Nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro giống lan Dendrobium Aduncum

LỜI CẢM ƠNĐồ án được hoàn thành là kết quả của quá trình tìm tòi học hỏi của bản thân và sự giúp đỡ động viên của gia đình, bạn bè, đặc biệt là sự hướng dẫn chỉ bảo tận tình của quý thầy cô. Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến tất cả các quý thầy cô giảng viên trong bộ môn Công nghệ Sinh học, các quý thầy cô trong khoa Hoá của trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng, các quý thầy cô trong nhà trường những người đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường.Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Đặng Đức Long tổ trưởng bộ môn Công nghệ Sinh học, khoa Hóa, trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình nghiên cứu.Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Hoàng Trung Hiếu trong suốt thời gian làm đồ án vừa qua đã tận tình giúp đỡ, động viên em vượt qua mọi khó khăn để đi đến kết quả cuối.Em cũng xin chân thành cảm ơn đến anh Tuấn và chị Thảo cùng các bạn trong nhóm nghiên cứu đã giúp đờ em trong quá trình nghiên cứu đề tài.Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè những người đã luôn động viên giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đồ án.Đà Nẵng, ngày 11 tháng 6 năm 2012 Sinh viên Trần Thị MơMỤC LỤCLỜI MỞ ĐẦU1CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU21.1. Giới thiệu chung về Dendrobium21.1.1. Phân loại21.1.2. Đặc điểm hình thái31.1.2.1. Cơ quan dinh dưỡng31.1.2.2. Cơ quan sinh sản31.1.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium51.1.3.1. Nhiệt độ51.1.3.2. Độ ẩm61.1.3.3. Ánh sáng61.1.3.4. Nhu cầu phân bón61.1.3.5. Sâu bệnh và các vấn đề khác71.2. Một số nghiên cứu về nhân giống lan Dendrobium91.2.1. Trên thế giới91.2.2. Ở Việt Nam121.4. Các phương pháp nhân giống trên cây lan131.4.1. Các phương pháp nhân giống truyền thống131.4.1.1. Nhân giống vô tính131.4.1.2. Nhân giống hữu tính131.4.2. Phương pháp nhân giống vô tính in vitro141.5. Sơ lược về kỹ thuật nhân giống in vitro151.5.1. Lịch sử151.5.2. Các kỹ thuật nhân giống in vitro161.5.3. Quy trình nhân giống171.5.3.1. Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc171.5.3.2. Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng171.5.3.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi181.5.3.4. Giai đoạn 4: Tạo rễ181.5.3.5. Giai đoạn 5: Đưa cây ra vườn ươm181.6. Các yếu tố ảnh hưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật191.6.1. Đảm bảo điều kiện vô trùng191.6.1.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật191.6.1.2. Nguồn tạp nhiễm201.6.2. Chọn môi trường dinh dưỡng201.6.3. Chọn mô cấy và xử lý mô cấy21CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU222.1. Đối tượng nghiên cứu222.2. Phương pháp nghiên cứu232.2.1. Môi trường nuôi cấy232.3. Thiết kế thí nghiệm242.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự nhân nhanh protocorm.242.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự nhân nhanh chồi lan.242.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến khả năng hình thành rễ của cây lan.252.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ IAA và Kin đến khả năng hình thành rễ lan.252.4. Thời gian và địa điểm thí nghiệm262.5. Xử lý số liệu26CHƯƠNG 3: KẾT VÀ QUẢ VÀ THẢO LUẬN273.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự nhân nhanh protocorm.273.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự nhân nhanh chồi lan.303.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến khả năng hình thành rễ của cây lan.343.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ IAA và Kin đến khả năng hình thành rễ lan.38KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ43TÀI LIỆU THAM KHẢO45PHỤ LỤC48DANH MỤC HÌNH ẢNHHìnhTên hìnhTrangHình 1.1Cấu tạo cơ quan sinh sản5Hình 2.1Lan Dendrobium Aduncum22Hình 3.1Protocorm sau 30 ngày nuôi cấy29Hình 3.2Chồi lan sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường P4 33Hình 3.3Chồi lan sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường P533Hình 3.4Rễ lan sau 4 tuần cấy trên nuôi môi trường V5 37Hình 3.5Rễ lan sau 4 tuần cấy trên nuôi môi trường V6 37Hình 3.6Rễ lan phát triển sau 4 tuần nuôi cấytrên môi trường… 42DANH MỤC BẢNGBảngTên bảngTrangBảng 3.1Kết quả nhân nhanh protocorm sau 4 tuần nuôi cấy27Bảng 3.2Kết quả của việc nhân nhanh chồi sau 4 tuần nuôi cấy30Bảng 3.3Kết quả ra rễ lan sau 4 tuần nuôi cấy34Bảng 3.4Kết quả ra rễ lan sau 4 tuần nuôi cấy38DANH MỤC BIỂU ĐỒBiểu đồTên biểu đồTrangBiểu đồ 1Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến sự nhân nhanh chồi lan31Biểu đồ 2Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến sự phát triển của rễ lan35Biểu đồ 3Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự phát triển của rễ lan39Biểu đồ 4Ảnh hưởng của nồng độ IAA và Kin đến sự phát triển của rễ lan39CÁC CHỮ VIẾT TẮT2,4D: 2,4 diclopheoxyacetic acidAC: Activated charcoalBA: N6 benzyl adenineBAP: 6 benzyl amino purincs: Cộng sựCW: Coconut waterĐHST: Chất điều hòa sinh trưởngIAA: Indole 3 acetic acidIBA: Indole 3 butyric acidKin: KinetinKC: Knodson CMS: Murashige và Skoog,1962TDZ: Thidiazuron

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, hoa cảnh không những đóng vai trò quan trọng trong đời sốngtinh thần mà còn ảnh hưởng sâu sắc đến tâm hồn con người và làm đẹp cho cảnhquan môi trường Do đó, quan tâm phát triển hoa cảnh là vấn đề cần thiết Hoalan là một trong những loại hoa được ưa chuộng nhất vì hình dáng, màu sắc, kíchthước phong phú và đa dạng nên chúng được trồng và sản xuất khá phổ biến

Dendrobium aduncum hay còn gọi là Hồng câu hay Thạch hộc móc, lan

móc, Hoàng thảo thân gãy, Câu trạng thạch hộc Đây là loài lan rừng có hoa nhỏ

mọc thành chùm, nằm trong chi Lan Hoàng Thảo Lan Dendrobium aduncum

hay phong lan nói chung hiện đang được nhiều người ưa chuộng trong nước cũng

như trên thế giới

Ở Việt Nam phần lớn lan được trồng hiện nay là được đem từ rừng vềhoặc nhân giống bằng phương pháp truyền thống như tách nhánh, gieo hạt,…Tuynhiên, việc nhân giống này cho hiệu quả không cao, chất lượng cây giống khôngđảm bảo Do đó, không đáp ứng đủ nhu cầu cho người tiêu dùng trong nước cũngnhư xuất khẩu

Việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy invitro vào quá trình nhân giống cây

phong lan là vấn đề đáng được quan tâm và nghiên cứu Kỹ thuật này khôngnhững giải quyết được những vấn đề khó khăn đang gặp phải trong việc nhângiống lan mà còn giúp chúng ta chủ động sản xuất một số lượng lớn cây giống cóchất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh

Dựa trên cơ sở đó và kế thừa các công trình nghiên cứu trước chúng tôi

tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro giống lan Dendrobium Aduncum” nhằm tìm được môi trường thích hợp mang lại hiệu quả

cao cho quá trình nhân giống cây Dendrobium aduncum.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về Dendrobium

1.1.1 Phân loại

Phong lan có vùng phân bố rộng lớn Họ phong lan (Orchidaceae) với 750 chi và hơn 25000 loài là họ lớn thứ hai sau họ cúc (Asteraceae) trong ngành hạt kín (Angiospermae) và cũng là họ lớn nhất trong lớp một lá mầm [14]

Việc phân loại phong lan khá phức tạp Theo truyền thống cổ điển các nhà

khoa học trước đây phân loại Dendrobium thuộc tông Epidendreae, họ phụ Epiden droideae, phân họ Orchidaceae.

Theo Nguyễn Xuân Linh (1998) phân loại lan Dendrobium như sau:

- Dendrobium crassinode (Hoàng thảo u lồi)

- Dendrobium draconis (Hoàng thảo nhất điểm hồng)

- Dendrobium farmeri (Hoàng thảo thủy tiên)

- Dendrobium hercoglossum (Hoàng thảo tím huế)

- Dendrobium heterocrrpun (Hoàng thảo nhất điểm hoàng)

- Dendrobium (Hoàng thảo dẹt)

- Dendrobium parciflorum (Hoàng thảo xương cá)

- Dendrobium parisshii (Hoàng thảo tím hồng)

- Dendrobium parishii (Hoàng thảo hạc vĩ)

- Dendrobium primulim (Hoàng thảo long tu)

- Dendrobium pumilum (Hoàng thảo phù dung) [7]

1.1.2 Đặc điểm hình thái

1.1.2.1 Cơ quan dinh dưỡng

 Rễ: Rễ lan thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật được bao bọc bởi mộtlớp mô xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nước, muối khoáng và ngăn chặn ánhsang mặt trời gay gắt Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc lạpkhông bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp cây quang hợp

 Thân: Lan Dendrobium thuộc loài đa thân có giả hành rất dài, hình trụ,

hình múi hay hình dẹt, có nhiều đốt thân Thân có dạng mọc thẳng hoặc rũxuống

 Giả hành: Giả hành là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềmchứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi câytrong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao Ngoài ra, giả hành còn chứadiệp lục tố nên có thể quang hợp Hình dạng và kích thước của giả hành rất đadạng từ nhỏ đến lớn, hình cầu thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạothành thân giả có lá mọc xen kẽ

 Lá: Các lá lan mọc xen kẽ nhau và ôm lấy thân giả do lá có tận cùng bằngmột cuống hay thuôn dài thành bẹ ôm thân

- Hình dạng và cấu trúc của lá rất đa dạng Lá có hình kim, trụ có rãnhhay phiến mỏng Dạng lá mềm mại, mang nước, nạc, dai, có màu xanh bóng sẫmhay nhạt là tùy thuộc vào vị trí sống của cây

- Phiến lá trải rộng hay gập theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấplại theo gân giữa như hình chữ V Những lá sát dưới gốc đôi khi giảm đi chỉ cònnhững bẹ không phát triển hay giảm hẳn thành vảy [6; 7]

1.1.2.2 Cơ quan sinh sản

 Hoa: Hoa lan Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá Chồi hoa

mọc từ các mắt ngủ giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và cả trên ngọn, cả trênthân ngọn cây gọi là Keikei

- Biểu hiện trước khi ra hoa có sự khác biệt như: có nhiều loài rụng hết látrước khi ra hoa, thời gian ra hoa đầu mùa mưa hay đầu tết

- Hoa mọc thành chùm đơn hay chùm kép hay từng hoa riêng lẻ Cành hoa

dạng rũ xuống hay thẳng đứng Giống Dendrobium thường có hoa lâu tàn, trung

bình từ 1-2 tháng Thời gian nở hoa có khi là suốt năm

- Cấu trúc hoa thì cực kì phong phú và hấp dẫn về hình dạng cũng như màusắc, tuy nhiên chúng luôn có các điểm chung sau:

+) Bao hoa có 2 vòng và 3 mảnh bao gồm 3 cánh đài và 3 cánh tràng 3cánh đài thường có dạng 3 cánh hoa giống nhau hay cánh lưng dài hơn 2 cánhbên Các cánh đài dựng đứng hay trải ra 3 cánh tràng có 2 cánh bên rất giống vớicác cánh đài rời hay dính với cánh đài bên, cánh tràng bên được gọi là cánh môi

có màu sắc biến đổi sặc sỡ, hấp dẫn côn trùng giúp hoa thụ phấn Cánh môi códạng như: nguyên, chia thùy, khía răng, có ta viền hay chia thành các sợi mảnh

+) Ở Dendrobium và hầu hết các chi phong lan khác có cấu tạo nhị, nhụy

nằm chính giữa hoa là dấu hiệu cơ bản để định dạng loại hoa phong lan Trongkhoang nhỏ của cột nhị có đính 1 khối phấn có hàng trăm nghìn hạt phấn dínhlại Khối phấn có thể chia thành 2 hay 4 được xếp thành từng đôi một trongkhoang Thường có tinh bột, sáp hoặc có sừng cứng bao quanh khối phấn

 Trái (quả): Quả lan thuộc loại quả nang Khi chín các nang bung ra chỉcòn dính lại với nhau ở đỉnh và gốc Ở một số loài, khi chín quả không nứt ra nênhạt chỉ ra khỏi vỏ khi quả bị mục nát

 Hạt: Một quả chứa từ 10.000 đến 100.000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt nênhạt lan có kích thước rất nhỏ, phôi hạt chưa phân hóa Sau 12-18 tháng hạt chínphát tán nhờ gió Khi gặp nấm cộng sinh tương thích trong điều kiện phù hợp hạt

sẽ nảy mầm [6; 7]

Hình 1.1: Cấu tạo cơ quan sinh sản

a Cấu tạo hoa chi tiết; b Quả lan chín

1.1.3 Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium

1.1.3.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ tác động ở cây lan qua con đường quang tổng hợp, cường độquang hợp gia tăng theo nhiệt độ, thường nhiệt độ tăng 10% thì tốc độ quang hợptăng lên gấp đôi Nhiệt độ còn ảnh hưởng đến sự ra hoa ở một số loại lan như lanBạch câu đòi hỏi giảm nhiệt độ khoảng 5-60C trong vài giây thì 9 ngày sau sẽ nởhoa đồng loạt,…

Căn cứ vào nhu cầu nhiệt độ có thể tạm chia Dendrobium thành các nhóm

chính sau:

- Nhóm Dendrobium ưa lạnh sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ lý

tưởng là 150C gồm các giống được lấy từ các vùng cao nguyên của Việt Nam và

Miến Điện trên cao độ 1000m như: các loài Vảy cá (Dendrobium Linlleyi), Thủy Tiên Tím (Dendrobium amabile), Long nhãn kim điệp (Dendrobium fimbriatum).

