Cây mọc từ hạt trong tự nhiên vào khoảng 40%, nếu ñược xử lý có thể tăng lên 90% (H.Sutarno & Rudjiman, 1999)

Cây trồng từ hạt ra hoa sau 4-5 tháng Trong thời kì sinh trưởng mạnh, nếu bị

cắt, cây tái sinh chồi khỏe Vào năm 1970, Viện Dược Liệu ñã tiến hành nghiên cứu

kỹ thuật trồng Dừa cạn trên quy mô sản xuất Cây ñược nhân giống bằng hạt, mỗi hecta cần gieo 500-700gr hạt trong vườn ươm Thời vụ gieo hạt vào tháng 9-10 hoặc tháng 1-2 Cần ngâm hạt 3-4 giờ, vớt ra ñể ráo rồi gieo lên luống vườn ươm ñã ñược chuẩn bị kỹ Sau ñó phủ rơm rồi tưới nước Sau khoảng một tuần, hạt nảy mầm, cần tháo bỏ rơm rạ Khi cây có 3-4 ñôi lá thật (khoảng 40-45 ngày sau khi gieo) ñánh ñi trồng Có thể gieo thẳng nhưng cách này tốn công chăm sóc Dừa cạn

ưa ñất pha cát, ñất phù sa, hơi chịu hạn nhưng kém chịu úng ðất cần làm kỹ, lên luống cao 20cm, mặt luống rộng 50-60cm, dùng 10-15 tấn phân chuồng hoai mục

và 120-150 kg super lân ñể bón lót Trồng với khoảng cách 30x30cm, sau khi trồng cần tưới ngay ñể cây mau bén rễ Tưới thúc cho mỗi hecta 100-200kg ure, tưới 2 lần, cách nhau 1 tháng Mặc dù cây chịu ñược hạn nhưng phải giữ ñủ ẩm thường xuyên Chú ý thoát nước nhanh sau khi mưa lớn Khi mới trồng, cây thường bị sâu

xám phá hoại Cây trong vườn có thể bị Phytophthora làm cho chết hàng loạt Cần

tỉa bớt cho ñất thoáng và phun phòng bằng Boxdeaux Sau khi trồng 3-4 tháng, cây cho thu hoạch, cành mang lá dài 10-15cm ñược cắt về phơi sấy khô Ở ñất thoát nước và chăm bón tốt có thể thu hoạch nhiều lứa Trung bình 1 hecta thu ñược 1-1,2 tấn lá khô mỗi lứa (Viện Dược liệu, 2004)

1.2 Các alkaloid – thành phần hóa học quan trọng nhất của Dừa cạn

1.2.1 Khái niệm

Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, và có tính base Thường gặp trong nhiều loại thực vật và ñôi khi còn tìm thấy trong một vài loài ñộng vật ðặc biệt, alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao ñối với cơ thể con người và ñộng vật, nhất là ñối với hệ thần kinh Với chỉ một lượng nhỏ alkaloid là chất ñộc gây chết người nhưng lại có khi nó là thần dược trị bệnh ñặc hiệu

Hàm lượng alkaloid có thể ñạt tới 10% trong các loại rau quả thông dụng như: khoai tây, chè, cà phê

1.2.2 Một số hợp chất alkaloid chắnh có trong cây Dừa cạn

Phần ở trên mặt ựất của cây chứa 0,2 Ờ 1% alkaloid đã có khoảng 150

alkaloid ựược phân lập từ Cantharanthus Nhờ sự phát triển của việc nghiên cứu tế

bào và các phương pháp phân tắch bằng sắc ký lỏng cao áp mà số lượng các chất ựược phát hiện ra ngày càng nhiều hơn

Xét về mặt cấu trúc, các alkaloid chứa trong loài Cantharanthus tồn tại dưới

hai dạng monomer và dimmer Theo I.S Johnson và cộng sự thì có thể sắp xếp các alkaloid này vào 3 nhóm lớn:

1 Các alkaloid monomer (như Vindoline, CatharanthineẦ.)

2 Nhóm các alkaloid dimer indole Ờ dihydroindole (loại vinblastine)

3 Các alkaloid dimer loại không phải vinblastine

1.2.1.1 Vindoline

Vindoline (C25H32N2O6) ựược Kamat và cộng sự phân lập từ năm 1958, Gorman và cộng sự xác ựinh cấu trúc năm 1962, ựược nghiên cứu là có tác dụng hạ ựường huyết (Trần Nguyên Hữu và cộng sự, 2003) Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy Vindoline là một dihyroindol có thể dùng làm nguyên liệu ựể sinh tổng hợp và tổng hợp hóa học tạo các dimer alkaloid

Vindoline có nhiều trong lá Dừa cạn khoảng 3 tháng tuổi

Là tinh thể có ựiểm chảy 150-155oC [a]26D = -18o/CHCl3

cấu trúc năm 1961, là alkaloid nhân indol tham gia vào cấu trúc của vinblastine Catharanthine ñược nghiên cứu là có tác dụng lợi tiểu (Trần Nguyên Hữu và cộng sự, 2003)

Là tinh thể có ñiểm chảy 126-1280C[a]26D = +298o/CHCl3

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của Vinblastine

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử của Vincristine

• Sinh tổng hợp vinblastine và vincristine (Pahwa, D., 2008)

Vinblastine ñược cấu tạo bởi hai alkaloid ñơn phân tử là catharanthine (indole)

và vindoline (dihyroindole), cả hai chất này ñều có dạng tự do trong cây Vincristine

có cấu trúc tương tự như vinblastine nhưng thay cho nhóm N-methyl ở vòng indole ở phần vindoline là nhóm N- formyl Hàm lượng hai alkaloid này trong cây là rất nhỏ (vincristine chỉ ñạt khoảng 0.0002% khối lượng trong dược liệu khô)

Mặc dù nhu cầu thực tế ñòi hỏi lượng vincristine nhiều hơn lượng vinblastine nhưng cây lại sản xuất ra nhiều vinblastine hơn Do ñó, người ta ñã tìm cách chuyển

từ vinblastine sang vincristine hoặc chất khác theo con ñường vi sinh sử dụng Streptomyces albogryseolus ñể N-demethyl hóa (Pahwa, D., 2008)

Hai alkaloid chống ung thư tự nhiên khác của Dừa cạn là vindesine và vinorelbine ñã ñược phát triển thành sản phẩm chống ung thư Gần ñây, vinflunine

có cấu trúc tương tự fluorinated, ñược chỉ ra có hoạt tính chống ung thư mạnh ñã ñược ñưa vào các thử nghiệm lâm sàng giai ñoạn III tại Châu Âu từ năm 2005

