Nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro giống lan Dendrobium Sena Red 2

Hoa lan là một trong những giống hoa rất được yêu thích không chỉ về màu sắc, kiểu dáng mà còn mang một nét đẹp rất sang trọng và trang nhã. Chính vì vậy hiện nay rất nhiều hộ gia đình đang có thú chơi hoa lan. Nguyên nhân của trào lưu trên là do cuộc sống ngày càng phát triển, nhu cầu tạo góc vườn nhỏ, mang màu xanh cây lá thiên nhiên vào trong nhà của những người dân ngày càng cao. Với ưu điểm ít chiếm diện tích, không quá khó trồng, cho hoa đẹp lại lâu tàn nên việc chọn, trồng và tạo một vườn lan nhỏ trong khuôn viên nhà là sự lựa chọn của nhiều người.Bên cạnh đó, hoa lan là sản phẩm cây trồng có giá trị kinh tế cao, ngày càng có nhiều cơ sở kinh doanh hoa lan mọc lên, kinh doanh nhiều chủng loại. Nhưng làm sao để có số lượng lớn cây giống, đồng đều, chất lượng cao là một vấn đề khó 16. Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, ngành vi nhân giống cây đặc biệt trên đối tượng cây hoa lan từng bước phát triển, nhiều đơn vị nhà nước cũng như tư nhân đã mạnh dạn đầu tư để sản xuất cây giống phục vụ cho nông dân. Tuy nhiên qui mô cũng như những hạn chế về đội ngũ kỹ thuật cũng như kiến thức về lĩnh vực này có hạn về trang bị kỹ thuật hiện đại, vì thế cây giống có chất lượng thấp không đồng đều, không đáp ứng được nhu cầu của thị trường. Hầu hết các giống hoa lan phải nhập giống từ Thái Lan.Hiện nay, việc nghiên cứu và nhân giống hoa lan đã được tiến hành ở nhiều nơi, nhưng hầu hết đều chưa có thành tựu nào đột biến để ngành nhân giống hoa lan phát triển đáp ứng được nhu cầu của thị trường. Những thành công hiện nay thường là nhân giống với quy mô sản xuất nhỏ. Trong đó kỹ thuật nhân giống hoa lan phổ biến hiện nay là nhân giống trên môi trường thạch. Ngoài ra, hiện nay trên thế giới nhiều nước có ngành công nghệ sinh học phát triển đã ứng dụng các công nghệ cao để nhân nhanh giống cây trồng như: hệ thống fermenter, bioreactor, quang tự dưỡng,… Ở nước ta các công nghệ này mới chỉ thực hiện ở phòng thí nghiệm của một số trường Đại Học, Viện Nghiên cứu hoặc trung tâm công nghệ sinh học trong mấy năm gần đây. Tuy nhiên việc nghiên cứu xác định môi trường thích hợp cho từng cây trồng nhân bằng các hệ thống này còn rất hiếm. Để từng bước áp dụng công nghệ mới trong sản xuất cây lan giống ở nước ta, đẩy nhanh tiến độ sản xuất cây giống theo quy mô công nghiệp, góp phần khắc phục sự thiếu hụt cây giống trong sản xuất hiện nay. Chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro giống lan Dendrobium Sena Red’’ nhằm tìm ra môi trường thích hợp nhân giống lan Dendrobium Sena Red.

MỞ ĐẦU

Hoa lan là một trong những giống hoa rất được yêu thích không chỉ về màusắc, kiểu dáng mà còn mang một nét đẹp rất sang trọng và trang nhã Chính vìvậy hiện nay rất nhiều hộ gia đình đang có thú chơi hoa lan Nguyên nhân củatrào lưu trên là do cuộc sống ngày càng phát triển, nhu cầu tạo góc vườn nhỏ,mang màu xanh cây lá thiên nhiên vào trong nhà của những người dân ngày càngcao Với ưu điểm ít chiếm diện tích, không quá khó trồng, cho hoa đẹp lại lâu tànnên việc chọn, trồng và tạo một vườn lan nhỏ trong khuôn viên nhà là sự lựa chọncủa nhiều người

Bên cạnh đó, hoa lan là sản phẩm cây trồng có giá trị kinh tế cao, ngày càng

có nhiều cơ sở kinh doanh hoa lan mọc lên, kinh doanh nhiều chủng loại Nhưnglàm sao để có số lượng lớn cây giống, đồng đều, chất lượng cao là một vấn đềkhó [16]

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học,ngành vi nhân giống cây đặc biệt trên đối tượng cây hoa lan từng bước phát triển,nhiều đơn vị nhà nước cũng như tư nhân đã mạnh dạn đầu tư để sản xuất câygiống phục vụ cho nông dân Tuy nhiên qui mô cũng như những hạn chế về độingũ kỹ thuật cũng như kiến thức về lĩnh vực này có hạn về trang bị kỹ thuật hiệnđại, vì thế cây giống có chất lượng thấp không đồng đều, không đáp ứng đượcnhu cầu của thị trường Hầu hết các giống hoa lan phải nhập giống từ Thái Lan.Hiện nay, việc nghiên cứu và nhân giống hoa lan đã được tiến hành ở nhiềunơi, nhưng hầu hết đều chưa có thành tựu nào đột biến để ngành nhân giống hoalan phát triển đáp ứng được nhu cầu của thị trường Những thành công hiện naythường là nhân giống với quy mô sản xuất nhỏ Trong đó kỹ thuật nhân giống hoalan phổ biến hiện nay là nhân giống trên môi trường thạch

Ngoài ra, hiện nay trên thế giới nhiều nước có ngành công nghệ sinh họcphát triển đã ứng dụng các công nghệ cao để nhân nhanh giống cây trồng như: hệthống fermenter, bioreactor, quang tự dưỡng,… Ở nước ta các công nghệ này mới

chỉ thực hiện ở phòng thí nghiệm của một số trường Đại Học, Viện Nghiên cứuhoặc trung tâm công nghệ sinh học trong mấy năm gần đây Tuy nhiên việcnghiên cứu xác định môi trường thích hợp cho từng cây trồng nhân bằng các hệthống này còn rất hiếm

Để từng bước áp dụng công nghệ mới trong sản xuất cây lan giống ở nước ta,đẩy nhanh tiến độ sản xuất cây giống theo quy mô công nghiệp, góp phần khắcphục sự thiếu hụt cây giống trong sản xuất hiện nay Chúng tôi tiến hành đề tài:

"Nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro giống lan Dendrobium Sena Red’’

nhằm tìm ra môi trường thích hợp nhân giống lan Dendrobium Sena Red.

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về lan Dendrobium

Hoa lan là những loài thực vật rất đặc biệt, chúng đại diện cho họ thực vật

tiến hoá nhất trong các họ thực vật một lá mầm, ước tính họ lan Orchidaceae có

khoảng 750 chi và 15.000 – 25.000 loài [17]

Trong đó giống lan này được đặt tên vào năm 1799 chữ Dendrobium có nguồn gốc của chữ Hy Lạp Dendro có nghĩa là cây gỗ, cây lớn; bio là sự sống, vì tất cả các loại Dendrobium đều là phụ sinh sống bám trên cây gỗ [5].