Các loài này nếu được trồng ở nhiệt độ cao hơn hoặc bằng 250C, thì cây vẫnsống, nhưng phát triển yếu hơn và hiếm bao giờ ra hoa

- Nhóm Dendrobium ưa nóng, gồm đa số các giống Dendrobium rừng của Châu Úc, Indonesia, Malaysia và các loài của giống Dendrobium lai hiện được

trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh phía Nam, nhiệt độ thích hợp cho

các loài của nhóm này là 250C Tuy nhiên các giống Dendrobium lai chịu được

một nhiệt độ cao hơn nhiều

- Ngoài ra còn có một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùng

lạnh và vùng nóng, những ở vùng lạnh cây sinh trưởng và ra hoa nhiều hơn như:

các loài Dendrobium Primulinum, Dendrobium fanmeri, Dendrobium chrysotoxum nhiệt độ lý tưởng của các loài này là 200C [6; 7; 20]

1.1.3.2 Độ ẩm

Các cây lan, nhất là phong lan sống bám trên các cây cao, chúng lấy nước

từ các trận mưa, từ hơi nước trong không khí Chính độ ẩm quyết định sự hiệndiện của các loài phong lan

Thông thường độ ẩm tương đối tối thiểu 70% thích hợp cho sự tăngtrưởng của nhiều loài Cấu tạo giá thể quá ẩm và úng là điều kiện bất lợi cho sự

sinh trưởng của giống Dendrobium vì có thể toàn bộ rễ bị thối và biểu hiện là các

cây con mọc từ phần ngọn của thân Tuy nhiên độ ẩm lý tưởng nhất vẫn là độ ẩmcủa vùng bản xứ mà loài đó được tìm thấy [6]

1.1.3.4 Nhu cầu phân bón

Dendrobium thân đứng là loài lan đòi hỏi dinh dưỡng cao, chúng cần rất

nhiều phân bón và có thể dùng rất nhiều dạng phân bón khác nhau Còn các loại

Dendrobium thân thòng ăn phân yếu phải dùng nồng độ thật loãng.

Các loại phân hữu cơ như: phân heo, bánh dầu khô, phân tôm cá, phântrâu bò khô,…có thể dùng rất tốt bằng cách pha loãng với nước rồi tưới hoặc vòchặt thành từng viên đặt trên bề mặt giá thể, rễ lan sẽ hấp thu dần dần các dưỡngchất được phóng thích qua quá trình tưới nước.

Các loại phân vô cơ được dùng, thường có công thức 30-10-10 dùng 3 lần/

1 tuần với nồng độ 1 muỗng cà phê/4lít Trong suốt mùa tăng trưởng (từ đầutháng 5 đến cuối tháng 1) một tháng trước khi bước vào mùa nghỉ (trong suốttháng 2) ta bón phân 10-20-30 làm 2 lần/1 tuần để tạo một sức chịu đựng cho câytrước khi bước vào mùa nghỉ Trong mùa tăng trưởng nếu cây có nụ hoa, ta thayphân 30-10-10 bằng phân 10-20-20 với chu kỳ bón như trên cho đến kho hoa tàn

Trong mùa nghỉ hoàn toàn không bón phân cho Dendrobium, hay đúng hơn giảm và không bón phân cho Dendrobium khi cây hoàn tất thời kỳ tăng trưởng

hằng năm của nó [6; 7]

1.1.3.5 Sâu bệnh và các vấn đề khác

Vì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và

môi trường xơ dừa sẽ mục nát sau một thời gian ngắn được trồng Đây là 2nguyên nhân gây ra nhiều sâu bệnh hại cho các loài dán và cuốn chiếu cắn phá rễtrong giá thể

Cách phòng trừ sâu bệnh:

a) Bệnh hại trên lan:

- Bệnh đen thân cây lan: Do nấm Fusarium sp gây nên

Phòng trị: Nên tách những cây bị bệnh để riêng và dùng thuốc phòng trừhay nhúng cả cây vào thuốc trị nấm Nếu cây lớn hơn thì cắt bỏ phần thối rồiphun thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000

- Bệnh đốm lá: Do nấm Cercospora sp gây nên Bệnh thường phát sinh mạnh trên cây lan Dendrobium sp., gây hại trong mùa mưa ở những vườn lan có

độ ẩm cao Phun thuốc trừ nấm (như trên)

- Bệnh thán thư: do nấm Collectotrichicum sp gây ra Bệnh phát triển

mạnh vào mùa mưa nên phải phòng trừ trước Thường cắt bỏ lá vàng rồi phunthuốc diệt nấm 5 – 7 ngày/1 lần

- Bệnh thối mềm vi khuẩn: Do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra Vết

bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo chiềurộng của lá Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh mô bệnhkhô tóp có màu trắng xám

 Để phòng trừ bệnh do nấm, trước hết cần bảo đảm cho cây đủ dinh dưỡng

và tỷ lệ N:P:K phải cân đối Dư N và thiếu K thường làm cho lá mềm, dễ nhiễmbệnh Ánh sáng phải đầy đủ để giữ độ cứng cho lá Lá bị gãy do dư N, thiếu Khay do thiếu ánh sáng Không tưới dư nước vì dễ làm cho rễ và đọt úng Phunthuốc phòng ngừa thường xuyên 1 tháng 1 lần đến 2 lần Nếu thấy bệnh xuấthiện cần phun nhiều hơn (1 tuần 2 đến 3 lần) cho đến khi triệu chứng bệnh giảmthì trở lại phun theo cách phòng ngừa

Các thuốc có thể sử dụng là: Aliette 2/1000; Rovral 2/1000: trừ bệnh thốiđọt, thối cổ rễ ở cây con Zineb 2/1000, Maneb 2/1000, Captan 2/1000; Benlate1/1000; cerezan 1/1000 Các thuốc có chứa gốc Cu (Đồng) chỉ nên sử dụng ởcây trưởng thành và không nên dùng nhiều lần trong một thời gian ngắn Lá bịgãy do dư N, thiếu K hay do thiếu ánh sáng

b) Sâu hại lan:

