Nghiên cứu nhân nhanh invitro cây chuối tiêu hồng

Theo Nguyễn Quang Thạch và cộng sự 1995 cho biết hoàn toàn có thể sử dụng phương pháp in vitro ñể nhân nhanh cây chuối, vật liệu nuôi cấy tốt nhất cho mục ñích nhân nhanh là các mô chồi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
    -

VŨ VĂN ðẠI

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH INVITRO

CÂY CHUỐI TIÊU HỒNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
    -

VŨ VĂN ðẠI

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH INVITRO

CÂY CHUỐI TIÊU HỒNG

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS PHAN HỮU TÔN

HÀ NỘI – 2013

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các ñề tài khác

Tôi cũng xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược ghi rõ nguồn gốc

Học viên

Vũ Văn ðại

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi ñã nhận ñược sự quan tâm, giúp ñỡ của nhiều cá nhân và cơ quan ñơn vị Nay luận văn ñã hoàn thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới:

PGS TS Phan Hữu Tôn, người ñã tận tình hướng dẫn và tạo mọi ñiều kiện, giúp ñỡ tôi nghiên cứu và thực hiện ñề tài

Các thầy giáo, cô giáo thuộc Khoa Công nghệ sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã nhiệt tình giảng dạy và tạo mọi ñiều kiện cho tôi hoàn thành khóa học

Các cán bộ, kỹ thuật viên phòng Ứng dụng tiến bộ KHCN– Sở Khoa học

và Công nghệ Bắc Ninh ñã nhiệt tình hướng dẫn, giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện cho tôi thực hiện luận văn Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam ñã cung cấp mẫu vật nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia ñình

và bạn bè ñã giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt thời gian học tập

Bắc Ninh, tháng 9 năm 2013

Học viên

Vũ Văn ðại

MỤC LỤC

THỰC VẬT TRONG CÔNG TÁC NHÂN GIỐNG CÂY

2.1.1 Vật liệu thực vật 14

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo cụm chồi chuối Tiêu

3.2.2 Ảnh hưởng của kinetin lên sự phát sinh chồi và tạo cụm chồi ở

3.3.1 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng α-NAA ñến sự phát

3.3.2 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IAA ñến sự phát sinh

3.3.3 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IBA ñến sự hình

3.4 Ảnh hưởng của tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thuộc

nhóm cytokinin và auxin ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu

3.4.1 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và

3.4.2 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IAA

3.4.3 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IBA

3.4.4 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và

3.4.5 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IAA

3.4.6 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IBA

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

α-NAA ABA BAP IAA IBA

Benzylamino purine Axit indol axetic Axit indol butyric Knudson C

Murashige and Skoog Robert Ernst

Vacin and Went

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỞ ðẦU

1 ðẶT VẤN ðỀ

Công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật ñã trải qua hơn một trăm năm hình thành và phát triển, ñem lại giá trị to lớn cho loài người Hiện nay, hầu hết các cơ sở nghiên cứu giống cây trồng trên thế giới ñều áp dụng công nghệ này với các mục ñích khác nhau

Ở Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật ñã ñược bắt ñầu nghiên cứu và ứng dụng từ giữa những năm 70 của thế kỷ XX Những kết quả bước ñầu trong nghiên cứu và ứng dụng ñã ñạt kết quả khả quan ñối với một

số ñối tượng cây trồng như khoai tây, mía, lúa…, ñặc biệt là chuối

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt ñới gió mùa, nóng ẩm mưa nhiều, là ñiều kiện lý tưởng cho sự sinh trưởng và phát triển của chuối Chuối như một loại cây quan trọng trong chuyển dịch cơ cấu cây trồng trong nông nghiệp ven

ñô Trong thế giới các loài chuối, chuối Tiêu Hồng ñược ưa chuộng hơn cả Chuối Tiêu Hồng có màu sắc ñẹp, ñộ chín của quả ñồng ñều Ngoài giá trị dinh dưỡng, chuối còn có ý nghĩa lớn trong nền kinh tế quốc dân Giống chuối này từ lâu ñã ñược con người thuần hoá, sưu tầm ñể tạo ra giống như ý muốn phục vụ nhu cầu của con người Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, chuối Tiêu Hồng ñược nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô hiện ñại với hệ số nhân giống cao, sạch bệnh, cây cho thu hoạch ñồng loạt Hiện nay quy trình sản xuất cây giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật ñã ñược hoàn thiện bởi các Viện nghiên cứu như ( Viện Rau quả, Viện Di truyền Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ) Hàng năm các Viện ñã cung cấp rất nhiều cây giống ñến tay người sản xuất Tuy nhiên cây giống sản xuất bằng nuôi cấy mô thường ñắt ñỏ và ñể chủ ñộng cung cấp nguồn cây giống tại chỗ, theo yêu cầu thời vụ và sản xuất hàng hóa tập trung thì việc sản xuất cây giống

in vitro trực tiếp tại các tỉnh là lựa chọn tối ưu cả về kinh tế cũng như từng

bước nâng cao trình ñộ chuyên môn cho ñội ngũ kỹ thuật viên tại các tỉnh Hiện nay tại Bắc Ninh sau khi thực hiện chủ trương dừng sản xuất gạch thủ công mặt bằng bãi gồ ghề, phần lớn diện tích hiện vẫn bỏ hoang hóa tổng diện tích ñất bãi sản xuất nông nghiệp là 2400ha Do vậy việc ñưa vào trồng cây chuối Tiêu Hồng ñược nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào góp phần quan trọng vào việc khai thác tiềm năng về ñất ñai, lao ñộng ñể từng bước phát triển một nền sản xuất nông nghiệp hàng hóa có giá trị kinh tế cao trên cơ sở áp dụng những tiến bộ khoa học công nghệ tiên tiến Với mục tiêu

ñó thì Trung tâm Thông tin và Ứng Dụng tiến bộ khoa học công nghệ có

nhiệm vụ ñưa cây chuối nhân nhanh in vitro vào tại tỉnh nhằm hạ giá thành

cây giống và chủ ñộng cung cấp cây giống ñáp ứng nhu cầu sản xuất là cần thiết

Xuất phát từ yêu cầu ñó chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:

