Xây dựng mô hình và thử nghiệm điều trị bệnh xơ hóa gan bằng liệu pháp tế bào gốc trên chuột nhắt trắng (mus musculus var. Albino)

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu Cơ chế của việc hoạt hóa phát sinh xơ hóa và sự chuyển biệt hóa của tế bào hình sao thành MFB có thể tóm tắt qua ba giai đoạn: bắt đầu bằng giai đoạn t

Lời đầu tiên con xin cảm ơn Bà nội, Ba Me, O Kim đã ngày đêm hy sinh lặng lẽ, dạy con biết vượt qua gian khổ để trưởng thành Em xin cám ơn Anh Hai đã tin tưởng, động viên em trên bước đường em đi

Cho tôi được bày tỏ lòng ngưỡng mộ và chân thành biết ơn Thầy BS.CKII Trần Minh Thông, người đã truyền cho tôi niềm tin yêu khoa học, chu đáo tận tình giúp tôi tháo gỡ những vướng mắc trong thời gian nghiên cứu và tiến hành luận văn Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Phan Kim Ngọc Thầy luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất, quan tâm, động viên và giúp đỡ để tôi tiến hành nghiên cứu của mình Tôi cũng đã rất may mắn nhận được sự giúp đỡ của TS Lê Kim Hòa và TS Đỗ Minh Sĩ tạo cho tôi nhiều cơ hội để báo cáo bảo vệ luận văn này

Tôi đặc biệt rất cảm ơn bạn Ngô Duy bình đã đồng hành với tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn Cám ơn Bình đã luôn giúp đỡ, quan tâm, chia sẻ với tôi những khó khăn, niềm vui, nỗi buồn trong cuộc sống

Tôi xin chân thành cảm ơn anh Phạm Văn Phúc, anh Lê Thành Long đã giúp đỡ và cho tôi nhiều lời khuyên bổ ích

Cảm ơn bạn Trương Hải Nhung, Đặng Thị Tùng Loan, Trần Thị Như Mai, Nguễn Thị Diệu Hằng, em Nguyễn Thành Trung, Phạm Quốc Việt, Huỳnh Nhã Vân, Lê Ngọc Châu đã chia sẻ, giúp đỡ tôi rất nhiều

Cuối cùng tôi xin cám ơn tất cả các bạn bè, đồng nghiệp trong PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Tp Hồ Chí Minh, ngày 08 tháng 09 năm 2010

Trần Hồng Diễm

Trần Hồng Diễm Mở đầu

MỞ ĐẦU

NGUYÊN NHÂN TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU [23] [25] [42] [48]

Theo thống kê của National Center for Health Statistics (2006) xơ gan và suy gan mạn là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở các quốc gia trên thế giới, phổ biến đứng hàng thứ 12 ở Hoa Kỳ năm 2002, với 27,555 trường hợp tử vong (9,2/100,000 người) Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến xơ gan chẳng hạn như tiếp xúc với hóa chất công nghiệp, uống rượu hoặc nhiễm siêu vi B, C trong thời gian dài Khoảng 70,000 công nhân ở 15 nước Châu Âu (CAREX, 1990-1993); 100,000 công nhân ở Mỹ (NOES, 1997) có khả năng phơi nhiễm với CCl4 Theo

Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam nằm trong vùng dịch tễ cao, với tỷ lệ 15 - 20% dân số mang mầm bệnh viêm gan siêu vi B, khoảng 20% trường hợp viêm gan

B chuyển thành xơ gan Tổn thương ống mật cũng có thể gây xơ gan, như sự tắc ống mật cơ học, bệnh viêm xơ gan do tắc mật nguyên phát (primary bliary cirrhosis)

và viêm xơ chai đường mật nguyên phát (primary sclerosing cholangitis) (Peter Fickert và cộng sự, 2007)

Hiện nay, ở Việt Nam điều trị bệnh xơ gan ở giai đoạn sớm, chủ yếu là dùng các thuốc chống xơ như Colchicine, Corticoids (trong viêm gan tự miễn), và một số thuốc khác đang nghiên cứu (HOE 007) Đối với xơ gan nặng, các tế bào gan bị hoại tử cao dẫn tới suy chức năng gan thì sự điều trị chỉ là giải quyết các biến chứng của xơ gan như cổ trướng, tăng huyết áp cửa gan…

Biện pháp tối ưu và là hy vọng duy nhất đối với bệnh nhân xơ gan ở giai đoạn muộn là cấy ghép gan mới Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là hiếm nguồn gan hiến tặng, chi phí cao và phải dùng thuốc ức chế miễn dịch để tránh thải loại Năm 2005, chỉ có khoảng 1/3 trong danh sách 17,000 người chờ ghép gan được cấy ghép gan (Maggie H và cộng sự, 2006) Vì vậy các nhà nghiên cứu trên thế giới đang gấp rút tìm ra các phương pháp điều trị mới Trong đó, liệu pháp tế bào gốc đang được triển khai nghiên cứu ở nhiều nước và cho thấy tiềm năng hứa

Trần Hồng Diễm Mở đầu

hẹn phục hồi chức năng gan (Isao Sakaida, 2006; M.T Abdel Aziz và cộng sự, 2007; P Burra và cộng sự, 2008; Scott V Perryman và cộng sự, 2008 )

Xuất phát từ tính cấp thiết của đề tài, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: Xây dựng mô

hình và thử nghiệm điều trị bệnh xơ hóa gan bằng liệu pháp tế bào gốc trên

chuột nhắt trắng (Mus musculus var Albino)

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Xây dựng thành công mô hình xơ hóa gan trên chuột nhắt trắng bằng hóa chất

- Đánh giá hiệu quả và vai trò của tế bào gốc trung mô trong điều trị xơ hóa gan trên chuột

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nội dung 1: Tạo mô hình xơ hóa gan chuột bằng CCl4 liều 0,8 ml/kg trong 8 tuần

- Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả gây xơ hóa gan của CCl4 liều 0,8 ml/kg, dựa trên các chỉ tiêu:

1 Xét nghiệm sinh hóa (hoạt độ ALT, AST)

2 Đánh giá mô học (nhuộm hematoxylin và eosin)

3 Đánh giá sự biểu hiện gen ở mức phiên mã (procollagen 1(I), integrin 1, ecto-5’-nucleotidase)

- Nội dung 3: Thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ tủy xương chuột

- Nội dung 4: Thu nhận quần thể tế bào đơn nhân tủy xương chuột

- Nội dung 5: Đánh giá hiệu quả điều trị xơ hóa gan sau 3 tuần ghép tế bào gốc trung mô và quần thể tế bào đơn nhân tủy xương chuột, dựa trên các chỉ tiêu:

1 Xét nghiệm sinh hóa (hoạt độ ALT, AST)

2 Đánh giá mô học (nhuộm hematoxylin và eosin)

3 Đánh giá sự biểu hiện gen ở mức phiên mã (procollagen 1(I), integrin , ecto-5’-nucleotidase)

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 SƠ LƯỢC VỀ GAN 3

1.1.1 Giới thiệu 3

1.1.2 Phôi học của gan 3

1.1.3 Cấu trúc gan 6

1.1.4 Khả năng tái sinh của gan 7

1.2 Xơ gan 9

1.2.1 Bệnh nguyên 9

1.2.2 Bệnh học 10

1.2.3 Bệnh sinh 10

1.2.3.1 Cơ chế phát sinh xơ hóa ở gan 10

1.2.3.2 Các tế bào tiềm năng phát sinh xơ hóa khác 14

1.2.3.3 Tương tác giữa các loại tế bào trong phát sinh xơ hóa 15

1.2.4 Chẩn đoán – xét nghiệm 16

1.2.4.1 Xét nghiệm sinh hóa 16

1.2.4.2 Sinh thiết – xét nghiệm mô học 18

1.2.5 Chữa trị 19

1.2.5.1 Bằng thuốc 19

1.2.5.2 Ghép gan 20

1.3 Liệu pháp tế bào 21

1.3.1 Cấy ghép tế bào gan 22

1.3.2 Cấy ghép tế bào gốc gan ứng viên 22

1.3.2.3 Cấy ghép tế bào gốc không thuộc gan 24

1.3.3 Tế bào gốc tủy xương 26

1.3.4 Tế bào gốc từ máu cuống rốn người 31

1.3.5 Tế bào gốc từ mô mỡ 32

1.4 Cơ sở lý thuyết gây độc gan của carbon tetrachloride 33

1.5 Cơ sở lý thuyết nghiên cứu sự biểu hiện collagen trong gan xơ hóa 36

1.6 Cơ sở lý thuyết nghiên cứu sự biểu hiện tế bào tổng hợp chất nền (integrin 1) trong gan xơ hóa 38

1.7 Cơ sở lý thuyết nghiên cứu sự biểu hiện enzym ecto-5’-nucleotidase trong gan xơ hóa 39

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 42

2.1 Vật liệu 42

2.1.1 Đối tượng thí nghiệm 42

2.1.2 Dụng cụ 43

2.1.3 Thiết bị 44

2.1.4 Hóa chất 45

2.2 Phương pháp nghiên cứu 47

2.2.1 Mô hình gây tổn thương gan bằng CCl4 47

2.2.2 Phương pháp đánh giá hiệu quả gây xơ hóa gan của CCl4 48

2.2.2.1 Xác định hoạt độ enzym alanine transaminase, enzym aspartate transaminase trong huyết tương chuột 48

2.2.2.2 Đánh giá cấu trúc mô học gan qua mẫu gan nhuộm hematoxylin và eosin 52 2.2.2.3 Đánh giá sự biểu hiện gen mã hóa cho procollagen α1(I), integrin 1, ecto-5’-nucleotidase ở mức phiên mã 57

