Khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá và rễ cây nhàu (morinda citrifolia l ) in vitro

Ngăn chặn sự tiến triển của các bệnh lý trên bằng cách bổ sung các chất chống oxy hóa tự nhiên hiện diện trong thực vật do các chất chống oxy hóa này có khả năng làm sạch các gốc tự do

TRUONG DAI HQC CAN THO KHOA KHOA HOC TU NHIEN

CBS

LUAN VAN TOT NGHIEP DAI HOC CHUYEN NGANH SINH HQC

KHAO SAT KHA NANG CHONG OXY HOA

CUA CAO CHIET LA VA RE

CAY NHAU (Morinda citrifolia L.) IN VITRO

Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Cần Thơ, Tháng 5/2013

LỜI CÁM ƠN

Luận văn tốt nghiệp đóng một phần quan trọng trong hành trang học tập của sinh viên nói chung, sinh viên ngành Sinh Học nói riêng Nó giúp tôi có thê tiếp cận được với thực tế, có thêm nhiều kiến thức về ngành học và định hướng cho lựa chọn nghiên cứu khoa học sau này; từ đó trang bị những kiến thức thực tế tổng quan giúp tôi có khả năng định hướng tốt công việc và có những chuẩn bị tốt sau khi kết thúc học tập ở trường

Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc nhất đến Cô TS Đái Thị Xuân Trang đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành đến quí Thầy Cô Bộ môn Sinh học - Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã cho tôi nền tảng kiến thức, cho tôi niềm tin để tôi có thể học hỏi và trao đồi thêm kỹ năng của mình Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến quí Thầy Cô

Bộ môn Hóa học - Khoa Khoa Học Tự Nhiên, các anh chị cán bộ Phòng Sinh Học Phân Tử - Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi

hoàn thành tốt luận văn

Tôi xin cám ơn bạn Nguyễn Phạm Phương Thảo và chị Ninh Khắc Huyền

Trân, Cao Học Sinh Thái Học K18 đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình

nghiên cứu, các bạn lớp Sinh Học K35 đã chia sẻ, động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Có thể trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, với vốn kiến thức và kinh nghiệm còn non nớt, chắc chắn tôi không thể không có những thiếu sót nhất định Rất mong được sự hướng dẫn, chỉ bảo từ phía quí thầy cô, các anh chị đi trước đề tôi

có thể hoàn thiện hơn, tiếp tục con đường nghiên cứu vì khoa học, vì xã hội

Xin chân thành cảm ơn!

Hồ Ngọc Phụng

LỜI CAM KÉT

Tôi xin cam đoan Luận văn này được hoàn thành dựa trên kết quả nghiên cứu

của tôi dưới sự hướng dẫn của Cô Đái Thị Xuân Trang Các số liệu và kết quả trình

bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa từng được cá nhân nào công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây

Cán bộ hướng dẫn Tác giả luận văn

TS Đái Thị Xuân Trang Hồ Ngọc Phụng

-11-PHAN KY DUYET CAN BO HUONG DAN

Ts Dai Thi Xuân Trang

DUYET CUA HOI DONG BAO VE LUAN VAN

Cân Thơ, ngày tháng năm 2013 CHU TICH HOI DONG

iti

-MỤC LỤC CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU - 22292EEE©+E+22EEEEE++2222215122222221322222112ecee 1 LiL Dat VAI AG occ cecccecssssssscsssveessssseeessssessssvesssseessssessssssessssevesssuesssssetsssseieesseseees 1

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.3 Nội dung nghiên CỨU ¿5:5 2x x2 HH HH Hư 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU . 2222222222¿2¿22cceccereerreresree 3

2.1 Sơ lược về chất chống oxy hóa - 2222¿+2222E+22+tEE2E1522E2EEE.ccrrrrkex 3 2.1.1 StressS OXy hÓa chì HH H1 HH re 3

2.1.2 Chất chống oxy hóa -22222222c 2222222112122 4

2.1.2.1 Chất chống oxy hóa có bản chất enzyme -5222cccvcce: 5 2.1.2.2 Chất chống oxy hóa không có bản chất enzyme -:¿ 7 2.2 Giới thiệu về Trolox con e U1 2.3 Đại cương về cây Nhàu - 2222 2222122211122 cerre 12

2.3.1 Khoa phan loa ố 12

2.3.2 Đặc điểm Him thai e ccssessssssscssssssssssssessesseccssssssssessseecsssssssssssssnseeeeees 12

2.3.3 Thành phần hóa học của cây Nhàu

2.4 Một số nghiên cứu về cây Nhàu -2¿-2¿©2222+22+ttEEEEEErrtrrkkrrrrrrrrek 13

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Phurong tin nghiém CUU occ 17

3.1.1 Dia diém va thoi gian thực hiện - - 5c net, 17

-iv-3.1.3 Hóa chất ch H001 17 3.1.4 Đối tượng nghiên cứu -2c¿++2222+2++2222215222222112 22222212 errrkk 18 3.2 Phương pháp nghiÊn CỨU - 6 S9 Ek SE RE HH rgiưy 18 3.2.1 Phương pháp khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá và rễ cây 0n, 0T ồ.ồ.ồ.ồ.ồ.ốẻốằốằố 18 3.2.1.1 Phương pháp trích cao lá và rễ cây Nhàu bằng dung môi ethanol 18 3.2.1.2 Khảo sát sự chống oxy hóa téng sé (Total Antioxidant Status (TAS) assay) in vitro của cao chiết lá và rễ cây Nhầu -c2cccccccccce 19

