Nghiên cứu chế tạo và sử dụng hạt nano sắt từ để gắn kết với DNA

PHỤ LỤCPhụ lục 1: Pha TE 1XPha TE 10X :Cân 0,121g Tris base 100mM, chỉnh pH 8,0 bằng HCl Thêm 0,186g EDTA 50mM, rồi định mức 10ml ta có được TE 10X.Từ TE 10X pha thành TE 1X : 1ml TE10X và 9ml nước cất.Phụ lục 2: Pha 500ml TBE 1X từ TBE 10XTBE 10X chứa các thành phần: Tris 89mMAcid boric 89mMEDTA 2mM, pH 8,4. Lấy 10ml TBE 10X rồi định mức bằng nước cất đến 500ml ta có được TBE 1XPhụ lục 3: Thành phần dung dịch tải mẫu 5X (Loading dye)50 mM TrisHCl, pH 8,025% Glycerol5 mM EDTA0,2% Bromophenol Blue0,2% Xylene Cyanole FFPhụ lục 4: Thành phần đệm PCR (Pfu buffer)100 mM TrisHCl, pH 8.3 ở 25°C; 500 mM KCl; 15 mM MgCl2; 0,01% gelatin.Phụ lục 5: Cách pha SDS 10%Cân chính xác 0,1g SDS hòa tan trong khoảng 1ml nước cất.Đun nóng dung dịch trong bể ổn nhiệt đến khi SDS tan hết.Phụ lục 6: Cách pha Tris HCl 0,5M pH 8,0; Tris HCl 20mM pH 7,0 Khối lượng Tris base cần dùng cho 250ml Tris HCl 0,5M: m = C.V.M = 0,5.0,25.121,1 = 15,1375gCân chính xác 15,1375g Tris base hòa tan vào trong khoảng 200ml nước cất.Chỉnh pH 8,0 bằng HCl.Định mức đến 250ml.Khối lượng Tris base cần dung cho 100ml Tris HCl 20nM :Cân chính xác 0,242g Tris base hòa tan vào 50ml nước cấtChỉnh pH 7,0 bằng HCl Định mức đến 100mlPhụ lục 7: Cách pha phenolĐun cách thủy chai phenol ở nhiệt độ khoảng 800C đến lúc thành thể lỏng. Lấy ra khoảng 100ml, thêm 100ml Tris HCl 0,5M pH 8,0 vào, khuấy trong 20 phút bằng máy khuấy từ. Chờ khoảng 30 phút, hút phần dung dịch ở trên bỏ đi.Thêm vào tiếp 100ml Tris HCl 0,1M pH 8,0, khuấy trong 20 phút. Chờ 30 phút để tách thành 2 pha rồi lại hút phần dung dịch ở trên bỏ đi.Lặp lại bước trên khoảng 3 – 4 lần, chuẩn độ bằng giấy quỳ, nếu pH của phenol trên 7 hay 8 là đạt.Chia ra cho vào các ống Falcol. Sau cùng thêm vào khoảng 10ml Tris HCl 0,1M và bảo quản ở 200C.Phụ lục 9: Cách pha NaCl 0,5M, NaCl 2MPha 100ml NaCl 0,5MCân chính xác 2,922g NaCl hòa tan vào khoảng 90ml nước cất.Định mức đến 100ml.Pha 10ml NaCl 2MCân chính xác 1,17g NaCl hòa tan vào 5ml nước cất.Định mức đến 10ml.Phụ lục 10: Cách pha ethanol 70%Lấy 70ml ethanol tuyệt đối cho vào bình tam giác, thêm vào 30ml nước cất ta được 100ml ethanol 70%.Phụ lục 12: Cách pha gel agarose 1%Đối với gel agarose 1%: Cân 0,5g agarose hòa vào 50ml TBE 1X, đun trong lò vi sóng đến khi agarose tan hết.Phụ lục 13: Cách pha mồi PCRMồi ở dạng đông khô, cần thêm nước cất vô trùng đã khử DNase, RNase (dH2O) vào để hòa tan mồi thành dạng lỏng.Thêm vào ống chứa mồi xuôi (P1 – F) 392µl dH2O (đã khử DNase, RNase) và ống chứa mồi ngược (P1 – R) 386 µl dH2O (theo hướng dẫn của nhà sản xuất SIGMA) ta được 2 mồi có nồng độ 100µM mỗi mồi.Ta dùng mồi có nồng độ 25µM mỗi mồi nên tiến hành pha loãng mồi ban đầu.Lấy 12,5µl mỗi mồi cho vào 1 ống eppendorf sạch DNase, RNase. Thêm vào 25µl dH2O (đã khử DNase, RNase), vortex đều ta được 50µl mồi (gồm cả mồi xuôi và mồi ngược) có nồng độ 25µM mỗi mồi.