2.2.3 Phương pháp thu nhận và nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc ứng viên từ tủy xương chuột 62

2.2.5 Phương pháp nhuộm tế bào bằng Trypan blue 69

2.2.6 Phương pháp ghép tế bào gốc trung mô tủy xương, tế bào đơn nhân tủy xương điều trị xơ hóa gan trên chuột 69

2.2.7 Phương pháp đánh giá hiệu quả điều trị xơ hóa gan của tế bào cấy ghép 72

2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 72

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN 73

Phần I: KẾT QUẢ XÂY DỰNG MÔ HÌNH XƠ HÓA GAN CHUỘT BẰNG HÓA CHẤT CCL4 0,8 ML/KG 3.1 Kết quả xét nghiệm sinh hóa: hoạt độ enzym alanine transaminase (ALT), enzym aspartate transaminase (AST) trong huyết tương 73

3.1.1 Hoạt độ ALT-AST sau 5 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg 73

3.1.2 Hoạt độ ALT-AST sau 8 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg 74

3.1.3 So sánh hoạt độ ALT-AST giữa tuần 5 và tuần 8 75

3.2 Kết quả nhuộm mô học hematoxylin và eosin 77

3.2.1 Kết quả mô học sau 5 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg 78

3.2.2 Kết quả mô học sau 8 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg 80

3.3 Kết quả đánh giá sự biểu hiện gen mã hóa cho procollagen α1(I), integrin 1, ecto-5’-nucleotidase ở mức phiên mã 83

3.3.1 Sự biểu hiện gen mã hóa cho procollagen α1(I) ở mức phiên mã 83

3.3.2 Sự biểu hiện gen mã hóa cho intergrin ở mức phiên mã 85

3.3.3 Sự biểu hiện gen mã hóa cho ecto-5’-nucleoxidase ở mức phiên mã 87

Phần II: KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỦY XƯƠNG CHUỘT 3.4 Kết quả thu nhận tế bào gốc trung mô ứng viên 92

3.5 Kết quả đánh giá marker tế bào gốc trung mô ứng viên 95

3.6.1 Kết quả biệt hóa của MSC ứng viên thành tế bào xương 97

3.6.2 Kết quả biệt hóa của MSC ứng viên thành tế bào mỡ 98

Phần III: KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ BẰNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ VÀ TẾ BÀO ĐƠN NHÂN TUỶ XƯƠNG 3.7 Kết quả xét nghiệm sinh hóa: hoạt độ enzym alanine transaminase (ALT), enzym aspartate transaminase (AST) trong huyết tương 100

3.8 Kết quả nhuộm mô học hematoxylin và eosin 103

3.9 Kết quả đánh giá sự biểu hiện gen mã hóa cho procollagen α1(I), integrin  ecto-5’-nucleotidase ở mức phiên mã 107

3.9.1 Sự biểu hiện gen mã hóa cho procollagen α1(I) ở mức phiên mã 108

3.9.2 Sự biểu hiện gen mã hóa cho intergrin ở mức phiên mã 111

3.9.3 Sự biểu hiện gen mã hóa cho ecto-5’-nucleoxidase ở mức phiên mã 115

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 121

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ix

TÀI LIỆU THAM KHẢO x

PHỤ LỤC xviii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách các dụng cụ dùng trong thí nghiệm 43 Bảng 2.2 Danh sách các thiết bị dùng trong thí nghiệm 44 Bảng 3.1 Kết quả hoạt độ ALT, AST sau 5 tuần, 8 tuần xử lý (2 lần/ tuần) với dầu bắp, CCl4 liều 0,8 ml/kg 73 Bảng 3.2 Kết quả đánh giá marker bề mặt của MSC ứng viên 95 Bảng 3.3 Kết quả hoạt độ ALT, AST sau 3 tuần điều trị với PBS (đối chứng), MSC, BMC 101

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

αCP2 Alpha complex protein 2

ALT (GPT) Alanine transaminase (Glutamate pyruvate transaminase) ANIT Alpha-naphthyl-isothiocyanate

ASH Alcoholic steatohepatitis

AST (GOT) Aspartate transaminase (Glutamate oxaloacetate)

AT-MSC Adipose tissue- Mesenchymal stem cell

BEC Biliary epithelial cell

CSF Colony stimulating factor

DDC 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine

DDR2 Discoin domain receptor 2

DMNS Dimethylnitrosamine

ECM Extracellular matrix

EMT Epithelial-mesenchymal transition

EPC Endothelial progenitor cell

G-CSF Granulocyte-colony stimulating factor

GGT Gamma glutamyl transpeptidase

HCC Hepatocellular carcinoma

HGF Hepatic growth factor

HSC Haematopoietic stem cell

ICAM-1 Inter-cellular adhesion molecule 1

IGF-1 Insulin-like growth factor 1

iPSC induced-pluripotent stem cell

MAPC Multipotent adult progenitor cells

M-CSF Macrophage-colony stimulating factor

MMP Matrix metalloproteinase

Mrp3 Multidrug resistance protein 3

Mrp4 Multidrug resistance protein 4

NAFLD Non-alcoholic fatty liver disease

NCAM Neural cell adhesion molecule

Ntcp Natri Taurocholate co-transporting polypeptide Oatp4 Organic anion transporting polypeptide

PAF Platelet-activating factor

PBC Primary biliary cirrhosis

PBS Phosphate buffered saline

PDGF Platelet-derived growth factor

PPARγ Peroxisome proliferator-activated receptor gamma PSC Primary sclerosing cholangitis

ROS Reactive oxygen species

SREBP-1c Sterol regulatory element binding protein

TGF- β Transforming growth factor- β

TIMP Tissue inhibitor of metalloproteinase

VCAM-1 Vascular cell adhesion molecule 1

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sự hình thành chồi gan (dạng sơ đồ) 4

Hình 1.2 Gen có liên quan đến sự phát triển sớm gan 5

Hình 1.3 Cấu trúc tiểu thùy gan 7

Hình 1.4 Các thay đổi trong cấu trúc gan với sự xơ hóa phát triển (b) so với gan bình thường (a) 11

Hình 1.5 Bệnh sinh của sự xơ hóa gan (sự phát sinh xơ hóa) 12

Hình 1.6 Các phương pháp nhuộm trong chẩn đoán mô học gan 19

Hình 1.7 Sự khác biệt giữa biệt hóa và dung hợp bởi phân tích di truyền học dựa trên nhiễm sắc thể giới tính 29

Hình 2.1 Chuột nhắt trắng (Mus musculus var Albino), 4-5 tuần tuổi 42

Hình 2.3 Hóa chất (a) RT-PCR PreMix Kit one step (b) Mồi cho procollagen 1(I), integrin 1, ecto-5’-nucleotidase 46

Hình 2.4 Quy trình thí nghiệm 47

Hình 2.5 Thao tác cho chuột uống: (a) Thao tác giữ chuột (b) Đưa kim vào thực quản 48

Hình 2.6 (a) Thao tác thu nhận máu từ đuôi chuột (b)Thao tác thu huyết tương chuột 49

Hình 2.7 Các thao tác sinh thiết 53

Hình 2.8 Công thức cấu tạo của hematoxylin 54

Hình 2.9 Công thức cấu tạo của eosin Y (a) và eosin B (b) 54

Hình 2.10 Một tiểu thùy gan bình thường với 3 vùng tế bào 56

Hình 2.11 (a) Thao tác load mẫu vào lỗ răng lược (giếng) bằng micropipette, (b) Điện di agarose mẫu cDNA trong bể điện di nằm ngang 61

Hình 2.12 Kết quả điện di một số đoạn DNA trong gel agarose 62

Hình 2.13 Thao tác thu nhận và nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc ứng viên từ tủy xương chuột 64

Hình 3.1 Biểu đồ thể hiện hoạt độ ALT trong huyết tương chuột sau 5 tuần, 8 tuần uống dầu bắp (đối chứng), CCl4 liều 0,8 ml/kg, 2 lần/ tuần 76 Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện hoạt độ AST trong huyết tương chuột sau 5 tuần/ 8 tuần uống dầu bắp (đối chứng), CCl4 liều 0,8 ml/kg, 2 lần/ tuần 77 Hình 3.3 Cấu trúc đại thể gan chuột thuộc nhóm đối chứng (sau 5 tuần cho uống dầu bắp 2 lần/ tuần) 78 Hình 3.4 Cấu trúc vi thể gan chuột thuộc nhóm đối chứng (sau 5 tuần cho uống dầu bắp 2 lần/ tuần) (kết quả nhuộm H&E) 78 Hình 3.5 Cấu trúc đại thể gan chuột sau 5 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg 79 Hình 3.6 Cấu trúc vi thể gan chuột sau 5 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg (kết quả nhuộm H&E) 79 Hình 3.7 Cấu trúc đại thể gan chuột thuộc nhóm đối chứng (sau 8 tuần cho uống dầu bắp 2 lần/ tuần) 80 Hình 3.8 Cấu trúc vi thể gan chuột sau 5 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg (kết quả nhuộm H&E) 81 Hình 3.9 Cấu trúc đại thể gan chuột sau 8 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg 81 Hình 3.10 Cấu trúc vi thể gan chuột sau 8 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg (kết quả nhuộm H&E) 82 Hình 3.11 Cấu trúc vi thể gan của chuột rat trong nghiên cứu của Wang xian Tang

và cộng sự 2003 (kết quả nhuộm H&E) 83 Hình 3.12 Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuếch đại RT-PCR procollagen α1(I), GAPDH 84 Hình 3.13 Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuếch đại PCR collagen trong nghiên cứu của M.T Abdel Aziz và cộng sự (2007) 85 Hình 3.14 Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuyếch đại RT-PCR integrin

GAPDH 86 Hình 3.15 Kết quả Western blot về sự biểu hiện -Smooth muscle actin (-SMA) trong nghiên cứu của Cheuk-Kwan Sun và cộng sự (2010) 87