Rệp vảy: Rệp thường bám trên các thân giả hành còn non Phòng trị bằngcách: Dùng bàn chải chà xát rồi phun dung dịch thuốc Malathion 50 pha loãng

Bọ trĩ: Gây hại chủ yếu trong mùa nắng Dùng Malathion 5 mg/bình 4 lítnước, phun 1 tuần/lần, phun liên tiếp liên tục trong 3 tuần [6; 7; 20]

1.2 Một số nghiên cứu về nhân giống lan Dendrobium

1.2.1 Trên thế giới

Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng

tăng nên việc nghiên cứu nhân giống lan Dendrobium rất được quan tâm và phát

triển mạnh mẽ

Tháng 6 năm 2006, S Aktar & cs tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinhhọc USDA, Sở Công nghệ sinh học, Đại học Nông nghiệp Bangladesh,

Mymensingh đã nghiên cứu khả năng hình thành rễ lan Dendrobium trong môi

trường có chứa nồng độ khác nhau của IBA (0, 0.5, 1.0, 1.5 và 2.0 mg/l) và 1%than hoạt tính Kết quả ra rễ tốt nhất thu được từ môi trường chứa 1,0 mg/l IBA[11]

Tháng 4 năm 2011, Sana Asghar & cs đã tiến hành nghiên cứu nhân

nhanh chồi giống lan Dendrobium nobile var Emma từ chồi nách sử dụng môi

trường có bổ sung benzylaminopurine (BAP) ở các nồng độ 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5

và 3,0 mg/l và kinetin (Kin) cũng như nước dừa (CW) với các thể tích khác nhau

50, 100, 150, 200, 250 và 300 ml Qua nghiên cứu họ nhận thấy ở môi trường cóchứa 1,5 mg/l BAP kết hợp với Kin cho kết quả nhân chồi cao nhất Tạo câyhoàn chỉnh tốt nhất trên môi trường chứa 2 mg/l IBA với tỷ lệ phần trăm rễ(97,5%) số lượng rễ (4,70) và chiều dài cây (3,47 cm) hiệu quả hơn so với NAA.Nồng độ cao hơn của IBA và NAA (3,0 mg/l) cho thấy khả năng hình thành rễkém [12]

Tháng 8 năm 2010, M Maridass & cs đã tiến hành nhân giống in vitro phong lan Dendrobium nanum từ nguồn vật liệu ban đầu là thân rễ Nghiên cứu

này được đăng trên Tạp chí Công nghệ sinh học quốc tế (2010) Vật liệu thân rễđược rửa bằng nước cất, rửa qua ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theo khử trùngvới hypoch natri 3% (bổ sung 2-3 giọt Tween 80 EAC ml) trong 20 phút và sau

đó rửa sạch cho 4-5 lần bằng nước cất vô trùng Thân rễ được trẻ ra cắt miếngnhỏ (5mm) và các mảnh rễ được cấy trên môi trường cơ bản của MS có bổ sungcác kích thích tố như NAA, BAP và kinetin Các mẫu hình thành protocorm tốt

trên môi trường có chứa 2.0μMM / l NAA và 1,2 μMM / l kinetin Sau đó protocormphát sinh chồi tốt nhất trên môi trường MS + 0.5μMM / l BAP [13].

Năm 2011, trên tạp chí của trường đại học Khoa học & Công nghệ Assam

S Dutta1, A Chowdhuryl và cs đã đăng công trình nghiên cứu của mình về việc

phát triển và nhân nhanh giống lan Dendrobium aphyllum Vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu này là các hạt lan Dendrobium aphyllum Các quả lan mười lăm

tuần tuổi sau khi khử trùng, các hạt được tách ra và gieo trực tiếp lên môi trường

MS cơ bản Sau năm tuần theo dõi nhóm nghiên cứu đã ghi nhận kết quả với tỷ lệnảy mầm và hình thành protocorm của hạt đạt 90,6% Các protocorm tiếp tụcđược cấy chuyển sang môi trường mới là môi trường MS cơ bản có bổ sung cácchất điều hòa sinh trưởng IAA và Kin riêng rẽ và kết hợp với các nồng độ khácnhau Kết quả ghi lại sau hai tuần theo dõi cho thấy các protocorm (PLBs) có sựphát triển rễ và chồi Kết quả này có sự khác biệt đáng kể giữa các môi trường

Từ chiều dài trung bình của rễ và chồi được ghi lại cho thấy sự phát triển tốt nhấttrên môi trường kết hợp MS + 0.05mL (50µg/100mL) IAA+0.15mL(50µg/100mL) Kin với thông số chiều dài rễ và chồi là (0,50 cm và 0,78 cm)[14]

Với Maslini Japar Ali, Rosmah Murdad and Mariam Abd Latip tai trườngĐại học Sabah Malaysia Vừa qua năm 2011, họ đã tiến hành nghiên cứu xácđịnh môi trường và điều kiện ánh sáng thích hợp nhất cho sự nảy mầm hạt giống

in vitro của Dendrobium tetrachromum và Dendrobium hamaticalcar Hạt từ quả

trưởng thành (120 ngày sau khi thụ phấn) được tách và nuôi cấy thí nghiệm trêncác môi trường: ½MS, MS và KC Những ảnh hưởng của các loại phụ gia hữu cơnhư nước dừa(5, 10, 15, 20%), peptone, chiết xuất từ khoai tây, và men bia nồng

độ khác nhau (1, 2, 4 và 6g/L) đến hạt giống nảy mầm cũng đã được nghiên cứu.Các kết quả thu được trong các thí nghiệm cho thấy rằng hạt giống các loài

D.tetrachromum nảy mầm rất tốt trên tất cả các môi trường cơ bản đã thử nghiệm

với hơn 50% sự nảy mầm diễn ra khi theo dõi sau 30 ngày và 100% sau 70 ngày

Đối với D hamaticalcar, ½MS là môi trường tốt nhất cho nảy mầm hạt giống.

