Vai trò, ý nghĩa của các xét nghiệm phân tử trong chuẩn đoán và theo dõi điều trị bênh viêm gan siêu vi B và C

Vai trò và ý nghĩa của các xét nghiệm sinh học phân tử trong chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh viêm gan siêu vi B và C BS.. Xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan BPCR phát hiện HBV

Vai trò và ý nghĩa của các xét nghiệm sinh học phân tử trong chẩn đoán và theo dõi điều trị

bệnh viêm gan siêu vi B và C

BS TS Phạm Hùng Vân (1)

(1) Giảng viên Bộ Môn Vi Sinh, Khoa Y, ĐHYD TP HCM

Chủ nhiệm tổ Bộ Môn Vi Sinh, Khoa ĐDKTYH

Phó phòng thí nghiệm trung tâm ĐHYD

Thành viên chính của ANSORP và ARFID

Cố vấn khoa học Công Ty NAM KHOA

WHO 2001

Nhieãm vieâm gan sieâu vi B (HBV)

Xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan B

PCR phát hiện HBV-DNA

qPCR định lượng HBV-DNA

qPCR định lượng HBV-DNA

Điều trị qHBVDNA/3th

LamR, AdfR

105

Phát hiện đột biến precore

Phát hiện đột biến kháng thuốc

Nhieãm vieâm gan sieâu vi C (HCV)

Nhiễm HCV (100) (Phase cấp)

Mạn tính 85% (85)

Xơ gan 20% (17)

Ung thư gan

Xơ gan tiến triển

25% (4.5)

Khỏi 15% (15)

Ổn định 80% (68)

Diễn tiến chậm 75% (13)

Dieãn tieán nhieãm HCV

Genotype - 1 Điều trị 48 tuần

Genotype non-1 Điều trị 24 tuần

Định lượng HCV genotype

<2 log 10 >2 log 10 hay âm tính

HCV-RNA

Cuối điều trị HCV-RNA

Tuần 12 Định lượng

HCV RNA (+) Tái phát

HCV RNA (-) Đáp ứng

(2002 NIH Consensus Conference)

Xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan C

RT-qPCR định lượng HCV-RNA Định genotype HCV

RT-qPCR định lượng HCV-RNA

RT-PCR phát hiện HCV-RNA

Thực tế đã đòi hỏi các nhà khoa học, đặc biệt là các nhà y học phải nhanh chóng phát triển và ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, nhất là PCR và real-time PCR vào chẩn đoán và hổ trợ cho theo dõi điều trị bệnh nhân viêm gan siêu vi tại Việt Nam

PCR và real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở do vậy chúng ta có khả năng không phải bị

lệ thuộc vào các hãng sản xuất kit ở nước ngoài, nhờ vậy giá thành sẽ rẽ

Mồi Taq polymerase dNTP

PCR buffer + MgCl2

PCR MIX

DNA đích (Template)

94 o C/15s-1min 55-65 o C/15s-1min

72 o C/30s-3min

Phát hiện

 qua kích thước (điện di)

 hay qua trình tự (lai)

Ct curve

Standard curve

Melt curve

Real-time PCR

chạy PCR và đồng thời phát hiện sản phẩm khuếch đại

Laser or

UV

Camera

Thiết bị Real-time PCR

Primers Taq polymerase dNTP

PCR buffer + MgCl2

Real-time PCR MIX

Target DNA (Template)

Real-time PCR mix

Chất phát huỳnh quang

Định danh dựa vào kiểu hình sinh vật hóa học

biểu hiện từ các kiểu gen hay một trình tự đặc hiệu của đoạn genXác định dựa vào kích thước đoạn gen

PCR cĩ đặc hiệu khơng?

PCR đặc hiệu tương đương nuơi cấy

Các bước trong xét nghiệm PCR phát hiện

tác nhân vi sinh vật

Mẫu thửChuẩn bị mẫu thửTách chiết nucleic acid

Chạy PCRPhát hiện sản phẩm PCR và phân tích kết quả

Một xét nghiệm PCR định tính chuẩn mực

Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực

Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực

Xác định Genotype HCV

 Phương pháp real-time

 Phương pháp InoLIPA

 Phương pháp giải trình tự

HCV – cDNA 5’NC

Real-time TQ PCR

Xác định genotype HCV

so sánh giải trình tự và InoLIPA (234 mẫu)

Định genotype HCV hữu dụng lâm sàng

chỉ có phương pháp giải trình tự 5’-NC

Phân bố genotype HCV

kết quả 918 mẫu (21/9/2006-29/12/2007)

1b 56.96%

2c 0.22%

1c 0.76%

2a 10.98%

2b 1.09%

3a 0.22%

4a 0.11%

6a 21.63%

6h 0.22%

6b 0.11%

1a 7.70%

Phát hiện đột biến kháng thuốc của HBV

 Phương pháp PCR-RFLP

 Phương pháp real-time

 Phương pháp giải trình tự

Ethanol precipitation

CEQ 8000

Định genotype HBV và phát hiện đột biến kháng thuốc

Kỹ thuật giải trình tự vùng rt gene (Nam Khoa)

Phát hiện kháng Lamivudine, adefovir

giải trình tựgene PreS

Vừa phát hiện nhiều vị trí đột biến

(kể cả heterozygote)

Vừa cho kết quả genotype

Xác định genotype HBV Tìm đột biến kháng thuốc của HBV

BS nên cho chỉ định tìm đột biến kháng thuốc và genotype HBV

khi bệnh nhân không đáp ứng điều trị lamuvidine

Kết quả xác định genotype HBV

C 31%

B 69%

Kết quả genotype của 455 mẫu huyết thanh

bệnh nhân HBV-DNA [+]

Tỷ lệ % đột biến YMDD

455 mẫu huyết thanh bn HBV-DNA [+]

Đột biến YMDD 455 mẫu huyết thanh bn HBV-DNA [+]

Phân b theo l ố theo lượng virus ượng virus ng virus

1762, 1764

Kết quả PCR khuếch đại đoạn gen HBV precore

dài khoảng 250 bp

Tri thức sẽ chẳng bao giờ đủ Nếu không đem trãi nghiệm với đời

Ước vọng cũng trở thành vô nghĩa Nếu cứ ngồi ôm mộng giữa chơi vơi

“Knowing is not enough, we must apply Willing is not enough, we must do”

Goethe

Phan Kim Ngọc và Phạm Hùng Vân