Hình 3.16 Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuyếch đại RT-PCR

ecto-5’-nucleotidase, GAPDH 88

Hình 3.17 Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuếch đại RT-PCR procollagen α1(I), ecto-5’-nucleotidase, GAPDH 89

Hình 3.18 Mối liên hệ giữa sự biểu hiện CD73 với sự phát sinh xơ hóa gan (kết quả nhuộm H&E) 90

Hình 3.19 (a) Tế bào vừa thu nhận từ tủy xương, (b) Quần thể tế bào sau 24 giờ nuôi cấy 92

Hình 3.20 (a) Quần thể tế bào sau 48 giờ nuôi cấy, (b) Quần thể tế bào sau 72 giờ nuôi cấy 93

Hình 3.21 (a) Quần thể tế bào sau 8 ngày nuôi cấy, (b) Quần thể tế bào sau 15 ngày nuôi cấy 93

Hình 3.22 (a) Tế bào sau cấy chuyền 5 ngày, (b) Tế bào sau cấy chuyền 7 ngày 94

Hình 3.23 Một số kiểu hình tập đoàn của MSC ứng viên khi nuôi cấy ở mật độ thấp 95

Hình 3.24 Kết quả phân tích Flow cytometry của MSC ứng viên 96

Hình 3.25 Kết quả nhuộm Alizarin red 98

Hình 3.26 Kết quả nhuộm Oil red 99

Hình 3.27 Cấu trúc đại thể gan chuột sau 3 tuần tiêm 0,1 ml PBS (lô CCl4-PBS), 5x104 tế bào gốc trung mô tủy xương (lô CCl4-MSC), 5x104 tế bào đơn nhân tủy xương chuột (lô CCl4-BMC) 104

Hình 3.28 Cấu trúc vi thể gan chuột sau 3 tuần điều trị (a) lô CCl4-PBS, (b) lô CCl4-MSC, (c) lô CCl4-BMC (kết quả nhuộm H&E) 106

Hình 3.29 Cấu trúc vi thể gan chuột trong nghiên cứu của Sivasami và cộng sự (2010) (kết quả nhuộm H&E) 107

Hình 3.30 Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuyếch đại RT-PCR procollagen 1(I), GAPDH 109

Hình 3.31 Kết quả biểu hiện collagen trong nghiên cứu của (a) M.T Abdel Aziz và cộng sự (2007), (b) Sivasami và cộng sự (2010), (c) Cheuk-Kwan Sun và cộng sự (2009) 110 Hình 3.32 Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuyếch đại RT-PCR integrin

, GAPDH 112 Hình 3.33 Kết quả biểu hiện -Smooth muscle actin (-SMA) trong nghiên cứu của (a) Sivasami và cộng sự (2010), (b) Cheuk-Kwan Sun và cộng sự (2010) 113 Hình 3.34 Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuyếch đại RT-PCR ecto-5’-nucleotidase, GAPDH 116

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

1.1 SƠ LƯỢC VỀ GAN

1.1.1 Giới thiệu [1]

Gan là một cơ quan đảm nhiệm nhiều chức năng phức tạp trong cơ thể động vật có xương sống, bao gồm cả người Cơ quan này đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa các chất (carbonhydrat, protein, lipid, …) và một số các chức năng khác trong cơ thể như dự trữ (máu, glycogen, các vitamin, sắt và đồng, …), tổng hợp (protein huyết tương: các yếu tố đông máu, albumin)

Gan cũng sản xuất dịch mật cần thiết cho quá trình tiêu hóa mỡ Gan còn có chức năng lọc máu, giáng hóa các chất độc và thuốc; giáng hóa insulin và các hormon khác; giáng hóa hemoglobin tạo sắc tố mật giúp phân hủy và tái sử dụng hồng cầu; biến đổi ammonia thành ure Trong ba tháng đầu tiên của thai kỳ, gan là nơi tạo hồng cầu chính cho thai nhi Gan còn tham gia vào quá trình miễn dịch Hiện tại, không có một cơ quan nhân tạo nào có thể đảm trách được toàn bộ chức năng vô cùng phức tạp của gan Chỉ một vài chức năng có thể thực hiện được thông qua con đường nhân tạo để điều trị suy gan

1.1.2 Phôi học của gan [15]

Ở chuột, bắt đầu từ ngày thứ 8 của thời kỳ thai nghén, gan phát triển từ nội bì

cơ quan tiêu hóa nguyên thủy (ventral foregut endoderm) Bằng chứng đầu tiên của

sự biệt hóa gan là sự cảm ứng mRNA mã hóa albumin và -fetoprotein trong tế bào nội bì (endodermal cells), ngay cả trước khi biệt hóa kiểu hình Giữa ngày 8,5 và 9,5, tiền thân tế bào gan (hepatocyte precursors) sản sinh, bắt đầu ở ngày 9,5, di cư đến trung bì tim (cardiac mesoderm) trong vách xương gan (septum transversum) Tín hiệu từ trung bì tim làm tế bào tăng mức mRNA mã hóa albumin và -fetoprotein, hình thành nên chồi gan (liver bud) Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (Fibroblast growth factors – FGFs) 1, 2 và 8 có đủ khả năng để cảm ứng sự biểu

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

hiện gen gan trong nội bì cơ quan tiêu hóa nguyên thủy chuột (murine foregut endoderm) FGF receptor 1 và 4 biểu hiện ở tế bào nội bì cơ quan tiêu hóa nguyên thủy (foregut endoderm cells) và thiết yếu cho sự cảm ứng này

Ở ngày 10,5 bắt đầu có sự tạo mạch cho chồi gan, theo sau là sự tăng lớn kích thước gan Những tế bào ở giai đoạn sớm trong chồi gan dương tính với cả albumin

và -fetoprotein Những kiểu hình biệt hóa của tế bào gan (hepatocyte) và biểu mô ống mật (bile duct epithelium) rõ nét lên trong giữa kỳ thai nghén Các nghiên cứu xác định dòng chưa được công bố, nhưng nói chung người ta cho rằng ống mật và tế bào gan xuất phát từ tiền thân thông thường, đó là nguyên bào gan (hepatoblasts) Người ta chưa biết liệu chỉ có một loại nguyên bào gan hay có một sự phát triển dòng theo thứ bậc gồm những nguyên bào gan nguyên thủy và các tiền thân có hai tiềm năng Nguyên bào gan thai có thể được cho là tương đương với một tế bào gốc gan thai

Hình 1.1 Sự hình thành chồi gan (dạng sơ đồ) [15]

(a) Ở đốt thân phôi 6, trung bì tim tạo nên (mũi tên) nội bì cơ quan tiêu hóa nguyên thủy để hoạt hóa gen đặc trưng gan (biểu hiện bởi khối trắng) (b) Tế bào gan sớm bắt đầu sản sinh trong lớp nội

bì (c) Tế bào gan sớm di cư vào vùng trung mô lỏng lẻo gọi là vách xương ngang Tế bào gan sớm sau đó kết tụ xung quanh mao mạch kiểu xoang trong trung mô, hình thành nên gan Người ta đã nhận diện ra một vài gen rất quan trọng đối với sự phát triển của gan (hình 1.2) Những gen đầu tiên giữ vai trò quan trọng đó là yếu tố phiên mã

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

HNF3 và GATA-4 Các gen này thiết yếu cho sự chuyên biệt hóa nội bì và cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của các biểu mô khác như phổi và tuyến tụy Hiện tại, các yếu tố chịu trách nhiệm cho sự biểu hiện gen gan lúc bắt đầu trước khi hình thành chồi gan chưa được biết đến Trái lại, người ta vừa nhận diện được vài nhân tố có liên quan đến sự hình thành chồi gan như: c-jun, yếu tố tăng trưởng người (hepatocyte growth factor-HGF), và c-met được cho là thiết yếu cho sự hình thành chồi gan Các yếu tố khác như 1-integrin hoạt động trong sự phát triển sau

đó của gan (hình 1.2)

Nói chung, sự hiểu biết về sự phát triển gan ở mức phân tử vẫn còn rất ít Có khả năng là nhiều cơ chế được khám phá cho đến nay liên quan đến chuyên biệt hóa gan trong suốt quá trình tạo phôi cũng sẽ được ứng dụng để tái tạo tiền thân gan và sinh học tế bào gốc gan (liver stem cell)

Hình 1.2 Gen có liên quan đến sự phát triển sớm gan [15]

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

1.1.3 Cấu trúc gan [1] [15][45][53]

Gan nằm ngay bên dưới cơ hoành ở phần trên, bên phải ổ bụng (bên phải dạ dày) Gan mềm, có màu đỏ sẫm, chiếm 2 % khối lượng cơ thể người và 5 % khối lượng cơ thể chuột Gan là cơ quan duy nhất với hai nguồn cung cấp máu dẫn vào Động mạch gan cung cấp máu oxy hóa, và tĩnh mạch cửa mang máu trong tĩnh mạch giàu chất dinh dưỡng và hormon từ nội tạng (ruột và tuyến tụy) Động mạch gan, tĩnh mạch cửa, và ống mật chủ đi vào gan ở cùng vị trí, tạo thành bộ ba cửa rãnh ngang gan (portal hepatis)

Gan được bao phủ bởi một lớp mô liên kết phân nhánh kéo dài suốt toàn bộ nhu mô gan và có chức năng như các vách (septa) Lớp mô liên kết này chia nhu mô gan thành những đơn vị nhỏ gọi là các tiểu thùy