Khi bổ sung CW 15% hoặc 2 GL-1 peptone vào môi trường ½ MS thấy chúng

tăng cường nảy mầm của hạt giống D.tetrachromum Tại thời điểm nuôi 30 ngày,

hơn 90% hạt giống đã nảy mầm và nảy mầm 100% được lấy khi nuôi được 50

ngày Đối D hamaticalcar, bổ sung 1 g/L men hoặc nước chiết khoai tây 1 g/L vào ½ MS cũng kích thích nảy mầm hạt giống in vitro 30 ngày, tỷ lệ nảy mầm

thu được là 88% (nấm men) và 96% (khoai tây) và 100% nảy mầm đã được quansát thấy sau 50 ngày Đối với cả hai loài, 24 giờ chiếu sáng phù hợp cho hạtgiống nảy mầm trong ống nghiệm [15]

Bijaya Pant and Deepa Thapa (5/2012) khi nghiên cứu để phát triển một

giao thức nhân nhanh một giống Dendrobium primulinum Lindl có nguy cơ tuyệt

chủng đã nhận thấy: thông qua việc nuôi cấy các đỉnh chồi có kích thước từ 0.3đến 0.5mm trên môi trường MS cơ bản và môi trường MS có bổ sung với sự kếthợp của các nồng độ khác nhau của các chất điều hòa tăng trưởng NAA, BAPcác protocorm hình thành đã sản xuất chồi và rễ Sau 5 tuần nuôi cấy số lượngchồi tăng nhanh nhất trên môi trường MS với BAP (1,5 mg/l) và NAA (0,5 mg/l).Trong thí nghiệm tạo rễ, rễ được quan sát sau 3 tuần cấy thấy trên môi trường

MS với nguồn cung cấp ngoại sinh của IAA 0.5 mg/l cây lan ra rễ tốt nhất Khi racây trên giá thể đất sạch và rêu (dớn) tỷ lệ 2:1 Gần 70% của cây con sống sót[16]

Trong năm 2007-2008, một nhóm nghiên cứu tại trường Đại học Quốc giaSingapore đã phát triển thành công một phương pháp để tạo hoa trong ống

nghiệm giống lan ở vùng nhiệt đới Dendrobium Chao Praya nụ cười (Dendrobium Pinky, Dendrobium Kiyomi Beauty) với nguyên liệu từ hạt trên môi

trường KC (Knudson năm 1946) [17]

Lá cắt ra từ cây con trong ống nghiệm của giống Vanda Somsri hồng và Dendrobium Bobby Mesina Red đã được sử dụng trong nghiên cứu để tạo ra PLB

(Protocorm Like Body) của Chong Siang Tee và cs Và các chồi lá đã được nuôicấy trên môi trường MS cơ bản với 3% (w/v) sucrose Các loại điều hòa sinhtrưởng thực vật như 1-napthaleneacetic acid (NAA), picloram, 6-benzyladenine(BAP) và kinetin với nồng độ khác nhau (1, 3, 5 mg/L) đã được sử dụng đểnghiên cứu tác động đến sự phát triển PLBs [18]

1.2.2 Ở Việt Nam

Hiện nay, ngoài các có các công trình nghiên cứu về cây lan Dendrobium

trên thế giới, tại nước ta công việc nghiên cứu để nhân nhanh giống lan này cũngđang rầm rộ phát triển Dưới đây là một vài công trình nghiên cứu điển hình

Năm 2006, Trịnh Cẩm Tú và cs đã có công trình “Sử dụng kỹ thuật nuôi

cấy in vitro để nghiên cứu về sự phát triển của phát hoa Dendrobium sonia” Công trình này cho ta thấy được sự ra hoa của Dendrobium sp liên quan đến sự

chuyển tiếp mô phân sinh dinh dưỡng tạo lá và thân sang mô phân sinh sinh dụctạo hoa Bên cạnh đó vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ảnhhưởng đến số lượng hoa cũng được thảo luận [9]

Bùi Thị Tường Thu và cs (2007), khi nghiên cứu sự ảnh hưởng của chấtđiều hòa sinh trưởng đến quá trình phát sinh phôi và tế bào đã đưa ra một số kết

quả về lan Dendrobium như sau: Mẫu nuôi cấy ban đầu là chồi non, được cắt

thành lát mỏng, nuôi cấy trên môi trường VW + 1 mg/l BA + 0,3 mg/l NAA + 10

% CW + 1 g/l peptone + 20 g/l sacchrose + 1 g/l AC Sau thời gian nuôi cấy 30ngày, tế bào soma phát sinh trên vết cắt Tỷ lệ tạo soma là 100% trên các mẫunuôi cấy Tế bào soma màu trắng sáng, được tiến hành nhân sinh khối trên 6 môitrường thực nghiệm và kết quả thu được tế bào soma tăng sinh mạnh mẽ trên môitrường VW + 1 mg/l BA + 0,3 mg/l NAA + 10% CW [10]

Các phương pháp nuôi cấy ứng dụng kỹ thuật lát mỏng tế bào ngày càngđược sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Nguyễn Thanh Tùng và

cs (2010), đã áp dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân giống in vitro cây Hoàng thảo thân gãy (Dendrobium aduncum) Trong nghiên cứu của

nhóm tác giả này đã dùng vật liệu khởi đầu để cắt lát mỏng theo chiều ngang

TCL là chồi in vitro Kết quả cho thấy mẫu cảm ứng tốt trên môi trường ½ MS

có bổ sung thêm 0,5 mg/l BA và tái sinh tốt trên môi trường MS có bổ sung 3mg/

l Kin + 0,3 mg/l NAA Từ protocorm tỷ lệ chồi đạt được 5,67 chồi/mẫu [8]

Lan Dendrobium là loại cây sống bám trên cây hoặc trên giá thể trồng Vì

vậy, việc nghiên cứu giá thể trồng thích hợp cho loại lan này là điều hết sức quan

trọng Năm 2007, nhóm tác giả tại TP Hồ Chí Minh do Huỳnh Thanh Hùng chủ

trì đã nghiên cứu và đưa ra một loại giá thể trồng phù hợp với lan Dendrobium.

Tác giả nhận thấy trồng trên giá thể phối hợp giữa phân trùn, sơ dừa, rễ lục bình

và dớn cho cây lan Dendrobium sinh trưởng tốt nhất [1].

Vũ Ngọc Lan và cs (2010), khi nghiên cứu giá thể trồng lan Hoàng thảo

(Dendrobium hancockii) cho thấy loại lan này sống thích hợp nhất trên giá thể gỗ

nhãn [4]

1.4 Các phương pháp nhân giống trên cây lan

1.4.1 Các phương pháp nhân giống truyền thống

1.4.1.1 Nhân giống vô tính

a) Tách bụi:

- Phương pháp này dùng để tách các chậu lan quá đầy, đồng thời làm tăng

số lượng cây mới

- Các giả hành già được tách ra khi hoa đã tàn và chỉ tách khi đã trồng được

từ 2 - 3 năm Giả hành già được ươm lại trên giá thể ẩm để tạo chồi con, các chồicon được nuôi cùng với giả hành cho đến lúc đã tạo ra rễ mới, đủ sức phát triểnmới tách lần thứ hai Từ một giả hành có thể cho mỗi đợt 1 - 2 cây con [6; 21] b) Chiết cành:

Ở Dendrobium thường tạo ra cây con trên giả hành (Keikei) một cách tự

nhiên Khi các cây con phát triển khá mạnh, có rễ tốt có thể tách ra khỏi giả hành

