tóm tắt luận án nghiên cứu sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia đa giá f(ab’)2 từ huyết tương ngựa; đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm

Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu và huyết tương phải sử dụng trong điều trị rắn độccắn, Bộ y tế đã quan tâm chỉ đạo việc nghiên cứu, ứng dụng sản xuất huyết thanh kháng n

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Lý do chọn đề tài:

Theo WHO ước tính, mỗi năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu đơn vị máu phục vụ cấp cứu điều trị (≈ 2%dân số) [40]; ngoài máu và các chế phẩm máu, chế phẩm huyết tương, còn phải kể đến các chế phẩm huyết

thanh như: gamma globulin, anti-HBs globulin, anti-T lymphocyte globulin, antivenom [141],[147],[152]

trong đó, huyết thanh kháng nọc rắn (antivenom) là loại chế phẩm rất quan trọng, đặc biệt trong điều trị rối loạn đông cầm máu do nhiễm độc nọc rắn (họ Vipridae).

Là nước nhiệt đới, với ¾ diện tích rừng núi và đất nông nghiệp, bờ biển dài hơn 3000 km, Việt Nam cómôi trường rất thuận lợi cho rắn độc phát triển Phần lớn cư dân sinh sống, làm việc trong môi trường nôngnghiệp, rừng núi, hải đảo nguy cơ bị rắn độc cắn rất cao (> 30.000 người /năm [21]); ngoài tổn thất nhânmạng, chi phí điều trị rất tốn kém: nhiều nạn nhân phải thở máy hàng tháng hoặc phải truyền hàng chục lítmáu và huyết tương để cứu tính mạng; kỷ lục, đầu tháng 6/2013, bệnh viện Bạch Mai đã phải truyền ≈ 46 lítmáu và chế phẩm để cứu một người bệnh [174]

Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu và huyết tương phải sử dụng trong điều trị rắn độccắn, Bộ y tế đã quan tâm chỉ đạo việc nghiên cứu, ứng dụng sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR)[6],[8] Đến nay, đã có một số nghiên cứu rất thành công, góp phần cứu sống hàng ngàn bệnh nhân, giảm

mạnh lượng máu và chế phẩm phải sử dụng [6],[21],[23]

Tuy vậy, sau nhiều năm nỗ lực, đến nay chúng ta vẫn đang thiếu trầm trọng nhiều loại HTKNR; hầunhư ta chỉ có duy nhất hai loại HTKNR cho rắn hổ đất và rắn lục tre [8],[165],[166],[171] Do tính đặc hiệukháng nguyên nọc rắn theo vùng địa lý, mỗi quốc gia phải tự chế tạo HTKNR cho chính quốc gia mình(khuyến cáo của WHO) [141],[20],[6] Để đáp ứng nhu cầu cấp cứu, điều trị rắn độc cắn, chúng ta rất cần

đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất HTKNR; đặc biệt là các HTKNR cho các loài rắn độc nguy hiểm, thường gặp; trong các loài đó, hàng đầu phải kể đến rắn cạp nia, chiếm 35,8% các loài rắn độc họ rắn hổ (Elapidae)

tại Việt Nam, là loài rắn độc có độc tính cực mạnh, gây tử vong rất cao (> 80% nếu không được cấp cứu điềutrị kịp thời) [14]

Thực tế điều trị rắn cạp nia cắn ở Việt Nam từ trước đến nay cho thấy: nước ta có hai loài rắn cạp nia

thường gặp, chủ yếu là rắn cạp nia nam (Bungrarus candidus) và rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus).