MỞ ĐẦU

Trong lĩnh vực khoa học công nghệ nano, sắt kim loại kích thước nanođược quan tâm nghiên cứu rất nhiều, vì nó có ứng dụng rất đa dạng trong sảnxuất và đời sống Gần đây hạt nano sắt từ đang được ứng dụng nhiều vào côngnghệ thông tin và truyền thông chế tạo linh kiện điện tử và cảm ứng Một nhánhquan trọng của công nghệ nano, đó là lý sinh học nano, trong đó, vật liệu nanođược sử dụng để chẩn đoán, điều trị bệnh và nghiên cứu trong sinh học phân tử

Trong sinh học phân tử, người ta thường xuyên phải tách phân tử DNA,RNA ra khỏi môi trường của chúng để làm tăng nồng độ khi phân tích hoặc chocác mục đích khác Công việc tách chiết DNA đảm bảo độ tinh sạch của nó rấtquan trọng nhưng với phương pháp thông thường phải sử dụng nhiều hóa chất,dung môi hữu cơ, tốn nhiều thời gian Trong khi đó, ở nước ngoài phân táchDNA sử dụng các hạt nanô từ tính là một trong những phương pháp thường được

sử dụng Vì nó làm giảm được thời gian xử lý, lượng hóa chất cần dùng, phântách dễ dàng bằng cách sử dụng một nam châm

Ngoài ra, hạt nano từ tính còn được ứng dụng nhiều trong các xét nghiệm mẫumáu của bệnh nhân nhiễm các loại virus như viêm gan B, bệnh ung thư, dẫntruyền thuốc … Hạt nano từ tính được ứng dụng nhiều bởi độ nhạy cao, dễ ứngdụng và có thể thu hồi lại được Nhưng ở Việt Nam thì chưa có nhiều nghiên cứu

về công nghệ sản xuất hạt nano từ tính dùng trong công nghệ sinh học Vì vậy

chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo và sử dụng hạt nano sắt từ để gắn kết với DNA”.

Mục tiêu của đề tài là tạo ra một loại vật liệu mới có thể ứng dụng trong côngnghiệp, y sinh học Đồng thời cũng tiến hành thử nghiệm ứng dụng vào nghiêncứu sinh học phân tử mà cụ thể là gắn kết với DNA cho nhiều mục đích nghiêncứu khác nhau

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về hạt nano sắt từ

Vật liệu nano đang đi sâu vào đời sống hiện đại và đang dần dần chiếmmột ý nghĩa rất lớn đối với đời sống của con người nhờ vào các tính chất rất đặcbiệt của chúng mà các vật liệu truyền thống trước đó không có được Tính đặcbiệt của vật liệu nano có được là nhờ kích thước nhỏ bé của chúng.[3]

Vật liệu nanô ô xít sắt từ tính thường được ứng dụng trong y sinh học có thể cósẵn trong tự nhiên nhưng cũng có thể được tổng hợp Hai loại ô xít sắt đượcnghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất là magnetite Fe3O4 và maghemite γ - Fe2O3.Ngoài ra các loại ferrite như MO.Fe2O3 trong đó M = Ni, Co, Mn, Zn, Mg cũngđược nghiên cứu nhiều.[7]

1.1.1 Các phương pháp tạo hạt nano sắt từ

1.1.1.1 Phương pháp nghiền

Phương pháp nghiền được phát triển từ rất sớm để chế tạo hạt nanô từ tínhdùng cho các ứng dụng vật lý như truyền động từ môi trường không khí vàobuồng chân không, làm chất dẫn nhiệt trong các loa công suất cao, Trongnhững nghiên cứu đầu tiên về chất liệu từ [18], vật liệu từ tính ô-xít sắt Fe3O4,được nghiền cùng với CHHBM (a-xít Oleic) và dung môi (dầu, hexane).CHHBM giúp cho quá trình nghiền được dễ dàng và đồng thời tránh các hạt kết

tụ với nhau Sau khi nghiền, sản phẩm phải trải qua một quá trình phân tách hạtrất phức tạp để có được các hạt tương đối đồng nhất.[3]

Phương pháp nghiền có ưu điểm là đơn giản và chế tạo được vật liệu vớikhối lượng lớn Việc thay đổi CHHBM và dung môi không ảnh hưởng nhiều đếnquá trình chế tạo Tuy nhiên cũng có những nhược điểm là tính đồng nhất của cáchạt nanô không cao vì khó có thể khống chế quá trình hình thành hạt nanô Hạtnanô từ tính chế tạo bằng phương pháp này thường được dùng cho các ứng dụngvật lý.[3]

nm Phương pháp thứ hai có thể tạo hạt nanô có kích thước từ 2 nm – 15 nm.Bằng cách thay đổi pH và nồng độ ion trong dung dịch mà người ta có thể cóđược kích thước hạt như mong muốn đồng thời làm thay đổi điện tích bề mặt củacác hạt đã được hình thành.[3]