để trồng

- Phương pháp chiết tách đảm bảo được tính chất di truyền của cây bố mẹnhưng lại cho một thế hệ cây con sinh trưởng không đồng đều nên khó cung cấpmột số lượng cây con lớn để phục vụ cho nuôi trồng với quy mô lớn [6; 21]

1.4.1.2 Nhân giống hữu tính

a) Sự thụ phấn: Trong thiên nhiên sự thụ phấn ở lan do côn trùng thực hiện.Cấu trúc của hoa lan là hoàn toàn để thích nghi cho sự thụ phấn ấy

Có 2 phương pháp thụ phấn:

- Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa của bông hoa này được rơi trên núm nhụycủa chính hoa ấy Điều này hiếm khi xảy ra trong tự nhiên ở hoa lan vì cấu trúccủa bộ phận sinh dục đực và cái ở hoa lan

- Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa ở hoa này rơi vào núm nhụy của hoakhác của cùng một cây hay cùng loài (thường xảy ra trong thiên nhiên do côntrùng thực hiện), hoặc khác loài, khác giống (thường do con người thực hiện).b) Quả lan: Nếu sự thụ phấn có kết quả thì có thể ngay trong ngày hay sangngày hôm sau, các phiến hoa xụ lại nhưng không rụng Và để tránh sự thụ phấnkhác do côn trùng người ta dùng bao nilon trùm lại nhưng không buộc kín miệng

vì hầm hơi sẽ làm hư trái

Sau khi thụ phấn, bầu noãn từ từ trương, phình to ra thành trái Mỗi trái cóthể chứa hàng ngàn đến triệu hạt Khi trái từ màu xanh lục chuyển sang màuvàng lục thì nên hái trái

c) Gieo hạt: Trong thiên nhiên muốn hạt lan nảy mầm được thì hạt lan phảiđược nhiễm một loại nấm ký sinh Người ta đã khám phá ra một số loài nấm giúphạt lan nảy mầm Mỗi loài chỉ giúp nảy mầm ở một số giống lan mà thôi

- Rhizoctonia repens giúp nảy mầm Cattleya, Cypripedium, Dendrobium.

- Rhizoctonia mucoroudes giúp nảy mầm Vanda, Phalaenopsis.

- Rhizoctonia lanugiosa giúp cho hạt nảy mầm ở Oncidium [6; 21].

1.4.2 Phương pháp nhân giống vô tính in vitro

Do các phương pháp nhân giống truyền thống thường cho hiệu quả nhângiống thấp và chất lượng cây giống không cao nên trong phòng thí nghiệm chúng

tôi đã tiến hành nhân giống lan Dendrobium bằng phương pháp nhân giống vô tính in vitro.Phương pháp này có các ưu điểm sau:

- Hệ số nhân giống nhanh

- Cho ra các cá thể tương đối đồng nhất về mặt di truyền

- Có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đốitượng khó nhân bằng phương pháp thông thường)

- Chủ động kế hoạch sản xuất

- Tạo được cây sạch virus

- Các cây sau nhân in vitro có xu hướng được trẻ hóa nên nâng cao hiệu

quả nhân bằng các phương pháp thông thường sau đó [2]

1.5 Sơ lược về kỹ thuật nhân giống in vitro

- Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden

và Schwann vào thực nghiệm Tuy nhiên, ông đã gặp thất bại trong nuôi cấy các

tế bào đã phân hoá tách từ lá một số cây một lá mầm: Erythronium, Ornithogalum, Tradescantia (do cây một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy,

hơn nữa ông dùng các tế bào mất khả năng tái sinh)

- Năm 1922, Kotte (học trò của Haberlandt) và Robbins đã thành côngtrong việc lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ rễ củamột cây hoà thảo trong môi trường lỏng chứa muối khoáng và glucose Tuynhiên, sự sinh truởng chỉ tồn tại một thời gian, sau đó chậm dần và ngừng lại mặc

dù tác giả chuyển qua môi trường mới

- Năm 1934, White J.P thông báo nuôi cấy thành công trong một thời gian

dài đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng chứa

muối khoáng và glucose và nước chiết nấm men Sau đó, cũng chính Whitechứng minh có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hổn hợp loại vitamin B:Thiamin (B1), Pyridoxin (B6), Nicotinic acid Đồng thời trong thời gian này, R.J

Gautheret (ở Pháp) đã tiến hành nuôi cấy môi tượng tầng một số cây gỗ (câyliễu) khi đưa auxin vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên sự sinh sản các tế bàođầu tiên không vượt quá 8 tháng

- Năm 1939, Gautheret thông báo kết quả đầu tiên của ông với Viện Hàn

Lâm Khoa Học Pháp về việc nuôi cấy các mô vô hạn của cây cà rốt (Daucus carote )

- Sau thế chiến thứ hai, lĩnh vực này đặc biệt phát triển nhanh và nhiều kếtquả nghiên cứu quan trọng trong nông nghiệp được công bố [2]

1.5.2 Các kỹ thuật nhân giống in vitro

 Nhân giống bằng chồi nách

Chồi nách nhô từ vị trí bình thường trong nách lá mang đỉnh sinh trưởngphụ có khả năng mọc thành chồi giống như thân chính Khi các mẫu cấy là chồiđược giảm ưu thế ngọn sẽ dẫn tới sự tự sản xuất chồi nách ở mỗi lá hay ở cả nách

lá Trong nhiều loại cây trồng, chồi nách xuất hiện tùy vào sự cung cấp cytokinin,chồi nách thường xuất hiện sớm và phát triển thành chồi bậc hai, bậc ba … Khicác cụm chồi này phát triển chúng ta có thể phân tách để cấy chuyền trong môitrường mới

Nói chung kỹ thuật tăng sinh bằng chồi nách được áp dụng cho bất kỳ câycây trồng sản xuất chồi nách bình thường và phản ứng với cytokinin như: BAP,Zip & Zeatin (Mantell, Mathew & Mackee) [2]

 Nhân giống bằng chồi đỉnh

Sự thành công trong nuôi cấy đỉnh chồi thay đổi tùy theo mẫu cấy sử dụng

và việc áp dụng kích thích tố riêng biệt Kích thước đỉnh chồi nhỏ (0.1 mm - 0.5mm) thường khó cắt và cho tỉ lệ sống thấp, nhưng nó lại quan trọng trong việcphát triển nguyên liệu gốc sạch bệnh Những kích thước đỉnh chồi từ 0.5 mm - 2

mm thì thông dụng hơn và thích hợp trong việc nhân giống (Hartmann & Kester,1983) Thường nuôi cấy đỉnh chồi trong môi trường có chứa auxin kết hợp vớicytokinin, nồng độ cytokinin sẽ tăng lên trong những lần cấy chuyền [2]