Đây là hai loài rắn có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” rất giống nhau, thoáng nhìn rất khó phân biệt Hailoài rắn này khác nhau cả về độc tính nọc và biểu hiện lâm sàng, chẩn đoán rất dễ nhầm lẫn, HTKNR đơnđặc hiệu không có tác dụng chéo và cũng chưa có VDK để chẩn đoán xác định [15] Nghiên cứu sản xuấtHTKNR đa giá cho cả hai loài rắn độc nguy hiểm này là giải pháp đem lại thuận lợi cho cấp cứu điều trịbệnh nhân rắn cạp nia cắn trong cả nước Để tăng tính an toàn của HTKNR, dạng F(ab’)2 là tối ưu Đồng

thời, việc hoàn thiện quy trình sản xuất, tiêu chuẩn hóa sản phẩm là hết sức cần thiết

2 Mục tiêu đề tài:

(1) Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tương ngựa đáp ứng Tiêu chuẩn Việt Nam(Dược điển Việt Nam)

(2) Đánh giá chất lượng của chế phẩm trong phòng thí nghiệm

3 Ý nghĩa của đề tài và những đóng góp mới:

3.1 Lần đầu tiên tại Việt Nam và trên thế giới đã sản xuất được chế phẩm HTKN-RCN đa giá chống lại nọc

độc hai loài RCN thường gặp, nguy hiểm nhất Việt Nam, cũng là những loài rắn độc vào hàng bậc nhất trên

thế giới

3.2 Lần đầu tiên hoàn thiện và chuẩn hóa được toàn bộ các công đoạn của quy trình sản xuất, cho ra sảnphẩm HTKNR đạt Tiêu chuẩn Quốc gia về huyết thanh kháng nọc rắn điều trị cho người Sản phẩm đạt 9/10chỉ tiêu cơ bản của WHO về chất lượng

3.3 Đã sản xuất và tinh sạch thành công HTKN-RCN đa giá dạng F(ab’)2 là dạng chế phẩm tiên tiến, hiệuquả nhất hiện nay, loại bỏ được Fc của phân tử IgG, giải quyết tận gốc vấn đề an toàn miễn dịch khi điều trị.3.4 Vấn đề hiệu lực kháng nọc rắn của chế phẩm: đã được giải quyết thành công với các giải pháp đồng bộ:chọn lựa đúng chủng loại rắn, lấy nọc có chất lượng, làm mất độc lực nọc nhưng vẫn giữ được tính KN; đảm

bảo lịch trình miễn dịch, liều lượng KN + tá dược; theo dõi chăm sóc để ngựa sinh KT tốt nhất, huyết tương

có hiệu giá KT cao; theo dõi hình thành KT đặc hiệu; đảm bảo lấy máu vô trùng; tinh chế mảnh F(ab’)2 vẫngiữ được tính hoạt động sinh học; tinh sạch các F(ab’)2 có nồng độ cao nhất

4 Bố cục của luận án:

Luận án gồm 128 trang, ngoài phần đặt vấn đề và kết luận, luận án có 4 chương chính:

- Đặt vấn đề: 2 trang

- Chương 1: Tổng quan (38 trang).

- Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (18 trang).

- Chương 3: Kết quả nghiên cứu (31 trang).

- Chương 4: Bàn luận (37 trang).

- Kết luận & Kiến nghị: 2 trang

Luận án có: 29 bảng, 4 biểu đồ và sơ đồ, 63 ảnh và hình vẽ (48 ảnh phụ lục), 175 tài liệu tham khảo (40Tiếng Việt, 114 Tiếng Anh, 21 website), 4 phụ lục

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Máu và huyết tương:

1.2 Các loại chế phẩm máu và chế phẩm huyết tương:

1.3 Phương pháp tách chiết các thành phần huyết tương:

1.3.1 Phương pháp tủa lạnh bằng ethanol

1.3.2 Phương pháp tủa bằng muối

1.5.1 Tình hình tai nạn do RCN tại Việt Nam

1.5.2 Chi rắn cạp nia (Bungarus) tại Việt Nam

1.5.3 Đặc điểm nọc rắn cạp nia và cơ chế bệnh sinh

1.5.4 Tình hình NC, sản xuất HTKN-RCN ở Việt Nam & Thế giới

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng & vật liệu nghiên cứu:

- Đối tượng NC: Nghiên cứu trên các động vật thí nghiệm: rắn cạp nia bắc và rắn cạp nia nam, ngựa, thỏ,chuột lang, chuột nhắt trắng

- Vật liệu NC: nọc RCN bắc và nọc RCN nam đông khô: 3,1 gam

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: NC labo + thực nghiệm trên động vật