3.2.2 Thống kê phân tích số liệu -2222222v++ccrrsttttEEEkrrvrrrrrrrree 20 CHƯƠNG 4 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN -¿22222222222222ccrrrrree 21 4.1 Xác định độ ẩm của các mẫu làm 21 4.2 Khao sat kha nang chéng oxy hóa tổng số (Total Antioxidant Status (TAS) assay) của cao chiết lá và ré cay Nhu it Vitro ccsscccssssssssssssssssesssssssssessesssseesseees 21 CHUONG 5 KET LUAN VA KIEN NGHI

1 Kết Wa icc cccccsescsssescsssssssssssesssssvecssssecsssssssssuesessssvecsssesessssecsssseestasneeessseeeesssees 27

2 Kiến nghị -222222222+222221222271111222T71111 221 E21 2 re 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 2222222+2222E15222E2E11112221711E122271 1 ccee 28

-V-MỤC LỤC HÌNH Hình 4.1 Đường chuẩn khảo sát khả năng chống oxy hĩa tổng số in wirro

Của “TTỌOX (St TT TT HH TH ghưệt 21 Hình 4.2 Phần trăm lượng ROS cịn lại sau phản ứng với chất chống oxy

hĩa cĩ trong cao chiết lá và rễ cây Nhàu - 24

-Vi-MUC LUC BANG Bang 4.1 Độ ẩm của các mẫu cây -2222222cetttcEEerrrrrrrrkrererrree 20

Bảng 4.2 Khả năng chống oxy hóa tổng số của cao chiết lá và rễ cây Nhàu

¬— 22

-Vii-DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ECs : Effective concentration of 50%

EDTA: Disodium dihydrogen ethylenediaminetetraacetate

GSH: Glutathione

GSSG: Glutathione disulfide

GSH-Px: Glutathione peroxydase

LDL: Low-density Lipoprotein (Lipoprotein ti trong thap)

NADPPH: Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate

OD: Mat d6 quang phé

ROS: Reactive Oxygen Species

SOD: Superoxide dismutase

TAS: Total Antioxidant Status

TBA: Acid thiobarbituric

TBA-RS: Thiobarbituric acid reactive substances

Trolox: 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid

-Viii-TÓM LƯỢC Những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy sự phát triển của các bệnh lý như

bệnh ung thư, bệnh tim, xơ vữa động mạch, đái tháo đường do nhiều nguyên nhân

trong đó nguyên nhân chính là stress oxy hóa Ngăn chặn sự tiến triển của các bệnh

lý trên bằng cách bổ sung các chất chống oxy hóa tự nhiên hiện diện trong thực vật

do các chất chống oxy hóa này có khả năng làm sạch các gốc tự do có hại cho cơ thể

từ sự stress oxy hóa Đề tài khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá và rễ

cây Nhàu (Morinda cirjola L.) ín vữro được thực hiện nhằm đánh giá khả năng

chống oxy hóa của lá và rễ cây Nhàu đề áp dụng vào điều trị bệnh Sự làm sạch gốc

tự do của các cao chiết được đo lường thông qua khả năng chống oxy hóa tổng số (TAS) Kết quả nghiên cứu cho thấy, 2 mẫu cao chiết đều có có khả năng chống oxy hóa nhưng ở mức độ khác nhau Ở nồng độ 0,25; 0,5; 0,75; 1,5; 3; 5; 10 mg/ml, cao

rễ có hàm lượng chất chống oxy hóa tính tương đương theo ug Trolox cao hơn cao

lá Do đó, ở các nồng độ trên, cao rễ có khả năng chống oxy hóa tổng số TAS mạnh hơn so với cao lá Từ kết quả nghiên cứu đạt được cho thấy cao lá và rễ Nhàu có khả năng chống oxy hóa để làm sạch các gốc tự do từ sự stress oxy hóa

Từ khóa: cây Nhàu, TAS, Trolox, stress oxy hóa, gốc tự do, chất chống oxy hóa

-1X-CHUONG 1 GIOI THIEU 1.1 Đặt vấn đề

Stress oxy hóa (oxidative stress) là kết quả của sự hình thành gốc tự do vượt

quá mức kiểm soát của các hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể Điều này xảy ra khi các chất chống oxy hóa có nồng độ quá thấp, không đủ đề trung hòa các gốc tự

do Kết qua các gốc tự do sẽ tắn công các phân tử lipid, protein, acid nucleic của tế bào dẫn đến tồn thương cục bộ và kết quả cuối cùng là gây sự hoạt động bắt thường của cơ quan (Meister, 1992; Katalinic et al., 2006) Stress oxy hóa dẫn đến hậu quá

là phát sinh nhiều loại bệnh của tuổi già như Parkinson (Tappel, 1968), Alzheimer (Behl, 1997) và một số bệnh về thần kinh khác (Reiter, 1995); xơ vữa động mạch,

bệnh đái tháo đường, bệnh phối, bệnh ung thư, viêm khớp, thoái hóa võng mạc, đục

thủy tính thể, suy giảm hệ thống miễn dịch (Langseth, 1995; Mahakunakorn, 2003)