 Nhân giống bằng chồi bất định

Chồi bất định là một cấu trúc thân và lá mọc lên một cách tự nhiên trên môcây trồng, ở vị trí khác với nách lá bình thường Một số các nguyên liệu nuôi cấygồm: lá, vẩy, cuống lá…Mặc khác các chồi mới có thể phát triển gián tiếp từcallus hình thành trên mặt cắt của mẫu cấy Chồi nhô lên từ ngoại biên của callus

và không liên hệ trực tiếp tới mô mạch của mẫu cấy Tuy nhiên chồi bất định cóthể làm tăng tỉ lệ cây bị biến dị [2]

1.5.3 Quy trình nhân giống

1.5.3.1 Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

- Chọn cây mẹ để lấy mẫu, thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tếcao

- Chọn cơ quan để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ,hoa non, lá non,…

- Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao, sạchbệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ổn định Tùy điều kiện,giai đoạn này có thể kéo dài 3 đến 6 tháng

1.5.3.2 Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng

Mục đích là tạo ra nguồn nguyên liệu thực vật vô trùng đưa vào nuôi cấy

- Tốc độ sinh trưởng nhanh

Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc nhiều vào cách lấy mẫu Quan trọngnhất vẫn là đỉnh sinh trưởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân,mảnh lá, rễ…Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và môitrường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh trưởng nhanh [2]

1.5.3.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Quá trình nhân giống in vitro là quá trình tạo ra hệ số nhân chồi cao nhất

Để tăng hệ số nhân giống thì thành phần môi trường và các điều kiện nuôicấy phải được tối ưu hóa Môi trường nuôi cấy phải được đưa thêm các chất điềuhòa sinh trưởng: auxin, cytokinin, gibberelin… các chất bổ sung khác như nướcdừa, nước chiết nấm men… kết hợp các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng phù hợp

Thường thì trong giai đoạn này nên tăng cường thời gian chiếu sáng 16giờ/ngày, tối thiểu 1.000 lux Trong thực tế nghiên cứu, người ta nhận thấy khótách biệt ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng khỏi ảnh hưởng của cường độ chiếusáng Ánh sáng tím là thành phần quan trọng kích thích phân hoá Ánh sáng đỏ

có ảnh hưởng giống cytokinin (cytokinin-like effect), nó tạo nên sự tích lũycytokinin trong mô của một số loài, chính lượng cytokinin này đã góp phần kích

thích quá trình phát sinh cơ quan và tạo chồi từ những mô nuôi cấy in vitro.

Về nhiệt độ phải bảo đảm chế độ nhiệt độ trong khoảng 20-300C Trườnghợp những loài có nguồn gốc nhiệt đới, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp vào khoảng

từ 32-350C Ngược lại, đối với những loài hoa ở vùng ôn đới nhiệt độ thích hợpcho quá trình tạo cụm chồi phải < 300C

Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thứcnhân nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện tối thích [2]

1.5.3.4 Giai đoạn 4: Tạo rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát sinh rễ tự nhiên,nhưng thông thường các chồi này cần phải cấy chuyển sang một môi trường khác

để kích thích tạo rễ Ở một số loài các chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực tiếp rađất Giai đoạn này thường cần từ 2 đến 8 tuần [2]

1.5.3.5 Giai đoạn 5: Đưa cây ra vườn ươm

Đây là giai đoạn quan trọng bởi cây lúc này sẽ chuyển từ trạng thái dịdưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn

Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởngtốt cần đảm bảo:

- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá,

số rễ, chiều cao cây)

- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp

- Đặc biệt trong thời gian này cây phải được chăm sóc và bảo bệ trướcnhững yếu tố bất lợi sau:

+ Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô

+ Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn

+ Cháy lá do nắng [2]

1.6 Các yếu tố ảnh hưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Có 3 nhân tố chính:

- Đảm bảo điều kiện vô trùng

- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách

- Chọn mô cấy, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy

1.6.1 Đảm bảo điều kiện vô trùng

1.6.1.1 Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muốikhoáng, vitamin…rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển Do tốc

độ sinh trưởng và phát triển của các loại vi sinh vật này lớn hơn rất nhiều so vớicác tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ bị nhiễm một vài bào tửnấm hoặc vi khuẩn thì chỉ sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường

và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn Thí nghiệm sẽphải bỏ đi vì trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không thể phát triển và chết dần

Do đó, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô tế thực vật đòi hỏirất nghiêm khắc [2; 5]

1.6.1.2 Nguồn tạp nhiễm

Có 3 nguồn tạp nhiễm chính :

- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối

- Trên bề mặt hoặc bên trong các mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bào tửnấm hoặc vi khuẩn

- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn hoặc theo bụi lên bềmặt môi trường [2; 5]

1.6.2 Chọn môi trường dinh dưỡng

Thành công chính trong các thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật làtìm ra thành phần vật chất của môi trường dinh dưỡng cần thiết để tế bào có thểsinh trưởng và phát triển được Thành phần của môi trường dinh dưỡng thay đổitùy theo loài và bộ phận nuôi cấy, tùy theo sự phát triển và phân hóa của mô cấytùy theo việc muốn duy trì mô ở trạng thái callus, muốn tạo rễ, tạo mầm haymuốn tái sinh cây hoàn chỉnh

Hiện nay người ta đã đưa ra rất nhiều loại môi trường khác nhau cho cácthí nghiệm nuôi cấy mô Tuy nhiên, dù sử dụng môi trường nào đi chăng nữa thìmôi trường đó cũng phải đảm bảo đầy đủ 5 thành phần dinh dưỡng cần thiết saucho các mô cấy phát triển bình thường

- Đường làm nguồn cacbon

- Các muối khoáng đa lượng

- Các muối khoáng vi lượng

- Các vitamin

- Các chất điều hòa sinh trưởng

Ngoài ra, tùy từng nghiên cứu mà có thể bổ sung thêm một số chất hữu cơ

có thành phần hóa học xác định (các amino acid, EDTA,…) hoặc không xác định(nước dừa, nước chiết nấm men, nước chiết cà chua…) [2; 5]

1.6.3 Chọn mô cấy và xử lý mô cấy

Không có những hướng dẫn cụ thể trong việc chọn mô cấy Về nguyêntắc, trừ những mô cấy đã hóa gỗ, các mô khác nhau trong cơ thể thực vật đều cóthể dùng làm mô cấy Tuy vậy, có thể nhận xét chung là các mô đang phát triểnmạnh (mô phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phat triển, thịt quả non,cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh đốt,…) khi đặt vào môi trường có chứa mộtlượng chất kích thích sinh trưởng thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo Đểnghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, trước tiên người ta chú ý đếncác chồi nách và mô phân sinh ngọn [2; 5]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu trong thí nghiệm này là nguồn mẫu invitro giống lan Dendrobium Aduncum có sẵn trong phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật tại trường

ĐH Bách Khoa Đà Nẵng

Dendrobium Aduncum là loài lan rừng có hoa nhỏ mọc thành chùm

Tên Khoa học: Dendrobium aduncum Wall ex Lindl.