1.1.1.3 Phương pháp phỏng sinh học

Phương pháp phỏng sinh học bắt đầu từ phân tử protein chứa sắt là ferritin

là phương pháp được nghiên cứu kĩ lưỡng nhất Ferritin gồm một lõi Fe3+ hydratehóa được bao bởi nhiều lớp protein Do lõi Fe3+ bị giam hãm như vậy mà người

ta có thể tạo ra hạt nano magnetite[10] và magnetite/maghemite [24] với kíchthước 6 – 7 nm bằng cách ô xi hóa apoferritin (ferritin trống) bằngtrimethylamino-N-oxide [3]

1.1.1.4 Phương pháp hóa siêu âm

Phương pháp hóa siêu âm là các phản ứng hóa học được hỗ trợ bởi sóngsiêu âm cũng được dùng để tạo hạt nanô ô xít sắt.[8]

Hạt nanô từ tính dựa trên ô xít sắt đã được chế tạo bằng hóa siêu âm.[19] Đây làphương pháp rất đơn giản để tạo hạt nanô từ tính với từ độ bão hòa rất cao.[12]Muối iron (II) acetate được cho vào trong nước cất hai lần rồi cho chiếu xạ siêu

âm với công suất khoảng 200 W/2 h trong môi trường bảo vệ Sóng siêu âm đượctác dụng dưới dạng xung để tránh hiện tượng quá nhiệt do siêu âm tạo ra Khi tácdụng siêu âm, trong dung dịch sẽ xuất hiện các chất có tính khử và tính ôxi hóanhư H2, hydrogen peroxide (H2O2) Các sản phẩm trung gian năng lượng cao cóthể là HO2 (superoxide), hydro nguyên tử, hydroxyl và điện tử Các chất này sẽ

ôxi hóa muối sắt và biến chúng thành magnetite Fe3O4 Sau khi phản ứng xảy ra

ta thu được hạt nanô Fe3O4 với từ độ bão hòa có thể đến 80 emu/g, cao gần bằnggiá trị của Fe3O4 ở dạng khối.[3]

Khi chiếu xạ siêu âm dung dịch chứa muối iron (II) acetate thì xuất hiện các phảnứng sau:

H2O → H· + OH·

H· + H· → H2

OH· + OH· → H2O2

Fe(CH3COO)2 → Fe2+ + 2(CH3COO)-

Chất ôxi hóa mạnh hydrogen peroxide sẽ ô xi hóa Fe2+ thành Fe3+ theo phản ứngsau:

2 Fe2+ + H2O2 → 2 Fe3+ + 2OH

-Các ion Fe2 và Fe3+ kết hợp với nhau để tạo thành magnetite [3]

Hình 1.1 : Bằng phương pháp hóa siêu âm có thể tạo các hạt que Fe 3 O 4.[3]

1.1.1.5 Phương pháp điện hóa

Phương pháp điện hóa cũng được dùng để chế tạo hạt nanô ô xít sắt từtính Dung dịch điện hóa là dung dịch hữu cơ Kích thước của hạt nanô từ 3 – 8

nm được điều khiển bằng mật độ dòng điện phân Sự phân tán của các hạt nanônhờ vào các CHHBM dương Phương pháp này phức tạp và hiệu suất không caonhư các phương pháp khác nên ít được nghiên cứu [3]

1.1.2 Yêu cầu hạt nano từ tính dùng trong y sinh học

Hạt nanô từ tính dùng trong y sinh học cần phải thỏa mãn ba điều kiệnsau:

- Tính đồng nhất của các hạt cao

- Từ độ bão hòa lớn

- Vật liệu có tính tương hợp sinh học (không có độc tính).[3]

Tính đồng nhất về kích thước và tính chất liên quan nhiều đến phươngpháp chế tạo còn từ độ bão hòa và tính tương hợp sinh học liên quan đến bản chấtcủa vật liệu Trong tự nhiên, sắt (Fe) là vật liệu có từ độ bão hòa lớn nhất tạinhiệt độ phòng, sắt không độc đối với cơ thể người và tính ổn định khi làm việctrong môi trường không khí nên các vật liệu như ô-xít sắt Fe3O4 được nghiên cứurất nhiều để làm hạt nanô từ tính [3]

1.2 Giới thiệu về phân tử Deoxyribonucleic Acid (DNA )

1.2.1 Khái niệm DNA

DNA hay deoxyribonucleic acid là nguyên liệu di truyền ở người và hầuhết tất cả cơ thể sống Mỗi tế bào người chứa cùng một lượng DNA Hầu hếtDNA nằm trong nhân ( gọi là DNA nhân), một lượng nhỏ DNA có thể được tìmthấy ở ti thể ( gọi là DNA ti thể hay mtDNA ) [25]

1.2.2 Lược sử nghiên cứu

Năm 1890, từ trong nhân của các tế bào có ở trong mủ, Mise (Đức) đãphân tích và phát hiện phân tử DNA

Sau đó, năm 1924, bằng phương pháp hoá nhuộm, Fenlgen phát hiện được DNAtrong thể nhiễm sắc của nhân tế bào