Đơn vị chức năng của gan là tiểu thuỳ gan Tổng cộng có từ 50,000 đến 100,000 tiểu thuỳ Tiểu thuỳ gan hình trụ, ở giữa là tĩnh mạch trung tâm, đổ vào tĩnh mạch gan, rồi vào tĩnh mạch chủ Chung quanh tĩnh mạch trung tâm là các bè tế bào gan xếp theo hình nan hoa Mỗi bè tế bào thường gồm hai lớp tế bào gan và giữa các tế bào là các tiểu quản mật Lớp tế bào gan kéo dài từ khoảng không gian cửa đến tiểu TM trung tâm Tất cả các tế bào gan đều bài tiết mật vào các tiểu quản mật, rồi mật chảy vào các ống mật lớn hơn và cuối cùng đổ vào ống mật chủ Mật từ ống mật chủ đi thẳng vào tá tràng hay đi vào túi mật Khi ăn mật được phóng thích

từ túi mật vào tá tràng, sau đó mật được tái hấp thu tại hồi tràng vào tĩnh mạch cửa rồi vào các tế bào gan Vùng kết nối giữa tiểu quản mật và ống mật được gọi là ‘ống Hering’ (canals of Hering) Giữa các tiểu thuỳ gan có các tiểu tĩnh mạch cửa, tiểu động mạch gan từ đó máu đổ vào xoang mao mạch (sinusoid) nằm giữa các bè tế bào gan, phân phối oxy và chất dinh dưỡng cho tế bào ở gan, lấy CO2 và sản phẩm chuyển hóa từ tế bào ở gan và cuối cùng chảy vào tĩnh mạch trung tâm Tiểu tĩnh mạch cửa, tiểu động mạch gan và ống mật hình thành ‘bộ ba cửa’ (portal triad) của tiểu thùy Ngoài ra còn có các mạch bạch huyết Các mao mạch kiểu xoang được lót

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

bởi các tế bào nội mô và các tế bào Kuffer Lớp nội mô có những cửa sổ lớn, nên các chất từ huyết tương khuyếch tán vào khoảng Disse giữa các tế bào nội mô và tế bào gan Khoảng Disse liên hệ trực tiếp với các mạch bạch huyết

Hình 1.3 Cấu trúc tiểu thùy gan [53]

(a) 3 tiểu thùy có cấu trúc 6 cạnh được phân ranh giới bởi các portal triad ở ngoại biên và gồm một tĩnh mạch ở trung tâm, (b) Cấu trúc mô học của một tiểu thùy, (c) Cấu trúc của một phiến tế bào

gan

1.1.4 Khả năng tái sinh của gan [45]

Gan là một cơ quan đặc biệt có khả năng điều chỉnh sự tăng trưởng và khối lượng của chính nó Ở những loài gặm nhấm và người, gan phát triển nhanh chóng sau khi cắt bỏ hơn 50% khối lượng Quá trình gia tăng khối lượng này (do cắt bỏ một phần gan hay do tổn thương cấp tính do hoá chất) gọi là sự tái sinh của gan, mặc dù sự gia tăng này xảy ra thông qua sự tăng sinh bù hơn là sự tái sinh đúng nghĩa

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

Khả năng tái sinh gan hoàn toàn là một đặc tính đặc trưng của gan Sự tái sinh bắt đầu bằng việc kích hoạt sự phát triển quần thể gan nguyên thủy Tế bào gan trong cơ thể người trưởng thành đã biệt hóa, bình thường ở trạng thái không hoạt động và duy trì khả năng này cho đến khi cơ thể có nhu cầu Sau đó, chúng quay lại trạng thái không hoạt động, hoàn thành chức năng Những tế bào khác trong gan, bao gồm biểu mô mật (biliary epithelium), nội mô xoang mao mạch (sinusoidal endothelium), tế bào hình sao (stellate cells), và những tế bào Kupffer, cũng tăng sinh, với giai đoạn tiềm tàng khoảng 24 giờ ở chuột nhưng chưa được biết rõ ràng ở người Trong điều kiện bình thường, quá trình này là kết quả của sự điều hòa chính xác, phục hồi toàn bộ khối mô và cấu trúc tế bào Vì vậy, đây không chỉ là một mô hình hoàn hảo cho việc điều khiển sự phát triển tế bào gan, mà còn là phương tiện

để điều khiển sự tạo thành những tế bào mô chuyên biệt – sự phân cực tế bào và tổ chức không gian ba chiều

Tế bào gan nguyên thủy giống như một “người đóng góp” cho một “bể” tế bào gốc gan, mặc dù điều này không phù hợp với định nghĩa về tế bào gốc đã được công nhận – một tế bào có khả năng tự làm mới và đa năng Tế bào gan là đơn năng, mặc

dù có một số nghiên cứu cho rằng những tế bào gan phát triển thành tế bào biểu mô ống, người ta cho rằng nó không đóng vai trò chính trong cơ chế thay thế tế bào bình thường ở gan Trong những thử nghiệm trên động vật, phẫu thuật cắt bỏ một phần gan (partial hepatectomy-PH), tế bào gan có khả năng tái tạo lại những tế bào chức năng Đây không chỉ là lý thuyết, thực tế chúng tạo thành một quần thể tế bào giống như trong những mô khác đã được xác nhận như da, tủy xương hay đường ruột Nếu cắt bỏ hai phần ba gan, mỗi tế bào gan chỉ cần phân chia nhiều nhất hai lần để khôi phục lại gan Ở điều kiện bình thường, sự tái sinh gan xảy ra từ những tế bào gan nguyên thủy và những loại tế bào khác tồn tại trong gan mà không cần đến thành phần tế bào gốc

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

Người ta kết luận rằng ở gan, những tế bào đã biệt hoá ở trạng thái nghỉ sẽ tái bản nhanh chóng sau khi cắt một phần mô, trong khi những tế bào tiền thân của gan (oval cell) chỉ tăng sinh và tạo dòng trong những trường hợp mà sự tăng sinh của tế bào gan bị ngăn cản hay bị trở ngại Mặc dù tế bào gốc tuỷ xương có khả năng sinh

ra tế bào ovan và tế bào gan, nhưng sự chuyển biệt hoá này rất hiếm và kém hiệu quả

1.2 Xơ gan

Bệnh gan được phân loại theo nguyên nhân lẫn tác động của nó đến gan Các nguyên nhân bao gồm nhiễm trùng, tổn thương, phơi nhiễm các thuốc hay chất độc, quá trình tự miễn dịch hoặc thiếu hụt gen (như hemochromatosis) Những nguyvên nhân này có thể dẫn tới viêm gan, xơ gan, sỏi mật, gan nhiễm mỡ và ung thư gan

Sự thiếu hụt về gen có thể ngăn chặn các chức năng quan trọng của gan và dẫn tới tích tụ các chất gây hại như đồng và sắt

Xơ gan hay chai gan (cirrhosis) là kết quả sau cùng của nhiều loại bệnh gan mãn tính khác nhau Thuật ngữ “cirrhosis” được đưa ra bởi Laennec vào năm 1826

Nó bắt nguồn từ chữ Hy Lạp “scirrhus” dùng để mô tả bề mặt màu cam hay vàng nâu của gan khi mổ khám nghiệm tử thi

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

nhân có vẻ là do các bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD – Nonalcoholic fatty liver disease)

Ngoài ra còn có các nguyên nhân khác: viêm gan tự miễn, các bệnh di truyền (xơ hóa nang, thiếu alpha-1 antitrypsin, hemochromatosis, bệnh Wilson, chứng loạn chuyển hóa cacbon hydrat bẩm sinh và những bệnh tích trữ glycogen), thuốc, chất độc, nhiễm ký sinh trùng (sán máng),

Xơ gan được mô tả là những khối u (mô sẹo) nhỏ lan rộng khắp lá gan kết hợp với sự xơ hóa, các khối u tái sinh này được bao quanh bởi mô xơ dày đặc Sự xơ hóa và hình thành các mô sẹo gây biến dạng cấu trúc bình thường và khả năng tái sinh của các tế bào gan, làm tắc nghẽn các dòng máu từ ruột đến gan Do đó, xơ hóa góp phần gây ra thiếu máu cục bộ tế bào gan (gây ra loạn chức năng) và huyết áp cao ở cửa gan

1.2.3 Bệnh sinh [47] [50]

1.2.3.1 Cơ chế phát sinh xơ hóa ở gan

Có 4 thay đổi cơ bản nhất trong mô gan xơ hóa so với gan bình thường: (1) sự tái sắp xếp mô học; (2) sự thay đổi vi cấu trúc của chất nền ngoại bào (ECM – Extracellular matrix) ; (3) sự tăng hàm lượng ECM; (4) sự thay đổi thành phần của ECM

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

Xơ hóa gan là kết quả của đáp ứng chữa lành đối với tổn thương lặp đi lặp lại của gan Sau một tổn thương gan cấp tính (như viêm gan siêu vi), các tế bào nhu mô tăng sinh và thay thế các tế bào hoại tử hay apoptosis Quá trình này liên quan đến phản ứng viêm và sự tích tụ có giới hạn của ECM Nếu tổn thương gan vẫn tiếp diễn, cuối cùng sự tái sinh của gan không đủ để phục hồi, các tế bào gan sẽ bị thay thế bởi lượng lớn chất nền ngoại bào, bao gồm sợi collagen Sự phân bố sợi phụ thuộc vào căn nguyên của sự tổn thương Trong viêm gan siêu vi và các rối loạn ứ mật mãn tính, mô xơ ban đầu hình thành ở quanh khoảng cửa, trong khi ở bệnh gan

do rượu, mô xơ ban đầu xuất hiện ở quanh tĩnh mạch trung tâm và quanh các xoang mao mạch (Pinzani, 1999) Khi xơ hóa phát triển, bệnh tiến triển từ các dải collagen thành sự xơ hóa bắt cầu (bridging fibrosis) dẫn tới hình thành xơ gan (cirrhosis)

Hình 1.4 Các thay đổi trong cấu trúc gan với sự xơ hóa phát triển (b) so với gan bình thường