Dendrobium rất phong phú về chủng loại lớn nhất nhì chủng lan với khoảng

1.600 loài phân bố trên các vùng thuộc Châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều ở ĐôngNam Á và Châu Úc [5]

Điều kiện sinh thái của Dendrobium cũng rất đa dạng có nhiều loại chỉ mọc

và ra hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài ở vùng trung gian có loàithích nghi bất kỳ loại nào [5]

1.2 Phân loại lan Dendrobium

* Cây lan Dendrobium có thể chia thành hai nhóm sau

- Nhóm đơn thân: đây là nhóm chỉ tăng trưởng về chiều cao làm cho cây dài

ra mãi, được chia làm hai nhóm phụ [5]

+ Nhóm phụ lá mộc đối (Sarcanthinae) nhóm này lá được xếp thành hai

hành mọc đối nhau, lá trên xen kẻ với lá của hàng kia Gồm các giống như:

Vanda, Aerides, Phalaenopsis [5].

+ Nhóm phụ lá mộc thẳng dẹp hay tròn (Campylocentrinae): Papilionanthe, Luisia [3].

- Nhóm đa thân: đây là những cây tăng trưởng liên tục và căn cứ vào cách rahoa nhóm này chia thành hai nhóm phụ:

+ Nhóm ra hoa phía trên như: Cymbidium, Dendrobium Oncidium [5] + Nhóm ra hoa ở đỉnh: Catteya, Laelia, Epidendrum [5].

- Ngoài ra còn có một số giống mang tính chất trung gian như:

Centropetatum, Phachyphllum, Dichaea [5]

1.3 Đặc điểm hình thái

1.3.1 Hình dạng

Dendrobium là loại đa thân và nhiều giả hành, các giả hành thường mang

một thân và nhiều lá mọc xen kẽ, trên thân có nhiều mắt ngủ Căn hành với

khoảng cách giữa các mắt ngắn hơn Cattleya Hoa có thể mọc từ thân thành từng

chùm hay từng hoa cô độc, hoa có màu trắng và từ vàng đến tím Thường lá đàisau nằm một mình, hai lá đài bên dài ra dính lại với nhau ở mép và dính vào đáytrụ tạo thành một phần dưới chân của trụ phía dưới gọi là cằm Môi gắn vào cằm,đôi khi kéo dài về phía tạo thành cựa, móc hay túi Một nguyên hay có thuỳ, gai,sóc có long hay không, hai cánh hoa bên giống như hai đài [5]

Dendrobium được chia làm hai nhóm theo dạng thân của chúng:

- Dạng thòng hay Nobile là dạng thân mền thường ở vùng hơi lạnh như Đà

Lạt

- Dạng đứng hay Phalaenopsis là dạng thân cứng thường sống ở vùng khí

hậu nống hơn

Dendrobium Nobile và Dendrobium Phalaenopsis đều có chung đặc điểm

trong việc tạo lập các giả hành mới và trong sự biệt hoá chồi sơ khởi ở nách ládọc theo giả hành, nhưng chúng khác biệt trong việc tạo chôi và hoa [5]

- Ở Dendrobium Nobile ra hoa từ chồi sơ khởi của giả hành đã trưởng thành,

như Long Tu giả hành ra hoa khi đã rụng hết lá [5]

- Ở Dendrobium Phalaenopsis thì hoa mọc ở giả hành cũ lẫn giả hành mới.

Ở giá hành mới, chồi non nhất ở ngọn là chồi đầu tiên phát triển thành vòi hoa

Hình dạng Dendrobium rất biến thiên:

- Nhóm có giả hành rất dài và mang lá dọc theo chiều dài giả hành ấy,

thường rụng hết lá khi ra hoa như Long Tu (Dendrobium primulinum), Ý thảo (Dendrobium gratia sisimum) [5].

- Nhóm giả hành to ngắn, tận cùng thường có 2-3 lá dài, bền và không rụng.Phát hoa tập trung ở phần này tạo thành chùm đứng hay thòng như Thuỷ Tiên

Trắng (Dendrobium farmeri), Thuỷ Tiên vàng ( Dendrobium thyrisflorum), Vảy

cá (Dendrobium lindleyi) [5]

- Nhóm giả hành mảnh mai, dài hay ngắn có lá dọc theo chiều dài củachúng, dai bền không rụng, hoa thường cô độc ở nách như Hương Duyên

(Dendrobium revolitum)

Ngoài ra, còn một số Dendrobium được trồng phổ biến như sau:

- Kim điệp (Dendrobium chysotosum var delacuorii): Hoa vàng tươi môi

vàng đậm dưới trung tâm đậm

- Nhất điểm hồng (Dendrobium dracoins): Hoa trắng bóng như sáp với môi

sọc đỏ ở đáy

- Thạch hộc (Dendrobium crumenatum): Hoa trắng môi có bớt vàng thơm

nhưng mau tàn, ít hoa nhưng nở rộ cùng lúc

- Giả hạc (Dendrobium anosmum, Dendrobium superbum): Hoa màu hường

có hai bớt đậm hay tuyền và rất thơm

- Dendrobium draconis (Hoàng thảo nhất điểm hồng).

- Dendrobium hercoglossum (Hoàng thảo tím huế).

- Dendrobium heterocrrpun (Hoàng thảo nhất điểm hoàng).

- Dendrobium (Hoàng thảo dẹt).

- Dendrobium parciflorum (Hoàng thảo xương cá).

- Dendrobium parisshii (Hoàng thảo tím hồng).

- Dendrobium parishii (Hoàng thảo hạc vĩ).

- Dendrobium primulim (Hoàng thảo long tu).

1.3.2 Cơ quan dinh dưỡng

* Giả hành (thân giả) : Giả hành là những đoạn phình to, bên trong có các

mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng đểnuôi cây trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao Ngoài ra, giả hànhcòn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được Hình dạng và kích thước của giảhành rất đa dạng: hình cầu, thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạo thànhthân giả có lá mọc xen kẽ Một số loài ở xứ lạnh chỉ có nhiện vụ dự trữ chất dinhdưỡng nên giả hành không có màu xanh nhưng phía trên có mang lá [3]

* Thân: Dendrobium thuộc nhóm đa thân (còn gọi là nhóm hợp trục) có hệ

thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá thể hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ

Một số Dendrobium lá chỉ có ở các mầm non, là loài chống tàn chúng vàng úa và

rụng vào mùa thu, thân phì to giống như củ không có lá là nơi dự trữ năng lượng[3]

* Lá: Các lá mọc xen kẽ nhau và ôm lấy thân giả do lá có tận cùng bằng

một cuốn hay thuôn dài xuống thành bẹ ôm thân, hình dạng và cấu trúc lá rất đadạng [3]

Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng Dạng lá mềm mại mọng nướcnạc, dai, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tuỳ thuộc vào vị trí sống của cây.Phiến lá trãi rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lạitheo gân giữa như hình chữ V Những lá sát dưới gốc đôi khi giảm đi chỉ cònnhững bẹ không phát triển hay giảm hẳn thành vảy Các loài thuộc giống

Dendrobium vùng nhiệt đới nói riêng và họ Orchidaceae nói chung đôi khi trút lá

vào mùa khô hạn Sau đó, cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặp mưa thì cho chồi

mới [3].