Về sau những năm 40 của thế kỷ 20, cấu trúc DNA đã được tìm thấy với các đơn

vị cấu trúc là các nuclêotit Các nucleotit này sắp xếp thành từng cặp

Đến năm 1953,Watson (Mỹ) và Crick (Anh) từ các nghiên cứu hết sức kỹ lưỡngbằng các phương pháp lý, hoá đặc sắc đã đưa ra được cấu trúc phân tử chính xáccủa DNA Họ xác nhận DNA có dạng chuỗi xoắn kép.[30]

1.2.3 Thành phần cấu tạo của DNA

Về cấu trúc phân tử, DNA là một cao phân tử (polime), gồm nhiều đơnphân (monome) gọi là nucleotit Mỗi nucleotit gồm 3 thành phần:

- Đường pentozơ gọi là đêoxiribozơ (C5H10O4)

- Nhóm photphat (axit phophoric)

- Bazơ nitơ

Nhóm photphat gắn cacbon 5' của đường đêoxiribozơ, còn bazơ nitơ gắn vàocacbon 1' Có 4 loại bazơ nitơ:loại Adenin (A) và Guanin (G) là các dẫn xuất củabazơ purin; còn dẫn xuất của bazơ pyrimidin thì có Timin (T) và Xytozin (X).Các nucleotit nối với nhau thành chuỗi polinucleotit qua nhóm photphat vàđường pentozơ Mỗi gốc axit photphoric liên kết với nguyên tử cácbon 5' của mộtgốc đường và với nguyên tử cacbon 3' của một gốc đường khác qua các liên kếtphotphođieste

Hai chuỗi polinucleotit xoắn lại với nhau thành chuỗi xoắn kép, trong đó bazơnitơ chuỗi này liên kết với chuỗi kia bằng liên kết hiđro theo nguyên tắc bổ sung

Rõ ràng là DNA có cấu tạo đa phân, do nhiều đơn phân hợp lại, có cấu tạo nhiềubậc Sự đa dạng của sinh giới bắt nguồn từ đây Ở từng loài riêng có trình tự sắpxếp các nucleotit riêng trong phân tử DNA của loài, và cũng có cả đặc thù cùng

số lượng nucleotit riêng Trong một loài virus đơn giản nhất cũng có đến 5000nucleotit, còn trong 46 NST người thì có đến 5000 tỉ nucleotit Trong 2 chuỗipolinucleotit, đường pentozơ và photphat đều giống nhau, riêng 4 bazơ nitơ cóliên kết khác nhau.[27]

in vitro, PCR).

Giá trị trung bình của khoảng nhiệt độ trong quá trình biến tính gọi là nhiệt độnóng chảy của DNA (Tm - melting Temperature) Sau khi hai mạch đơn của phân

tử DNA tách rời ra, nếu ta giảm nhiệt độ từ từ, cộng với điều kiện thích hợp thì

Hình 1.2 : Cấu tạo DNA [26]

hai mạch sẽ bắt cặp trở lại - hiện tượng này gọi là sự hồi tính Nếu ta giảm nhiệt

độ một cách đột ngột thì sự bắt cặp trở lại sẽ không diễn ra [6]

1.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Tách DNA là cần thiết bởi các thực nghiệm của công nghệ gen đều tiếnhành với DNA DNA tách chiết được cần phải đảm bảo về độ tinh khiết vànguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo trongcông nghệ gen

Có rất nhiều phương pháp tách chiết DNA, tùy thuộc mục đích nghiên cứu màlựa chọn các phương pháp tách DNA cho phù hợp [4]

1.3.1 Tách chiết DNA ở thực vật

Tế bào thực vật ngoài màng tế bào còn có lớp thành cellulose vững chắc ởbên ngoài Do đó việc tách chiết DNA từ tế bào thực vật gặp phải những khókhăn, phức tạp nhất định Cho đến nay, có nhiều phương pháp tách chiết, tinhsạch Dna khác nhau từ nhiều đối tượng thực vật tuy nhiên, việc tách chiết thựcvật có nguyên tắc chung đó là :

- Nghiền các mô, tế bào bằng biện pháp cơ học : Nghiền mô trong đá khô, ni tơlỏng bằng cối, chày sứ để phá vỡ thành cellulose, giải phóng các thành phần bêntrong tế bào

- Sử dụng đệm có chất tẩy để phá vỡ màng bào, giải phóng DNA

- Sử dụng các hóa chất (phổ biến là EDTA) để bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy bởicác enzyme nuclease nội bào

- Sử dụng hóa chất như chloroform, isoamyl alcohol, phenol … để loại protein vàcác tạp chất ra khỏi DNA

- Thu hồi DNA bằng cách kết tủa DNA trong cồn, hoặc isopropanol, sau đó lytâm thu lấy kết tủa DNA

- Hòa tan DNA bằng nước cất hoặc dung dịch đệm.[4]

1.3.2 Tách chiết DNA động vật và vi khuẩn

Có thể tách chiết DNA của động vật từ các nguyên liệu khác nhau nhưmáu, nước bọt, mô cơ, lông, tóc và các loại mô khác Đối với vi khuẩn thì phảitiến hành nuôi vi khuẩn để thu sinh khối tế bào Có nhiều phương pháp tách chiếtkhác nhau[4] Tuy vậy tách chiết DNA của động vật và vi khuẩn đều có chungmột nguyên tắc gồm 3 giai đoạn cơ bản đó là :