(a) [47]

Theo sau tổn thương gan mãn tính, các tế bào lympho thâm nhập vào nhu mô gan Một vài tế bào gan bị apoptosis và các tế bào Kupffer hoạt hóa, phóng thích các chất môi giới sinh xơ hóa Tế bào hình sao tăng sinh và trải qua sự hoạt hóa kiểu hình, tiết ra lượng lớn các protein chất nền ngoại bào Sự co rút của các tế bào hình sao gây sự tăng cản trở dòng máu trong xoang mao mạch

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

Xơ hóa gan liên quan đến những thay đổi chủ yếu về cả lượng lẫn thành phần ECM (Benyon và Iredale, 2000) Ở giai đoạn tiến triển, lượng ECM trong gan cao xấp xỉ 6 lần so với gan bình thường, bao gồm collagen (tuýp I, III và IV), fibronectin, undulin, elastin, laminin, hyaluronan và proteoglycan Sự tích tụ ECM

là kết quả của cả sự tăng tổng hợp lẫn sự giảm thóai biến chất nền (Arthur M.J, 2000) Sự giảm hoạt động của các MMP (matrix metalloproteinase) phân giải chất nền chủ yếu là do sự biểu hiện vượt mức của các tác nhân ức chế đặc trưng (các TIMP) Tế bào hình sao là các tế bào sản xuất ECM chủ yếu trong mô gan tổn thương (Gabele và cộng sự, 2003) Trong gan bình thường, tế bào hình sao cư trú ở khoang Disse và là nơi dự trữ vitamin A chủ yếu Sau tổn thương mãn tính, các tế bào hình sao hoạt hóa và chuyển biệt hóa thành các nguyên bào sợi cơ (MFB - myofibroblast) nhờ những chất môi giới gây viêm (như TGF- β) (hình 1.5) Sự hoạt hóa tế bào hình sao dẫn đến sự biểu hiện của α-smooth muscle actin và sự biến mất các không bào mỡ kết hợp với sự giảm lượng retinoid Tế bào hình sao có đặc tính

co rút, tiền viêm và phát sinh xơ hóa (Milani và cộng sự, 1990; Marra, 1999)

Hình 1.5 Bệnh sinh của sự xơ hóa gan (sự phát sinh xơ hóa) [50]

(*) là hình quan sát bằng kính hiển vi điện tử của tế bào hình sao với nhiều giọt mỡ tạo thành vết

lõm trong nhân

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

Cơ chế của việc hoạt hóa phát sinh xơ hóa và sự chuyển biệt hóa của tế bào hình sao thành MFB có thể tóm tắt qua ba giai đoạn: bắt đầu bằng giai đoạn tiền viêm do sự hoạt hóa cận tiết tế bào hình sao bởi các tế bào gan hoại tử (hoặc apoptosis) với sự phóng thích các cytokin hoạt hóa bổ sung vào sự mất lượng heparin sulfat ức chế phân bào trên bề mặt tế bào Trong giai đoạn viêm, tế bào hình sao tiền hoạt hóa được kích thích hơn nữa bằng phương thức cận tiết bởi các bạch cầu xâm lấn, tiểu cầu, tế bào Kupffer hoạt hóa, tế bào màng trong xoang mao mạch

và các tế bào gan để chuyển biệt hóa thành MFB Giai đoạn sau viêm đặc trưng bởi

sự tiết các cytokin kích thích của MFB và sự tương tác giữa các thành phần chất nền Một vài trong số các cytokin này có thể kích thích MFB theo kiểu tự tiết và tế bào hình sao theo kiểu cận tiết Do vậy, giai đoạn sau viêm đóng góp đáng kể trong việc duy trì quá trình xơ hóa, thậm chí sau khi đã loại bỏ hay giảm bớt các giai đoạn tiền viêm và giai đoạn viêm

Các tế bào hình sao đã được hoạt hóa di cư và tích tụ tại các vùng mô đang hồi phục, tiết ra một lượng lớn ECM và điều hòa sự thóai biến ECM PDGF, chủ yếu được sản xuất bởi tế bào Kupffer, là một mitogen chiếm ưu thế cho các tế bào hình sao đã hoạt hóa Sự tổng hợp collagen trong các tế bào hình sao được điều hòa ở mức độ phiên mã và sau phiên mã (Lindquist và cộng sự, 2000) Sự tăng tính ổn định của mRNA điều hòa tăng tổng hợp collagen ở các tế bào hình sao hoạt hóa Trong những tế bào này, sự điều hòa sau phiên mã của collagen được chi phối bởi các trình tự trong vùng 3’ không được dịch mã thông qua protein gắn RNA αCP2 cũng như cấu trúc “kẹp tóc” (stem-loop) ở đầu 5’ của mRNA collagen (Lindquist và cộng sự, 2004) Điều thú vị là các tế bào hình sao biểu hiện một lượng lớn các marker thần kinh nội tiết (như reelin, nestin, neutophin, synaptophysin và protein thần kinh sợi đệm có tính acid) và mang những thụ thể của các chất dẫn truyền thần kinh (Geerts, 2001; Sato M và cộng sự, 2003; Oben J.A và cộng sự, 2003) Tế bào hình sao im lặng (chưa được hoạt hóa) biểu hiện các marker tiêu biểu cho tế bào tạo

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

mỡ (PPARγ, SREBP-1c, và leptin), trong khi tế bào hình sao đã được hoạt hóa biểu hiện các marker tạo cơ (α-smooth muscle actin, c-myb, và myocyte enhancer factor–2)

1.2.3.2 Các tế bào tiềm năng phát sinh xơ hóa khác

Các tế bào có nguồn gốc từ tủy xương cũng có thể là một nguồn tế bào sinh xơ hóa trong mô gan tổn thương Nghiên cứu của Kisseleva và cộng sự (2006) cho thấy các tế bào sợi từ tủy xương hiện diện trong gan và có thể biệt hóa thành MFB sản xuất collagen nhờ TGF-β Sự huy động tế bào tủy xương vào trong mô tổn thương

là cơ chế tổng quát cho sự xơ hóa và chữa lành vết thương của mô, được điều hoà bởi CSF và G-CSF Tế bào hình sao hoạt hóa có thể đóng một vai trò quan trọng do chúng tiết ra nhiều chất trung gian gây viêm (chemokin, M-CSF, SCF, PAF) và các phân tử kết dính bạch cầu (ICAM-1, VCAM-1, NCAM) cần cho sự huy động, hoạt hóa và trưởng thành của các tế bào từ tủy xương ở vùng tổn thương Sự di chuyển các tế bào tủy xương vào gan tổn thương được khẳng định là cũng có tác động tích cực trong việc phân giải sự xơ hóa do chúng biểu hiện các enzym chất nền MMP làm tăng sự tiêu giải chất nền ngoại bào

Gần đây ngày càng có nhiều nghiên cứu chứng minh một cơ chế khác phát sinh xơ hóa Đó là sự chuyển hóa biểu mô-trung mô (EMT – Epithelial-mesenchymal transition) của các tế bào biểu mô ống mật (và có khả năng là của các

tế bào gan) thành nguyên bào sợi Sự chuyển hóa EMT thành MFB được cho là cơ chế phát sinh xơ hóa chủ yếu trong các bệnh về ứ mật

Các dạng tế bào trong gan ngoài tế bào hình sao cũng có thể có tiềm năng phát sinh xơ hóa Sự hoạt hóa và tăng sinh của các tế bào trung mô ở khoảng cửa hay quanh cửa thành MFB quanh ống khởi động sự tích tụ collagen (Kinnman và Housset, 2002; Magness và cộng sự,2004), và là cơ chế bệnh sinh quan trọng trong

sự xơ hóa vùng cửa và sự hình thành vách trong các bệnh ứ mật Thật vậy, chỉ một lượng nhỏ MFB trong các tổn thương tắc nghẽn mật là có nguồn gốc từ tế bào hình

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

sao (Kinnman và cộng sự, 2003; Beaussier và cộng sự, 2007) Tế bào hình sao khác với các MFB từ khoảng cửa ở các marker riêng biệt và sự đáp ứng với các tác nhân kích thích apoptosis (Knittel và cộng sự, 1999)

Tầm quan trọng tương đối của từng loại tế bào trong sự phát sinh xơ hóa ở gan

có thể phụ thuộc vào căn nguyên của tổn thương Trong khi tế bào hình sao là dạng

tế bào sinh xơ hóa chủ yếu ở những khu vực quanh tĩnh mạch trung tâm, thì các MFB từ khoảng cửa có thể chiếm ưu thế khi tổn thương xảy ra ở các khoảng cửa Các cơ chế trên bổ sung gây giãn rộng “bể” nguyên bào sợi đang tổng hợp chất nền trong gan tổn thương Các chất môi giới phát sinh xơ hóa đặc biệt quan trọng là TGF- β (transforming growth factor- β), PDGF (platelet-derived growth factor), IGF-1 (insulin-like growth factor 1), ET-1 (endothelin-1) và các gốc oxy tự

do (ROS – reactive oxygen species bao gồm các gốc hydroxyl, anion superoxid)

1.2.3.3 Tương tác giữa các loại tế bào trong phát sinh xơ hóa

Trong suốt sự phát sinh xơ hóa gan có một sự tương tác phức tạp giữa các loại

tế bào gan khác nhau (Kmiec Z., 2001) Tế bào gan là mục tiêu cho hầu hết các tác nhân độc gan bao gồm những virus viêm gan, các chất chuyển hóa của rượu và acid mật (Higuchi và Gores, 2003) Các tế bào gan tổn thương phóng thích ROS và các chất môi giới sinh xơ hóa và gây ra sự huy động các tế bào bạch cầu nhờ các tế bào gây viêm Apoptosis của các tế bào tổn thương kích thích các hoạt động sinh xơ hóa của các MFB gan (Canbay A và cộng sự, 2004) Các tế bào gây viêm, tế bào lympho hay các tế bào đa nhân, hoạt hóa tế bào hình sao để tiết ra collagen (Casini