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử của Vindesine

Hình 1.6 Cấu trúc phân tử của Vinorelbine

Hình 1.7 Cấu trúc phân tử của Vinflunine

Những thành công của việc bán tổng hợp alkaloid từ Dừa cạn dựa trên một giả thuyết sinh học liên quan ñến catharanthine và vindoline là tiền chất Vinblastine, cũng như các alkaloid dimeric từ Dừa cạn khác, có thể là kết quả của sự kết hợp các phần vindoline với một dẫn xuất trung gian xuất phát từ Catharanthine Sau nhiều nỗ lực nghiên cứu, một alkaloid kiềm vinblastine – có cấu hình S ở C18, ñược tạo thành

bằng cách áp dụng một chuyển hóa của phản ứng Polonovski, cũng ñược gọi là phản ứng Polonovski – Potier, hoặc phản ứng nhờ enzyme peroxidase kiềm hay phản ứng thông qua ion sắt trong môi trường acid, tạo thành alkaloid mới anhydro vinblastine,

có cấu hình 18’S tự nhiên (Etiévant, C et al., 2001)

Do ñược tổng hợp ñơn giản từ Catharanthine và Vindoline, anhydro vinblastine ñược coi là một chất trung gian trọng ñiểm, hấp dẫn trong tổng hợp các alkaloid dimeric khác Từ anhydro vinblastine, bằng nhiều cách khác nhau, các nhà nghiên cứu ñã tổng hợp nên nhiều loại thuốc chống ung thư nổi tiếng hiện nay như vinblastine, vindesine, vinorelbine và vinflunine (Tatsuya, S et al., 2006)

Một số alkaloid có hoạt tính khác như leurosine (20’- epi vinblastine), ajmalicine (Raubasine), lochnerine, serpentine và tetrahydroalstronine

1.3 Tác dụng dược lý của cây Dừa cạn

1.3.1 Tác dụng trong dân gian

Trong dân gian, người ta thường sử dụng nước sắc Cantharanthus roseus

với tác dụng lợi tiểu, hạ ñường huyết, chữa bệnh lỵ, bệnh xuất huyết hoặc chữa vết thương hở Ở Châu Âu, Bắc Phi và Trung Phi, nước sắc của Dừa cạn ñược sử dụng làm thuốc lợi tiểu, giảm xung huyết phổi, chữa bệnh viêm họng Ở Mỹ, Dừa cạn ñược dùng dưới dạng thuốc ñắp ñể cầm máu Người Ấn ðộ sử dụng cây này trong trường hợp bị côn trùng cắn Ngoài ra Dừa cạn còn ñược dùng làm thuốc chống viêm mắt ở Caribe và thuốc chữa ho ở Trung Quốc (Baldwin A.S.et al., 1997)

Hiện nay, Dừa cạn ñã và ñang ñược nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu tìm hiểu Nhiều thử nghiệm lâm sàng ñã và ñang ñược thực hiện nhằm chứng minh các tác dụng chống ung thư của các alkaloid từ Dừa cạn

1.3.2 Tác dụng chống ung thư của alkaloid từ Dừa cạn

ðầu những năm 1950, Noble tại phòng thí nghiệm Collipv- ðại học Western Ontario – Canada ñã nghiên cứu lá Dừa cạn với mục ñích tìm hiểu tác dụng của cây này ñến lượng ñường huyết trong cơ thể Thay vì các hoạt tính trên, ông nhận thấy trong lá Dừa cạn có những chất tác dụng mạnh ñến tế bào bạch cầu và tủy xương

Từ ñó, theo hướng nghiên cứu các chất gây ñộc tế bào hoặc ức chế phân bào bạch cầu ác tính, cùng với các nhà khoa học khác là Beer và Cutts, Noble ñã chiết ra ñược chất có hoạt tính chống ung thư ñặt tên là Vincaleukoblastine vào năm 1958, sau ñó ñổi tên thành vinblastine (Johnson và cộng sự, 1959)

Cùng ñồng thời trong khoảng thời gian ñó, một nhóm các nhà khoa học khác bao gồm Svoboda, Johnson, Neuss và Gorman tại phòng thí nghiệm Lilly ñã nghiên cứu và chứng minh rằng những phân ñoạn alkaloid từ Dừa cạn có tác dụng kéo dài khả năng sinh sản của tế bảo DBA trên 2 chuột ñược cấy tế bào lympho ung thư cấp tính (bệnh bạch cầu P-1534) (Johnson và cộng sự, 1959)

Phát hiện ra hoạt tính chống lại bạch cầu P-1534 của Dừa cạn có ý nghĩa rất quan trọng Trong một nghiên cứu chuyên sâu về Leurosine, Svoboda ñã tìm ra một alkaloid cấu trúc ñôi phân tử (dimeric alkaloid) có cấu trúc tương tự như vinblastine (Johnson và cộng sự, 1959)

Kể từ sau những thử nghiệm lâm sàng ñầu tiên vào thập niên 1960, các alkaloid từ Dừa cạn như vinblastine (biệt dược là Velban® hoặc Velbe®) và vincristine (biệt dược là OncoVin®), ñã ñược sử dụng rộng rãi như các hóa trị liệu cho nhiều loại ung thư khác nhau: ung thư máu, ung thư mô bạch huyết, ung thư tinh hoàn và ung thư vú (Etiévant, C et al., 2001)

Có thể nói, việc phát hiện ra vinblastine và vincristine là một cột mốc quan trọng trong sự phát triển của hóa trị liệu ung thư Nó ñã mở ra nhiều con ñường nghiên cứu khác nhau như hóa học, sinh học và lâm sàng nhằm phát hiện và chứng minh các hoạt tính chống ung thư mới của các alkaloid từ Dừa cạn

Cơ chế chống ung thư của alkaloid Dừa cạn

Ngay sau khi phát hiện ra ñặc tính kháng ung thư in vivo của các alkaloid từ

Dừa cạn, ñã có rất nhiều thí nghiệm nghiên cứu tập trung vào giải thích cơ chế tác dụng của chúng Vinblastine liên kết ñặc hiệu với tubulin-protein heterodimeric phổ biến trong tất cả các tế bào nhân thật Tubulin và dạng polymer của nó là microtubules có vai trò quan trọng trong việc duy trì hình thái tế bào, vận chuyển

nội bào và xây dựng các thoi phân bào trong quá trình phân chia tế bào Các alkaloid ức chế sự kết hợp của tubulin vào microtubules do ñó ngăn chặn quá trình phân chia tế bào Chúng liên kết với β-tubulin tại các vị trí khác nhau (ñược gọi là miền Vinca của tubulin – miền này chưa xác ñịnh chính xác vị trí) Vì vậy, hoạt tính chống tăng sinh của các alkaloid Dừa cạn ñược cho là kết quả của sự tương tác của chúng với các thoi phân bào (Dumontet, C and Sickic, B.I., 1999)