“Nghiên cứu nhân nhanh invitro cây chuối Tiêu Hồng (M.acuminata)”

trong ñiều kiện thực tế phòng thí nghiệm của ñịa phương nhằm nhân

nhanh giống chuối Tiêu Hồng sạch bệnh, góp phần nâng cao hiệu quả cho người trồng chuối và thúc ñẩy việc áp dụng tiến bộ khoa học công nghệ vào sản xuất nông nghiệp tỉnh Bắc Ninh

2 MỤC ðÍCH, YÊU CẦU CỦA ðỀ TÀI

2.1 Mục ñích

- Tìm ñược môi trường tối ưu trong nhân giống in vitro chuối Tiêu Hồng

- Tìm ñược giá thể thích hợp nhất ñể ñưa cây chuối Tiêu Hồng từ trong ống nghiệm ra môi trường tự nhiên

2.2 Yêu cầu

- Xác ñịnh ñược môi trường nuôi cấy tốt nhất

- Xác ñịnh ñược môi trường thích hợp cho việc nhân nhanh ñể cho hệ

số nhân cao và chất lượng tốt

- Xác ñịnh ñược môi trường thích hợp cho việc tạo rễ cho chồi và môi

trường thích hợp cho sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng

- Xác ñịnh ñược giá thể thích hợp cho cây con ngoài vườn ươm

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Các kết quả thu ñược sẽ làm cơ sở cho việc nghiên cứu và giảng dạy ñối với cây chuối Tiêu Hồng

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Là cơ sở cho việc ñề xuất ñược quy trình nhân giống in vitro và thích

ứng cho cây chuối Tiêu Hồng cho phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tại Bắc Ninh

- Góp phần bảo tồn, thúc ñẩy sản xuất cây chuối Tiêu Hồng như một nghề trồng chuối mang lại giá trị kinh tế tại Bắc Ninh và các vùng lân cận

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VÀI NÉT VỀ PHÂN LOẠI VÀ đẶC đIỂM CỦA CHUỐI

1.1.1 đặc ựiểm thực vật học của họ chuối

Họ chuối gồm 2 chi với 70 loài, trong ựó: chi Ensete gồm 10 loài, phân bố chủ yếu vùng Châu Phi; chi Musa gồm 60 loài phân bố ở các vùng nhiệt ựới [5] Cây chuối có nguồn gốc từ đông Nam Á, sau ựó ựược di thực sang Châu Úc rồi tới các nước Trung và Nam Mỹ Một số tác giả còn cho rằng từ đông Nam Á cây chuối ựược chuyển qua Madagasca vào lục ựịa Châu Phi, sau ựó tới các ựảo Canari và Santodomigo (Champion,1976) [4]

Rễ thẳng: mọc ở phía dưới củ chuối, ăn sâu tác dụng chủ yếu giữ cây ñứng vững Rễ chuối chứa nhiều nước, giòn, mềm, yếu, dễ gãy ; sức chịu hạn, chịu úng ñều kém so với nhiều loại cây ăn trái khác [7;22]

1.1.1.2.Thân thật

Thân thật hay còn ñược gọi là củ chuối, có hình tròn dẹt và ngăn, khi phát triển ñầy ñủ có thể rộng 30cm Phần bên ngoài xung quanh củ chuối ñược bao phủ bởi những vết sẹo từ bẹ lá có dạng tròn Ở ñáy mỗi bẹ lá ñều có một chồi mầm nhưng chỉ các chồi ở phần giữa củ là phát triển ñược, có khuynh hướng mọc trồi dần lên Các sẹo lá mọc rất gần nhau làm thành khoảng cách rất ngắn

Củ chuối sống lâu năm, là cơ quan chủ yếu dự trữ chất dinh dưỡng, ñồng thời là nơi ñể rễ, lá, mầm và cuống hoa mọc ra Do ñó củ chuối to mập là cơ sở ñảm bảo cho cây sinh trưởng nhanh, năng suất cao Xung quanh củ chuối có nhiều mầm ngủ, sau này sẽ phát triển thành cây con [22]

Lá chuối phát triển mạnh nhất từ tháng 5 ñến tháng 8, mỗi tháng mọc ra

3 - 4 lá, phiến lá to, dày, màu xanh ñậm và bóng Từ tháng 10 trở ñi, cách 2 -

3 tuần mới ra 1 lá mới, lá thường mỏng, nhỏ, màu xanh nhạt, sinh trưởng chậm ðến tháng 12 - 1 mỗi tháng chỉ mọc ñược 1 lá [22]

1.1.1.4.Hoa chuối

Cây chuối con sau khi mọc (hoặc sau khi trồng) 8 - 10 tháng bắt ñầu hình thành mầm hoa, sau ñó khoảng 1 tháng bắt ñầu trổ buồng Hoa chuối thuộc loại hoa chùm gồm 3 loại: hoa cái, hoa lưỡng tính và hoa ñực [22]

Hoa cái: tập trung ở phía gốc cuống buồng, phần này dài nhất (50 - 100

cm) Loại hoa này nở ra trước tiên, nhị cái phát triển, nhị ñực thoái hóa Chỉ

có hoa cái là phát triển thành trái ñược Do ñó, khi trồng, chọn lọc cây giống tốt, chăm bón kịp thời ñể hình thành nhiều hoa cái là nhân tố quan trọng bảo ñảm năng suất cao [22]

Hoa lưỡng tính: nằm ở phần giữa bắp chuối, loại hoa này không nhiều

lắm, về sau sẽ rụng và không hình thành trái ñược [22]

Hoa ñực: nằm ở phía ñầu bắp chuối, nhị cái thoái hóa, nhị ñực phát

triển, dài bằng nhị cái Loại hoa ñực không thể hình thành trái ñược sau này sẽ khô ñi và rụng dần [22]

1.1.2 ðặc ñiểm thực vật học của chi chuối Tiêu

Chuối tiêu thuộc loại cây thảo, sống lâu năm, thân cây tròn, mềm, thẳng, có bẹ lá Cuống hình tròn có khuyết rãnh, lá to, dài Trái nằm trên buồng, có từ 6-8 nải, mỗi nải khoảng 12 trái Trái nhỏ, dài, mùi thơm Khi chín, vỏ vẫn màu xanh nhưng khi chín mùi thì màu vàng Quả chuối có vị ngọt, tính rất lạnh (tính hàn), không ñộc

1.1.3 ðặc diểm thực vật học của chuối Tiêu Hồng

Giống chuối tiêu hồng thuộc nhóm phụ chuối tiêu vừa Thân giả màu hồng ñỏ, có những mảng ñen nâu lớn liên tục Lá ñứng, ñầu lá uốn cong, gân chính màu trắng sáng ở gốc có nhiều phấn trắng, ñuôi gân lá ít phấn