Chat chéng oxy hóa có khả năng phục hdi các gốc tự do (ROS) Các hợp chất chống oxy hóa như axit phenolic, polyphenol và flavonoid có khả năng làm sạch các gốc tự do như peroxide, hydroperoxide hoặc lipid peroxyl và do đó ức chế cơ chế oxy hóa (Prakash et al., 2000) Chat chéng oxy hóa làm mat phản ứng của các gốc

tự do bởi hai cơ chế chính (1) chuyển giao hydro nguyên tử (Hydrogen Atom

Transfer - HAT), và (2) chuyên giao điện tử duy nhất (Electron Transfer - ET)

(Huang et al., 2005)

Ngày nay, do ánh hưởng của điều kiện sống như ô nhiễm môi trường, tiếng

ồn, căng thăng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bắt lợi, tôn thương cho co thé va là nguyên nhân cua nhiều căn bệnh nan y Nên cần có những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khá năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt,

có lợi cho sức khỏe của con người, mà các chất có khả năng chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên lại có hiệu quả, an toàn và ít bị ô nhiễm hơn các sản phẩm nhân

-1-tạo Vì vậy, việc điều tra và xác định các chất chống oxy hóa tự nhiên từ thực vật là

1.2 Mục tiêu cúa đề tài

Mục tiêu của đề tài là đánh giá khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá và rễ cây Nhàu Khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá và rễ cây Nhàu được đánh giá ïn vitro bang phương pháp TAS (Total Antioxidant Status)

1.3 Nội dung nghiên cứu

~ Trích các chất bằng dung môi ethanol 99% từ lá và rễ cây Nhàu

- Sử dụng phương pháp TAS đề xác định khả năng chống oxy hóa của lá và

ré cay Nhau in vitro

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về chất chống oxy hóa

2.1.1 Stress oxy hóa

Stress oxy hóa là sự rối loạn cân bằng giữa các chất chống oxy hóa và các chất oxy hóa theo hướng tạo ra nhiều các chất oxy hóa (Katalinic et al., 2006) Quá trình trao đồi chất và stress oxy hóa tạo ra một số sản phẩm trung gian là

các gốc tự do (ROS: Reactive oxygen species) Gốc tự do là tất cá các phân tử hóa

học chỉ có một điện tử duy nhất (electron mang điện âm) hay số điện tử lẻ Do các phân tử mang điện tử lẻ không cân bằng, không bền vững, dễ tạo ra phản ứng Các

phân tử mang điện tử lẻ luôn luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử mà nó thiểu từ các

phân tử khác, và lần lượt tạo ra một chuỗi những gốc tu do mdi (Pal et al., 2011) Trong cơ thê có rất nhiều loại gốc tự do, mà các gốc nguy hiểm hơn cả là superoxide, ozone, hydrogen peroxide, lipid peroxyl và nhất là gốc hydroxyl, là nguyên nhân gây ra nhiều tôn thương Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species) (Prakash et al., 2000)

Ban dau oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxide (O2e-), day la gốc tự

do quan trọng nhất của tế bào Từ superoxide (O2°-) nhiéu gốc tự do và các phân tử

khác của oxy có khả năng phản ung cao dugc tao ra nhu hydroxyl (HOs), hydroperoxyl (HOOs), peroxyl (ROOs), alkoxyl (ROs), lipoperoxide (LOOs), H,0, (Halliwell, 1991; Dyke et al., 1994)

Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, ADN, gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thé (Prakash et al., 2000) Đồng thời, khi một phân tử sống bị

các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục

phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền, gây ra các biến đồi có tác hại đối với cơ thé, gốc tự do hủy hoại tế

_3-bào bằng cách oxy hóa màng tế _3-bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí rồi gốc tự do tấn công các ty thé, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng Cuối cùng, bằng cách oxy hóa gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trưởng được (Packer, 1999) ROS cũng tham gia vào quá trình lão hóa và sự phát triển của nhiều bệnh thoái hóa, bao gồm bệnh Alzheimer và

Parkinson (Ganske and Dell, 2006)

Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách như gốc tự do có thể là sản phẩm của

những căng thắng tâm thần, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, được phẩm, tia

phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều chlorine và ngay cả oxygen (Halliwell, 1991; Donal, 2002)

Không phải là gốc tự do nào cũng có hại đối với cơ thể Nếu được kiểm soát,

nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melanin cần cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngăn ngừa nhiễm trùng, tăng

cường miễn dịch, dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kimh, co bóp cơ thịt

(Halliwell, 1991; Donal, 2002)

2.1.2 Chat chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là những chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại và loại

bỏ tác dụng độc hại của các gốc tự do một cách trực tiếp hoặc gián tiếp Chất chống oxy hóa có thể trực tiếp phản ứng với các gốc tự do hoạt động để tạo ra những gốc

tự do mới kém hoạt động hơn, từ đó có thể ngăn cản chuỗi phán ứng dây chuyền

được khởi đầu bởi các gốc tự do Chất chống oxy hóa cũng có thể gián tiếp tạo phức

với các ion kim loại chuyên tiếp trong phản ứng Fenton hoặc ức chế các enzyme xúc tác cho các quá trình sinh ra gốc tự do nhằm ngăn cản sự hình thành gốc tự do trong

cơ thể (Trần Hùng, 2006)