* Căn hành (thân – rễ): chỉ gặp ở lan đa thân, căn hành là nơi cấu tạo các cơ

quan dinh dưỡng mới và tên căn hành có nhiều mắt sống, chết hoặc hưu niên.Mặt lá nơi hình thành cũng mang rất nhiều rễ để nuôi sống cây lan [5]

* Rễ: ở lan đa thân rễ thường hình thành từ cặn hành còn các loại đơn thân

thì rễ mộc thẳng từ thân và thường xen kẽ với lá Rễ trên không của các loại lanphụ sinh có một trục chính bao quanh bởi mô không chặt, giống bọt biển baoquanh goi là mạch Mạch có thể hấp thụ hơi nước của không khí, cũng như tíchtrữ nước mưa và sương động [5]

1.3.3 Cơ quan sinh sản

* Hoa: Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá Chồi hoa mọc từ các

mắt ngủ giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và cả trên ngọn cây Sự biểu hiệntrước khi ra hoa khác biệt như có nhiều loài rụng hết lá trước khi ra hoa Thời

gian ra hoa đầu mùa mưa hay đầu tết Giống Dendrobium khi đủ dinh dưỡng thì

cho hoa thành chùm, phát hoa dài và thời gian ra hoa trung bình 1- 2 tháng [7]

* Quả: Họ Orchidaceae đều có quả thuộc quả nang nở ra theo 3-6 đường

nứt dọc, khi hạt chín các mảnh vỏ dính lại cùng nhau ở chóp hay ở định quả, cácnang bung ra chỉ còn dính lại với nhau ở đỉnh và gốc Ở một số loài, khi chín quảkhông nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi quả bị mục nát [7]

* Hạt: Hạt được cấu tạo một phôi chưa phân hoá, trên các mạng lưới nhỏ

xốp chứa đầy không khí Hạt rất nhỏ và bé trọng lượng của một hạt trong mỗi quảchỉ bằng một phần mười đến một phần ngàn miligam Những hạt giống khôngchứa các chất dinh dưỡng do gió gieo vãi, để được nẩy mầm cần có các điều kiệnnấm cộng sinh cần thiết, đặc biệt ở đầu các giai đoạn phát triển thì quả chứa10.000 – 100.000 hạt đôi khi đến 3 triệu hạt có kích thước rất nhỏ nên phôi hạtchưa phân hoá Sau 3 – 5 tháng hạt chín và phát tán nhờ gió [8]

1.4 Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendobium

1.4.1 Nhiệt độ

Giống Dendrobium gồm nhiều loài thích nghi với các điều kiện sinh thái khác nhau Có thể tạm chia Dendrobium làm 2 nhóm chính: nhóm ưa lạnh và

nhóm ưa nóng [2]

Nhóm Dendrobium ưa lạnh sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ lý tưởng

là 150C gồm các giống được lấy từ các vùng cao nguyên của Việt Nam và Miến

Điện trên độ cao 1000m ví dụ các loại Vảy Cá (Dendrobium Linlleyi), Thuỷ Tiên Tím (Dendrobium amabile), Long nhãn kim điệp (Dendrobium fimbriatum) Các

loài này nếu được trồng ở nhiệt độ cao hơn hoặc bằng 250C, thì cây vẫn sống,nhưng phát triển yếu hơn và hiếm khi ra hoa [10]

Nhóm Dendrobium ưa nóng, gồm đa số các giống Dendrobium rừng các Châu Úc, Indonexia, Malaixia và các loại của giống Dendrobium lại hiếm được

trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh phía Nam, nhiệt độ thích hợp chocác loại của nhóm này là 250C Tuy nhiên các giống Dendrobium lại chịu được

một nhiệt độ cao hơn nhiều [12]

Ngoài ra còn có một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở vùng lạnh

và vùng nống, nhưng ở vùng lạnh cây sinh trưởng và ra hoa nhiều hơn ví dụ cac

loại Dendrobium Primulinum, Dendrobium fanmeri, Dendrobium chrysotoxum

nhiệt độ lý tưởng các loại này là 200C [20]

1.4.2 Độ ẩm

Các cây lan, nhất là phong lan sống bám trên các cây cao chúng lấy nước từcác trận mưa, từ hơi nước trong không khí Chính độ ẩm quyết định sự hiện diệncủa các loài phong lan [3]

Lan Dendrobium thường mọc nơi ẩm ướt, cần tưới 1–2 lần/ngày bằng vòi

phun sương và nên có một khoảng thời gian khô nhẹ giữa 2 lần tưới và pH củanước từ 6,2–6,6 Không nên để nước đọng ở đọt cây, chồi hoa, nhất là vào mùa

nắng, sẽ làm thối đọt và hư hoa và mùa mưa cần giữ cây tránh ngập úng và thốiđọt [14].

Dendrobium cũng như đa số các giống lan khác chỉ phát triển tốt trong điều

kiện không khí ẩm và thoáng, ẩm độ tương đối cần thiết là 70% Cấu tạo giá thể

quá ẩm và úng là điều kiện bất lợi cho sự sinh trưởng của giống Dendrobium vì

có thể toàn bộ rễ bị thối và biểu hiện là các cây con mọc từ phần ngọn của thân[10]

1.4.3 Ánh sáng

Dendrobium là giống ưa sáng, có thể trồng trong điều kiện ánh sáng trực tiếp hay khuếch tán ánh sáng hữu hiệu cho giống Dendrobium có 70%, vì thế

giàn che với độ che ánh sáng 30% dưới đất và 40% ở trên cao với cường độ ánh

sáng từ 15.000- 30.000 lux rất thích hợp cho sự phạt triển của Dendrobium Các chậu Dendrobium được treo trong giàn không nên quá gần nhau, mà phải có

khoảng cách 25cm cho các loại có dạng lớn và 15cm cho các loại có dạng nhỏ,nhằm mục đích tạo cây có đủ ánh sáng và độ thoáng Nếu có đầy đủ giống ta nên

nhân một loại Dendrobium đồng nhất trong dàn hoặc nếu một giàn trồng nhiều

giống khác nhau nên chọn những cây cùng kích thước để sự phân bố ánh sángcho điều hoà và những cây cùng tuổi sử dụng phân bón dễ dàng hơn [10]