Trong các nghiên cứu in vitro, tác dụng của Vinca alkaloid trên tubulin phụ

thuộc vào nồng ñộ Ở nồng ñộ thấp (submicromolar), chúng ức chế chức năng và sự hình thành của microtubules từ tubulin Ở nồng ñộ cao nó diệt ñược cả tế bào (Molnar, A.et al., 1995)

Gần ñây, Knossow và cộng sự ñã công bố tìm ra vị trí gắn kết chính xác xủa các alkaloid Dừa cạn trên tubulin Họ cũng ñồng thời công bố các hình ảnh thu ñược bằng nhiễu xạ tia X cho thấy vị trí gắn kết này bị xen phủ một phần với vị trí gắn kết của phomopsin A, một peptit mạch vòng ñược phân lập từ loài nấm

Phomopsin leptostromifomis cũng có tác dụng ức chế sự trùng hợp của các tubulin

(Moisoi, N.et al., 2002)

1.3.3 Ứng dụng các alkaloid của Dừa cạn trong ñiều trị bệnh

Vinblastine sulfat: Là thuốc dùng trong liệu pháp phối hợp, là lựa chọn hàng

ñầu trong ñiều trị ung thư biểu mô tinh hoàn và ñược lựa chọn hàng thứ hai trong liệu pháp ñiều trị ung thư lá lách, ung thư nhau, ung thư biểu mô da ñầu và ung thư thận Lựa chọn thứ ba ñể ñiều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư dạng nấm da

Vincristine sulfat: Là một trong những thuốc ung thư ñược dùng rộng rãi nhất,

ñặc biệt có ích với bệnh ung thư máu, thường ñược dùng ñể làm thuyên giảm bệnh bạch cầu lympho cấp Nó ñược dùng trong liệu pháp phối hợp thuốc, là lựa chọn hàng ñầu ñể ñiều trị bệnh ung thư biểu mô phổi, ung thư ở hệ bạch huyết Hiện nay Dừa cạn ñang ñược nước ta xuất khẩu sang Pháp chủ yếu ñể ñiều chế thuốc chữa bệnh bạch cầu

Vindoline và catharanthine: ðược dùng ñiều trị bí tiểu và hạ lượng ñường

trong máu Ngoài ra, hai chất này còn là hai tiền chất quan trọng ñể tổng hợp ra vinblastine và vincristine

Ajmalicine: Là chất có biệt tính dược học mạnh, dùng ñể ñiều trị cao huyết

áp, giúp giảm ñau và ñiều trị các bệnh về thần kinh

Serpentine: Là thuốc dùng ñể ñiều trị bệnh cao huyết áp và thuốc an thần

1.4 Nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn

1.4.1 Nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn trên thế giới

1.4.1.1 Nghiên cứu phát sinh hình thái

Dhruva và cộng sự (1977) cho thấy việc tái sinh những cây C.roseus khỏe

mạnh có thể thực hiện từ những mô sẹo thông qua việc làm lây nhiễm ñoạn thân cây này với 3 loại mycoplasma-like organisms (MLOs) ñược nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng MS rắn (Mollers và Sarkar, 1989) Mô sẹo ñã ñược hình thành trên những mô bị nhiễm, sau ñó mô sẹo chuyển sang môi trường MS có bổ sung α naphthyl acetic acid (α-NAA) 1,0 mg/l; 6-benzyl aminopurine (BA) 0,25 mg/l

và gentamycin 10,0 ml/l Những cây này sau ñó dễ dàng thích nghi với ñiều kiện trong nhà kính nơi chúng sẽ ñược nuôi trong 1 năm Việc nhuộm màu lá với fluorochoromes DAPI (4,6- diamidino-2-phenylindole) và berberine sulfate ñã chứng minh sự vắng mặt của MLOs trong cây tái sinh

Ramavat và cộng sự (1978) ñã mô tả quá trình hình thành chồi non C.roseus từ

mô sẹo Sau ñó sự tái sinh cây từ những tế bào mô sẹo ñơn bội hay lưỡng bội C.roseus

ñược kết hợp với việc sử dụng những chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật như kinetin và β-indolylacetic acid (IAA) và ñược thực hiện bởi Abou- Mandour và cộng sự (1979)

Alen và cộng sự (1995) ñã ñề xướng việc nhân giống in vitro dừa cạn bằng

cách nuôi dưỡng mô phân sinh ngọn và chồi nách từ những cây ñược nuôi trong nhà kính Các tác giả ñã sử dụng môi trường MS cơ bản có bổ sung BA và 2,4-D ở nồng ñộ thấp, Những chồi nách này sẽ hình thành chồi ngọn sau 4-5 tuần nuôi cấy Một phần những chồi này ñã nhân giống ñược chuyển vào nuôi cấy tiếp Sau ñó

chúng ñược cắt và cho tạo rễ in vitro trong môi trường MS ñược bổ sung với α-

NAA và phát triển trong nhà kính với ñộ ẩm tương ñối 100% Trong cả 2 trường hợp ñều thành công

Andrea Swanberg và Wenhao Dai (2008) ñã nghiên cứu sự phát sinh hệ thống

tái sinh in vitro trên hai giống cây dừa cạn Thái Bình Dương Coral (P1) và SunstormRose (P2) Chồi ñược tái sinh từ nuôi cấy mô lá in vitro ñã sử dụng 6-

benzyladeine (BA) và α-naphthalene acetic acid (α-NAA)

Bei-Bei Xiang và cộng sự (2010) ñã tiến hành sàng lọc dòng tế bào

Catharanthus roseus ñể sản xuất hàm lượng ajmalicine cao ở cây tứ bội và nhị bội

Mô sẹo dừa cạn ñược hình thành từ cấy lá của cây tứ bội và lưỡng bội Mô sẹo ñược cảm ứng trong môi trường (MS) Murashige và Skoog bổ sung 0,5 axit α-naphthaleneacetic mg/l (α-NAA), 0,5 mg/l 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid, 2 mg/l 6-benzylaminopurine, 30 sucrose g/l và7,2 g/l môi trường thạch