A và cộng sự, 1997) Tế bào hình sao đã được hoạt hóa tiết ra các chemokin gây viêm, biểu hiện các phân tử kết dính tế bào và điều hòa sự hoạt hóa tế bào lympho (Vinas O và cộng sự, 2003) Tế bào Kupffer là các đại thực bào thường trú đóng vai trò chủ yếu trong phản ứng viêm bằng cách phóng thích ROS và cytokin (Naito

M và cộng sự, 2004; Thurman R.G, 1998) Đối với các rối loạn ứ mật mãn tính, các

tế bào biểu mô kích thích MFB tích tụ ở khoảng cửa, khởi sự sự tích tụ collagen

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

xung quanh các ống mật tổn thương Collagen tuýp IV, fibrinogen và nhân tố kích hoạt plasminogen dạng urokinase kích thích tế bào hình sao nội tại bởi các cytokin như TGF- β1 (Gressner A.M và cộng sự, 2002) Các collagen dạng sợi có thể liên kết và kích thích tế bào hình sao thông qua DDR2 (discoin domain receptor) và integrin

1.2.4 Chẩn đoán – xét nghiệm [50]

Xơ hóa gan (fibrosis) được nghi ngờ ở bệnh nhân có một rối loạn cơ bản hoặc uống một loại thuốc có thể gây xơ hóa hoặc có những bất thường không xác định về chức năng và các enzym của gan

1.2.4.1 Xét nghiệm sinh hóa

a Chức năng bài tiết

Gồm có xét nghiệm bilirubin, phosphatase kiềm, gamma glutamyl transferase (GGT)

Xét nghiệm bilirubin (sắc tố mật) gồm có bilirubin toàn phần, trực tiếp và gián tiếp Sắc tố biliburin thường bình thường nhưng sẽ tăng nếu xơ gan phát triển, đặc biệt ở xơ gan do tắc mật nguyên phát

Xét nghiệm phosphatase kiềm (PK) và γ-glutamyl transpeptidase (GGT) thường bình thường, chỉ tăng cao khi bị ứ mật hoặc tắc mật PK còn tăng trong các điều kiện sinh lý (có thai, trẻ đang tăng trưởng xương) hoặc trong các bệnh lý: xương (Pagel’s xương, huỷ xương, di căn xương), tắc ruột non GGT có nguồn gốc chủ yếu ở gan nên xét nghiệm này rất nhạy để đánh giá chức năng bài tiết ở gan Tăng GGT thường do nghiện rượu mạn, sau khi uống các thuốc gây cảm ứng men (acetaminophen, phenytoin,…), gan nhiễm mỡ không do rượu hoặc nguyên nhân khác: suy thận, nhồi máu cơ tim, tiểu đường, hoặc không rõ nguyên nhân

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

b Chức năng tổng hợp

Gồm có xét nghiệm albumin huyết thanh, globulin huyết thanh và thời gian đông máu Do khả năng dự trữ lớn và thời gian bán hủy dài (3 tuần) nên albumin huyết thanh chỉ giảm trong bệnh gan mạn (xơ gan) Sự giảm lượng albumin huyết thanh và thời gian đông máu kéo dài tương ứng trực tiếp với sự suy yếu chức năng tổng hợp của gan – thường xảy ra ở giai đoạn cuối Albumin cũng có thể thấp do thiếu dinh dưỡng Globulin huyết thanh tăng ở xơ gan và hầu hết những chứng rối loạn về gan

c Sự hoại tử của tế bào gan

Gồm có xét nghiệm enzym transaminase: ALT (GPT), AST (GOT) và enzym lactat dehydrogenase (LDH)

AST – Aspartate transaminase (hay GOT – Glutamic-Oxaloacetic Transaminase) có trong bào tương và ty thể ở tế bào cơ tim, cơ xương, gan, thận, não, tuỵ ALT – Alanine transaminase (hay GPT – Glutamic-Pyruvic Transaminase) chủ yếu ở bào tương của tế bào gan Enzym transaminase thường tăng trong đa số các bệnh về gan: Tăng cao (> 3000 U/l): hoại tử tế bào gan do viêm gan cấp hoặc mạn, viêm gan do thuốc, độc chất, sốc gan; tăng vừa (< 300 U/l): viêm gan do rượu, chủ yếu tăng AST; tăng nhẹ (< 100 U/l): viêm gan cấp hoặc mạn, mức độ nhẹ, bệnh gan khu trú hay lan toả hoặc có tắc mật Ở bệnh nhân xơ gan, các enzym transaminase thường tăng vừa phải Enzym transaminase còn tăng trong nhồi máu

cơ tim, tổn thương cơ xương… Ngoài ra còn có tỷ số De Rills (GOT/GPT): (O/P) < 1: hoại tử tế bào gan cấp (viêm gan siêu vi cấp); > 1: tổn thương gan mạn tính (xơ gan) hoặc do rượu

LDH không chuyên biệt cho gan vì nó cũng tăng trong nhiều bệnh lý khác LDH tăng trong hoại tử tế bào gan, sốc gan, ung thư Tỷ số ALT/LDH > 1,5  viêm gan siêu vi cấp; < 1,5  sốc gan, ngộ độc thuốc

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

Chỉ riêng các xét nghiệm có thể tăng sự nghi ngờ cho xơ gan nhưng không thể khẳng định hay loại trừ nó Sinh thiết gan được trở nên cần thiết nếu như chẩn đoán chưa đưa đến kết luận rõ ràng

1.2.4.2 Sinh thiết – xét nghiệm mô học [30] [50]

Sinh thiết gan được coi là phương pháp chuẩn cho việc đánh giá sự xơ hóa của gan Xét nghiệm mô học hữu dụng trong việc xác định nguyên nhân bệnh, đánh giá mức độ viêm-hoại tử và giai đoạn tiến triển của xơ hóa (sử dụng các thang chuẩn như Metavir, tỷ số Ishak) Các phương pháp nhuộm phổ biến bao gồm nhuộm hematoxylin và eosin, nhuộm Masson trichrom, sirius red, reticulin, nhuộm periodic acid Schiff (PAS) … Phương pháp nhuộm mô thường quy nhất là hematoxylin và eosin (H&E), trong đó nhân bắt màu xanh và tế bào chất bắt màu hồng Phương pháp này thường được sử dụng trong cả thực nghiệm lẫn lâm sàng, do chi phí không cao và có thể cho biết nhiều thông tin bệnh lý (sự xơ hoá, sự thâm nhập của tế bào viêm, hoại tử tế bào, thoái hoá tế bào…) Nhuộm Masson trichrom được dùng để đánh giá mức độ xơ hóa biểu thị rõ các sẹo collagen do đó xác định được giai đoạn tiến triển xơ hóa rõ ràng hơn Phương pháp này giúp phân biệt suy thoái cấu trúc gan cấp tính (không có sự cô đặc collagen đáng kể) với xơ hóa gan tiến triển Bên cạnh đó, nhuộm sirius red có thể cho thấy rõ các thành phần protein chất nền ngoại bào Phương pháp nhuộm reticulin làm nổi bật các sợi reticulin mỏng xung quanh cấu trúc xoang mao mạch gan (bề gan) Phương pháp nhuộm này có thể dùng hỗ trợ trong phân biệt các nốt u nhỏ tái sinh (ít hơn độ dày 3 lớp tế bào) và phân biệt rõ với ung thư tế bào gan nguyên phát (nhiều hơn độ dày 3 lớp tế bào) Trong tăng sản tái sinh nốt u nhỏ, một dạng đi kèm với nhiều rối loạn tự miễn, nhuộm reticulin có ích điển hình bởi vì nó thể hiện các bề gan “co lại” do các nốt u nhỏ tái sinh gồm bề gan

2 lớp tế bào Phương pháp nhuộm periodic acid schiff (PAS) thể hiện nổi bật màng

cơ bản (basement membrane) của biểu mô ống mật, phát hiện sự tích tụ glycogen, glycoprotein Ngoài ra còn có nhiều phương pháp nhuộm hóa mô khác được dùng

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

để phát hiện sự tích tụ các chất khoáng trong tế bào gan hay các tế bào cư trú khác trong gan Chẳng hạn như, prussian blue được dùng để phát hiện hemosiderin, và rubeanic acid được dùng để phát hiện tích tụ đồng trong tế bào gan

Hình 1.6 Các phương pháp nhuộm trong chẩn đoán mô học gan [30]

Các xét nghiệm khác

Các xét nghiệm không xâm lấn (ví dụ các marker huyết thanh) đang được nghiên cứu nhưng vẫn chưa sẵn sàng cho việc ứng dụng lâm sàng Xét nghiệm hình ảnh như chẩn đoán bằng siêu âm, chụp CT (Computed tomography) và MRI (Magnetic resonance imaging) có thể phát hiện những biến chứng liên quan đến xơ hóa gan như tăng áp tĩnh mạch cửa, chứng to lách, xơ gan nhưng không nhạy với chính sự xơ hóa nhu mô

1.2.5 Chữa trị

1.2.5.1 Bằng thuốc

Xơ gan là một bệnh hầu như không đảo ngược được nhưng việc chữa trị cơ bản các bệnh gan có thể làm chậm hay dừng tiến triển của nó Sự chữa trị phụ thuộc