Dendrobium có thể trồng dưới ánh sáng trực tiếp cây vẫn phát triển tốt, tuy

nhiên để ngăn ngừa trường hợp cây bị bỏng lá, ta tập cho cây thích nghi từ từ các

chậu khi trồng phải treo hơi khích vào nhau Đối với các loại giống Dendrobium,

thì thà cây bị bỏng lá bị thừa ánh sáng lớn hơn là thiếu Thiếu hơn ánh sángđốivới các loại thuộc giống này sẽ gây ra sự thoái hoá rõ rệt, số lượng hoa ít và éo ọt

Trái lại, thừa ánh sáng đối với các giống Dendrobium, chỉ cho cây xấu đi vì lá

quá vàng hoặc các giả hành trơ trụi, nhưng cây sẽ thích nghi dần dần và đảm bảo

ra nhiều hoa và đẹp nhưng dù kết quả ánh sáng lý tưởng là tốt nhất [13]

Ngoài ra, thời gian chiếu của ánh sáng trong ngày là điều kiện quyết định sự

ra hoa của một số loài chịu ảnh hưởng bởi quang kỳ, ví dụ: lan Giá hạc, Long tu,Kim điệp chỉ ra hoa với điều kiện ánh sáng có thời gian chiếu ít hơn 10 giờ trong

ngày Tuy nhiên, một giả thiết khác cần được nghiên cứu cũng có thể các loai hoanày ra hoa do sự thọ hàn vào tháng 12 Loài lan Thạch Hộc chỉ cần bị lạnh trongvài giờ, cây sẽ trổ hoa sau 1 tuần lễ [13].

1.4.4 Giá thể trồng

Đa số lan Dendrobium là bán địa lan nên chậu và giá thể trồng phải được

giữ ẩm tốt và không được úng, vì vậy chậu trồng nên có nhiều lỗ và giá thể trồngkhông nên có đất Hỗn hợp trồng tốt là xơ dừa hoặc dớn sợi, than gỗ vụn, lá khôvụn, phân gia súc khô; đối với các loài sống trên đá vôi thì cần thêm vài viên đávôi nhỏ, có thể thay bằng vỏ trứng hoặc vỏ sò đập vụn

1.4.5 Nhu cầu phân bón

Dendrobium thân đứng là loài lan đòi hỏi dinh dưỡng cao, vì thế chúng cần

rắt nhiều phân bón và có thể dùng rất nhiều dạng phân bón khác nhau Còn các

loại Dendrobium thân thòng ăn phân yếu phải dùng nồng độ thật loãng [13].

Phân heo có thể dùng rất tốt bằng dạng tưới pha thật loãng hay phân khô vòchặt thành từng viên dài đặt phía trên bề mặt giá thể Phân bánh dầu khô cungđược dùng hữu hiệu bằng cách ngâm nước rồi pha thật loãng để tưới hay dùngthẳng từ viên bánh dầu khô: dùng đầu ngón tay đặt cách xa giả hành khoảng 5cm

Rễ lan sẽ hấp thụ dần dần các dưỡng chất được phóng thích qua quá trình tướinước Một số các loại phân hữu cơ khác cũng được dùng như phân tôm cá, phântrâu bò khô [13]

Các loại phân vô cơ được dùng, thường có công thức 30-10-10 dùng 3 lần/1tuần với nồng dộ 1 muỗng cà phê/4lít Trong suốt mùa tăng trưởng (từ đầu tháng

5 đến cuối tháng 1) một tháng trước khi bước vào mùa nghỉ (trong suốt tháng 2)

ta bón phân 10-20-30 chia làm 2 lần/1 tuần để tạo một sức chịu đựng cho câytrước khi bước vào mùa nghỉ Trong mùa tăng trưởng nếu cây có nụ hoa, ta thayphân 30-10-10 bằng phân 10-20-20 với chu kỳ bón như trên cho đến khô hoa tàn[8]

Trong mùa nghỉ không cần bón phân cho Dendrobium khi cây hoàn tất thời

kỳ tăng trưởng hằng năm của nó Thường Dendrobium hoàn tất thời kỳ tăng

trưởng vào tháng 9 đến tháng 10 khi mà những lá cuối cùng của nó thấy đượctrên đỉnh giả hành và thân Thời kỳ tăng trưởng hoàn tất, giảm nước tưới và thức

ăn từ từ cho đến khi không còn gì nữa trong một thời gian chừng 4 tuần, vào lúcnày cây cần càng nhiều ánh nắng càng tốt và phối hợp với điều kiện khí hậutháng 12 ngày ngắn và nhiệt độ mát - những giống thay lá hằng năm chuẩn bịrụng lá để hình thành phát hoa [10]

Các giống không thay lá ít biểu lộ hơn và thường chỉ rụng một đế hai lá ởcác giả hành và thân già ít khi các nhà vườn trồng lan, dùng các loại phân riêng

rẻ, thường phân bón được dùng ở dạng hỗn hợp gồm vô cơ, và đôi khi những chấtphụ gia là các loại sinh tố và các nguyên tố vi lượng [10]

Mặc dù các loài thuộc giống Dendrobium cần và sử dụng rất nhiều phân

bón, nếu lạm dụng phân bón dù là phân hữu cơ cũng đưa đến tác hại, kết quả cuốicùng là sự chết Có thể giảm nồng độ phân bón theo tỷ lệ, để rút ngắn thời giantưới giữa 2 lần, nhưng nếu tăng nồng độ phân bón, nhằm mục đích kéo dài thờigian giữa 2 lần tưới sẽ ảnh hưởng không tốt đến cây [10]

1.4.6 Sâu bệnh và các vấn đề khác

Vì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và môi

trường xơ dừa sẽ mục nát sau một thời gian ngắn được trồng Đây là 2 nguyênnhân gây ra nhiều sâu bệnh hại [12]

Một loại rệp sáp Diaspis boisduvalli, kích thước rất bé khoảng đầu tăm,

thường xuất hiện trên bề mặt lá và loại này tác hại trên cây qua việc hút nhựa

Đối với các loài côn trùng cắn phá Dendrobium thì loại trừ chúng tương đối dễ dàng bằng Serpa, Bassa, nồng độ 1/500 Mặc dù Dendrobium là cây kháng bệnh rất mạnh, tuy nhiên cây vẫn bị nấm và virus như CymMV (Cymbidium mosaic virus) và ORSV (Odontoglossum ringspot virus) tấn công, nếu điều kiện vệ sinh

quá kém Nguy hiểm nhất là bệnh khô thân gần gốc và giả hành do một loài virus

xâm nhập, làm cho các giả hành bị khô và chết Đây cũng là một trong nhữngnguyên do làm cây mọc cây con trên ngọn thân Có thể ngừa bệnh cho giống

Dendrobium với khoảng cách dài hơn Cattleya là nửa tháng xịt 1 lần bằng các

loại thuốc ngừa nấm Topsil, Zineb, Bencmyl với nồng độ 1/400 [12]

Top of Form

Ngô Thị Trà Giang Lớp 10SHLT

D Airang Gold D Blue Violetta D Burana Delight D Burana Angel

D Red Flame D Sakda Blue D Salaya Gold D Salaya White

D Sena Red D Burana Platinum No 8 D Tropic House D Mangosteen

Hình 1.1 Một số dạng hoa đẹp của lan Dendrobium họ Orchidacea

1.5 Các nghiên cứu Dendrobium trong nước và thế giới

1.5.1 Nghiên cứu trong nước

Năm 2005 Nguyễn Thị Hoàng Uyên “ Nghiên cứu gieo hạt Dendrobium Superbum in vitro” Đại Học Nông Lam – Thành Phố Hồ Chí Minh.