Ainul Zura Zulkepli và Azman Abd samad (2011) ñã tiến hành nghiên cứu tạo

chồi từ lá C.roseus Thân và cuống lá từ cây trưởng thành của C.roseus ñược ñặt

trên MS có bổ sung α-NAA (0,75-1,25 mg/l) và BA (0,25-0,30 mg/l) ñể xác ñịnh loại cấy và nồng ñộ tối ưu ñiều hòa sinh trưởng thực vật ñể tạo chồi Sau 2 tuần nuôi cấy, bắt ñầu callus màu xanh lá cây và trắng ñược hình thành Tần số cao nhất của sự hình thành mô sẹo ñã ñược thu ñược từ cấy lá tại một sự kết hợp của BA 0,2 mg/l với 1,25 mg/l α-NAA Rễ ñược tái tạo từ cuống lá cấy có bổ sung 0,2 mg/l BA với 0,75 mg/l α-NAA ở tuần thứ 8 Lá và thân cấy không gây ra sinh chồi trong môi trường có chứa BA và α-NAA

1.4.1.2.Nuôi cấy sinh khối tế bào Dừa cạn ñể thu hợp chất alkaloid

Trước ñây những nguyên liệu thô dùng ñể sản xuất alkaloid thường ñược thu

nhận hầu hết tại những vùng mà C.roseus xuất hiện tự nhiên hoặc tại những vùng

nó ñược trồng trọt ðiều kiện thời tiết và ñặc tính của ñất ở một số nước châu Âu thì

bất lợi cho việc gieo trồng C.roseus Vì thế nó chỉ có thể ñược trồng như là một loại

cây hàng năm trong nhà kính và những nhà mái vòng làm bằng nhựa Mặt khác,

trong khi nhu cầu về alkaloid rất lớn và giá của chúng rất cao, nhưng hàm lượng alkaloid trong nguyên liệu thô thu nhận từ cây trong tự nhiên là rất thấp Do ñó, việc thu nhận indole alkaloid từ mô và cơ quan thực vật, và từ những cây ñược nhân

giống in vitro là những hướng ñi mới cần ñược phát huy Mô sẹo, huyền phù tế bào

và rễ tơ ñược nuôi trong bioreactor ñã ñược sử dụng trong nhiều thí nghiệm Những

mô ñược nuôi cấy từ những cơ quan khác nhau tổng hợp rất nhiều hợp chất thứ cấp

và có tính di truyền ổn ñịnh Nhiều triển vọng hứa hẹn bao gồm việc sản xuất những indole alkaloid như : ajmalicine trong mô sẹo, catharanthine trong lá ñược nuôi cấy trong bình lắc và bioreactor có sục khí và vinblastine từ chồi và rễ tơ

* Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào

Nhiều nghiên cứu ñã ñược thử nghiệm trong việc thu nhận huyền phù tế bào nuôi cấy cho năng suất thu indole alkaloid cao, ñặc biệt là vinblastine và vincristine Phương pháp sản xuất catharanthine và ajmalicine trong dịch huyền phù ñược nuôi cấy trong bioreactor ñã thành công Moreno và cộng sự (1996) ñã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất cảm ứng lên những con ñường chuyển hóa khác nhau liên quan ñến quá trình chuyển hóa hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù tế bào

C.roseus

Dịch trích tế bào nấm Phytium aphanidermatum ñã ñược tiệt trùng ñược

dùng trong nghiên cứu này Những tế bào C.roseus ngay lập tức biến ñổi quá trình

chuyển hóa của chúng ñể phản ứng lại tác ñộng của nấm Zhao và cộng sự (2001)

ñã thử nghiệm nhiều chất cảm ứng của nấm nhận ñược từ 12 loại nấm và ảnh hưởng

của chúng lên việc cải thiện sản xuất indole alkaloid ở huyền phù tế bào C.roseus

Những kết quả này cho thấy rằng những chất chiết từ nấm khác nhau kích thích tích lũy những indole alkaloid khác nhau, có thể gấp 2 ñến 5 lần ở nuôi cấy thường

Zhao và cộng sự (2001) ñã tăng sản phẩm catharanthine trong tế bào nuôi

cấy C.roseus bằng cách kết hợp chất cảm ứng nuôi trong bình lắc và bioreactor Tác

ñộng tổng hợp lên sự tích lũy alkaloid trong tế bào nuôi cấy ñã ñược theo dõi khi chúng ñược xử lý với một vài sự kết hợp giữa chất cảm ứng của nấm và hóa chất

Sự kết hợp giữa tetramethyl ammonium bromide và nấm sợi Aspergillus niger ñã

cho hiệu suất thu ajmalicine cao nhất và cải thiện sự tích lũy catharanthine Trong khi sự kết hợp giữa chất cảm ứng malate và sodium alginate cho kết quả hiệu suất catharanthine cao nhất và cũng tích lũy ajmalicine cao trong tế bào nuôi cấy Các tác giả sau ñó ñã phát triển quy trình này ñể nâng cao việc sản xuất catharanthine ở

tế bào C.roseus nuôi trong bình lắc và bioreactor Sau 10 ngày nuôi cấy ñã thu ñược

catharanthine với hiệu suất theo thứ tự là 25 mg/l, 32 mg/l và 22 mg/l trong bình lắc

500 ml, 1000 ml và bioreactor dạng sục khí 20 lít Tác giả cũng ñã quan sát thấy rằng sự kết hợp giữa việc xử lý malate và alginate kích thích sự phản ứng lại, ví dụ

như là sự oxy hóa lipid xảy ra ở hầu hết quá trình nuôi cấy C.roseus và ñiều này có

thể gián tiếp sản xuất indole alkaloid thông qua con ñường jasmonate

* Nuôi cấy rễ tơ

Trong những năm gần ñây, phương pháp nuôi cấy rễ, chủ yếu là rễ tơ của

C.roseus ñã tăng lên ñáng kể hơn cả mong ñợi, như là một nguồn tiềm năng của

những hợp chất có giá trị chữa bệnh này Sự phát triển của kỹ thuật vi nhân giống

cây và phương pháp ñể mở rộng việc nuôi cấy rễ in vitro là rất quan trọng và có thể

trở thành giải pháp quan trọng ñể giải quyết việc thu nhận indole alkaloid từ nguyên liệu thô

Những yếu tố di truyền của rễ tơ, thu ñược bằng sự nhiễm với

Agrobacterium rhizogenes, sản xuất hợp chất thứ cấp nhiều hơn là những cây tự

nhiên Hàm lượng alkaloid trong rễ tơ có thể tương ñương hoặc cao hơn khi ñối chiếu với hàm lượng ño ñược trong nghiên cứu ở rễ tự nhiên Những alkaloid chiếm

ưu thế trong rễ tơ là ajmalicine, serpentine, vidoline và catharanthine, ñược tìm thấy với hàm lượng cao hơn trong rễ tự nhiên