Có nhiều cách phân loại chất chống oxy hóa dựa trên nguồn gốc, cấu trúc của chất chống oxy hóa Một trong những cách đó là dựa trên bản chất enzyme hoặc không enzyme của chất chống oxy hóa

2.1.2.1 Chất chống oxy hóa có bán chất enzyme

Đây là hệ thống chống oxy hóa nội sinh tồn tại chủ yếu ở tế bào và giữ một

Vai trò quan trọng trong việc duy trì sự sống Tế bào sống luôn bị tổn hại bởi các gốc

tự do sinh ra trong các quá trình sinh lý như quá trình hô hấp và các quá trình bệnh

lý Vì vậy, một hệ thống chống oxy hóa nội sinh để bảo vệ tế bào là điều cần thiết

(Trần Hùng, 2006) Hệ thống đó bao gồm các enzyme như sau:

thanh H,0>

O,7°+0,7° 8°, O;+H;O;

Cu thé: Cu*-SOD + Oy — Cu'*- SOD + 0;

Cu'* - SOD + Oy + 2H* > Cu” - SOD + HạO;

Hydrogen peroxide duoc tao thành là chất nguy hiểm trong tế bào vì nó có thể chuyên thành gốc hydroxyl (trong phản ứng Haber — Weiss) là một trong những gốc nguy hiểm nhất cho tế bao (Borel et al., 2006)

“+ Glutathione peroxydase (GSH-Px)

Enzyme phân hủy H;O; ở các tế bào của động vật có vú chủ yếu là GSH-Px

(Flohé, 1982) Glutathione (GSH) là cofactor của enzyme GSH-Px GSH là một

tripeptide chứa 3 loại acid amin là acid glutamic, cysteine và glycine GSH-Px là enzyme có selen (Ursini et al., 1987), enzyme nay là một nhân tố chống oxy hóa mạnh gặp chủ yếu trong bào tương, nó ngăn cản việc hình thành các gốc tự do tạo

thành trong các quá trình tổng hợp diễn ra trong cơ thể, xúc tác sự khử hóa của H,05, cdc hydro peroxide va peroxide hitu co (Flohé, 1982)

H,0, + 2GSH — 2 H,O + GSSG ROOH + 2GSH — ROH + H,0 + GSSG GSH: Glutathione dang khtr

GSSG (Glutathione disulfide): Glutathione dang oxy hóa

Dang oxy héa phuc héi nhé glutathione reductase (GR)

GSSG + NADPH + H* _°., 2GSH+ NADPH

GSH-Px hoạt động khi HạO; ở nồng độ thấp, khi HạO; ở nồng độ cao catalase

sẽ hoạt động Khi H;O; còn lại rat it, catalase không còn tác dụng thì GSH-Px được

hoạt hóa và xúc tác phản ứng phân hủy H;O¿ Điều này rất quan trọng vì phản ứng với GSH-Px đòi hỏi phải có cơ chất là GSH, còn phản ứng với catalase thi không

cần GSH, vì thế tiết kiệm được glutathione cho cơ thể (Mahakunakorn, 2003)

Catalase

Catalase c6 trong các peroxisome cua tất cả các mô nhưng chủ yếu là ở trong

mo gan va than Catalase xtc tac phan huy rất mạnh H;O; thành H;O và xúc tác phản ứng giữa HạO; và chất cho proton (AH) (Chance at el., 1979; Mahakunakorn,

2003 )

2HạO; _€”“** ` 2H,O + O;

2H;O;+AH; _“#⁄% ` 2H,O+ A

Bộ ba enzyme catalase, SOD, GSH-Px bảo vệ những vị trí của cơ thể bị

“phơi nhiễm” như biêu mô phổi, hồng cầu Ở những vị trí này bộ ba enzyme trên có

nhiêu hơn so với các mô khác

2.1.2.2 Chất chống oxy hóa không có bản chất enzyme

Chất chống oxy hóa không có bản chất enzyme là những hợp chất do cơ thể

sinh ra (nguồn gốc nội sinh) như vitamin A, glutathione, glycine, methionine, hoadc

các chất chống oxy hóa ngoại sinh có nhiều trong thực vật gồm có các nhóm vitamin

C, vitamin E, flavonoid, lignan, alkaloid, courmarin, terpen, carotenoid Cac chat

này được xếp vào nhóm các chất chống oxy hóa không có bản chat 1a enzyme (Tran Hùng, 2006)

“ Vitamin E

Vitamin E là một chất chống oxy hóa hòa tan trong lipid, phân phối rộng khắp trong tế bào và được coi như là hàng phòng thủ trước tiên chống lại quá trình peroxide hóa lipid Vitamin E bảo vệ các acid béo chưa bão hòa và cholesterol trong màng tế bào

Vitamin E giúp tiết kiệm selenium của enzyme GSH-Px và bảo vệ những chất tương tự chất béo khác như vitamin A khỏi bị phân hủy (Buettner, 1993) Trong

sự hiện diện của ion Fe”'/ascorbate, vitamin E không ngăn chặn được sự khởi phát quá trình peroxide hóa lipid nhưng góp phần làm chậm lại tiến trình này (Wagner,