2.2.2 Tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm cần đạt:

Bảng 2.1: Tiêu chuẩn Quốc gia (Dược điển Việt Nam IV, 2009)

TT Tên các chỉ tiêu Tiêu chuẩn cần đạt

1 An toàn chung Đạt an toàn chung

2 Vô khuẩn Không có vi khuẩn, vi nấm

3 Chí nhiệt tố Không có chất gây sốt

4 Hiệu giá KT/lọ Đạt > 100 LD50/lọ (5ml)

6 Merthiolat ≤ 0,01%

Bảng 2.2: Tiêu chuẩn cần đạt theo WHO guidelines, 2008.

TT Tên các chỉ tiêu Tiêu chuẩn cần đạt

3 Chí nhiệt tố Không có chất gây sốt

4 Hiệu giá KT/lọ Đạt tiêu chuẩn đăng ký

6 Hàm lượng chất

bảo quản

Phenol < 2,5 g/lCresols < 3,5 g/l

2.2.3 Nội dung nghiên cứu:

2.2.3.1 Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’) 2

- Chế tạo KN nọc rắn cạp nia đa giá giảm độc lực

- Gây mẫn cảm ngựa, theo dõi hình thành KT đặc hiệu.

- Lấy máu, thu huyết tương, truyền trả khối hồng cầu

- Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2, xác định mức độ tinh sạch của sản phẩm

2.2.3.2 Đánh giá chất lượng HTKN-RCN trong phòng thí nghiệm:

- Kiểm định cơ sở, đánh giá tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm

- Kiểm định quốc gia, đánh giá an toàn, hiệu lực, đặc điểm lý hóa

- Sơ bộ tính giá thành sản xuất, đánh giá hiệu quả kinh tế, xã hội

2.2.4 Các phương pháp kỹ thuật nghiên cứu:

- Tuyển chọn RCN, lấy nọc, bảo quản nọc theo phương pháp của Trần Kiên, David Warell [21],[23],[24]

- Chế tạo KN và đánh giá chất lượng theo phương pháp của Trịnh Xuân Kiếm, khuyến cáo của WHO, 2008[151] & Dược điển VN

- Gây mẫn cảm ngựa, theo dõi hình thành KT đặc hiệu bằng thử nghiệm Ouchterlony và điện di miễn dịchhuyết thanh với nọc RCN

- Lấy huyết tương theo phương pháp plasmaferesis

- Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab')2 theo phương pháp cắt Fc của - globulin bằng pepsin, tủa phân đoạnvới ammonium sulphate, thẩm tích với nước cất, lọc Seize (WHO, 2008 [151])

- Kiểm định cơ sở: đánh giá bằng thử nghiệm an toàn chung, chí nhiệt tố, cấy khuẩn, cấy nấm, xác địnhLD50 và hiệu giá (ED50).

- Sau khi đạt chất lượng ở kiểm định cơ sở, đóng lọ vô khuẩn 5ml/lọ và yêu cầu Kiểm định Quốc gia

- Kiểm định cơ sở gồm: thử nghiệm an toàn chung (Safety test), thử nghiệm chất gây sốt (Pyrogens test), thử nghiệm vô khuẩn (Sterility test), thử nghiệm công hiệu (Potency test) Thử công hiệu gồm 2 bước: xác định

LD50 của nọc RCN theo công thức Karber, sau đó xác định ED50 của HTKN-RCN đã sản xuất

- Kiểm định Quốc gia: theo quy trình của Viện KĐQGVX&SPYT, gồm: 1 Thử nghiệm an toàn chung 2.