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

vào bệnh nguyên Ở xơ gan do rượu, việc ngừng tiêu thụ rượu sẽ dừng tiến triển xơ gan Tương tự, việc ngừng dùng thuốc độc đối với gan hoặc loại bỏ chất độc ngoài môi trường sẽ dừng tiến triển xơ gan Sự điều trị các bệnh chuyển hóa, như điều trị chứng thừa sắt trong hội chứng hemochromatosis hay thừa đồng trong bệnh Wilson cũng là những liệu pháp có hiệu quả Các bệnh viêm gan B và C có thể đáp ứng với việc điều trị bằng interferon và viêm gan tự miễn có thể tiến triển với prednisone và azathioprine (Imuran) Các loại thuốc như ursodiol (Actigall) có thể làm chậm tiến triển của xơ gan do tắc mật nguyên phát và bệnh viêm xơ chai đường mật

Ở những bệnh nhân bị xơ gan, việc chữa trị chủ yếu hướng vào các biến chứng Chứng giãn tĩnh mạch xuất huyết thực quản có thể được điều trị bằng liệu pháp xơ hóa nội soi hoặc thắt dây cao su Cổ trướng và phù thủng thường đáp ứng tốt với khẩu phần ăn ít Natri Cổ trướng và phù thủng nặng hơn có thể sử dụng liệu pháp lợi tiểu Viêm phúc mạc tự phát do vi khuẩn nên được chữa trị nhanh chóng bằng các kháng sinh thích hợp Những thuốc chuyển hóa ở gan nên cẩn thận khi sử dụng Các chứng rối loạn đông máu thỉnh thoảng sẽ đáp ứng với vitamin K

Đối với tăng áp tĩnh mạch cửa, có thể sử dụng thuốc beta-blocker hoặc nitrat Bệnh não do gan được điều trị bằng cách rửa ruột với lactulose Có thể bổ sung kháng sinh nếu cần thiết Với bệnh nhân xơ gan bị suy gan-thận nên được điều trị thẩm tách máu và bổ sung thuốc làm tăng lượng máu đến thận

Những điều trị khác hướng về các nguyên nhân đặc trưng của xơ gan Đối với viêm gan siêu vi, sử dụng interferon và các thuốc kháng virus Đối với viêm gan tự miễn, có thể sử dụng corticosteroid và các thuốc khác

1.2.5.2 Ghép gan [17] [29]

Các bệnh về gan tác động lên khoảng 17.5% dân số với những ca nghiêm trọng nhất được chữa trị bằng cấy ghép Cấy ghép gan cũng trở thành phương pháp thông thường với tỉ lệ sống sót một năm trên 80%

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

Ghép gan là một cách chữa trị hiệu quả cao cho xơ gan giai đoạn cuối Ghép gan là cách điều trị chuẩn áp dụng đối với một số bệnh gan cấp tính (như trúng độc, siêu vi gan bộc phát), bệnh gan bẩm sinh mạn tính (như rối loạn chu trình ure, rối loạn quá trình tổng hợp glycogen tuýp I, Crigler Najjar) hay mắc phải (như bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu, siêu vi gan mạn tính) giai đoạn cuối Ở những bệnh nhân bị xơ gan do tắc mật nguyên phát, mức bilirubin tăng biểu thị một tiên lượng xấu và những bệnh nhân này nên được cân nhắc ghép gan ngay khi nồng độ bilirubin bắt đầu tăng Các chuyên gia sẽ xác định các nguy cơ và lợi ích của ghép gan cho từng bệnh nhân Tỉ lệ tử vong đã được cải thiện hơn nhiều năm qua nhờ sử dụng các thuốc suy giảm miễn dịch và giữ cho gan được ghép vào không bị tấn công và tổn thương

Tuy nhiên, số lượng bệnh nhân cần ghép gan vượt xa số lượng gan hiến tặng Một bệnh nhân cần ghép gan phải trải qua một quá trình đánh giá phức tạp trước khi được cho vào danh sách chờ ghép gan Chỉ định cấy ghép hợp lý và công bằng cho bệnh nhân đã gây ra tranh cãi về vấn đề đạo lý (chẳng hạn như, tiêu chuẩn nào thích hợp cho bệnh nhân nhận gan ghép) Ngoài ra, yêu cầu về kỹ thuật và chi phí cao, đặc biệt là nguy cơ do dùng thuốc suy giảm miễn dịch trong thời gian dài

1.3 Liệu pháp tế bào [16] [17] [24] [23] [29] [32] [38] [28] [58]

Ghép gan là liệu pháp hiệu quả nhất để điều trị suy gan cấp hay mạn, nhưng phương pháp này có nhiều hạn chế như đã nêu (mục 1.2.6.2) Do đó, việc tìm ra liệu pháp chữa trị thay thế là rất cần thiết Rất nhiều nghiên cứu thực nghiệm trên liệu pháp cấy ghép tế bào đã và đang cho nhiều kết quả khả quan Các liệu pháp tế bào bao gồm cấy ghép các tế bào gan, tế bào gốc từ gan và tế bào gốc không thuộc gan

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

1.3.1 Cấy ghép tế bào gan

Một phương pháp thay thế cho việc cấy ghép gan toàn bộ cho những bệnh nhân có gan bị hủy hoại nhanh chóng và bệnh gan di truyền là cấy ghép tế bào gan

So với liệu pháp cấy ghép gan, cấy ghép tế bào gan có một số thuận lợi: thứ nhất là

tế bào gan từ một người cho có thể dùng cho hơn một bệnh nhân, thứ hai là cấy ghép tế bào không cần phẫu thuật, vì vậy tỉ lệ chết thấp hơn so với cấy ghép gan, thứ ba là tế bào gan có thể được dùng tạm thời cho tới khi gan của bệnh nhân có thể tái sinh

Liệu pháp ghép quần thể tế bào gan trưởng thành đã được thực hiện thành công trong nhiều mô hình thực nghiệm, tuy nhiên lại ít thành công hơn trong lâm sàng Oren và cộng sự cấy ghép tế bào gan chuột rat trưởng thành vào hệ cửa của chuột rat bị rối loạn albumin (albuminemic) và hồi phục mức albumin huyết thanh Thành công của việc ghép tế bào gan bị giới hạn do số lượng của chúng quá thấp để

có thể đạt được hiệu quả sinh học nên phải ghép một lượng lớn tế bào Hơn nữa, nếu chỉ cấy tế bào gan thì không thể phục hồi tổn thương ở ống mật, do vậy phải cung cấp ống thoát để duy trì khả năng bài tiết mật

Bên cạnh đó tỉ lệ tế bào ghép vào gan thấp và sức sống của những tế bào gan cấy ghép là hạn chế của phương pháp điều trị này Nói chung, các tế bào gan thu nhận sẵn có từ gan của tử thi người cho, điều này có nghĩa là tế bào gan phần lớn thiếu về chất lượng và số lượng cho cấy ghép Ngoài ra, thông thường các tế bào này được đông lạnh trước khi sử dụng, và điều này gây giảm thêm chức năng và khả năng tồn tại của tế bào

1.3.2 Cấy ghép tế bào gốc gan ứng viên

Hiện nay người ta biết rằng có một số tế bào gốc gan ứng viên cũng như là nguồn tiềm năng của tế bào gan cho cấy ghép Theo định nghĩa, một tế bào gốc phải

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

có khả năng tự làm mới và tạo thế hệ con cháu Liệu tế bào gốc gan là tế bào gốc đa tiềm năng (pluripotent) hay tế bào gốc vài năng (multipotent) chưa được biết rõ

1.3.2.1 Tế bào gốc gan thai

Trong suốt quá trình phát triển, nguyên bào gan tạo thành hai quần thể tế bào biểu mô của gan là tế bào gan và tế bào biểu mô ống mật, và vì vậy được phân loại

là tế bào gốc hai năng Chúng cũng được sử dụng rộng rãi trong các thử nghiệm cấy ghép tế bào và cho thấy sự tái tạo quần thể thành công cả hai loại tế bào ở gan động vật hữu nhũ Gần đây hơn, nguyên bào gan người được chứng minh rằng có khả

năng nhân đôi in vitro và biệt hóa thành tế bào gan sau khi cấy ghép

David A.Shafritz và cộng sự đã cấy ghép 50x106 tế bào gan thai chuột rat (ở ngày phôi 14) vào gan chuột rat trưởng thành bình thường bị cắt bỏ một phần gan Những tế bào này ghép vào gan, tăng sinh dần dần theo thời gian và biệt hóa thành

tế bào gan và tế bào biểu mô ống mật Ở tháng 4-6 sau khi ghép tế bào gan thai, David A.Shafritz và cộng sự đã quan sát thấy những cụm tế bào với những tế bào hai năng chứa cả tế bào gan và tế bào ống mật Sau 6 tháng, có sự thay thế kích thước gan bởi tế bào cấy ghép chiếm 23,5±1,7% Khoảng xấp xỉ 2% tế bào là tế bào tiền thân hay tế bào gốc và hiệu quả ghép vào gan là khoảng 10%, David A.Shafritz

và cộng sự đã ước tính có sự tăng gấp 3000 lần về số lượng tế bào trong gan từ những tế bào cấy ghép ban đầu Những tế bào cấy ghép biệt hóa thành tế bào gan không phân biệt về cấu trúc và chức năng so với tế bào gan con nhận, ngoại trừ những tế bào này biểu hiện enzym didpeptidyl peptidase IV (DPPIV)

1.3.2.2 Tế bào gốc gan trưởng thành

Sự tồn tại tế bào gốc trưởng thành trong gan vẫn còn được tranh cãi Theo sau tổn thương gan do các tác nhân gây cảm ứng sinh ung, hoặc khi sự nhân đôi tế bào gan bị ngăn chặn, có sự tăng sinh của những tế bào nhỏ ngay tại chỗ nối xung quanh tiểu quản được gọi là kênh Hering Chúng có nhân ovan, tế bào chất không nhiều và được gọi là tế bào ovan Tế bào ovan là ví dụ cho tế bào tiền thân gan, là thế hệ sau