1996) Vitamin E là một tập hợp 8 chat, trong d6 a — tocopherol là hợp chất thể hiện

hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất Tinh chất chống oxy hóa của a-tocopherol thể hiện qua việc ngăn chặn phản ứng của các gốc tự do bằng cách nhường 1 hydro (H) của gốc phenol cho gốc lipoperoxide (LOO») dé biến gốc tự do này thành hydroperoxyl (LOOR) theo phản ứng sau

LOO» + Tocopherol-OH —> LOOH + Tocopherol-O»

Trong quá trình phản ứng, tocopherol (tocopherol-OH) bị chuyển hóa thành gốc tocopheryl (tocopherol-O») bền do đó chấm dứt những phản ứng dây chuyền theo cơ chế gốc (Buettner, 1993; Langseth, 1995)

s* Vitamin C

Vitamin C (acid ascorbic) được tìm thấy nhiều trong thực phẩm tươi, rau quả

và trái cây Nó đóng một vai trò hết sức quan trọng trong nhiều hoạt động của cơ thé Vitamin C giúp cho cấu trúc collagen ôn định, cần thiết cho sự lành vết thương, tăng sức đề kháng cho cơ thể Vitamin C cũng là một chất chống oxy hóa rất quan trọng Vitamin C hoạt động như một chất chống oxy hóa trong môi trường nội bào lẫn ngoại bào Vitamin C cũng hoạt động cùng với các enzyme chống oxy hóa khác như GSH-Px, catalase và SOD Hơn nữa, vì vitamin C phục hồi và tái tạo vitamin E

từ dạng bị oxy hóa trong cơ thể, nên nó tăng cường hiệu lực chống oxy hóa của

vitamin E:

Tocopherol(TO') + Vitamin C (AseH') — Tocopherol(TOH) + gốc ascorbyl (Ase”) Các tôn thương oxy hóa của LDL-cholesterol đóng vai trò trung tâm trong sự hình thành xơ vữa động mạch Vitamin C ngăn chặn hữu hiệu sự oxy hóa LDL ngay

cả đối với người hút thuốc lá

Tuy nhiên, trong vài trường hợp, vitamin C gây hại cho cơ thể vì nó có thể đóng vai trò là một chất tiền oxy hóa Đặc biệt là khi nó ở nồng độ cao và có sự hiện diện của các ion kim loại chuyển tiếp (Fe”, Cu”) Khi đó, vitamin C sẽ đóng vai trò

là chất tiền oxy hóa xúc tác phản ứng Fenton tạo các gốc tự do O;*, HO" và H;O; (Buettner, 1993; Langseth, 1995)

+ Glutathione

Glutathione (GSH) 1a mt chat chống oxy hóa nội sinh phổ biến có phân tử lượng thấp GSH là một tripeptide gdm cdc acid amin nhu acid L-y-glutamic, L- cysteine va L-glycine Hoạt tính chống oxy hóa của GSH được thể hiện theo 2 cách a) GSH có hydrogen linh động nên có thể khử các gốc tự do bằng cách cho hydrogen cho các gốc tự do Gốc tự do GS' mới hình thành sẽ dimer hóa tạo thành hợp chất GSSG bên vững:

2GSH+2R° — 2RH+2GS"

GS’ + GS’ — GSSG b) GSH đóng vai trò là chất cho điện tử trong các phản ứng được xúc tác bởi enzyme GSH peroxidase và GSH-Px nhằm phân hủy các hợp chất peroxide hữu cơ

và vô cơ độc hại

GSH rất quan trọng trong việc chống oxy hóa ở não, nơi mà những chất

chống oxy hóa khác như SOD, Catalase và GSH-Px có nồng độ rất thấp Sự bất

thường của GSH trong não là một trong những nguyên nhân chính gây bệnh Parkinson Ngoai ra, GSH còn phản ứng với NO trong não tạo S-nitrosoglutathione làm giảm tác hại của NO lên tế bào thần kinh (Varga, 1991)

* Nhóm các hợp chất polyphenol

Polyphenol là nhóm các hợp chất tự nhiên có nhiều nhóm chức phenol trong cấu trúc phân tử Nhóm này gồm có các hợp chất phenol đơn giản, tanin và các hợp chất flavonoid Với cấu trúc có nhiều nhóm phenol, chúng có khả năng ngăn chặn các chuỗi phản ứng dây chuyền gây ra bởi các gốc tự do bằng cách phản ứng trực

tiếp VỚI gốc tự do đó tạo thành một gốc tự do mới bền hơn, hoặc cũng có thể tạo

phức với các ion kim loại chuyên tiếp vốn là xúc tác cho quá trình tạo gốc tự do Flavonoid là nhóm hop chat polyphenol rất phé biến trong giới thực vật và đã có trên 5000 hợp chất flavonoid đã được mô tả (Harbourne, 1994) Cấu trúc chung của flavonoid 1a diphenylpropan (C6-C3-C6), Flavonoid cé 2 vong benzen C6 (vòng A

va B) gan với dị vòng C3 có oxy Flavonoid là nhóm hợp chất có công dụng quan

trọng trong cả thực vật và động vật (CrozIer e/ ai., 1997)