1.4.2 Nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn ở Việt Nam

Tại Việt Nam, Dừa cạn chưa ñược nghiên cứu nhiều Hầu như chưa có

nghiên cứu nào về phát sinh hình thái, tạo cây Dừa cạn in vitro hoàn chỉnh mà chỉ

có một vài kết quả về nuôi cấy dịch huyền phù tế bào ñể thu sinh khối và ảnh hưởng

của các chất ñiều tiết sinh trưởng ñến quá trình nuôi cấy in vitro ñó Theo tác giả

Bùi Văn Lệ và Nguyễn Ngọc Hồng thì mô sẹo xanh ñược cảm ứng từ lá cây dừa cạn

in vitro ñược nuôi trong môi trường MS (Murashige và Skoog) lỏng có bổ sung các

chất ñiều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau gồm có auxin và cytokinin Ở nồng ñộ

1 mg/l α-NAA và 0,5 mg/l kinetin thu nhận ñược sinh khối và alkaloid toàn phần cao nhất trong khi cũng ở môi trường này nhưng thay thế α-NAA bằng 2,4-D ở cùng nồng ñộ thu ñược sinh khối và alkaloid toàn phần thấp Khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ ñường sacharose ñến việc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào Dừa cạn cho kết quả ở nồng ñộ 60g/l cho lượng sản phẩm là cao nhất Khi kết hợp nồng ñộ chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật cho hiệu quả nuôi cấy cao (1mg/l NAA; 0.5mg/l Kin)

và nồng ñộ ñường tối ưu (60g/l) thu nhận ñược lượng vincristine cao trong khi ở lá cây Dừa cạn ngoài tự nhiên không thu ñược lượng alkaloid này

1.5 ðột biến di truyền và phương pháp xử lý ñột biến bằng EMS

1.5.1 ðột biến di truyền

1.5.1.1 Khái niệm

ðột biến là những biến ñổi có tính chất hoá học vật liệu di truyền, xảy ra do tác ñộng của các yếu tố môi trường và bên trong tế bào

1.5.1.2 Phân loại các dạng ñột biến

Theo ñặc ñiểm biến ñổi của kiểu gen có thể phân biệt 4 kiểu ñột biến sau:

ðột biến gen (ñột biến ñiểm): Là những biến ñổi về thành phần bazơ của

ADN, làm biến ñổi các cấu trúc của gen, dẫn tới chức năng của chúng bị biến ñổi

ðột biến cấu trúc nhiễm sắc thể: Là những biến ñổi liên quan tới những ñoạn

khác nhhau trên nhiễm sắc thể, có thể quan sát thấy dưới kính hiển vi (bao gồm những biến ñổi như: mất ñoạn, thêm ñoạn, ñảo ñoạn, chuyển ñoạn)

Biến ñổi về số lượng nhiễm sắc thể: bao gồm thay ñổi số lượng của cả bộ

nhiễm sắc thể

ðột biến gen ở tế bào chất: ñó là những biến ñổi trên ADN của các bào quan như

ty thể, lạp thể, hay ở các episom, plasmid (ở vi khuẩn) (Nguyễn Hồng Minh, 1999)

Trong các dạng ñột biến nêu trên dạng làm biến ñổi cấu trúc nhiễm sắc thể thường dẫn ñến những biến ñổi có hại ñối với cơ thể sinh vật Vì vậy, các nhà chọn giống chú trọng chủ yếu ñến dạng ñột biến gen, dạng này liên quan ñến sự biến ñổi cấu trúc của gen dẫn tới sự xuất hiện alen mới (Phạm Thành Hổ, 2001)

Sự phát sinh ñột biến có thể do tự phát (ñột biến tự nhiên): ðột biến xuất hiện trong tự nhiên do tác ñộng của tập hợp các yếu tố (vật lý, hóa học…) có trong môi trường sống, và do những biến loạn về trao ñổi chất trong tế bào ðột biến do tác ñộng của con người (ñột biến nhân tạo): bằng cách sử dụng các tác nhân gây ñột biến như các tác nhân vật lý (tia X, tia gamma, bức xạ cực tím UV…), các tác nhân hóa học (các chất ñồng phân có tính base và những hợp chất có liên quan, chất kháng sinh, các tác nhân alkyl hóa, hydroxylamine, nitrous acid…)

Trong ñiều kiện tự nhiên, tần số xuất hiện ñột biến thay ñổi tùy thuộc vào từng loại cây trồng và của từng gen riêng biệt Tuy nhiên, tần số ñột biến rất thấp

10-6 và khó phát hiện, số ñột biến có lợi cho sản xuất và ñời sống con người lại càng thấp hơn Ngày nay các nhà chọn giống không thể chỉ trông chờ vào việc sử dụng các dạng ñột biến tự phát Vì vậy, việc nghiên cứu ñột biến nhân tạo ñược các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, nhằm tăng tần số xuất hiện ñột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nói chung và cây trồng nói riêng Mặc dù còn nhiều hạn chế nhưng ñột biến thực nghiệm ñã và ñang ñóng góp rất lớn cho việc cải thiện giống cây trồng trên thế giới

1.5.1.3.Vai trò của ñột biến thực nghiệm trong công tác chọn tạo giống

Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, nhiều phương pháp chọn tạo giống ñã và ñang ñược quan tâm phát triển Bằng các phương pháp truyền thống như lai tạo hay chọn lọc, ñể tạo ra một giống cây trồng năng suất cao, ổn ñịnh cần ít nhất 6 – 10 thế hệ Trong khi ñó chọn lọc bằng phương pháp ñột biến nhân tạo(ñột biến thực nghiệm) thì chỉ cần từ 3-6 thế hệ (Nguyễn Hữu ðống và cộng sự, 1997) ðồng thời sử dụng phương pháp này có thể giải quyết những vấn ñề mà nhiều phương pháp khác không thực hiện ñược như khi biến dị tự

nhiên về một ñặc tính mong muốn không có sẵn trong nguồn vật liệu di truyền; khi

có sẵn một gen cần thiết song do mối liên kết chặt chẽ với các gen khác làm cho gen

ñó không sử dụng ñược; khi tạo ñặc tính mong muốn không thể thực hiện ñược bằng phương pháp lai; khi muốn thay ñổi một hoặc một số tính trạng riêng biệt nhằm khắc phục nhược ñiểm của giống mà không làm thay ñổi những tính trạng khác của giống (Trần Duy Quý, 1997)

Với phương pháp ñột biến thực nghiệm, sử dụng các tác nhân lý hóa gây ñột biến ñã làm tăng sự sai khác di truyền trong quần thể Việc xử lý ñột biến thực nghiệm có thể tạo ra những ñột biến mang tính nhảy vọt ñáng kể Do ñó có thể tạo

ra giống mới khác xa giống cũ (Phạm Văn Duệ, 2005)