Thử nghiệm vô khuẩn 3 Thử nghiệm chí nhiệt tố 4 Thử nghiệm công hiệu (hiệu giá) 5 Nồng độ Proteintoàn phần 6 pH 7 Nồng độ NaCl 8 Nồng độ chất bảo quản (Merthiolat)

2.3.5 Thời gian, địa điểm nghiên cứu:

- Thời gian nghiên cứu: 6/2008 – 11/2011

- Địa điểm tiến hành: tại Đơn vị nghiên cứu HTKN, Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch Mai, Viện kiểmđịnh Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Trung tâm nghiên cứu dã ngoại thực nghiệm HVQY, Viện HH-TMTW, Bệnh viện 103, Bệnh viện Bạch Mai và một số địa điểm nghiên cứu tại Thư Phú, Lệ Mật (Hà Nội),Vũng Tàu

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HTKN - RCN ĐA GIÁ F(ab’) 2 :

3.1.1 Chế tạo KN, đánh giá chất lượngKN

Bảng 3.1: Kết quả tuyển chọn và lấy nọc RCN

Số rắn lấy

nọc (con)

SL rắn(con)

SL nọc(gam) SLNTB

SL rắn (con)

* Chú thích: SLNTB:số lượng nọc trung bình của một con rắn/lần lấy nọc

Bảng 3.2: Đánh giá sơ bộ về mức độ thường gặp của chi RCN ở VN

Loài rắn

Vùng

Bungarus fasciatus

Bungarus candidus

Bungarus multicinctu s

Bungarus slowinskii

Bungarus flaviceps

* Chú thích: Không gặp: (-); Gặp nhưng số lượng rất ít: (+)

Thường gặp, số lượng ít: (++); thường gặp, số lượng nhiều: (+++)

SL nọc (mg)

Thay đổi bất thường

Tăng TL(g)Sốt Rụng

SL nọc(mg)

Nhiệt độ trước/sau tiêm

KN(oC)

Thay đổi nhiệt độ

(kg) Khởiđầu Sau 1giờ 2 giờSau Sau 3giờ cao nhất

Bảng 3.6 Kết quả cấy khuẩn, cấy nấm KN.

Môi trường Sabouraud (37oC) Môi trường Thioglycolate (20-25oC)Ngày thứ

3

Ngày thứ7

Ngày thứ14

Ngày thứ1

Ngày thứ2

Ngày thứ 3

Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính

3.1.2.Kết quả gây mẫn cảm ngựa & theo dõi đáp ứng miễn dịch:

Bảng 3.7: Liều lượng KN và tá dược gây mẫn cảm ngựa.

Hô hấp

Tiêu hóa độngVận Hô hấp Tiêu hóa

Bảng 3.9: Hiệu giá KT kháng nọc RCN sau miễn dịch ngựa.

Lần 5

Ảnh 3.4 Vết tủa KN-KT trên thạch agarose 1,5% (ảnh trái)

Ảnh 3.5 Xác định KT đặc hiệu bằng điện di miễn dịch.

3.1.3 Lấy máu, tách huyết tương giàu KT, truyền trả khối HC:

Bảng 3.10: Khối lượng máu, huyết tương, khối hồng cầu thu được.

Số lượng

Ngựa NC

Máu ngựa(lit)

Huyếttương (lit)

Khối hồngcầu (lit)

Lần 2 5,1 3,1 2,0

Bảng 3.11: Lượng máu lấy và phản ứng của ngựa trong khi lấy máu.

Số lượng máu lấy

(lit)

Biểu hiện của ngựaBình thường Choáng nhẹ ShockNgựa

3.1.4 Kết quả tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’) 2 :

3.1.4.1 Cắt Fc, tủa phần protein không có KT với ammonium sulphate 14%, lọc bỏ tủa, thu dịch lọc chứa nhiều mảnh F(ab’) 2 :

Bảng 3.12: Thể tích dịch lọc có F(ab’)2 thu được.

Chỉ số NC

Lô NC

Huyết tươngSản xuất (ml)

HTKN-RCN bánthành phẩm (ml)

Lượng dịchthẩm tích bịhao hụt (ml)

cho thấy F(ab’)2 chiếm tỷ lệ cao gần như tuyệt đối).

3.2 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM HTKN-RCN ĐA GIÁ F(ab’)2 TRONG PHÒNG THÍ

NGHIỆM:

3.2.1 Kiểm định chất lượng tại cơ sở:

Bảng 3.18: Thử nghiệm an toàn trên chuột lang.