1 Phá bỏ màng tế bào

Có thể phá bỏ màng tế bào và màng nhân bằng phương pháp hóa học, vật

lý hoặc cơ học Đối với phương pháp hóa học thường sử dụng các chất tẩy rửanhư SDS, Triton 100 với nồng độ thích hợp Đối với phương pháp vật lý người tathường sử dụng sóng siêu âm để phá vỡ màng tế bào

2 Loại bỏ protein

Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm,

mà quan trọng nhất là protein Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khácnhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòatan (phenol, chloroform/nước)

3 Tủa nucleic acid

Mục đích của công đoạn này là nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc,một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme và khi cần có thểhòa lại trong nước theo nồng độ mong muốn.[5]

Thông thường các phương pháp tách chiết DNA này đều sử dụng nhiềuhóa chất để xử lý và qua nhiều bước ly tâm nên sẽ mất nhiều thời gian

1.4 Cở sở của việc cố định DNA lên hạt nano sắt từ

Bất cứ vật liệu nào đều có sự hưởng ứng với từ trường ngoài (H), thể hiệnbằng độ từ hóa (từ độ - M) Tỷ số c = M/H được gọi là độ cảm từ Tùy thuộc vàogiá trị, độ cảm từ có thể phân ra làm các loại vật liệu từ khác nhau

- Vật liệu có c < 0 (~ -10-6) được gọi là vật liệu nghịch từ

- Vật liệu có c > 0 (~10-6) được gọi là vật liệu thuận từ

- Vật liệu có c > 0 với giá trị rất lớn có thể là vật liệu sắt từ, ferri từ

Ở đây, vật liệu từ tính ngụ ý là vật liệu sắt từ, ferri từ hoặc siêu thuận từ Ngoài

độ cảm từ, một số thống số khác cũng rất quan trọng trong việc xác định tính chấtcủa vật liệu, ví dụ như: từ độ bão hòa Ms (từ độ đạt cực đại tại từ trường lớn), từ

dư Mr (từ độ còn dư sau khi ngừng tác động của từ trường ngoài), lực kháng từ

Hc (từ trường ngoài cần thiết để một hệ, sau khi đạt trạng thái bão hòa từ, bị khửtừ) Nếu kích thước của hạt giảm đến một giá trị nào đó (thông thường từ vài chođến vài chục nanô mét), phụ thuộc vào từng vật liệu cụ thể, tính sắt từ và ferri từbiến mất, chuyển động nhiệt sẽ thắng thế và làm cho vật liệu trở thành vật liệusiêu thuận từ Đối với vật liệu siêu thuận từ, từ dư và lực kháng từ bằng không.Điều đó có nghĩa là, khi ngừng tác động của từ trường ngoài, vật liệu sẽ khôngcòn từ tính nữa, đây là một đặc điểm rất quan trọng khi dùng vật liệu này cho cácứng dụng y sinh học.[3]

Mặt khác, các hạt nanô từ tính có kích thước tương ứng với kích thước củacác phân tử nhỏ (1-10 nm) hoặc kích thước của các vi rút (10-100 nm) Chính vìthế mà hạt nanô có thể thâm nhập vào hầu hết các cơ quan trong cơ thể và giúpcho chúng ta có thể thao tác ở qui mô phân tử và tế bào Diện tích bề mặt lớn củacác hạt nanô giúp cho các hiệu ứng xảy ra bên trên bề mặt diễn ra rất mạnh mẽ

Ví dụ chức năng hóa bề mặt của hạt nanô từ tính thì việc gắn kết hạt nanô với các

tế bào thông qua các kháng thể/kháng nguyên sẽ dễ dàng.[3]

Hình 1.3 : Sơ đồ mô tả quá trình gắn DNA lên hạt nano

và kiểm tra sản phẩm [23]

Ngoài ra, để ứng dụng trong sinh học các hạt nano cần phải được chức năng hóa

bề mặt để có thể tiếp hợp với các đối tượng sinh học như DNA, kháng thể,enzyme Các nhóm chức thường gặp là nhóm amino, biotin, steptavidin,carbonxyl, thiol [29]

1.5 Ứng dụng hạt nano từ tính trong y sinh học

Trong y sinh học, người ta thường xuyên phải tách một loại thực thể sinhhọc nào đó ra khỏi môi trường của chúng để làm tăng nồng độ khi phân tích hoặccho các mục đích khác Phân tách tế bào sử dụng các hạt nanô từ tính là mộttrong những phương pháp thường được sử dụng Quá trình phân tách được chialàm hai giai đoạn: đánh dấu thực thế sinh học cần nghiên cứu; và tách các thựcthể được đánh dấu ra khỏi môi trường bằng từ trường [29]

Việc đánh dấu được thực hiện thông qua các hạt nanô từ tính Hạt nanôthường dùng là hạt ô xít sắt Các hạt này được bao phủ bởi một loại hóa chất có