- Thân giả cao 2,2-2,6 m, ñường kính 17,9-18,3 cm

- Thời gian từ trồng ñến thu hoạch 10-11 tháng

- Buồng quả hình trụ có 9 nải, 168 quả Khối lượng buồng 20,4 kg

- Kích thước quả: dài 18,3 cm, ñường kính 3,9 cm

(http://kienthuctamnong.gov.vn)

1.2 ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NUƠI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CƠNG TÁC NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG

1.2.1 Các hướng nghiên cứu ứng dụng

Nhân giống in vitro là một trong những ứng dụng chính của cơng nghệ tế

bào thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm sinh trưởng hoặc các mơ phân sinh của cây Theo các cơng trình thí nghiệm của Amato (1977), chỉ cĩ đỉnh sinh trưởng của chồi mới đảm bảo sự ổn định về di truyền, tiếp đến là mơ phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt để làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống

Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng nhằm phục vụ cho các mục đích chính như: duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm, làm vật liệu cho cơng tác chọn giống; duy trì và nhân nhanh các cá thể đầu dịng để cung cấp hạt giống cho các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực cĩ củ, cây rau, cây cảnh ; nhân nhanh ở điều kiện vơ trùng cách ly tái nhiễm kết hợp với việc làm sạch bệnh virut, rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các cây tự nhiên cĩ đặc điểm tốt; bảo quản tốt tập đồn giống vơ tính về các lồi cây giao phấn trong ngân hàng gen [2], [19]

1.2.2 Ưu thế của nhân giống in vitro

Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất Từ một cây trong vịng 1-2 năm cĩ thể tạo thành hàng triệu cây Nhân được số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ, trong 1m2 cĩ thể để 18000 cây [19], [26]

Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng với nguồn bệnh, vì vậy đảm bảo giống sạch bệnh; thuận tiện trong vận chuyển và bảo quản (cây giống giữ

ở 40C trong hàng tháng vẫn cho tỷ lệ sống 95%) ðồng thời, cĩ thể sản xuất quanh năm mà khơng phụ thuộc vào mùa vụ, cĩ tiềm năng cơng nghiệp hố cao [26]

1.2.3 Các phương thức nhân giống in vitro

1.2.3.1 Nuôi cấy mô phân sinh hoặc ñỉnh sinh trưởng

Theo Lê Trần Bình (1997), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu vật nuôi cấy ñược tách từ ñỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của chóp ñỉnh sinh trưởng Tuy nhiên trong thực tế việc nuôi cấy mẫu vật như vậy rất khó thành công, người ta chỉ tiến hành nuôi cấy khi mục ñích là làm sạch virut cho cây trồng Nuôi cấy mô phân sinh hoặc ñỉnh sinh trưởng ñược tiến hành phổ biến nhất ở các ñối tượng chuối, phong lan, dứa, mía

Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc ñỉnh sinh trưởng cần chú ý tới tương quan giữa ñộ lớn chồi, tỷ lệ sống và mức ñộ ổn ñịnh về mặt di truyền của chồi, vì thông thường nếu ñộ lớn của chồi tăng thì tỷ lệ sống và mức ñộ

ổn ñịnh di truyền tăng nhưng hiệu quả kinh tế giảm và ngược lại Do vậy phải kết hợp giữa các yếu tố ñể tìm ra phương pháp lấy mẫu tối ưu Một ñỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở ñiều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi và các chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh có rễ ñầy ñủ Nếu xét về nguồn gốc các cây tái sinh từ nuôi cấy nguyên liệu ban ñầu là mô phân sinh hoặc ñỉnh sinh trưởng thì có ba khả năng: cây phát triển từ chồi ñỉnh (chồi ngọn); cây phát triển từ chồi nách phá ngủ; cây phát triển từ chồi mới phát sinh Tuy nhiên trong thực tế rất khó phân biệt ñược chồi phá ngủ

và chồi mới phát sinh [28]

Có 2 phương thức hình thành cây tái sinh từ nuôi cấy mô phân sinh hoặc ñỉnh sinh trưởng Cây tái sinh trực tiếp từ chồi ñỉnh hoặc chồi nách phá ngủ Phương thức này chủ yếu ở các ñối tượng 2 lá mầm như: khoai tây, thuốc lá, cam, chanh, hoa cúc, nhưng có cả cây 1 lá mầm như dứa sợi, mía cây tái sinh qua giai ñoạn hình thành dẻ hành (protocorm), chủ yếu gặp ở các ñối tượng một lá mầm như: phong lan, dứa, hoa huệ Gần ñây phương thức này cũng bắt ñầu ñược bắt ñầu ñược áp dụng có kết quả ở các cây ăn quả và cây lâm nghiệp, trong ñó có cây quý như cà phê, táo, lê, cây thông, bồ ñề Tổng

số có trên 30 chi khác nhau ñược nuôi cấy thành công [2]

1.2.3.2 Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây

Vì tế bào thực vật có tính toàn năng nên ngoài mô phân sinh và ñỉnh sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công, các bộ phận còn lại của cơ thể thực

vật ñều có thể thực hiện cho việc nhân giống in vitro ñược Các bộ phận ñó là:

ñoạn thân ở các ñối tượng như ở thuốc lá, cam, chanh, ; mảnh lá ở thuốc lá,

cà chua, bắp cải ; cuống lá ở Nacissus; các bộ phận của hoa như súp lơ, lúa

mì và nhánh củ ở hành tỏi [2]

1.2.4 Quy trình nhân giống in vitro

1.2.4.1 Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những ñặc tính và tính trạng

của cây mẹ ban ñầu nên trong giai ñoạn này cần chọn lọc cây mẹ cẩn thận, cây mẹ thường là cây có nhiều ñặc tính ưu việt, khoẻ, có giá trị kinh tế cao Sau ñó, chọn cơ quan ñể lấy mẫu thường là mô non, ñoạn thân có chồi ngủ, lá non hoặc hoa non Mô chọn ñể nuôi cấy thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sạch bệnh, giữ ñược các ñặc tính sinh học quý của cây mẹ, ít nguy cơ biến dị Tuỳ theo ñiều kiện, giai ñoạn này có thể kéo dài 3-6 tháng [19]