Do có bản chất là polyphenol các flavonoid thường có tính chống oxy hóa mạnh giúp cơ thể chống lại các tổn thương do gốc tự do một cách hữu hiệu Nhờ

vậy, flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý tim mạch như đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch (KrIs- Etherton et al., 2004; Ness et al., 1997)

_9-Do có cấu trúc gan giéng voi a- tocopherol nên các flavonoid cé thé thay thé cho nhau trong một số hệ thống Bên cạnh tính chống oxy hóa, flavonoid còn có khả năng ức chế một số enzyme Nhiều loại enzyme trong số này là các enzyme oxy hóa khử như cyclooxygenase, lipoxygenase, và NADPH oxydase Flavonoid còn có khả năng chống ung thư một cách hiệu quả mặc dù cơ chế chính xác của tác động này vẫn chưa được hiểu rõ Những nghiên cứu gần đây đã chứng minh ảnh hưởng của flavonoid trong sự ngăn ngừa phát sinh ung thư Điều này thúc đây nhiều nghiên cứu về sự ức chế phát sinh ung thư phụ thuộc flavonoid do việc loại các gốc tự do (Kris-Etherton et al., 2004; Zima and Kalousova, 2005)

Mỗi flavonoid đều có những lợi ích riêng, nhưng chúng thường hoạt động hỗ

trợ nhau Quercetin là một flavonoid phổ biến nhất, nó là genin cho nhiều loại

flavonoid khác như rutin, quercitrin Những dẫn xuất này khác nhau bới phần đường gắn vào khung quercetin

Quercetin đã được chứng minh là có vai trò quan trọng trong hoạt động kháng viêm của cơ thể do nó có thể ngăn chặn trực tiếp nhiều tiến trình khởi phát sự viêm bằng cách ức chế sự sản xuất và phóng thích histamin và các chất trung gian khác trong quá trình viêm và dị tmg (Formica ef al.,1995; Marozzi et al.,1970; Wadsworth et al., 1999) Ngoai ra quercetin còn có khả năng chéng oxy hóa và tiết kiệm lượng vitamin C sử dụng Khi phản ứng với gốc tự do, quercetin tạo một gốc

tự do mới bền hơn do hiệu ứng liên hợp trong cấu trúc quercetin nói riêng và các hợp chất phenol nói chung, giúp giải tỏa các điện tử tự do (Filipe et al., 2004) Như vậy, khả năng chống oxy hóa của flavonoid là do sự trung hòa các gốc

tự do và làm chậm đáng kế sự khới đầu của quá trình peroxide hóa lipid, tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp do đó ngăn chặn sự peroxide hóa lipid, ức chế việc tạo ra các gốc tự do bằng cách ức chế một số enzyme như xanthine oxidase, cyclooxygenase, lipoxygenase (Takuya et al., 2005)

Ở cấp độ tế bào, một trong những đặc tính hữu ích nhất của flavonoid — trung hòa các gốc tự do — là nhờ vào cấu trúc hóa học cũng như sự liên kết chặt chẽ của nó

-10-với màng tế bào; flavonoid bảo vệ LDL chống lại sự oxy hóa ở giai đoạn khởi đầu của sự peroxide hóa lipid Flavonoid gắn vào bề mặt của phân tử LDL hình thành

liên kết ether làm giới hạn sự tấn công mạnh mẽ của các tác nhân oxy hóa và các

géc tu do (Takuya et al., 2005) Nhờ vậy mà flavonoid có thể bảo vệ tế bào chống

lại các tôn thương do các gốc tự do một cách rất hiệu quả

2.2 Giới thiệu về Trolox

Trước đây, vitamin E đã được nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa vì

vitamin E là một dạng œ-tocopherol tồn tại trong tế bảo và được chứng minh là chất làm sạch mạnh các gốc tự do gây thiệt hại cho màng tế bào (Oral et al., 2006)

Vitamin E làm sạch các gốc peroxyl tự do và hình thành œ-tocopherol phenoxyl tự

đo ít độc hại hơn cho cơ thé (Burton and Ingold, 1983)

Hợp chất Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)

là dẫn xuất tan trong nước có cấu trúc tương tự œ-tocopherol đã được nghiên cứu (Scott et al., 1974; Bisby et al.,1984) va Trolox 1a chat chéng oxy ha chuan thuong

được sử dụng để so sánh khả năng làm sạch gốc tự do của các chất cần được khảo sat (Wong et al., 2005)

-11-2.3 Đại cương về cây Nhàu

2.3.1 Khóa phân loại

Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida)

Phân lớp: Phân lớp hoa môi (Lamiidae)

Bộ: Cà phê (Rubiales) Họ: Cà phê (Rubiaceae)

Giống: Morinda Loài: Morinda citrifolia L

Lá đơn, mọc đối, phiến lá to, hình bau dục hai đầu thuôn nhọn; dài 15 - 30

cm, rong 10 — 15 cm Lá màu xanh bóng, đậm ở mặt trên, mặt dưới nhạt hơn Bìa lá

hoi don sóng Gân lá hình lông chim, nổi rõ ở mặt dưới, 6 — 7 cặp gân phụ Cuống lá

dài 1 -3 cm Lá kèm nằm giữa hai lá mọc đối, hình xoan, màu xanh nhạt Cụm hoa là

đầu hình tròn hay hơi bầu dục, ở ngoài nách lá Trục cụm hoa hình trụ, màu xanh,

nhan, dai 1 — 2 cm Day cum hoa cé phién hẹp, dài 5 — 8 mm (Phạm Hoàng Hộ, 2003; Trương Thị Đẹp, 2007)