Năm 2006 Trịnh Cẩm Tú & Bùi Trang Việt “nghiên cứu sự phát triển của

phát hoa Dendrobium Sonia” của trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học

Quốc Gia –Hồ Chí Minh [9]

Dương Hoa Xô và Nguyễn Đăng Nghĩa (2008) “Nghiên cứu ứng dụng một

số biện pháp kỹ thuật mới để phát triển mô hình sản xuất nhóm hoa lan Mokara

và Dendrobium” Trong nghiên cứu này tác giả đã xây dựng quy trình bón phân cho lan Dendrobium nhằm đạt năng suất và chất lượng cao [15].

Năm 2010, Phùng Văn Phê, Ngyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành

“Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in vitro loại lan kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall) Lindl” Khoa Lâm học, Trường Đại học Lâm nghiệp, Xuân

Mai, Chương Mỹ, Hà Nội Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,Đại Học Quốc Gia việt Nam [13]

Phan Ngọc Toàn, trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, tháng08/2011 “Nghiên cứu Khảo sát môi trường tái sinh chồi và tạo protocorm lan

rừng thủy tiên tím (Dendrobium ambile (Lour.) O’brien)”.

Vũ ngọc Phương, Thái Xuân Du, Trịnh Mạnh Dũng “ Nghiên cứu nhân

giống vô tính phong lan Dendrobium in vitro dưới điều kiện ánh sáng tự nhiên”.

Phòng công nghệ tệ bào thực vật, viện sinh học nhiệt đới

Vũ Ngọc Phương, Thái Xuân Du, Trịnh Minh Dũng “Nghiên cứu nhân

giống vô tính in vitro lan Dendrobium điều kiện ánh sáng tự nhiên” Phòng công

nghệ tế bào thực vật - Viện Công Nghệ Nhiệt Đới –Viện Khoa học và Công nghệViệt Nam.

Hoàng Quý Châu, MBA Lê Thúy Anh, MS Lê Huỳnh, “ Nghiên cứu Lan

Dendrobium gieo hạt ra hoa trong ống nghiệm” phòng công nghệ sinh học, Khoa

Lâm Nghiệp trường ĐH Nông Lâm Tp.HCM

1.5.2 Trên thế giới

Năm 1934, White J.P thông báo nuôi cấy thành công trong một thời gian dài

đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng chứa muối

khoáng và glucose và nước chiết nấm men Sau đó cũng chính White chứng minh

có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hổn hợp loại vitamin B: Thiamin (B1),Pyridoxin (B6), Nicotinic acid Đồng thời trong thời gian này, R.J Gautheret (ởPháp) đã tiến hành nuôi cấy môi tượng tầng một số cây gỗ (cây liễu) khi đưaauxin vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên sự sinh sản các tế bào đầu tiên khôngvượt quá 8 tháng [8]

Năm 1939, Gautheret thông báo kết quả đầu tiên của ông với Viện Hàn Lâm

Khoa Học Pháp về việc nuôi cấy các mô vô hạn của cây cà rốt (Daucus carote ).

Sau thế chiến thứ hai, lĩnh vực này đặc biệt phát triển nhanh và nhiều kếtquả nghiên cứu quan trọng trong nông nghiệp đươc công bố

Năm 1957 Skoog và Miller đã khám phá vai trò tỷ lệ nồng độ các chất

auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan ( rễ hoặc chồi).

Skoog F and Miller C.O., In vitro Symp Soc Exp Biol., No.11:118-131 [18]

Dendrobium được nuôi cấy tái sinh thành công từ tế bào soma (Meesawat và

Kanchanapoom, 2002)

Chen Chang và Wei - Chin Chang (2003) đã thành công khi callus có được từ

thân rễ của Cymbidium ensifolium var misericors ra hoa in vitro trên môi trường

1/2 MS chứa 1,5 µM NAA kết hợp với TDZ (nồng độ từ 3,3-10 µM) hay 2iP

(nồng độ 10-33 µM) sau 100 ngày nuôi cấy [13]

Tháng 6 năm 2006 S Aktar và cộng sự tai phòng thí nghiệm Công nghệsinh học USDA, sở công nghệ sinh học, Đai học nông nghiệp Bangladesh,

Mymensingh đã nghiên cứu khả năng hình thành rễ lan Dendrobium trong môi

trường chứa nồng độ IBA (0, 0.5, 1.0, 1.5 và 2mg/l) kết hợp than hoạt tính 1%.Kết quả tốt nhất môi trường chứa IBA 1.0mg/l [15]

Tháng 4 năm 2010 Sana Asghar và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nhân

nhanh chồi giống lan Dendrobium noibile var Emma từ chồi nách có bổ sung

BAP ở các nồng độ 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 và 3.0mg/l và kinetin cũng như nồng độnước dừa thay đổi từ 50, 100, 150, 200, 250 và 300ml/l Qua nghiên cứu họ nhậnthấy môi trường chứa 2mg/l IBA với tỷ lệ phần trăm rễ (95,5%) số lượng rễ(4,70%) và chiều dài cây (3,47cm) hiệu quả hơn so với NAA Nồng độ cao hơncủa IBA và NAA 3mg/l cho thấy khả năng hình thành rễ kém [16]

1.6 Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấynguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhântạo ở điều kiện môi trường [8]

Nhân giống in vitro hay còn gọi vi nhân giống được sử dụng đặc biệt cho

việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằngnhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện

vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác Thực tế,

các nhà vi nhân giống dùng thuật ngữ nhân giống in vitro và nuôi cấy mô thay đổi

cho nhau để chỉ cho phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng [8]

1.6.1 Các điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.6.1.1 Yêu cầu cơ bản nhất của phòng nuôi cấy mô phải đảm bảo vô trùng

- Khái niệm vô trùng bao gồm vô trùng môi trường nuôi cấy và cả sự đảm bảocho mẫu nuôi cấy hoàn toàn vô trùng [8]

1.6.1.2 Các yếu tố cơ bản cuả kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật [20]

- Khi thiết lập phòng nuôi cấy mô thực vật phải đảm bảo được tính liên tụcthuận lợi cho các thao tác, các giai đoạn trong suốt quá trình nuôi cấy mô

- Đảm bảo được vệ sinh (tính vô trùng) của sản phẩm cuối cùng

- Chuẩn bị môi trường đúng cách, chọn đúng môi trường cho từng loại thực vật

và từng giai đoạn nuôi cấy

- Chọn và xử lý mô thích hợp trước khi nuôi cấy

1.6.1.3 Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy

Có nhiều công thức môi trường khác nhau được sử dụng cho nuôi cấy mô in vitro nhiều loại cây khác nhau Trong đó môi trường MS được sử dụng phổ biên

nhất, có cải biến bằng sự thay đổi thành phần các vi lượng Tuy nhiên tất cả cácmôi trường nuôi cấy gồm 5 thành phần cơ bản [8]

- Đường: Trong nuôi cấy mô, nguồn cacbon để mô và tế bào thực vật tổnghợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia tăng sinh khối của mô không phải

do quá trình quang hợp cung cấp mà do đường có trong môi trường dinh dưỡng

Thường sử dụng nguồn cacbon là đường Saccharose [8].