1.2.4.2 Thiết lập hệ thống cấy vô trùng

Là giai ñoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy ñể tạo nguyên liệu sạch bệnh cho nhân giống, giai ñoạn này ñược tiến hành theo các bước:

Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy

Cấy mẫu vật vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi trường

nhân tạo (giai ñoạn này là giai ñoạn cấy mẫu in vitro)

Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus sẽ ñược nuôi trong phòng nuôi cấy với ñiều kiện nhiệt ñộ ánh sáng phù hợp Sau một thời gian nhất ñịnh, từ mẫu nuôi cấy ñã bắt ñầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc các cơ quan hoặc các phôi vô tính Giai ñoạn này phụ thuộc vào từng ñối tượng ñem nhân giống, thông thường kéo dài từ 2-12 tháng hoặc ít nhất 4 lần cấy chuyển [19]

1.2.4.3 Nhân nhanh chồi

ðây là giai ñoạn sản xuất cây nhân giống quyết ñịnh hiệu quả của quá trình nuôi cấy mô, cây ñược nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy Khi mẫu cấy sạch ñã ñược tạo ra, từ ñó nhận ñược các cụm chồi và các phôi vô tính sinh trưởng tốt trong quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai ñoạn sản xuất Người ta cần tạo ra tốc ñộ nhân nhanh cao nhất trong ñiều kiện nuôi cấy Thành phần và ñiều kiện môi trường cần tối ưu hoá ñể tạo ñược mục tiêu nhân nhanh ðối với môi trường nhân chồi, người ta sử dụng các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin (BAP, kinetin) với nồng ñộ khác nhau tuỳ từng ñối tượng cây Quy trình cấy chuyển ñể nhân nhanh chồi thường trong khoảng 1-2 tháng tuỳ loài cây Tỷ lệ nhân nhanh khoảng 2-8 lần sau một lần cấy chuyển Nhìn chung giai ñoạn này thường kéo dài 10-36 tháng Giai ñoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban ñầu không nên kéo dài quá lâu ñể tránh sự hình thành biến dị sôma [19]

1.2.4.4 Tạo rễ (tạo cây hoàn chỉnh)

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát triển rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải cấy chuyển sang một môi trường khác

ñể kích thích tạo rễ ðối với môi trường tạo rễ, người ta thường sử dụng chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin như α-NAA, IAA, IBA Thông thường giai ñoạn này kéo dài 2-8 tuần tuỳ ñối tượng Khi cây có ñủ các bộ phận thân, lá, rễ với kích thích nhất ñịnh ñảm bảo cho sinh trưởng, phát triển bình thường ngoài tự nhiên, người ta mới tiến hành giai ñoạn tiếp theo là ñưa cây ra ngoài môi trường tự nhiên [19]

1.2.4.5 Chuyển cây ra ñất trồng

ðây là giai ñoạn ñầu cây ñược chuyển từ ñiều kiện vô trùng trong ống nghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên Giai ñoạn này quyết ñịnh khả năng ứng

dụng của quy trình nhân giống in vitro ða số các loài cây trồng chỉ sau khi

chồi ñã ra rễ tạo thành cây hoàn chỉnh với kích thước nhất ñịnh mới ñược

huấn luyện và chuyển ra ngoài vườn ươm Cây nuôi cấy in vitro ñược sinh

trưởng và phát triển trong những ñiều kiện tối ưu về nhiệt ñộ, ñộ ẩm, pH, dinh dưỡng Vì vậy, trước khi ñưa ra trồng, người ta cần huấn luyện cây ñể thích nghi với ñiều kiện tự nhiên Quá trình thích nghi với ñiều kiện bên ngoài của cây ở giai ñoạn ñầu yêu cầu cần ñược chăm sóc ñặc biệt Vì vậy, cây ñược chuyển từ môi trường từ bão hoà hơi nước sang vườn ươm với những ñiều kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần phải ñáp ứng các yêu cầu: che cây non bằng nilon và có hệ thống phun sương cung cấp ñộ ẩm và làm mát cây; giá thể trồng cây có thể là ñất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa ñất, mùn cưa và bọt biển Giai ñoạn này ñòi hỏi 4-16 tuần [19]

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CHUỐI BẰNG KỸ

THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

1.3.1 Các nghiên cứu trong nước

Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật không chỉ ñược sử dụng trong nghiên cứu mà còn ñược áp dụng rộng rãi vào thực tiễn chọn giống, không chỉ ở cây ngũ cốc mà còn ở cây rau, hoa cây cảnh và cây ăn quả

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật phục vụ nhân giống cây trồng ñã triển khai trên 20 năm ở nước ta Nhân giống thương mại quy mô lớn ñã ñạt ñược ở một số cây trồng như nhân nhanh chuối, nhân nhanh khoai tây sạch bệnh, nhân nhanh các giống mía nhập nội… Quy trình công nghệ nhân nhanh giống chuối và giống mía ñã ñược Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn công nhận và áp dụng [2]

Các nghiên cứu về nhân giống chuối trước ñây chỉ chú trọng các biện pháp kỹ thuật nhân bằng củ và tách chồi Những kỹ thuật này hiện còn ñược

áp dụng khá phổ biến ở nhiều vùng miền và nhất là ở quy mô sản xuất nhỏ

Kỹ thuật nhân giống vô tính chuối bằng phương pháp in vitro ở nước ta cũng thu ñược một số kết quả sau:

ðoàn Thị Ái Thuyền và cộng sự (1993) ñã ñưa ra quy trình nhân giống

chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô bao gồm 5 công ñoạn chính sau: ñưa mẫu vào nuôi cấy → tạo và nhân nhanh chồi chuối → tạo rễ cây → ươm chuối trong vườn ươm → bầu chuối và trồng ra ruộng sản xuất Và cũng cho biết cây chuối nuôi cấy mô ở vườn ươm 60 - 70 ngày (luống ươm 30 - 40 ngày và bầu ñất 30 ngày) thì ñược xuất vườn, khi ñó cây cao 40 - 50 cm [21]

Theo ðỗ Năng Vịnh và cộng sự (1994) cho biết tỷ lệ tái sinh dao ñộng

từ 68,42 - 92,31% do bị chi phối bởi bản chất di truyền của giống chuối và các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy Hệ số nhân của chuối Tiêu cao nhất khi bổ sung BAP từ 7 - 9 mg/lít Nước dừa không biểu hiện ảnh hưởng ñến chuối Tiêu nhưng có ảnh hưởng tốt tới hệ số nhân của chuối Rừng ở lượng 10%, khi có mặt BAP với lượng 7 mg/lít [26]