Hoa đều, lưỡng tính Đài hoa là một gờ tròn Cánh hoa 5, phía dưới dính lại

thành ống tràng hình phễu, màu xanh nhạt, cao 7 — 12 mm, bên trong có nhiều lông

trắng; 5 thùy dài khoảng 5 —- 8 mm, màu trắng, hình bầu dục đầu nhọn, đỉnh có phụ

-12-bộ là một mẫu nhỏ cong vào trong Khi hoa nở các thùy cong xuống phía dưới, tiền khai hoa vặn Bộ nhụy đực có 5, bằng nhau, rời, gắn ở phần loe của ống tràng xen kẽ

với các cánh hoa, chỉ nhị rất ngắn Bao phần hình đầu tên, màu vàng nhạt, dài khoảng 4 mm Hạt phấn rời, hình cầu, màu vàng nhạt Lá noãn có 2, ở vi tri trước và sau, bầu dưới có hai ô, mỗi ô một noãn, đính phôi kiểu trung trục Vòi và đầu nhụy:

Vòi nhụy dạng sợi màu xanh nhạt, đài 5 mm; 2 đầu nhụy dạng phiến mỏng, dài 3

mm, màu xanh Đĩa mật dày, hình khoen, màu vàng (Phạm Hoàng Hộ, 2003;

2.3.3 Thành phần hóa học cúa cây Nhàu

Rễ Nhàu chứa moridin là một anthraquinoic két tinh thanh tinh thé hinh kim,

màu vàng cam, tan trong nước sôi và các chất kiềm, ít tan trong nước lạnh, không

tan trong ether Ngoài ra, còn có 1-metoxyrubiazin, moridon, alizarin va 1-oxy-2,3-

dimetoxy anthraquinon Lá nhàu cũng có chứa moridin Trong nhàu còn có nhiều

selenium, lignans, polysaccharides, flavonoids, iridoids, acid béo, catechin, B- sitoterol, damnacanthal, alkaloids (Truong Thi Dep, 2007)

2.4 Một số nghiên cứu về cây Nhàu

Nghiên cứu của Umezawa er al (1992) đã ly trích một hợp chất từ rễ Nhàu

có tên là 1-methoxy-2-foremyl-3-hydroxyanthraquinone có thể kìm hãm sự xâm nhiễm của HIV lên các tế bào MT-4 mà không kìm hãm sự phát triển của tế bào Hai chất được phân lập từ rễ Nhàu là Damnacathal và Nordamnacathal có tác dụng gây độc ở cả hai dòng tế bào ung thư là dòng ung thư tế bào tiết hắc tố B16 va ung thư máu dòng L 1210 (Đỗ Quốc Việt er ai., 1998 )

-13-Nghiên cứu của Hirazumi and Furusawa (1999) trên nước ép trái cây của Morinda citrifolia chia mét polysaccharide giau chat chống hoạt động của khối u

Nghiên cứu thành phần hóa học và một số dạng bào chế từ trái Nhàu Morinda citrifolia L của Võ Thị Bạch Tuyết er ai (2002)

Nghiên cứu hoạt động oxy hóa của dịch chiết từ rễ, trái và lá Mengkudu (Morinda citrifolia L.) dé danh giá hoạt động chống oxy hóa của các cao chiết khác

nhau cua Zin et al (2002)

Trong công nghiệp dệt, Antraquinone là một nhóm chất nhuộm tự nhiện màu

vàng hoặc đỏ có trong rễ nhiều loài Morinda Sp Chất nhộm màu này được sử dụng

rộng rãi trong công nghiệp nhuộm vải ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là phía Bắc

Thai Lan (Aobchey et al., 2002)

Nghiên cứu của Phạm Thị Vân Anh e¿ ai., (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của cao qua Nhau (Morinda citrifolia L.) trên động vật thực nghiệm bị suy giảm miễn dịch bằng chiếu tia xạ Kết quả chứng minh được cao quả Nhàu làm tăng trọng lượng lách và tuyến ức tương đối, tăng số lượng bạch cầu lympho, mono, diệt tự nhiên so với lô chuột chỉ chiếu tia gamma đơn thuần không được dùng thêm thuốc thử

Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sương e ai (2004) đã cô lập một acid triterpen từ cao alcol của rễ cây Nhàu, Morinda cirifolia L Acid này được nhận

danh là acid ursolic dựa trên các dữ liệu phô nghiệm

Theo nghiên cứu của Pu e/ ai (2004) thì chuột đực được uống nước ép trái Morinda cirifolia có tác dụng ức chế sự làm rỗng dạ dày (gastric emptying) thông qua một cơ chế liên quan đến kích thích cholecystokinin (CCK — có tác dụng kích thích sự tiết của enzyme tuyến tụy và ức chế sự làm rỗng dạ dày) và kích hoạt thụ

thể CCK

-14-Rễ nhàu được dùng chữa cao huyết áp, chữa nhức mỏi tay chân, đau lưng, sài

uốn ván và nhiều bệnh khác Lá nhàu dùng chữa ly, tiêu chảy, cảm sốt và nấu canh

ăn cho bổ Dùng ngoài giã đắp làm lành vết thương, vết loét, làm chóng lên da non Dịch lá được đùng đắp trị bệnh viêm khớp gây đau nhức Vỏ nâu nước dùng cho phụ

nữ sau khi sinh uống bổ Quá nhàu khi chín có thể ăn với muối giúp dễ tiêu hóa,

điều kinh, trị băng huyết, bạch đới Quả nướng chín ăn chữa kiết ly, ho hen, cảm và

phù thũng (Trương Thị Đẹp, 2007)