- Khoáng đa lượng: Nhu cầu muối khoáng của mô tế bào thực vật không thểthiếu so với điều kiện thực vật ngoài tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phảicung cấp là nitơ, photpho, kali, canxi, magie, sắt Trong đó dung dịch mẹ củakhoáng đa lượng nên pha với nồng độ gấp 10 lần dung dịch chuẩn, lọc bỏ nhữngphần không tan và trữ trong tủ lạnh 2-40C [8]

- Khoáng vi lượng: Cần với một lượng rất ít nhưng không thể thiếu, dungdịch mẹ của khoáng vi lượng nên pha với nồng độ gấp 100 lần dung dịch chuẩn,cất trữ trong tủ lạnh hoặc tủ đông cho đến khi sử dụng [8]

- Nồng độ đa lượng và vi lượng trong môi trường ra rễ thường giảm xuốngtrong môi trường ra rễ thường giảm xuống so với một nữa so với bình thường và

tuỳ theo loại cây Nguyên nhân là do nhu cầu về đạm trong giai đoạn này giảm[4].

- Vitamin: Thực vật cần vitamin để xúc tác quá trình biến dưởng khác nhaucác vitamin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô như: Thiamine HCl (vitaminB1), Pyridoxine HCl (vitamin B6), acide nicotinic [4]

Vitamin được pha chế với nồng độ gấp 500 hoặc 1000 lần so với dung dịchchuẩn và trữ trong tủ đông cho đến khi sử dụng Dung dịch Vitamin dễ bị nhiễmnấm và vi khuẩn, vì vậy cần thiết phải giữ ở nồng độ 00 [4]

- Các chất hữu cơ: Nước dừa (CW – coconut water) được dùng thông dụngtrong nuôi cấy mô Nước dừa cung cấp bổ sung cho các môi trường các loạiđường amino acid chất sinh trưởng và các chất trao đổi khác Nước dừa kíchthích những tế bào hay mầm cây non chưa trưởng thành và phát triển phôi, nướcdừa thường dùng nồng độ 15% Từ việc sử dụng nước dừa nhiều mô thực vậtnghiền tách chiết và bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sựphát triển và ngoài ra bổ sung như chuối, mầm lúa mì, dịch chiết khoai tây [8]

- Than hoạt tính: Than hoạt tính có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bấtđịnh Nó có tác dụng hấp phụ các chất hữu cơ ngoại trừ đường Sự kết hợp của0,5g/l than hoạt tính trong môi trường đã tìm thấy có lợi cho sự tăng trưởng chồi,

và 1g/l bổ sung trong môi trường tạo rễ cho cây con hoàn chỉnh Ngoài ra thanhoạt tính bổ sung trong môi trường còn góp phần tăng nhanh protocorm [8]

1.6.1.4 Các chất điều hòa sinh trưởng

* Auxin: Auxin là hormon thực vật đầu tiên trong cây được phát hiện vào

năm 1934 Đó chính là IAA, con người đã tổng hợp nhiều chất có bản chất hóahọc khác nhau nhưng chúng có hoạt tính sinh lý tương tự như IAA gọi chung là

auxin tổng hợp Các auxin tổng hợp được sử dụng rộng rãi trong sản xuất là IBA,

α-NAA, 2,4D…[8]

- Cơ quan chính tổng hợp auxin trong cây là ngọn chồi Từ đấy, nó được vận

chuyển phân cực khá nghiêm ngặt xuống các cơ quan phía dưới theo hướng gốc(không di chuyển ngược lại), nên càng xa đỉnh ngọn thì hàm lượng của auxincàng giảm dần Ngoài ra, các cơ quan còn non đang sinh trưởng cũng có khả năng

tổng hợp một lượng nhỏ auxin như lá non, quả non, phôi hạt…Chất tiền thân tổng

hợp nên IAA trong cơ thể là amin tryptophan [8]

s- Auxin trong cây có thể bị phân hủy sau khi sử dụng xong hoặc bị dư thừathành sản phẩm không có hoạt tính sinh lý Sự phân hủy có thể bằng enzym IAA-oxidaza, hoặc bằng quang oxi hóa Sản phẩm của phân hủy IAA không còn làhoạt tính sinh lý [8]

- Auxin có thể ở dạng tự do có hoạt tính sinh lý nhưng hàm lượng IAA trongcây chỉ chiếm 5% Chủ yếu IAA ở dạng liên kết với một số chất khác và dạngnày không có hoạt tính sinh lý mà để dự trữ Hai dạng auxin này có thể biến đổithuận nghịch cho nhau khi cần thiết, có thể xem ba quá trình: tổng hợp, phân hủy

và chuyển hóa thuận nghịch giữa hai dạng auxin là sự điều chỉnh hàm lượngauxin trong cây, bảo đảm cho cây sinh trưởng [8]

* Cytokinin: Cytokinin là nhóm hormon thực vật thứ ba được phát hiện vào

năm 1963 Khi nuôi cấy mô tế bào thực vật, người ta phát hiện ra một nhóm chấthoạt hóa sự phân chia tế bào mà nếu thiếu chúng, sự nuôi cấy mô không thànhcông Cytokinin trong cây chủ yếu là chất zeatin và các cytokinin tổng hợp được

sử dụng khá rộng rãi trong nuôi cấy mô tế bào là kinetin và benzyl adenin (BA)[8]

- Cơ quan tổng hợp cytokinin là hệ thống rễ và từ rễ, cytokinin được vậnchuyển lên các bô phận trên mặt đất theo hướng ngược chiều với auxin nhưngkhông có tính phân cực rõ rệt như auxin Ngoài rễ, một số cơ quan non đang sinhtrưởng cũng có khả năng tổng hợp một lượng nhỏ bổ sung thêm cho nguồncytokinin của rễ [8]

* Giberelin (Gb): Gb là nhóm hormon thứ hai được phát hiện vào năm

1955-1956 Khi nghiên cứu cơ chế gây nên bệnh lúa von (cây lúa sinh trưởngchiều cao quá mức gây nên bệnh lý), các nhà khoa học đã chiết tách được chất

gây nên sinh trưởng mạnh của cây lúa bị bệnh Đó chính là acid giberelic (GA3),Giberelin cũng được xem là một phitohocmon quan trọng của thế giới thực vật[8].