Theo Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (1995) cho biết hoàn toàn có thể sử dụng phương pháp in vitro ñể nhân nhanh cây chuối, vật liệu nuôi cấy tốt nhất cho mục ñích nhân nhanh là các mô chồi ñỉnh và chuối có thể sử dụng kỹ thuật bóc bẹ không cần khử trùng, môi trường thích hợp cho quá trình khởi ñộng phát sinh chồi ban ñầu là môi trường MS + (5 - 7) ppm BA, môi trường nhân nhanh tương tự như môi trường khởi ñộng nhưng sau nhiều lần cấy chuyển cần giảm hàm lượng BA thậm trí tới 0 ppm và có thể bổ sung nước dừa là 10% Còn môi trường ra rễ tốt nhất là MS + 0,2 g/lít than hoạt tính và cũng nhận xét việc ñưa cây chuối in vitro ra vườn ươm vụ hè thu là hoàn toàn thuận lợi, tỷ lệ sống ñạt 100% trên cả 3 giá thể nghiên cứu là: cát, ñất thịt nhẹ, ñất + cát + phân chuồng [17]

Theo ðỗ Năng Vịnh và Cộng sự (1995), cây chuối nuôi cấy mô cần ñưa ra luống giâm gồm 3 lớp: lớp dưới là ñất dày 5cm, lớp giữa là phân chuồng ải trộn với ñất cát pha tỷ lệ 1:1 dày 7cm, lớp trên cùng là cát vàng 5 -7 cm; mật ñộ giâm là 300 - 400 cây/m2; thời gian ở luống giâm là 30 ngày Sau

ñó, chuối ñược ñưa ra bầu ñất có kích thước 7 - 10 × 10 - 15 cm; thời gian ở bầu ñất từ 45 - 60 ngày, mùa ñông rét có thể lâu hơn Như vậy, tổng thời gian

ở vườn ươm là 2,5 - 3 tháng hoặc lâu hơn nữa Cũng có thể ñưa thẳng cây non

ra bầu ñất không qua luống giâm ðất ñóng bầu có thành phần: phân hữu cơ

vi sinh + cát + ñất phù sa hoặc ñất pha cát (tỷ lệ 1:1:1) là tốt nhất [26]

Theo Phạm Kim Thu và ðặng Thị Vân (1997), từ nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất cây giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô, Tác giả kết luận môi trường nuôi cấy chuối là MS (1962) có bổ sung 1 ppm Thiamin HCl

ñã làm tăng khả năng tái sinh chồi chuối, nền giá thể ra cây cho tỷ lệ sống cao nhất là 1/3 ñất + 1/3 phân hữu cơ + 1/3 cát ñen và thời vụ ra cây thích hợp từ thánh 4 ñến tháng 10 Ứng dụng kết quả này ñã sản xuất ñược hàng triệu cây giống cung cấp cho các tỉnh phía Bắc (Nam ðịnh, Thái Bình…)

1.3.2 Các nghiên cứu của nước ngoài

Chuối là ñối tượng cây ăn quả có hình thức sinh sản vô tính với phương thức nhân giống truyền thống là sử dụng chồi nách làm giống trồng những thế hệ kế tiếp.Vì vậy, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào nhân giống chuối

ñã ñược nghiên cứu, ứng dụng từ rất lâu nhiều nước trên thế giới như Malayxia, Asutralia, Pháp, Trung Quốc… và ñã góp 1 phần ñáng kể phục vụ ngành sản xuất chuối xuất khẩu

Theo Reuveni (1986), kỹ thuật nuôi cấy in vitro chuối có một số ưu

ñiểm sau :

- Nhân ñược số lượng lớn giống như cây trồng ban ñầu ñã xác ñịnh tính trạng

- Chất lượng cây giống hoàn toàn sạch bệnh, tránh ñược những sâu hại gây ra qua nguồn ñất (tuyến trùng) vì vậy tiết kiệm ñược chi phí hóa chất do sử lý ñất

- Cây nuôi cấy mô có thể trồng một vụ với mức ñộ thâm canh cao, thời gian sinh trưởng ngắn, có ñiều khiển ñược thời gian thu hoạch

- Tỷ lệ cây sống cao trên ñiều kiện ñồng ruộng (>98%), khả năng sinh trưởng nhanh hơn cây có nguồn gốc từ chồi nách

- Cây giống in vitro phát triển ñồng ñều, ra hoa ñồng loạt và thời gian

thu hoạch ngắn

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU, ðỊA ðIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Các chất kích thích sinh trưởng, ñường saccarose, agar, nước dừa, vv

Nuôi cấy ñược tiến hành trên nền môi trường MS, B5 và môi trường

Phytamax (Bảng thành phần môi trường theo phụ lục 01ñính kèm)

* Dụng cụ

Bình tam giác, pipet, cốc thủy tinh ñịnh mức

Bông, giấy làm nút, giấy thấm

Bình tam giác 250ml

Bộ ñồ cấy gồm: dao cấy, que cấy, ñĩa cấy…

Buồng cấy vô trùng (Biological Safety Cabinets) của hãng Nuarie, Mỹ Nồi khử trùng (Auto Clave) của hãng ToMy, Nhật bản

Bình phun ñể tưới cây

Panh, kéo, chậu nhựa, rổ nhựa, giá thể trồng cây…

2.1.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

2.1.2.1 ðịa ñiểm

Các nội dung nghiên cứu ñược tiến hành tại phòng thí nghiệm nuôi cấy

mô và vườn thực nghiệm Sở Khoa học & Công nghệ Bắc Ninh

2.2.2.2 Thời gian: Từ 01/06/2012 ñến 03/2013

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường cơ bản MS, B5 và Phytamax

ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin ñến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin ñến phát sinh rễ và tạo cây hoàn chỉnh

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin và nhóm cytokinin lên sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng

- Nghiên cứu tìm ra loại giá thể thích hợp nhất cho ra cây chuối Tiêu Hồng (ñất, cát, trấu hun …)

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm ñược bố trí một cách ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc 30 bình, mỗi bình 5 mẫu