TT

Trọnglượng(gam)

HTKN(ml)

Theo dõi chuột thí nghiệm Tăng

trọnglượng(gam)

Rụnglông

Trọng lượngTuần 1 Tuần 2 Tuần

Thể tíchHTKN(ml)

Nhiệt độ thỏ trước/sau khi tiêmHTKN RCN (oC) Chênhlệch

(oC)Trước Sau 1 h Sau 2 h Sau 3 h

Ngày 14

Ngày3

Ngày5

Ngày 7

tính

Âmtính

Âmtính

Âmtính

Âmtính

Âmtính

Lô II tínhÂm tínhÂm Âmtính Âmtính tínhÂm tínhÂm

Bảng 3.21: Xác định liều chết 50% (LD50) của nọc RCN Việt Nam

Theo dõi chuột thí nghiệm chuột chếtTỷ lệ

(%)Chết Sống Tổng số

Nọc RCN

40 LD50(ml)

SốLD50/

chuột

Tình trạngchuột NC

Bảng 3.23: Kết quả Kiểm định Quốc gia về chất lượng HTKN-RCN

4.1.1 Chế tạo KN:

- Tuyển chọn rắn, lấy nọc: tuyển chọn rắn, lấy nọc là công đoạn đầu tiên rất quan trọng của quy trình sản

xuất Nọc rắn của 2 loài RCN dự định chế tạo HTKN-RCN đa giá phải có chất lượng tốt, đại diện cho quần

thể cả 2 loài RCN ở Việt Nam Sau 6 lần tiến hành thu gom đã lấy đủ số lượng nọc cần thiết của cả 2 loàiRCN bắc và nam Nọc của RCN ít, khó lấy và rất nguy hiểm (bảng 3.1)

- Xác định các loại rắn khoang thường gặp ở Việt Nam: Việt Nam có nhiều loài rắn khoang “khúc đen,

khúc trắng”, dễ nhầm lẫn với nhau (bảng 3.2) là B candidus, B multicinctus và Rắn khoang sông Hồng (B slowinskii), trong đó RCN nam và RCN bắc là 2 loài thường gặp, có số lượng nhiều nhất trong tự nhiên, cần

sản xuất antivenom phục vụ điều trị, các loài khác ít gặp

- Kết quả chế tạo KN nọc rắn cạp nia đa giá, giảm độc lực:

Sử dụng 3 g nọc nguyên chất của cả 2 loài RCN, chế tạo được 272,8 ml dung dịch KN nọc RCN giảm độclực Đã phân chia số lượng KN ra các loại thể tích khác nhau căn cứ vào liều KN miễn dịch trong lịch trình

dự kiến và trọng lượng của ngựa nghiên cứu Đóng lọ theo từng nhóm có thể tích từ 0,1 ml đến 6 ml, chia ra

9 bậc cho 9 tháng gây mẫn cảm cho ngựa Số lượng KN chế tạo đủ dùng trong nghiên cứu, phòng tình huốngngựa chết, nghiên cứu thất bại và lưu trữ phục vụ kiểm tra chất lượng HTKNR (bảng 3.3)

- Kiểm tra chất lượng KN: các bảng 3.4, 3.5, 3.6 cho thấy: chất lượng KN đạt yêu cầu về an toàn chung, vô

khuẩn, không có chất gây sốt khi gây mẫn cảm cho động vật thí nghiệm Với loại độc tố có độc lực rất mạnhvới sinap thần kinh – cơ như nọc RCN, chế tạo KN để gây mẫn cảm nếu không đảm bảo, sẽ gây chết độngvật Khử độc tính nọc rắn, chỉ giữ lại tính KN độc tố là mục đích của chế tạo KN Quá trình khử độc với

glutheraldehyde, các vi khuẩn đã bị tiêu diệt một phần lớn; những vi khuẩn, vi nấm bị loại bỏ bằng lọc quamàng lọc Ø 0,2 µm Trong quá trình chế tạo KN (lấy nọc, khử độc nọc, tiến hành ly tâm, bỏ cặn, thu dungdịch KN, lọc vô trùng, chiết vào các lọ nhỏ, đóng nắp lọ, ), yêu cầu vô khuẩn, loại trừ chất gây sốt đã đượctuân thủ nghiêm túc (bảng 3.5, 3.6)