Dịch chiết trái Morinda citrjfolia đã được nghiên cứu về hoạt động chống

oxy hóa, xác định tổng hàm lượng phenol và flavonoid theo những quy trình chiết khác nhau (Ramamoorthy and Bono, 2007)

Nghiên cứu của Nayak e¿ ai (2007) đánh giá hoạt động chữa lành vết thương của dịch chiết ethanol của lá Morinda citrifolia L Nghién cứu sử dụng chiết xuất ethanol của lá (150 mg/kg/ngày) được sử dụng để đánh giá các hoạt động chữa lành vết thương trên chuột Kết quả cho thấy ngày thứ II, các động vat điều trị bằng chiết xuất giám 71% khu vực vết thương so với nhóm còn lại giảm 57% Nâng cao khả năng co vết thương, giảm thời gian hình thành biểu mô, tăng hàm lượng hydroxyproline và đặc điểm mô học cho thấy chiết xuất lá Noni có thể có lợi ích điều trị trong việc chữa lành vết thương

Nghiên cứu của Palu et al (2007) điều tra các cơ chế có liên quan đến những tac déng diéu hda mién dich cia Morinda citrifolia L in vitro và in vivo ở chuột Nghiên cứu ảnh hưởng của cao quả Nhàu (Morinda cirjfolia L.) lên số lượng Iympho bào T CD4, T CD8 và sự chuyển dạng lympho bào trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid (CY) Kết quả cho thấy cao quả Nhàu làm tăng khá năng chuyển dạng lympho bảo, tăng số lượng lympho bào T

CD4 và T CD§ trong cả máu ngoại vi và tổ chức lách (Phạm Thị Vân Anh et al.,

2008)

-15-Nghiên cứu của Muralidharan and Srikanth (2009) được thiết kế để điều tra

các hoạt động chống loét của dịch chiết ethyl acetate cua trai Morinda citrifolia L trên các mô hình loét dạ dày và tá tràng khác nhau ở chuột Morinda citrifolia cho

thấy sự ức chế acid đạ dày tối đa (53,54%), acid tự do (52,55%) và acid tổng số (30,30%) Các chỉ số loét trong các động vật được điều trị bằng M cirjfolia ít hơn

đáng kể so với các trường hợp điều trị bằng thuốc theo tiêu chuẩn Từ đó cho thấy rằng M ciirjfolia có khả năng chống loét đáng kế để bảo vệ niêm mạc đạ dày và tá tràng

Morinda cirifolia còn được sử dụng để nghiên cứu khả năng kháng khuẩn

Lá được say khô, nghiền thành bột Sử dụng dung môi khác nhau như benzen, chloroform, ethyl acetate, ethanol và nước dé tách chiết Bốn sinh vật, cụ thé 1a vi

khuẩn Escherichia coli, tụ khuân cau Staphylococus aureus, nam Candida albicans

va nam Aspergillus niger da dugc sit dung dé diéu tra Két quả xét nghiệm kháng khuẩn cho thấy chất chiết xuất từ Noni có khả năng chống lại các sinh vật thứ

nghiém (Usha et al., 2010)

Vỏ rễ Nhàu Morinda cirifolia L được sử dụng để nghiên cứu đánh giá tác dụng giảm đau trong các mô hình động vật khác nhau Nghiên cứu cho thấy chiết xuất methanol vỏ rễ Nhàu có hiệu quả giảm đau tương tự như aspirin và NSAIDs (Nonsteriodal anti-inflammatory drugs) (Prasad et al., 2010)

Ngoài việc nghiên cứu hoạt động chống oxy hóa, Morinda cirifolia còn được

tập trung nghiên cứu hoạt động làm sạch gốc tự đo của dịch chiết ethanolic của rễ

Morinda citrifolia trong ống nghiệm (Pal er al., 2011)

Bên cạnh đó, các tác dụng chống trầm cảm của các chất chiết xuất từ trái cây Morinda citrifolia đã được nghiên cứu trong ông nghiệm với các xét nghiệm sinh

học monoamine oxidase (MAO) A và B chỉ ra rằng trái cây Nonl có chất ức chế

MAO-A va MAO-B tự nhién (Deng and West, 2011)

-16-CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Địa điểm thực hiện :

Phòng thí nghiệm Sinh Học, Bộ môn Sinh, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Đại

Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu gồm máy cô quay (Evaporate), máy

đo quang phổ BecKman Coulter 640B (Mỹ), máy ly tâm lạnh Mikro 220R (Đức),

cân phan tich AB104-S, may do pH Metler Toledo, may trộn mau Vortex, may

khuấy từ, máy Ổn nhiệt