2.3.2 Phương pháp pha môi trường và nuôi cấy

2.3.1.1 Pha môi trường nuôi cấy

Pha môi trường ñặc với thành phần và nồng ñộ các chất phù hợp Môi trường có ñầy ñủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin… Tất cả các hóa chất phải ñược tan ñều, không kết tủa Môi trường có bổ sung chất ñộn là thạch làm giá ñỡ không quá rắn hay quá mềm ñể khi cấy mẫu vật ñược dễ dàng Khử trùng môi trường theo phương pháp Pasteur

2.3.1.2 Phương pháp nuôi cấy

Trước khi tiến hành nuôi cấy, cần khử trùng box cấy bằng ñèn UV trong thời gian 30-60 phút, khử trùng bộ cấy bằng cách ñốt trên ngọn lửa ñèn cồn, sau ñó ñể nguội

Cụm chồi chuối ñược lấy từ bình giống ra, tách thành từng cụm nhỏ các cụm chồi này ñược cấy vào môi trường nhân giống Bố trí thí nghiệm với các công thức môi trường tùy từng mục ñích nghiên cứu Bình nuôi cấy ñược ñặt trong nhà nuôi cấy với cường ñộ ánh sáng 2000lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt ñộ 25-270C

2.3.2 Phương pháp ra cây

Khi cây con có bộ rễ khỏe, lá xanh tốt ñược tiến hành huấn luyện ñưa cây trồng ngoài tự nhiên bằng cách ñể các bình cây ra nơi có ánh sáng khuếch tán 2-3 ngày trước khi ñưa cây ra khỏi bình

Khả năng sống của cây khi chuyển từ trong ống nghiệm ra vườn ươm

quyết ñịnh hiệu quả kinh tế của phương pháp nhân giống in vitro Do ñó, một

quy trình ra cây ñạt hiệu quả cao có ý nghĩa rất lớn

2.3.2.1 ðưa cây ra ngoài môi trường

Các bình cây ñược mở nút, cho nước vào ngâm 10-15 phút, sau ñó lắc nhẹ cho thạch rời ra khỏi cây, dùng panh nhẹ nhàng gắp cây ra khỏi bình, cố gắng ñể cây ñược nguyên vẹn không bị dập nát

Ngâm cây trong chậu nước sạch, sau ñó rửa dưới vòi nước chảy cho hết thạch bám vào bộ rễ của cây

Những cây ñủ tiêu chuẩn ñược trồng trên giá thể ñất, cát, trấu hun, ñất + trấu hun (1:1), cát + trấu hun (1:1), ñất + cát + trấu hun (1:1:1)

Sau khi trồng, phun nước nhẹ nhàng cho chặt gốc cây

2.3.2.2 Chăm sóc cây con

Trong 2-3 ngày ñầu tưới nước lã bằng cách phun sương 3 giờ/lần Trời rét, khô hanh phải che nilon tránh rét và tránh thoát nước nhanh Nilon che phải ñục ra một số lỗ thủng cho thoáng khí Sau 3 ngày có thể bỏ nilon che, ñể cây ra nơi ñủ ánh sáng, thoáng khí nhưng không gió, tránh nắng mưa trực tiếp Tưới nước bằng bình phun 2-3 lần/ngày Sau 3-4 tuần cây sống ra rễ mới, lá mới là có thể ñưa ra vườn ươm

Công thức ảnh hưởng của môi trường ñến sự phát sinh chồi và cụm chồi

Công thức Môi trường

Các thí nghiệm ñược tiến hành nuôi cấy trên môi trường tốt nhất ở thí nghiệm 1 có bổ sung ,6,5g agar + 30g ñường + 100ml nước dừa sau ñó bổ sung riêng rẽ hoặc kết hợp các chất ñiều tiết sinh trưởng ở các nồng ñộ khác nhau theo các công thức thí nghiệm

2.3.3.2.1 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi

và tạo cụm chồi ở chuối Tiêu Hồng

- Môi trường nền: Môi trường tốt nhất ở nội dung 1, bổ sung saccharose 30g/l + agar 6,5g/l + nước dừa 100ml/l, pH môi trường ~ 5,8, bổ sung BAP theo bảng sau

Công thức ảnh hưởng của BAP ñến sự phát sinh chồi và tạo cụm chồi ở

chuối Tiêu Hồng Công thức Nồng ñộ BAP (mg/l)

2.3.3.2.2 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi

và tạo cụm chồi ở chuối Tiêu Hồng

- Môi trường nền: Môi trường tốt nhất ở nội dung 1, bổ sung saccharose 30g/l + agar 6,5g/l + nước dừa 100ml/l, pH môi trường ~ 5,8, bổ sung BAP theo bảng sau

Công thức ảnh hưởng của kinetin ñến sự phát sinh chồi và tạo cụm chồi ở

chuối Tiêu Hồng Công thức Nồng ñộ kinetin (mg/l)

2.3.3.3.1 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và α-NAA ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng

- Môi trường nền: Môi trường tốt nhất ở nội dung 1, bổ sung saccharose 30g/l + agar 6,5g/l + nước dừa 100ml/l, pH môi trường ~ 5,8, bổ sung BAP và NAA theo bảng sau

Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và α-NAA tới sự

sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng

Công thức Nồng nhóm BAP (mg/l) Nồng ñộ NAA (mg/l)

B là nồng ñộ BAP tốt nhất ở thí nghiệm nội dung 2

2.3.3.3.2 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IAA ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng

- Môi trường nền: Môi trường tốt nhất ở nội dung 1, bổ sung saccharose 30g/l + agar 6,5g/l + nước dừa 100ml/l, pH môi trường ~ 5,8, bổ sung BAP và IAA theo bảng sau

Công thức Nồng nhóm BAP (mg/l) Nồng ñộ IAA (mg/l)

B là nồng ñộ BAP tốt nhất ở thí nghiệm nội dung 2

2.3.3.3.3 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IBA ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng

- Môi trường nền: Môi trường tốt nhất ở nội dung 1, bổ sung saccharose 30g/l + agar 6,5g/l + nước dừa 100ml/l, pH môi trường ~ 5,8, bổ sung BAP và IBA theo bảng sau

Công thức Nồng nhóm BAP (mg/l) Nồng ñộ IBA (mg/l)

2.3.3.3.4.Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng Kinetin và α-NAA ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng

- Môi trường nền: Môi trường tốt nhất ở nội dung 1, bổ sung saccharose 30g/l + agar 6,5g/l + nước dừa 100ml/l, pH môi trường ~ 5,8, bổ sung kinetin

và NAA theo bảng sau

Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và α-NAA tới

sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng

Công thức Nồng ñộ kinetin (mg/l) Nồng ñộ NAA (mg/l)