4.1.2 Quy trình gây mẫn cảm ngựa, theo dõi đáp ứng miễn dịch:

- Lịch trình miễn dịch ngựa, liều lượng KN và tá dược:

Cách 1 tháng/lần là khoảng thời gian bảo đảm an toàn cho ngựa sau miễn dịch (liền vết loét, mệt, yếu, )đồng thời là khoảng thời gian cần thiết cho quá trình đáp ứng miễn dịch xảy ra (theo WHO, cần từ 3-8 tuần).Liều KN gây mẫn cảm tăng dần, kết hợp với tá dược Freund gây kích thích đáp ứng miễn dịch thứ phát của

hệ miễn dịch ngựa Tá dược Freund được sử dụng gồm 1 trong 2 loại: CFA hoặc IFA Đây là một huyền dịch

KN được nhũ hóa (emulsify) trong dầu khoáng, để tăng cường độ đáp ứng miễn dịch (immunopotentiator).Nhiều tác giả đã sử dụng phương pháp kết hợp KN và CFA để tăng mạnh hiệu giá KT cho thấy hiệu quả rất

rõ rệt Pratanaphon R và cộng sự (1997), đã trộn lẫn KN nọc rắn hổ đất Thái Lan và với các tá dược khácnhau như: CFA đơn thuần (50% CFA + 50% KN), CFA với tỷ lệ 25% (75% KN và 25% CFA), KN + vắc

xin nội độc tố uốn ván (tetanus toxoid), KN + vắc xin nội độc tố bạch hầu (diphtheria toxoid ) với tỷ lệ khác

nhau, đã thu được kết quả tốt, hiệu giá KT tăng cao mạnh mẽ trong thời gian ngắn so với nhóm chứng chỉ

dùng KN và tá dược là bentonite gel

- Theo dõi sức khỏe ngựa sau mỗi lần miễn dịch: Tiêm KN và tá dược CFA lần thứ nhất ở cả 2 ngựa đều

thấy ngựa mệt mỏi, bỏ ăn, yếu bại, nằm tại chỗ hoặc lười vận động; tại chỗ tiêm bình thường Lần tiêm thứ 2

và 3 nhắc lại sau 1 tháng, thấy ngựa bỏ ăn hoặc ăn kém, tại chỗ tiêm xuất hiện vết loét, đường kính 3-7 cm.Những lần tiêm với tá dược IFA, không xảy ra loét chỗ tiêm; biểu hiện toàn thân bình thường, ngựa vẫn đilại, ăn uống tốt, dáng điệu khỏe mạnh Hiện tượng loét da xảy ra sau miễn dịch ngựa bằng tá dược CFA lầnthứ 2,3 nhưng không loét ở những lần gây mẫn cảm với tá dược IFA (bảng 3.8) (có thể do CFA có BCGchết?) Theo WHO, chỉ tiêm một lần CFA và hạn chế tiêm tại một điểm số lượng lớn KN + tá dược, tuynhiên nhóm nghiên cứu đã không tuân thủ điều này; ngựa vẫn sống và đáp ứng miễn dịch xảy ra bìnhthường, song việc chăm sóc vất vả hơn; cũng không chứng minh được hiệu quả đáp ứng miễn dịch cao hơn

so với hướng dẫn của WHO

- Theo dõi hiệu giá KT sau miễn dịch: Sau miễn dịch 9 lần, hiệu giá KT đặc hiệu với KN nọc RCN tăng lên

mức 2048 ở cả 2 ngựa và ổn định sau lần miễn dịch thứ 8 và 9 Như vậy, có thể lấy máu sớm hơn sau 7 lầnmiễn dịch bằng KN nọc RCN và tá dược Kết quả bảng 3.9 cũng cho thấy, với 2 ngựa khỏe, có cân nặngtương đương và được nuôi ở 2 địa điểm khác nnhau, cùng một liệu trình miễn dịch với liều lượng như nhau,

có thể cho kết quả hiệu giá KT khác nhau Điều này gợi ý: chế độ chăm sóc và dinh dưỡng đóng vai trò quan