- Ngày nay người ta đã phát hiện ra trên 60 loại Gb trong cây, ký hiệu là

GA1, GA2, GA3, … GA60; trong đó GA3 có hoạt tính sinh lý mạnh nhất và là dạng

GA được sản xuất và sử dụng hiện nay trong sản xuất GA3 được sản xuất bằngcon đường lên men và chiết xuất sản phẩm từ dịch nuối cấy nấm…[8]

- Gb được tổng hợp trong lá non, một số cơ quan non đang sinh trưởng nhưphôi hạt đang nảy mầm, quả non, rễ non…Sự vận chuyển của nó trong cây theo

hệ thống mạch dẫn và không phân cực như auxin GA trong cây cũng có thể ởdạng tự do và dạng liên kết với các hợp chất khác bình thường [8]

* Axit abxixic: ABA là môt chất ức chế sinh trưởng khá mạnh được pháthiện vào năm 1966 ABA được tổng hợp ở hầu hết các cơ quan rễ, lá, hoa, quả,củ…nhưng chủ yếu là cơ quan sinh sản Sau khi hình thành hoa, hàm lượng củaABA tăng lên rất nhanh ABA được tích lũy nhiều trong các cơ quan đang ngủnghỉ, cơ quan dự trữ, cơ quan sắp rụng Sự tích lũy ABA sẽ kìm hãm quá trìnhtrao đổi chất, giảm sút các hoạt động sinh lý và có thể chuyển cây vào trạng tháingủ nghỉ sâu [8]

* Etylen:Etylen là một chất khí đơn giản nhưng là một hormon quan trọngtrong cây nó điều chỉnh quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Etylen đượctổng hợp trong tất cả các tế bào, các mô, nhưng nhiều nhất ở các mô già và đặcbiệt trong quả đang chín Khác với các hormon khác được vận chuyển theo hệthống mạch dẫn, etylen là chất khí nên được vận chuyển bằng phương thứckhuếch tán, do đó phạm vi vận chuyển không xa [8]

* Các nhân tố khác

- Agar: Là một gel không phản ứng với thành phần môi trường, hơn nữa

chúng không bị thủy phân bởi các enzyme thực và duy trì ổn định nhiệt độ nuôicấy được tiến hành Agar đối với môi trường đặc là một polysaccarit làm từ rông

biển Agar tan 1000C và khi nguội thì đông đặc lại, thường sử dụng agar thươngmại với tỷ lệ 8-10g/l môi trường [1].

- Nhiệt độ: nhiệt độ phong nuôi cấy thường điều chỉnh nhiệt độ 22-250C,mỗi tế bào thực vật khác nhau thì có nhiệt độ nuôi cấy khác nhau [1]

- Ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát sinh cây, các yếu tố ảnh hưởngnhư cường độ chiếu sáng, chu kỳ và thành phân quang phổ của ánh sáng Cường

độ ánh sáng từ 1000-2500lux được phổ biến nuôi cấy cho nhiều loại mô [17]

- pH môi trường: Tế bào thực vật đòi hỏi môi trường tối ưu cho sự sinh trưỡng

và phát triển trong nuôi cấy mô trông nuôi cấy Sự ổn định pH của môi trường là yếu

tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào Môi trường nuôi cấy pH 5,8 trước khi khửtrùng được xem là tối ưu Nếu thấp thì giảm khả năng đông đặc của agra, còn cao quámôi trường bị rắn, thường dùng NaOH 1N và HCl 1N để điều chỉnh pH [12]

1.6.2 Ứng dụng của việc nhân lan bằng in vitro

- Gia tăng lượng hoa lan trên thị trường

- Nhân giống các loại lan hiếm nhằm nhân giống số lượng cả trong tự nhiên vàtrong các chương trình bảo tồn

- Cung cấp cây con để bán, hạn chế sự khai thác cây hoang dại, kích thích sựquan tâm của quần chúng và tạo nguồn thu ngân sách

- Kết hợp với lai giống tạo ra các cây con khoẻ mạnh và sạch bệnh có màu sắcđặc biệt

- Do cây in vitro nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp (nguồn dinh

dưỡng điều kiện môi trường thích hợp) do đó có thể sản xuất cây con quanh năm

- Có thể sử dụng cây in vitro làm cây mẹ cho các bước tiếp theo.

- Thu hút được lượng lao động lớn từ những người về hưu đến những ngườikhông có công ăn việc làm

- Làm tăng lượng cây xanh đồ thị và vùng ven đô thị góp phần cải thiện môitrường.

- Nâng cao mức sống văn hoá của người nuôi trồng và người dân đô thị thưởngthức cái đẹp của hoa lan tự nhiên

- Làm cho bộ mặt thành phố như bộ mặt đất nước ngày càng đẹp hơn và vănminh hơn

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Lan Dendrobium thuộc:

Hình 1.2 Hoa lan Dendrobium Sena Red

* Quy trình nhân nhanh chồi và tạo rễ cho hoa lan Dendrobium

Cụm chồi gồm nhiều thể chồi

Nhân nhanh protocorm Nhân nhanh cụm chồi

Môi trường cấy và cụm protocorm (tách 4 miếng) Môi trường nuôi cấy và cụm chôi (tách 4 miếng)

Cụm protocorm phát triển chuyển sang Cụm chồi phát triển chuyên sang môi

môi trường nhân nhanh chồi (tách 4 miếng) trường tạo rễ (tách 4 miếng)

Cụm chồi phát triển

Cây con 5 - 7 cm và 3 – 4 lá

Cây non Tạo rễ

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Môi trường nuôi cấy cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962) là môi trường

cơ bản được dùng để nuôi cấy giống lan Dendrobium Sena Red trong quá trình

thực hiện nghiên cứu Môi trường kết hợp với chất điều hoà sinh trưởng với nồng

độ khác nhau tuỳ theo mục đích của từng thí nghiệm bên cạnh đó mẫu đối chứng.Nguồn cacbon cung cấy cho môi trường saccharose và được đông đặc môi trườngbằng agar, pH môi trường đưa về 5,8 trước khi khử trùng 200C trong thời gian 20phút

Trong quá trình tiến hành thí nghiệm môi trường được bổ sung thêm nướcdừa (CW - Coconut water) nồng độ 15% và than hoạt tính (AC - Activatedcharcoal) nhằm mục đích tạo điều nâng cao chất lượng nhân giống

- Môi trường nhân nhanh protocorm:

MS + (0,5 → 3mg/l) BA + 15% CW + 0,5% AC + 2% đường + 0,8 agar

MS + (0,1 → 1,5mg/l) NAA + 15% CW + 0,5% AC + 2% đường + 0,8 agar

MS + (0,1 → 1,5mg/l) NAA + 2mg/l BA + 15% CW + 0,5 %AC + 2% đường+ 0,8 agar

MS + (0,5 → 3mg/l) BA + 0,1mg/l NAA+ 15% CW + 0,5% AC + 2% đường+ 0,8 agar

- Môi trường nhân nhanh cụm chồi:

MS + (0,5 → 3mg/l) BA + 15% CW + 0,5% AC + 2% đường + 0,8 agar

MS + (0,1 → 1,5mg/l) NAA + 0,5mg/l BA+ 15% CW + 0,5% AC + 2%đường + 0,8 agar

- Môi trường tạo rễ:

MS + (0,1 → 1mg/l) NAA + 15% CW + 1% AC + 2% đường + 0,8 agar.