Với các thành tựu nổi bật về vật lý, hóa học, con người ñã sử dụng các tia phóng xạ (tác nhân lý học) và các chất hóa học (tác nhân hóa học) như cochicine, EMS…trong công tác chọn giống cây trồng và ñã thu ñược các thành tựu ñáng kể Theo Ban Di truyền và chọn giống thực vật của tổ chức Nông nghiệp quốc tế và tổ chức Năng lượng nguyên tử quốc tế (FAO, IAEA) ñã cho biết tính ñến năm 1996, số lượng các giống ñột biến thu ñược là 1737 giống từ hơn 50 nước trên thế giới Các giống này ñược tạo ra từ 154 loài thực vật Trong ñó cây trồng chiếm 1257 giống,

187 giống hoa cúc, 35 giống cây cảnh, 34 giống hoa phong lan, 30 giống xương rồng

và rất nhiều loài khác (Nguyễn Hữu ðống và cộng sự, 1997) Từ những kết quả thu ñược chứng tỏ ñây là một trong những phương pháp có hiệu quả nhất ñể tạo ra giống mới Nhiều nhà khoa học trên thế giới ñã ñánh giá: một trong những thành tựu xuất sắc nhất của thế kỷ 20 là khám phá ra phương pháp tạo giống bằng cách gây ñột biến thực nghiệm

Theo một số tài liệu thì tác nhân gây ñột biến hóa học có hiệu quả cao hơn tác nhân vật lý Nếu dưới ảnh hưởng của chiếu tia thì ở các cây nông nghiệp xuất hiện 10% -15% biến ñổi di truyền có khả năng sống thì tác nhân hóa học cho phép thu nhận từ 30 – 60% Hơn nữa, tác nhân gây ñột biến thực nghiệm làm xuất hiện những biến dị ñặc biệt hơn (Trần Thượng Tuấn, 2005)

1.5.2 Ethy methane sulphonate (EMS) Ờ Tác nhân gây ựột biến hóa học

EMS là hợp chất hóa học nằm trong nhóm các hợp chất alkyl hóa: nhóm này gồm phần lớn các mutagen hóa học ựược dùng phổ biến cho mục ựắch chọn giống hiện nay như EI, EMS, NEU, NUMẦ quá trình alkyl hóa là sự thay thế hydro có trong bazơ nitơ bằng một gốc alkyl có trong các chất alkyl hóa (như C2H5 có trong EMS) (Lê Duy Thành, 2001)

EMS có tên khoa học là Ethyl methane sulphonate, công thức hóa học:

CH3 Ờ CH2 Ờ O Ờ SO2 Ờ CH3

* Cơ chế tác ựộng của EMS:

EMS là chất gây ựột biến gen, gây nên những ựột biến ựiểm và mất ựoạn nhỏ ADN (Yoshio Itoh, 2002)

EMS gây alkyl hóa với bazơ nitơ thường xuất hiện ở vị trắ O6 của Guanin khiến cho nó sau ựó có thể kết cặp với Thymine và dẫn ựến sự ựồng hoán giữa các bazơ nitơ (ựồng hoán Ờ transition Ờ là sự thay thế một purin này bằng một purin khác hoặc một pyrimidin này bằng một pyrimidin khác, hoặc sự thay thế một cặp bazơ này bằng một cặp bazơ khác mà vẫn giữ nguyên ựịnh hướng của purin và pyrimidin) (Lê Duy Thành, 2001)

Trong các tác nhân gây ựột biến hóa học, EMS là chất ựược sử dụng phổ biến và cho hiệu quả cao Dung dịch hóa chất này phải ựược chuẩn bị trước khi dùng và nó ựược tồn trữ như dung dịch gốc ỘstockỢ Tốc ựộ thủy phân của chất này ựược ựo bằng phương pháp bán thời gian Ộhalf lifeỢ Qua các kết quả nghiên cứu người ta cho thấy tốc ựộ thủy phân của EMS phụ thuộc rất lớn vào nhiệt ựộ Trong nước cất (pH = 7) ở nhiệt ựộ 20oC half life của EMS là 93 giờ, ở 30oC là 26 giờ, ở

37oC là 10 giờ (Bùi Chắnh Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007) Vì vậy, ựể ựảm bảo hoạt tắnh của chất gây ựột biến chỉ nên chuẩn bị dung dịch trước khi xử lý không quá 30 phút (đào Thanh Bằng và cộng sự, 1997)

Người ta còn phát hiện ra dimethylsulphoxide (DMSO) là một chất mang có chức năng thúc ựẩy hiện tượng phát sinh ựột biến gen của EMS Xử lý chất này làm giảm sự sinh trưởng 30%-40% có khả năng tạo nên ựột biến ở tấn suất tối hảo cho cây trồng thuộc nhóm mễ cốc (Bùi Chắnh Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007)

ðể gây ñột biến cho cây trồng có thể xử lý hóa chất EMS trên các bộ phận như: hạt, chồi, củ, phôi trong thời gian ñang phát triển Tuy nhiên, ñối với mỗi giống, bộ phận của cây trồng có sự cảm ứng khác nhau với hóa chất gây ñột biến

Vì vậy, ñối với từng giống, từng bộ phận cây trồng cần phải xác ñịnh nồng ñộ, thời gian tác ñộng hợp lý mới có thể mong muốn ñem lại hiệu quả di truyền cao

2.6 Các nghiên cứu về xử lý EMS trong công tác chọn giống

Các tác giả Tulmann Neto và cộng sự vào năm 2004 ñã nghiên cứu ảnh hưởng gây ñột biến của EMS lên giống cúc Dendranthema grandiflora Tzvelev Các tác giả tiến hành thí nghiệm trên cuống nhỏ non của giống cúc cv.Ingrid (màu hồng thẫm) ñược xử lý với dung dịch EMS nồng ñộ 0,77% trong 1h và 45 phút, sau ñó ngâm trong nước 15 phút và làm sạch bề mặt Tiếp theo ñó, mẫu ñược cấy trên môi trường + 1g/l hydrolyzed casein, 1mg/l 6-benzylaminopurine (BAP) và 2mg/l indole-3-acetic acid (IAA) Ước lượng có khoảng 910 mẫu thu ñược từ xử lý EMS cuống hoa cho kết quả ra hoa Thí nghiệm thu ñược khoảng 40 dạng ñột biến (chiếm 5,2%) cho màu sắc cánh hoa khác nhau (màu hồng cam, màu hồng nhạt, màu ñồng, màu trắng, màu vàng và màu da cam) Hầu hết chúng (89% tổng số) là ñồng dạng về kiểu hình