Hình 1.4 : Đánh dấu và tách tế bào bằng hạt nano[29]

tính tương hợp sinh học như là dextran, polyvinyl alcohol (PVA), Hóa chất baophủ không những có thể tạo liên kết với một vị trí nào đó trên bề mặt tế bào hoặcphân tử mà còn giúp cho các hạt nanô phân tán tốt trong dung môi, tăng tính ổnđịnh của chất lỏng từ Giống như trong hệ miễn dịch, vị trí liên kết đặc biệt trên

bề mặt tế bào sẽ được các kháng thể hoặc các phân tử khác như các hoóc-môn,a-xít folic tìm thấy Các kháng thể sẽ liên kết với các kháng nguyên Đây là cáchrất hiệu quả và chính xác để đánh dấu tế bào Các hạt từ tính được bao phủ bởicác chất hoạt hóa tương tự các phân tử trong hệ miễn dịch đã có thể tạo ra cácliên kết với các tế bào hồng cầu, tế bào ung thư phổi, vi khuẩn, tế bào ung thưđường tiết niệu và thể golgi [29]

Tách tế bào bằng từ trường đã được ứng dụng thành công trong y sinh học Đây

là một trong những phương pháp rất nhạy để có thể phát hiện tế bào ung thư từmáu, đặc biệt là khi nồng độ tế bào ung thư rất thấp, khó có thể tìm thấy bằng cácphương pháp khác.[15]Người ta có thể phát hiện kí sinh trùng sốt rét trong máubằng cách đo từ tính của kí sinh trùng đánh dấu từ[10] hoặc đánh dấu các tế bàohồng cầu bằng chất lỏng từ tính.[16]

Tế bào thường

Tế bào được đánh dấuDòng chảy

Hình 1.5 : Nguyên tắc tách tế bào bằng từ trường [29]

Ngoài ra, trong phản ứng PCR trong sinh học nhằm khuyếch đại DNAnào đó, quá trình làm giàu DNA ban đầu cũng được thực hiện nhờ hạt nanô từtính.[20]Với nguyên tắt tương tự như phân tách tế bào, hạt nanô từ tính đượcdùng để phân tách DNA.[29]

1.5.1 Tách DNA của siêu vi Herpes bằng hạt nano từ tính

Hạt nano từ tính chức năng hóa amino được sử dụng để tách DNA củasiêu vi Herpes gây bệnh ngoài da và bệnh đường sinh dục Bằng cách chức nănghóa amino hạt nano ô xít sắt để gắn kết với một đoạn DNA dò đặc trưng cho siêu

vi Herpes, DNA đích trong bệnh phẩm cần xét nghiệm sẽ gắn kết với hạt nano cóDNA dò được phân tách bằng một nam châm Nồng độ của DNA sau phân táchtăng hàng trăm lần so với ban đầu Kết hợp với một cảm biến điện hóa đơn giản,

độ nhạy vừa phải, quy trình làm giàu DNA giúp nồng độ DNA đạt đến mức màcảm biến có thể phát hiện ra Quy trình phân tách này và cảm biến có thể xácđịnh nhanh siêu vi này ở vùng sâu, vùng xa, những nơi còn chưa có các thiết bị y

tế chính xác [14] Đây là một phương pháp có thể sử dụng để mở rộng để xácđịnh sự có mặt của nhiều loại siêu vi khác như siêu vi cúm gia cầm.[29]

1.5.2 Làm giàu DNA của siêu vi viêm gan B bằng hạt nano từ tính bọc SiO 2

Hạt nano từ tính được bọc bởi một lớp silica được sử dụng trong làm giàuDNA của siêu vi viêm gan B Nguyên tắc làm giàu DNA của hạt nano từ tính lànhư sau:

Bề mặt của silica bị hydroxide hoá, hấp phụ một proton làm cho bề mặt cóthể tích điện dương Các DNA với khung Phosphate tích điện âm sẽ có xu hướnghút vào hạt nano từ tính bọc silica Sử dụng từ trường ngoài để tách tất cả cácDNA ra khỏi các vật phẩm sinh học khác bằng từ trường sẽ thu được các DNA

có dính các hạt nano từ tính Sử dụng dung môi thích hợp, bề mặt của silica cóthể hấp phụ một gốc hydroxyl làm cho tích điện âm Lúc này DNA sẽ rời khỏihạt nano từ tính do chúng có cùng điện tích Loại bỏ hạt nano từ tính bằng từtrường ngoài sẽ thu được dung dịch gồm toàn các DNA Nhân bản DNA của siêu

vi viêm gan bằng PCR rồi xác định sự có mặt của chúng bằng phép đo diện di.[29]

1.5.3 Hạt nano vàng để phát hiện tế bào ung thư vú

Hạt nano vàng, bạc được sử dụng trong y sinh học để đánh dấu tế bào.Nhờ kích thước của hạt nano nhỏ hơn nhiều bước sóng ánh sáng chiếu vào màxuất hiện hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt làm cho khả năng tán xạ ánhsáng của các hạt nano kim loại rất mạnh Các hạt nano kim loại quý như vàng,bạc, bạch kim bền trong môi trường làm việc, thân thiện với cơ thể là đối tượngđược ứng dụng nhiều nhất