B là nồng ñộ Kinetin tốt nhất ở thí nghiệm nội dung 2

2.3.3.3.5 Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IAA ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng

- Môi trường nền: Môi trường tốt nhất ở nội dung 1, bổ sung saccharose 30g/l + agar 6,5g/l + nước dừa 100ml/l, pH môi trường ~ 5,8, bổ sung kinetin

và IAA theo bảng sau

Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IAA tới sự

sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng

Công thức Nồng ñộ kinetin (mg/l) Nồng ñộ IAA (mg/l)

2.3.3.3.6.Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IBA ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng

- Môi trường nền: Môi trường tốt nhất ở nội dung 1, bổ sung saccharose 30g/l + agar 6,5g/l + nước dừa 100ml/l, pH môi trường ~ 5,8, bổ sung BAP và IBA theo bảng sau

Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IBA tới sự

sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng

Công thức Nồng ñộ kinetin (mg/l) Nồng ñộ IBA (mg/l)

B là nồng ñộ kinetin tốt nhất ở thí nghiệm nội dung 2

2.3.3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin ñến phát sinh rễ và tạo cây hoàn chỉnh

2.3.3.4.1 Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng α-NAA ñến sự phát sinh rễ của chuối Tiêu Hồng

- Môi trường nền: Môi trường tốt nhất ở nội dung 1, bổ sung saccharose 30g/l + agar 6,5g/l + nước dừa 100ml/l, pH môi trường ~ 5,8, bổ sung NAA

2.3.3.4.2 Thí nghiệm 11: Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IAA ñến

sự phát sinh rễ của chuối Tiêu Hồng

- Môi trường nền: Môi trường tốt nhất ở nội dung 1, bổ sung saccharose 30g/l + agar 6,5g/l + nước dừa 100ml/l, pH môi trường ~ 5,8, bổ sung IAA

2.3.3.4.3 Thí nghiệm 12: Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IBA ñến

sự phát sinh rễ của chuối Tiêu Hồng

- Môi trường nền: Môi trường tốt nhất ở nội dung 1, bổ sung saccharose 30g/l + agar 6,5g/l + nước dừa 100ml/l, pH môi trường ~ 5,8, bổ sung IBA

cây trồng ngoài tự nhiên bằng cách ñể các bình cây ra nơi có ánh sáng khuếch tán 2-3 ngày trước khi ñưa cây ra khỏi bình

Sau ñó cây nuôi cấy mô ñược trồng trên giá thể ñất, cát, trấu hun … theo bảng sau:

Các ño ñếm trong phòng thí nghiệm:

- Số lượng chồi ban ñầu, số lượng chồi thu ñược

- Chiều cao trung bình của chồi

- Số rễ trung bình chồi

2.3.4.2 Các chỉ tiêu theo dõi và tính toán

∑ Chồi thu ñược + Hệ số nhân chồi (lần) =

∑ Chồi ban ñầu

∑ Chiều cao chồi + Chiều cao trung bình của chồi(cm) =

∑ Số chồi ∑ Số rễ thu ñược + Số rễ trung bình chồi =

∑ Số chồi thu ñược ∑ chiều dài rễ thu ñược + Chiều dài trung bình rễ =

∑ Số rễ thu ñược

+ Sinh trưởng kém (+): Các cụm chồi phát triển không ñồng ñều,chồi gầy

2.3.5 Phương pháp tính toán kết quả

Sau khi tiến hành nuôi cấy và thu thập số liệu, số liệu thu ñược sẽ ñược tính toán trên phần mềm Excel chương trình thống kê sinh học IRRISTAT 4.0

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 So sánh ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy MS, B5 và Phytamax tới

sự phát sinh chồi và tạo cụm chồi chuối Tiêu Hồng

Môi trường là ñiều kiện tối cần thiết, là yếu tố cho sự phân hóa tế bào

và cơ quan trong nuôi cấy từ ñó quyết ñịnh ñến số lượng và chất lượng chồi Mỗi một loại vật liệu khác nhau có những ñòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường Môi trường có chứa thành phần và hàm lượng dinh dưỡng khác nhau tạo nên hiệu quả nuôi cấy khác nhau lên quá trình tạo chồi và cụm chồi

Có nhiều công trình nghiên cứu mô chuối của một số tác giả như: Ma và Shii (1972), Kawit – Wanichkul và công sự (1993), ðỗ Năng Vịnh và Cộng sự (1995), Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (1995), Phạm Kim Thu và ðặng Thị Vân (1997) ñều sử dụng môi trường MS ñể nuôi cấy mô cây chuối Tuy nhiên nghiên cứu môi trường nuôi cấy cây chuối Tiêu Hồng thì rất ít tác giả nghiên cứu Do ñó ñể nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường ñến sự hình thành chồi và cụm chồi trong nuôi cấy mô cây chuối Tiêu Hồng chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 3 loại môi trường: MS cơ bản, B5 và Phytamax bổ sung saccharose 30g/l + agar 6,5g/l + nước dừa 100ml/l , pH môi trường ~ 5,8 nhằm tìm ra môi trường tối ưu cho sự phát sinh chồi chuối Tiêu Hồng, với mỗi công thức 30 mẫu, 3 lần nhắc lại Kết quả thu ñược sau 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần nuôi cấy tổng hợp thể hiện qua bảng 3.1

Bảng 3.1 So sánh ảnh hưởng của môi trường MS, B5 và Phytamax tới sự

phát sinh chồi và tạo cụm chồi ở chuối Tiêu Hồng

Sau 3 tuần

Kết quả bảng số liệu 3.1 cho thấy, trên cả 3 loại môi trường mà chúng tôi tiến hành thí nghiệm ñều phát sinh chồi và cụm chồi nhưng các môi trường khác nhau thì tỷ lệ tạo chồi và cụm chồi khác nhau Ảnh hưởng của môi trường MS tới sự phát sinh chồi và tạo cụm chồi của chuối Tiêu hồng cao hơn

so với môi trường Phytamax và môi trường B5 Cụ thể, ở môi trường MS, tỷ

lệ mô sống, tỷ lệ mô tạo chồi và tỷ lệ mô tạo cụm chồi sau 3 tuần lần lượt ñạt 80,63%; 34,44%; 28,89% Các chỉ tiêu so sánh trên ở môi trường Phytamax thấp hơn so với mẫu nuôi cấy trên môi trường MS sau 3 tuần (sau 3 tuần lần lượt ñạt 61,48%; 31,85%; 24,04%) và môi trường B5 (sau 3 tuần lần lượt ñạt 58,52%; 29,26%; 19,35%) Theo các nhà khoa học môi trường Phytamax và môi trường B5 thích hợp cho loài phong lan, còn môi trường MS ñược sử dụng rộng rãi hơn cả và thích ứng rộng cho nhiều loại cây nuôi vấy invitro Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy tính ưu việt của môi trường