Tên tiếng Việt: Hoàng Thảo Thân gãy, Thập hoa, Hồng câu, Thạch hộc móc, lan móc, Câu trạng thạch hộc,…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

 Quy trình nhân giống cây lan Dendrobium Aduncum

(Nguồn vật liệu tự nhiên)

(Chồi phát sinh từ protocorm)

(Protocorm)

(Nhân chồi)

(Cây hoàn chỉnh) (Vườn ươm)

2.2.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường MS (Murashige and Skoog,1962) là môi trường cơ bản được

dùng để nuôi cấy giống lan Dendrobium aduncum trong suốt quá trình nghiên

cứu Môi trường có bổ sung riêng rẽ hoặc kết hợp các chất điều hoà sinh trưởngvới nồng độ khác nhau tuỳ theo mục đích của từng thí nghiệm Nguồn cacbonđược cung cấp bởi đường saccharose, môi trường được làm đặc bằng agar, pHmôi trường được điều chỉnh đến 5,8 trước khi hấp khử trùng ở 1210C trong thờigian 20 phút

Để nâng cao chất lượng nhân giống chúng tôi có bổ sung vào môi trườngnước dừa (CW - Coconut water) và than hoạt tính (AC - Activated charcoal).

- Môi trường nhân protocorm:

MS + (0,5mg/l →1,5mg/l) BA + 0,5mg/l NAA + 15% CW + 0,5 % AC +2% đường + 0,8% agar

- Môi trường nhân nhanh cụm chồi:

MS + (0,5mg/l →2mg/l) BA + 0,1mg/l NAA + 10% CW + 0,5 % AC +2% đường + 0,8% agar

- Môi trường tạo cây hoàn chỉnh:

MS + (0,1mg/l →0,9mg/l) NAA + 0,1mg/l BA + 10% CW + 0,5 % AC +2% đường + 0,8% agar

MS + (0,5mg/l →1,5mg/l) IAA + 10% CW + 0,5 % AC + 2% đường +0,8% agar

MS + (0,5mg/l →1,5mg/l) IAA + 0,1mg/l Kin + 10% CW + 0,5 % AC +2% đường + 0,8% agar

2.2.2 Điều kiện nuôi cấy

Các mẫu cấy được nuôi ở nhiệt độ 250C ± 2, ánh sáng 2000-3000 lux, thờigian chiếu sáng 8-10 h/ngày

2.3 Thiết kế thí nghiệm

2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự nhân nhanh protocorm.

Thí nghiệm được bố trí với 4 loại môi trường nuôi cấy khác nhau Môitrường gồm môi trường MS cơ bản, trong đó có 20 g/l saccharose, 8 g/l agar,15% CW, 0,5 g/l AC và bổ sung thêm các chất điều hoà sinh trưởng BA (0; 0,5;1; 1,5) mg/l sử dụng kết hợp với NAA có nồng độ 0,5 mg/l

Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức môitrường cấy 15 mẫu, mỗi mẫu có kích thước 0,5 cm

Quan sát và ghi nhận kết quả sau 4 tuần nuôi cấy

* Chỉ tiêu theo dõi:

- Kích thước

- Màu sắc

- Trạng thái mẫu protocorm

2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự nhân nhanh chồi lan.

Thí nghiệm được bố trí trên 5 loại môi trường nuôi cấy khác nhau Trongmôi trường thành phần chính là môi trường MS trong đó có 20 g/l saccharose, 8g/l agar, 10 % CW, 0,5 g/l AC và bổ sung thêm các chất điều hoà sinh trưởng là

BA kết hợp với NAA với các nồng độ khác nhau, BA (0; 0,5; 1; 1,5; 2) mg/l kếthợp với NAA có nồng độ cố định là 0,1 mg/l

Trong công đoạn này chúng tôi thực hiện cấy các mẫu chồi sau khi đã thunhận được ở công đoạn trước - công đoạn nhân nhanh protocorm Đây là giaiđoạn quan trọng quyết định đến số lượng cây giống đạt được của cả quá trìnhnhân giống

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi môi trường được thực hiện từ18-20 cụm chồi Kích thước mỗi cụm là 1 cm Trên các cụm có mang nhiềuprotocorm hoặc các đỉnh chồi phát sinh từ protocorm Trong thí nghiệm này cácchỉ tiêu được theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy

* Chỉ tiêu theo dõi:

- Số chồi/mẫu cấy ( hệ số nhân chồi)

- Chiều cao chồi

- Số lá/chồi

2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến khả năng hình thành rễ của cây lan.

Với cách bố trí ngẫu nhiên trên 6 loại môi trường khác nhau chúng tôi đã

tiến hành khảo sát khả năng hình thành rễ của giống lan Dendrobium Aduncum

trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 20 g/l saccharose, 8 g/l agar, 10 % CW,0,5 g/l AC Môi trường có bổ sung NAA với nồng độ (0; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9)mg/l kết hợp với 0,1 mg/l BA Quan sát và thu nhận kết quả sau 4 tuần nuôi cấy

* Chỉ tiêu theo dõi

- Tỷ lệ ra rễ

- Số rễ/cây

- Chiều dài rễ

- Số lá/cây

- Chiều cao cây

2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ IAA và Kin đến khả năng hình thành rễ lan.

Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 7 loại môi trường khác nhau, trong

đó thành phần chính của các môi trường là môi trường cơ bản MS có bổ sung 20g/l saccharose, 8 g/l agar, 10 % CW, 0,5 g/l AC và các chất điều hoà sinh trưởngIAA với nồng độ (0; 0,5; 1; 1,5) mg/l sử dụng riêng rẽ và IAA nồng độ (0; 0,5; 1;1,5) mg/l kết hợp với 0,1 mg/l Kin Quan sát và thu nhận kết quả sau 4 tuần nuôicấy

* Chỉ tiêu theo dõi

- Tỷ lệ ra rễ

- Số rễ/cây

- Chiều dài rễ

- Số lá/cây

- Chiều cao cây

2.4 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

- Thời gian: Từ tháng 2 năm 2012 đến tháng 5 năm 2012

- Địa điểm: Trung tâm Công nghệ Tế bào Thực vật, Trường Đại học BáchKhoa- Đại học Đà Nẵng

2.5 Xử lý số liệu

Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm thống kê spss 16.0 với mứcxác suất có ý nghĩa p < 0,05

- Tên đầy đủ: Spss inc Headquarter

- Xuất xứ: United States 2007