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

của tế bào gốc gan và có hai năng biệt hóa thành tế bào gan và tế bào biểu mô ống mật Tế bào ovan cũng tham gia vào tái sinh gan khi gan bị tổn thương

Ngoài ra, người ta quan sát thấy rằng khi chuột rat có chế độ ăn thiếu đồng, các đảo tụy suy thoái trong khi các ống và mô nội tiết vẫn còn Điều thú vị là, khi cho chuột rat ăn lại chế độ ăn bình thường, các đảo tái sinh và đi kèm với sự xuất hiện các ổ tế bào gan Sự xuất hiện của các tế bào gan trong tụy gợi ra quan điểm cho rằng có tế bào gốc gan trong tụy Tế bào sản sinh ra tế bào gan được cho là các

tế bào ovan tụy

Tuy nhiên, mối quan tâm trong việc ứng dụng liệu pháp tế bào ovan là chúng

có khả năng sinh ra ung thư biểu mô tế bào gan và các tế bào ống mật ở chuột Vì vậy, để khắc phục những vấn đề này, các nguồn khác của tế bào gan cần phải được tìm ra

1.3.2.3 Cấy ghép tế bào gốc không thuộc gan

Có ít nhất ba loại tế bào khác có thể được dùng như là một nguồn tế bào cho cấy ghép, gồm: tế bào phôi, tế bào gốc trưởng thành (không thuộc gan), và tế bào đã biệt hóa ngoài gan

a Tế bào gốc phôi

Tế bào gốc phôi xuất phát từ khối tế bào bên trong (inner cell mass) của phôi ở giai đoạn blastocyst (là giai đoạn phát triển mà trong đó phôi bám vào thành tử cung) Trong suốt quá trình sinh tạo phôi, những dòng tế bào riêng biệt được hình thành từ các tế bào đa tiềm năng (pluripotent cells) Lá nuôi ngoại bì phôi (trophoectoderm) và nội bì nguyên thủy phát triển thành các mô ngoài phôi, trong khi lớp ngoại bì nguyên thủy biệt hóa thành tất các các dòng tế bào phôi: ngoại bì, trung bì và nội bì Trong đó các tế bào phôi nội bì tham gia tạo các cơ quan như gan, tụy, phổi và ruột

Đã có nhiều nhà khoa học chứng minh tiềm năng của tế bào gốc phôi (ở

người, ở chuột) có khả năng biệt hóa thành dòng tế bào gan in vitro Cụ thể trong

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

nghiên cứu của Benvenisty và cộng sự cho thấy tế bào gốc phôi người biệt hóa thành tế bào giống tế bào gan một cách tự phát, biểu hiện marker gan chẳng hạn như

-fetoprotein Ngoài ra, tế bào gốc phôi được cho là nguồn tạo ra tế bào gan với số lượng đủ để dùng cho liệu pháp tế bào Nhưng việc kiểm soát quá trình biệt hóa, tạo

ra số lượng đáng kể tế bào gan và điều kiện cần thiết cho sự tăng sinh tế bào gan cần được nghiên cứu thêm

Các nhà nghiên cứu cũng công bố rằng tế bào gốc phôi có thể được cảm ứng thành dòng tế bào gốc gan và nội bì trong nuôi cấy, và sau đó ghép vào gan với khả năng biệt hóa thành cả tế bào gan lẫn tế bào biểu mô ống mật Tuy nhiên, mức độ tái tạo quần thể gan bởi tế bào gốc phôi biệt hoá thành tế bào gan còn thấp Người ta

hy vọng trong tương lai sử dụng tế bào gốc phôi chuyên biệt dòng sẽ cho hiệu quả điều trị tốt hơn

Bằng chứng về khả năng biệt hóa của tế bào gốc phôi thành tế bào gan chưa thực sự rõ ràng do những nghiên cứu dùng các marker không chuyên biệt gan (được biểu hiện trong nội tạng hay nội bì ngoài phôi) Marker chuyên biệt cho gan vẫn chưa được tìm ra Một vấn đề khác đó là nhiều nghiên cứu chỉ dựa vào sự biểu hiện của một protein huyết tương như albumin đại diện cho chức năng tế bào gan, mà thực sự tế bào gốc phôi có thực sự biến đổi thành một tế bào gan có chức năng đầy

đủ hay không còn là câu hỏi

Bên cạnh đó, tính thiết thực về liệu pháp tế bào gốc phôi còn liên quan đến vấn đề thải loại miễn dịch, đạo đức sinh học có thể tạo nên hạn chế trong việc dùng nguồn tế bào này

b Tế bào gốc đa tiềm năng cảm ứng

Vì vậy, sự phát triển tế bào gốc đa tiềm năng cảm ứng giống tế bào gốc phôi (iPSC) có thể tỏ ra có ích Thông qua việc cảm ứng sự biểu hiện của gen Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4; iPSC có thể được tạo ra từ tế bào sinh dưỡng trưởng thành đã

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

biệt hóa hoàn toàn; nhờ đó có tiềm năng tránh hạn chế tồn tại trong việc sử dụng tế bào gốc phôi

Một loạt các nghiên cứu trên gặm nhấm cho thấy iPSC biệt hóa có thể được dùng để chữa trị bệnh tế bào lưỡi liễm, bệnh Parkinson và Haemophilia A Các nhà nghiên cứu cũng cho rằng tế bào giống tế bào gan có nguồn gốc từ iPSC người có thể có tiềm năng chữa trị cho những bệnh gan chuyển hóa

Tuy nhiên hạn chế tương tự với tế bào đã biệt hóa có nguồn gốc từ tế bào gốc phôi vẫn còn (như nguy cơ hình thành tetratoma) Để ứng dụng iPSC trong điều trị

là cả quãng đường rất dài Ứng dụng thực tế hơn của iPSC đó là sử dụng trong nghiên cứu mô hình bệnh và độc học thuốc, cụ thể là trong nghiên cứu cơ chế tái sinh gan sau xơ hóa

1.3.3 Tế bào gốc tủy xương

Do các liệu pháp tế bào từ gan, tế bào gốc phôi và iPSC có nhiều mặt giới hạn nên hiện nay các nhà khoa học đang quan tâm đến khả năng trị liệu của các tế bào

từ tủy xương (BMC)

Các nghiên cứu gần đây khám phá ra rằng BMC đóng vai trò chủ yếu trong hoặc sự tái sinh hoặc cứu chữa gan bị xơ hóa, cũng như là trong tái sinh gan sau tổn thương gan mạn tính hay cấp tính Từ cuối thập niên 90 đến nay đã có nhiều thử nghiệm chứng minh và hoàn thiện giả thiết tế bào gốc tủy xương có khả năng biệt hóa thành tế bào gan trưởng thành có chức năng Hầu hết các thử nghiệm đều được tiến hành trên những mô hình tổn thương gan ở gặm nhấm, sử dụng phương pháp cấy ghép (tiêm) tất cả hay một phần của tủy xương hoặc tế bào gốc máu ngoại vi

Cơ sở của những nghiên cứu này là sự khám phá ra BMC có khả năng biệt hóa thành các tế bào trưởng thành (ngoài tế bào máu) ở nhiều mô trưởng thành khác nhau, khả năng đó được gọi là tính “mềm dẻo”

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

Trong nghiên cứu đánh giá hiệu quả khi tiêm ngoại vi toàn bộ tủy xương vào 9 bệnh nhân xơ gan của Terai và cộng sự (2006), cho thấy đều có sự tăng lượng albumin và mức protein tổng, cải thiện trị số Child-Pugh ở cả 9 bệnh nhân, 6/9 bệnh nhân có sự giảm chứng cổ trướng Nhìn chung, các kết quả cho thấy tế bào gốc tủy xương có khả năng cải thiện chức năng của gan ở những bệnh nhân này và có thể được áp dụng trong trị liệu mà dường như không có triệu chứng đồng phát nào đáng

kể

Lagasse và cộng sự đã cấy những tế bào tủy xương từ một động vật hoang dại được chuyển gen ‘LacZ’ mã hóa β-galactosydase vào chuột thiếu enzym fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) - một mô hình động vật bị rối loạn chuyển hóa tyrosin (tyrosinemia) tuýp I Gan con nhận được tái tạo dần nhờ những tế bào gan có cả β-galactosydase và enzym fumarylacetoacetate hydroxylase Vì vậy, việc tiêm những BMC vào tĩnh mạch chuột FAH đã cứu những con chuột này và khôi phục chức năng sinh học gan của nó

Các nghiên cứu cho rằng khi tiêm tế bào gốc có nguồn gốc từ tủy xương có thể kích thích sự tái sinh gan và hồi phục chức năng gan trong tổn thương gan mạn tính bằng cách biệt hóa thành tế bào gan và thúc đẩy phân giải tổ chức xơ trong gan trên chuột thông qua cảm ứng enzym metalloproteinase (MMP), đặc biệt là MMP 2, 9,

13

Tuy nhiên, Forbes và cộng sự lại quan sát thấy 6.8-22% nguyên bào sợi cơ (MFB) trong mô sẹo gan là có nguồn gốc từ tủy xương Sau đó, các nghiên cứu khác trên chuột cho thấy sự đóng góp của BMC với sự tái sinh nhu mô là rất nhỏ (0,6%), trong khi đó chúng lại góp phần đáng kể vào quần thể tế bào hình sao gan (68%) và MFB (70%) MFB trong gan chuột được cho là có nguồn gốc chủ yếu từ

tế bào gốc trung mô và đại thực bào của tủy xương; MFB đáp ứng tăng sinh tái tạo

để giúp gan thoát khỏi viêm và tổn thương nhưng lại gây xơ hóa gan Vì vậy cần có những nghiên cứu nhận diện quần thể tế bào nào trong tủy xương là tốt nhất cho