MS trong nuôi cấy mô cây chuối Tiêu Hồng tạo chồi và cụm chồi Do vậy, qua nghiên cứu và quan sát kết quả, chúng tôi sử dụng môi trường MS, bổ sung saccharose 30g/l + agar 6,5g/l + nước dừa 100ml/l cho các nghiên cứu tiếp theo

Kết quả trên cũng trùng lặp với nhận xét của Nguyễn Thị Liễu và cộng

sự (2011) khi cho rằng: mặc dù có rất nhiều công thức môi trường nuôi cấy khác nhau dùng ñể nuôi cấy các loài thực vật khác nhau nhưng công thức pha môi trường MS ñược sử dụng nhiều nhất, thường chỉ thay ñổi các thành phần khoáng ña lượng

A B C

Hình 3.1 So sánh ảnh hưởng của môi trường MS, Phytamax và B5 tới sự

phát sinh chồi và tạo cụm chồi chuối Tiêu Hồng

A Mô chuối sau 3 tuần

sử dụng chất ñiều hòa sinh trưởng khác nhau Mục tiêu của nghiên cứu là tìm

ra môi trường tốt nhất và các chất ñiều tiết sinh trưởng bổ sung vào hợp lý nhất ñể thu ñược số lượng và chất lượng chồi tốt nhất Vì vậy chúng tôi làm thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng ñến sự phát sinh chồi và cụm chồi Chất ñiều tiết sinh trưởng bổ sung vào là BAP Chất này thuộc nhóm cytokinin, là nhóm ñược sử dụng rộng rãi nhất trong kỹ thuật

nuôi cấy mô hiện nay Tác dụng chủ yếu của BAP là kích thích sự phân chia

tế bào, thúc ñẩy sự hoạt ñộng của chồi Nồng ñộ sử dụng khác nhau tuỳ ñối tượng thực vật nuôi cấy

Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, BAP thường ñược sử dụng với nồng ñộ thay ñổi từ 1 - 5mg/l là thích hợp cho nhiều loại mô cấy Ở các nồng ñộ cao hơn hoặc thấp hơn ñều biểu hiện hiệu quả kích thích kém, dẫn ñến sự tạo chồi và sinh trưởng của chồi giảm Với nồng ñộ BAP cao

sẽ hoạt hóa sự hình thành chồi bất ñịnh [21] Dựa trên nghiên cứu của một

số tác giả trên ñối tượng khác nhau như: nuôi cấy mô phân sinh giống lan [29], nuôi cấy mô phân sinh giống chuối Laba [25], chúng tôi tiến hành

nghiên cứu thăm dò ñể tìm ra môi trường tối ưu cho sự phát sinh chồi và cụm chồi của chuối Tiêu hồng bằng cách sử dụng môi trường ñối chứng không có các chất kích thích sinh trưởng (môi trường MS + saccharose 30g/l + nước dừa 100ml/l + agar 6,5g/l) và môi trường có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng ở các nồng ñộ khác nhau (bổ sung BAP ở các nồng ñộ từ 1,0mg/l ñến 9,0mg/l) Thí nghiệm ñược tiến hành với 3 lần nhắc lại, mỗi công thức 30 mẫu Theo dõi sau 1, 2, 3 tuần nuôi cấy, quan sát và ghi nhận ñược kết quả qua bảng số liệu 3.2

Từ kết quả bảng 3.2 chúng tôi thấy sau 3 tuần nuôi cấy tất cả các công thức ñều phát sinh chồi khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các nồng ñộ BAP khác nhau thì khả năng phát sinh chồi có sự khác nhau Ở môi trường ñối chứng sau 3 tuần, tỷ lệ mô tạo chồi ñạt 31,85% Môi trường nuôi cấy bổ sung BAP nồng ñộ 5mg/l cho hiệu quả cao nhất Sau 3 tuần nuôi cấy, tỷ lệ mô tạo chồi ñạt 58,89% Như vậy, sau 3 tuần nuôi cấy, tỷ lệ mô tạo chồi ở môi trường bổ sung BAP 5mg/l tăng lên 10.48%, còn môi trường ñối chứng chỉ tăng lên 1,85% Như vậy, tỷ lệ mô tạo chồi ở môi trường bổ sung BAP 5mg/l tăng 5,66 lần so với tỷ lệ mô tạo chồi của môi trường ñối chứng

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo cụm chồi

Tỷ lệ mô tạo chồi (%)

Số chồi/mô Chiều cao

chồi (cm)

Chất lượng chồi

Sau 3 tuần

ðC 0 31,85 1,67 3,08 + + CT1 1 40,00 3,62 2,56 + + CT2 3 41,48 3,85 2,72 + + CT3 5 58,89 4,58 1,49 + + + CT4 7 39,26 4,15 2,59 + + CT5 9 36,30 4,03 2,67 + +

LSD 0,35 0,19 0,12

Ghi chú: (++):Chồi phát bình thường

(+++):Chồi xanh, mập, phát triển cân ñối, lá to xanh ñậm

Ở môi trường ñối chứng tuy không bổ sung các chất kích thích sinh trưởng, song trong môi trường có bổ sung nước dừa Trong nước dừa có chứa các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin với nồng ñộ thấp nên sự phát sinh chồi và cụm chồi thấp Môi trường tối ưu có bổ sung BAP 5mg/l và có

sự cân ñối giữa các thành phần dinh dưỡng nên sự phát sinh chồi và cụm chồi cao

Do vậy, ñể ñạt hiệu quả cao trong các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi

bổ sung BAP với nồng ñộ 5mg/l vào môi trường nuôi cấy Kết quả trên cũng phù hợp với kết luận của Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (1995) khi nghiên cứu về ảnh hưởng của BAP tới sự sinh trưởng chuối Tác giả cho rằng, bổ sung 5 - 7mg/l BAP vào môi trường nuôi cấy cho hiệu quả sinh trưởng tốt