Nguyên tắc ứng dụng hạt nano kim loại quý trong đánh dấu tế bào như sau: hạtnano vàng được gắn kết với kháng thể đặc hiệu kháng tế bào ung thư vú anti-HER2, sau đó gắn lên mẫu bệnh có tế bào ung thư Nhờ liên kết kháng nguyên-kháng thể đặc hiệu mà hạt nano gắn lên bề mặt của tế bào Chiếu ánh sáng lên tếbào thì do khả năng tán xạ mạnh của hạt nano vàng mà các tế bào ung thư sẽđược phân biệt với các tế bào thường không có khả năng tán xạ Kết quả cho thấynếu không gắn với kháng thể kháng tế bào ung thư thì hạt nano vàng không gắnlên tế bào ung thư Khi có kháng thể gắn với hạt nano vàng, hạt nano vàng bámlên các tế bào Dưới ánh sáng hiển vi trường tối, các tế bào này phát sáng rấtmạnh, khác biệt hẳn với các tế bào khi không có hạt nano vàng gắn kết [29]

1.5.4 Dẫn truyền thuốc

Một trong những nhược điểm quan trọng nhất của hóa trị liệu đó là tínhkhông đặc hiệu Khi vào trong cơ thể, thuốc chữa bệnh sẽ phân bố không tậptrung nên các tế bào mạnh khỏe bị ảnh hưởng do tác dụng phụ của thuốc Chính

vì thế việc dùng các hạt từ tính như là hạt mang thuốc đến vị trí cần thiết trên cơthể (thông thường dùng điều trị các khối u ung thư) đã được nghiên cứu từ nhữngnăm 1970, những ứng dụng này được gọi là dẫn truyền thuốc bằng hạt từ tính

Có hai lợi ích cơ bản là:

- Giảm lượng thuốc điều trị

- Thu hẹp phạm vi phân bố của các thuốc trong cơ thể nên làm giảm tácdụng phụ của thuốc

Hạt nanô từ tính có tính tương hợp sinh học được gắn kết với thuốc điềutrị Lúc này hạt nanô có tác dụng như một hạt mang Thông thường hệ thuốc/hạttạo ra một chất lỏng từ và đi vào cơ thể thông qua hệ tuần hoàn Khi các hạt đivào mạch máu, người ta dùng một gradient từ trường ngoài rất mạnh để tập trungcác hạt vào một vị trí nào đó trên cơ thể Một khi hệ thuốc/hạt được tập trung tại

vị trí cần thiết thì quá trình nhả thuốc có thể diễn ra thông qua cơ chế hoạt độngcủa các enzym hoặc các tính chất sinh lý học do các tế bào ung thư gây ra như độ

pH, quá trình khuyếch tán hoặc sự thay đổi của nhiệt độ Quá trình vật lý diễn ratrong việc dẫn truyền thuốc cũng tương tự như trong phân tách tế bào [3]

Hình 1.6 : Sự khác biệt khi dẫn thuốc bằng hạt nano

Hình 1.7 : Nguyên lý dẫn thuốc dùng hạt nano từ tính [3]

Mạch máu

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu và hóa chất

2.1.1 Các phân tử DNA, oligonucleotide

DNA được tách chiết từ vi khuẩn Bacillus subtilis được nuôi trên môi

trường lỏng ở Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh Học – Trường Đại họcBách Khoa Đà Nẵng

Hóa chất cần cho tách chiết DNA bao gồm :

- SDS (Sodium dodecyl sulfate – C12H25O4SNa, SIGMA, Mỹ)

- Tris base (C4H11NO3, SIGMA, Mỹ)

- EDTA (C10H14N2O8Na2.2H2O, Trung Quốc)

- Phenol (C6H5OH, Trung Quốc)

- Chloroform (CHCl3, Trung Quốc)

- Ethanol (C2H5OH)

- NaCl và nước cất vô trùng

2.1.2 Vật liệu tạo hạt nano sắt từ bọc silica

Các hạt nano sắt từ tự tổng hợp được tại phòng thí nghiệm Bộ môn Côngnghệ Sinh học – Trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng

Các hóa chất cần dùng cho việc tổng hợp sắt : muối FeCl3.6H2O vàFeCl2.4H2O, dung dịch NH4OH 23% ÷ 25%, citric acid (CA), cồn 960, giấy đo

pH, nước cất 2 lần và cồn 900C [1,2,3] Các hóa chất đó đều có nguồn gốc từTrung Quốc

Hóa chất dùng để chức năng hóa bề mặt hạt sắt từ là ATPS, nước cất 2 lần

2.1.3 Vật liệu và hóa chất điện di

- Agarose (SIGMA, Mỹ)

- TBE (BIO-RAD, Mỹ)