Chen Wei và cộng sự, 2004 nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS lên các

phôi tiểu bào tử in vitro họ cải bắp (Brassica napus) cho thấy: Khi xử lý các tiểu bào

tử của B.napus in vitro ở các nồng ñộ 0 ; 1,0 ; 1,5 ; 2,0 ; 2,5 và 3,0 mM/l và các

khoảng thời gian 12, 24 và 36h, kết quả chỉ ra rằng số lượng hầu hết các sản phẩm phôi tiểu bào tử ñều giảm xuống, tăng dần ở các nồng ñộ xử lý và các khoảng thời gian xử lý Sản phẩm phôi giảm còn một nửa ở nồng ñộ 2,5mM/l và khoảng thời gian 24h Ở mức này, các tiểu bào tử bị ñột biến có giá trị rất quan trọng trong xử lý

ñột biến EMS in vitro B.napus

Tác giả Luan và cộng sự, 2007 ñã sử dụng EMS nhằm gây ñột biến tăng tính

chịu mặn của các giống khoai lang (Ipomoea batatas L.) Mẫu mô lá ñược sử dụng

ñem xử lý EMS ở nồng ñộ 0,5% trong thời gian 0 ; 1,0 ; 1,5 ; 2,0 ; 2,5 và 3,0 h ; sau ñó tráng lại bằng nước cất vô trùng 4 lần Mẫu ñược nuôi cấy trên môi trường

MS + 200 mM NaCl nhằm chọn lọc các dòng tế bào ñột biến và các dòng này sẽ ñược cấy chuyển 5 lần (20 ngày/1 lần) Sau ñó các dòng chọn ñược ñược cấy

chuyển sang môi trường tạo phôi vô tính MS + 4mg/l ABA + 10mg/l GA Sau 15 ngày cấy chuyển sang môi trường MS + 0.05 mg/l ABA + 0,2 mg/l ZT (zeatin) Các giống như ML1, ML2 và ML3ñược phục tráng từ các dạng phôi vô tính thích hợp

xử lý với EMS nồng ñộ 0,5% trong 2,0 và 2,5 h Các giống chọn tạo ñược có ñặc tính chịu mặn hơn hẳn các giống gốc

Năm 1998, các tác giả thuộc Viện Lúa ñồng bằng sông Cửu Long ñã gây ñột biến thành công giống lúa thơm Jasmine 85 bằng xử lý hóa chất EMS trong nuôi cấy mô Thí nghiệm ñược thực hiện từ vụ hè thu năm 1998 ñến năm 2001 ðặc ñiểm: Lúa Jasmine 85 có nguồn gốc từ Hoa Kỳ là giống ñặc xuất khẩu của Hoa Kỳ ñược thế giới ưa chuộng Khi trồng ở Việt Nam, lúa bị nhiễm sâu bệnh nên chi phí cao, không cạnh tranh lại với các nước khác, thị trường nội ñịa cũng khó tiêu thụ Sau khi

xử lý, thế hệ M1, cá thể ñược trồng ở ruộng vào thời ñiểm có dịch rầy, phần lớn ñều

bị cháy rầy Từ 59 cá thể này, theo kỹ sư Phạm Thị Hường-người tham gia quá trình chọn tạo giống mới Jasmine 85, chọn tiếp ñến thế hệ M5, tuyển chọn một số dòng ñã thuần ñưa vào so sánh năng suất, trong ñó có 4 dòng OM 3566-14, OM 3566-15, OM 3566-16 và OM 3566-70 có triển vọng

Theo thời báo Nông nghiệp Việt Nam, 2001: Tại Malaysia bằng cách lấy ñỉnh sinh trưởng nuôi cấy tạo mô sẹo rồi dùng các tác nhân rồi dùng các tác nhân gây ñột biến

có thể là hóa chất như EMS 0,2%, DMSO 2% (Dimethylsulfoxide) hoặc tia gamma ñược ñiều chế từ Co60 ñã chọn tạo thành công giống chuối FATON-1 Giống chuối FATON-1 có ñặc ñiểm: từ lúc trồng tới khi thu hoạch khoảng 37 tuần (gần 9 tháng) sớm hơn các giống gốc của nó là giống chuối Cavedish gần 6 tháng ðiều này ñặc biệt có ý

nghĩa do chuối (Musa sp) là cây sinh sản vô tính nên việc cải tiến giống chuối là rất khó

khăn, vì không có sự kết hợp giữa 2 giao tử ñực và cái trong phôi Do ñó việc cải tiến giống chuối chủ yếu dựa vào ñột biến kết hợp với nuôi cấy mô

Ở nước ta ñã có rất nhiều kết quả nghiên cứu về nuôi cấy in vitro và xử lý

EMS trên nhiều ñối tượng khác nhau nhưng trên ñối tượng Dừa cạn hoàn toàn chưa

ñược quan tâm Vì vậy, chúng tôi tiến hành nuôi cấy in vitro và xử lý EMS trên ñối

tượng Dừa cạn và theo dõi sinh trưởng, phát triển và hàm lượng alkaloid tổng số có trong các dòng cây sau xử lý ñột biến với mong muốn chọn ra ñược những dòng có triển vọng phục vụ cho công tác chọn giống sau này

Chương 2 ðỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ðối tượng, vật liệu và ñịa ñiểm nghiên cứu

+ ðối tượng nghiên cứu: Giống Dừa cạn hoa hồng (Catharanthus roseus var

roseus)

+ Vật liệu ngiên cứu: Các chồi ñỉnh, ñoạn thân không mang mắt ngủ, ñoạn

thân mang mắt ngủ và mô lá Dừa cạn in vitro

+ ðịa ñiểm nghiên cứu: Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

+ Thời gian nghiên cứu: 15/7/2012 – 31/3/2013

+ Các hóa chất và thiết bị cần thiết cho thí nghiệm:

+ Các máy móc, thiết bị phục vụ nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2 Nội dung nghiên cứu: Bao gồm 3 nội dung chính

2.2.1.Nội dung 1: Nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn

2.2.2.1 Nội dung 1.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng ñến sự phát sinh hình thái từ mô Dừa cạn in vitro

*Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của auxin ñến sự phát sinh hình thái từ mô Dừa

cạn in vitro

+ Vật liệu: Mô lá, ñoạn thân không mang mắt ngủ

+ Công thức thí nghiệm

CT1(ðC): MS CT2: MS+ 0,25mg/l 2.4D CT3: MS+ 0,5mg/l 2.4D CT4: MS+ 0,75mg/l 2.4D CT5: MS+ 1,0mg/l 2.4D CT6: MS+ 0,25mg/l α-NAA CT7: MS+ 0,5mg/l α-NAA CT8: MS+ 0,75mg/l α-NAA CT9: MS+ 1,0mg/l α-NAA

* Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của cytokinin ñến sự phát sinh hình thái từ mô

Dừa cạn in vitro

+ Vật liệu: Mô lá, ñoạn thân không mang mắt ngủ

+ Công thức thí nghiệm

CT1(ðC): MS CT2: MS+ 0,5mg/l Ki CT3: MS+ 1,0mg/l Ki CT4: MS+ 1,5mg/l Ki CT5: MS+ 2,0mg/l Ki CT6: MS+ 0,5mg/l BA CT7: MS+ 1,0 mg/l BA CT8: MS+ 1,5mg/l BA CT9: MS+ 2,0mg/l BA

* Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tổ hợp auxin và cytokinin ñến sự phát sinh

hình thái từ mô Dừa cạn in vitro

- Thí nghiệm 3a: Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D và Kinetin ñến sự phát sinh

hình thái từ mô Dừa cạn in vitro

+ Vật liệu: Mô lá, ñoạn thân không mang mắt ngủ

+ Công thức thí nghiệm

CT1(ðC): MS CT2: MS+ 1,0mg/l 2,4D + 0,5mg/l Ki CT3: MS+ 1,0mg/l 2,4D + 1,0mg/l Ki CT4: MS+ 1,0mg/l 2,4D + 1,5mg/l Ki CT5: MS+ 1,0mg/l 2,4D + 2,0mg/l Ki

- Thí nghiệm 3b: Ảnh hưởng của tổ hợp α-NAA và BA ñến sự phát sinh

hình thái từ mô Dừa cạn in vitro

+ Vật liệu: Mô lá, ñoạn thân không mang mắt ngủ

+ Công thức thí nghiệm

CT1 (ðC): MS+1,0 mg/l α-NAA CT2: MS +1,0 mg/l α-NAA + 1,0 mg/l BA

CT3: MS +1,0 mg/l α-NAA + 2,0 mg/l BA CT4: MS +1,0 mg/l α-NAA + 3,0 mg/l BA CT5: MS +1,0 mg/l α-NAA + 4,0 mg/l BA Sau thí nghiệm 3 tìm ra ñược công thức phát sinh hình thái tốt nhất của mô

Dừa cạn in vitro

2.2.2.2 Nội dung 1.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng và ánh sáng ñến sinh trưởng phát triển của chồi Dừa cạn in vitro

* Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 1,0 mg/l α-NAA ñến sự sinh

trưởng phát triển của chồi Dừa cạn in vitro

+ Vật liệu: ðoạn thân mang mắt ngủ

+ Công thức thí nghiệm

CT1 (ðC): MS+1,0 mg/l α-NAA CT2: MS +1,0 mg/l α-NAA + 1,0 mg/l BA CT3: MS +1,0 mg/l α-NAA + 2,0 mg/l BA CT4: MS +1,0 mg/l α-NAA + 3,0 mg/l BA CT5: MS +1,0 mg/l α-NAA + 4,0 mg/l BA

* Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng ñến khả năng ra rễ

của chồi Dừa cạn in vitro

- Thí nghiệm 5a: Ảnh hưởng của α-NAA và than hoạt tính ñến khả năng ra rễ của chồi Dừa cạn in vitro

+ Vật liệu: Chồi ñỉnh in vitro

+ Công thức thí nghiệm

CT1 (ðC): MS CT2: MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,5 mg/l α-NAA CT3: MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 1,0 mg/l α-NAA CT4: MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l α-NAA

- Thí nghiệm 5b: Ảnh hưởng của IBA ñến khả năng ra rễ của chồi Dừa cạn

in vitro

+ Vật liệu: Chồi ñỉnh in vitro

+ Công thức thí nghiệm

CT1 (đC): MS CT2: MS + 0,5 mg/l IBA CT3: MS + 1,0 mg/l IBA CT4: MS + 1,5 mg/l IBA

- Thắ nghiệm 5c: Ảnh hưởng của tổ hợp α-NAA và IBA ựến khả năng ra rễ

của chồi Dừa cạn in vitro

+ Vật liệu: Chồi ựỉnh in vitro

+ Công thức thắ nghiệm

CT1:MS CT2: MS+ 0,5mg/l α-NAA + 0,5mg/l IBA CT3: MS+ 0,5mg/l α-NAA + 1,0mg/l IBA CT4: MS+ 0,5mg/l α-NAA + 1,5mg/l IBA CT5: MS+ 1,0mg/l α-NAA + 0,5mg/l IBA CT6: MS+ 1,0mg/l α-NAA + 1,0mg/l IBA CT7: MS+ 1,0mg/l α-NAA + 1,5mg/l IBA CT8: MS+ 1,5mg/l α-NAA + 0,5mg/l IBA CT9: MS+ 1,5mg/l α-NAA + 1,0mg/l IBA CT10: MS+ 1,5mg/l α-NAA + 1,5mg/l IBA Sau thắ nghiệm 5 tìm ra ựược công thức tối ưu cho ra rễ ựể tiến hành thắ nghiệm ra rễ cho các chồi sau xử lý EMS

* Thắ nghiệm 6: Ảnh hưởng của phổ ánh sáng và cường ựộ chiếu sáng ựến

sự sinh trưởng và phát triển của chồi Dừa cạn in vitro

+ Vật liệu: Chồi ựỉnh in vitro

+ Công thức thắ nghiệm

CT1: Sử dụng 2 bóng huỳnh quang thường (đèn blast sắt từ)

CT2: Sử dụng 1 ựèn HQNN T8-36W NCM 55(cường ựộ bức xạ (Ibx) = 25 ộmol/m2/s) CT3: Sử dụng 2 ựèn HQNN T8-36W NCM 55(cường ựộ bức xạ (Ibx) = 35 ộmol/m2/s) CT4: Sử dụng 3 ựèn HQNN T8-36W NCM 55(cường ựộ bức xạ (Ibx) = 60 ộmol/m2/s) CT5: Sử dụng 1 ựèn HQNN T8-36W B/R (cường ựộ bức xạ (Ibx) = 25 ộmol/m2/s) CT6: Sử dụng 2 ựèn HQNN T8-36W B/R (cường ựộ bức xạ (Ibx) = 35 ộmol/m2/s) CT7: Sử dụng 3 ựèn HQNN T8-36W B/R (cường ựộ bức xạ (Ibx) = 60 ộmol/m2/s)