MS + (0,1 → 1mg/l) IAA + 15% CW + 1% AC + 2% đường + 0,8 agar

2.3 Điều kiện nuôi cấy

- Các mẫu được nuôi trong nhiệt độ 250C ± 2 và cường độ ánh sáng 2000 3000lux, thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày và độ ẩm phòng cấy 60% - 80%

-2.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và kết hợp BA với NAA đến sự nhân nhanh protocorm

- Thí nghiệm 1: được bố trí với 5 loại môi trường nuôi cấy khác nhau Môitrường gồm môi trường MS cơ bản, trong đó có 20g/l saccharose, 8g/l agar, 15%

CW, 0,5 g/l AC có bổ sung thêm chất điều hoà sinh trưởng BA với nồng độ (0; 0,5;1; 2; 3) mg/l, ký hiệu M0, M1, M2, M3, M4

- Thí nghiệm 2: được bố trí với 5 loại môi trường nuôi cấy khác nhau Môitrường gồm môi trường MS cơ bản, trong đó có 20g/l saccharose, 8g/l agar, 15%

CW, 0,5 g/l AC có bổ sung thêm chất điều hoà sinh trưởng NAA với nồng độ (0; 0,1;0,5; 1; 1,5) mg/l mg/l, ký hiệu M0, M5, M6, M7, M8

- Thí nghiệm 3: được bố trí với 5 loại môi trường nuôi cấy khác nhau Môitrường gồm môi trường MS cơ bản, trong đó có 20g/l saccharose, 8g/l agar, 15%

CW, 0,5 g/l AC có bổ sung thêm chất điều hoà sinh trưởng BA 2mg/l kết hợp vớinồng độ NAA (0; 0,1; 0,5; 1; 1,5) mg/l, ký hiệu M9, M10, M11, M12

- Thí nghiệm 4: được bố trí với 5 loại môi trường nuôi cấy khác nhau Môitrường gồm môi trường MS cơ bản, trong đó có 20g/l saccharose, 8g/l agar, 15%

CW, 0,5 g/l AC có bổ sung thêm chất điều hoà sinh trưởng NAA 0,1mg/l với nồng

độ và BA (0; 0,5; 1; 2; 3) mg/l, ký hiệu M13, M14, M15, M16

Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thực môi trườngcấy 16 mẫu, mỗi mẫu kích thước 0,5 – 1 cm

* Chỉ tiêu theo dõi

- Theo dõi và ghi nhận kết quả sau 4 tuần nuôi cấy

- Thí nghiệm được lặp lại 2 lần

- Nhận xét môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất

- Thời gian tạo protocorm

- Tình trạng phát triển của protocorm

2.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và kết hơp giữa BA với NAA đến

sự nhân nhanh chồi lan.

- Thí nghiệm 1: được bố trí với 5 loại môi trường nuôi cấy khác nhau Môitrường gồm môi trường MS cơ bản, trong đó có 20g/l saccharose, 8g/l agar, 15%

CW, 0,5 g/l AC có bổ sung thêm chất điều hoà sinh trưởng BA với nồng độ (0; 0,5;1; 2; 3) mg/l, ký hiệu M0, MB1, MB2, MB3, MB4

- Thí nghiệm 2: được bố trí với 5 loại môi trường nuôi cấy khác nhau Môitrường gồm môi trường MS cơ bản, trong đó có 20g/l saccharose, 8g/l agar, 15%

CW, 0,5 g/l AC có bổ sung thêm chất điều hoà sinh trưởng BA 0,5mg/l kết hợp vớinồng độ NAA với nồng độ (0; 0,1; 0,5; 1; 1,5) mg/l, ký hiệu MBN5, MBN6, MBN7,MBN8

Trong công đoạn này sử dụng mẫu ở thí nghiệm sau khi thu nhận được ở côngđoạn nhân protocorm Đây là quá trình quyết định số lượng chồi để tạo rễ

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi môi trường thực hiện 16 cụm chồi.Kích thước mỗi cụm khoảng 5 chồi hoặc đỉnh chồi/cụm Trong chỉ tiêu này thì tatheo dõi từ tuần thứ 2 trở đi

* Chỉ tiêu theo dõi

- Nhận xét chồi môi trường nhân nhanh chồi phát triển tốt nhất.

- Sự tạo thành cây giữa các môi trường.

- Màu sắc và chiều dài lá

- Thời gian xuất hiện rễ đầu tiên

2.6 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến sự tạo rễ

- Thí nghiệm 1: được bố trí với 4 loại môi trường nuôi cấy khác nhau Môitrường gồm môi trường MS cơ bản, trong đó có 20g/l saccharose, 8g/l agar, 15%

CW, 1 g/l AC có bổ sung thêm chất điều hoà sinh trưởng BA với nồng độ (0; 0,1;0,5; 1) mg/l, ký hiệu MN1, MN2, MN3

- Thí nghiệm 2: được bố trí với 4 loại môi trường nuôi cấy khác nhau Môitrường gồm môi trường MS cơ bản, trong đó có 20g/l saccharose, 8g/l agar, 15%

CW, 1 g/l AC có bổ sung thêm chất điều hoà sinh trưởng BA với nồng độ (0; 0,1;0,5; 1s) mg/l, ký hiệu MI4, MI5, MI6 Qua sát thu kết quả từ tuần thứ 3 trở đi

* Chỉ tiêu theo dõi

- Chiều dài rễ

- Sự tăng trưởng chiều dài cây

- Số lượng rễ trên mẫu

- Số lượng lá trên chồi

- Tỷ lệ phần trăm ra rễ

2.7 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

- Thời gian: Từ tháng 2 năm 2012 đếm tháng 5 năm 2012

- Địa điểm: Trung Tâm Công Nghệ Tế Bào Thự Vật, trường Đai Học Bách Đại Học Đà Nẵng

Khoa-2.8 Xử lý số liệu

- Số liệu thu được xử lý bằng phần mềm thống kê SPSS 16.0

- Tên đầy đủ: Statistical Package for the Social Sciences

- Xuất xứ: United States 2007