- Dung dịch tải mẫu 5X (Loading dye, BIO-RAD, Mỹ)

- Ethidium bromide (C21H20BrN3 - EtBr)

- Thang DNA 1000bp (Marker, BIO-RAD, Mỹ)

2.1.4 Vật liệu và hóa chất dùng cho phản ứng PCR

- DNA vi khuẩn B.subtilis

- Primer

- dNTP

- Enzym polymerase : Pfu polymerase

- Dung dịch đệm : Pfu buffer

- dH2O đã khử DNase, RNase (Invitrogen, Mỹ)

- Máy khuấy từ gia nhiệt

- Máy ly tâm lạnh Universal 320R (Hittech-Đức)

- Tủ sấy

- Máy lắc khô

- Bộ điện di ngang (Đài Loan)

- Máy PCR luân nhiệt hãng Bio Rad (Mỹ)

- Máy đo quang phổ (UV) Ultrospec 2000

- Thiết bị hấp tiệt trùng

- Tủ lạnh (4oC, -20 oC), cân phân tích, cân điện tử

- Máy đo pH OAKION 510 (Singapore)

và không gia nhiệt Nồng độ ion sắt (II) là 0,1; 0,05.

2.2.1.1 Tổng hợp hạt nano sắt từ không gia nhiệt và acid citric

Cân 3,98 g muối FeCl2.4H2O và 10,92 g muối FeCl3.6H2O rồi hòa vào200ml nước cất (2 lần) để tạo được dung dịch có nồng độ 0,1 ion sắt (II) Hỗnhợp này được khuấy đều bằng máy khuấy từ với tốc độ cố định trước (500 vòng/phút) Với nồng độ 0,05 ion sắt (II), cân 0,995g FeCl2.4H2O và 2,705gFeCl3.6H2O hòa tan trong 100ml nước cất

Sau đó nhỏ từng giọt dung dịch NH4OH 25% đồng thời trong quá trình khuấy,tốc độ 1 giọt/s Thỉnh thoảng dùng giấy pH để kiểm tra độ pH của dung dịch.Khi dung dịch đạt độ pH khoảng 10,5-11 thì ngưng quá trình phản ứng Hỗn hợpthu được sau phản ứng là kết tủa màu đen (Fe3O4) và các chất hòa tan [2]

Sau đó để phân tách các hạt sắt từ ra khỏi dung dịch ta ly tâm 3 lần trong nước,rồi sau đó chuyển sang ly tâm trong cồn 96o, với tốc độ quay 2800 vòng/phút,thời gian trong 5 phút [1, 2]

Sản phẩm thu được là chất rắn đặc sệt màu đen

Để thu được bột nano đem kết tủa sấy ở 440C trong thời gian 20h, hoặc phân tánchúng trong nước để thu được dung dịch chất lỏng từ [2]

2.2.1.2 Tổng hợp hạt nano sắt từ có gia nhiệt và bổ sung acid citric

Tiến hành tổng hợp hạt nano từ tính bằng phương pháp đồng kết tủa cógia nhiệt và bổ sung thêm acid citric để giúp sản phẩm hạt sắt từ phân tán tốttrong dung dịch Cách tiến hành như sau :

Cân 0,86g FeCl2.4H2O và 2,35g FeCl3.6H2O (tỉ lệ mol 1 :2) hòa hỗn hợpmuối vào 40 ml nước cất để tạo nồng độ 0,1 ion sắt (II) và đun nóng đến 80oC.Khuấy mạnh hỗn hợp phản ứng bằng máy khuấy từ, thêm 5 ml NH4OH bằng ốngnhỏ giọt và tiếp tục đun nóng thêm 30 phút nữa

Sau đó, thêm 1g CA trong 2 ml nước cất và nâng nhiệt lên 95oC, tiếp tục khuấytrong 90 phút nữa Lượng kết tủa sắt được hình thành Phần CA dư được trunghòa bằng NaOH [22] Để kết tủa lắng một thời gian, hút bỏ phần phần nước ởtrên và thêm nước cất vào bảo quản ở nhiệt độ phòng

2.2.2 Chức năng hóa bề mặt hạt nano sắt từ

Để tạo nhóm chức năng trên bề mặt hạt nano sắt từ, chúng tôi sử dụng3-aminopropyl triethoxysilane (APTS, n = 2) để tạo ra nhóm amino Các bướctiến hành như sau :

1 Lấy 400 mg hạt nano sắt từ cho vào 100 ml nước cất hai lần rồi dùng máy siêu

âm phân tán hạt vào dung dịch để thu được một thể huyền phù ổn định

2 Nhỏ 1ml dung dịch APTS vào trong dung dịch huyền phù nói trên và khuấy từtrong thời gian 8 giờ để quá trình chức năng hóa bề mặt xảy ra hoàn toàn

3 Lọc rửa 5 lần bằng nước cất và lọc từ để thu sản phẩm hạt nano sắt từ có bềmặt là các nhóm amino, viết tắt là amino-NP [29]

2.2.3 Nuôi vi khuẩn B subtilis thu sinh khối