Nghiên cứu tổng hợp và xác định hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất hemiasterlin

Nghiên cứu tổng hợp toàn phần và bán tổng hợp các hợp chất có nguồn gốc sinh vật biển được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, cung cấp đủ mẫu cho các nghiên cứu sâu về hoạt tính in

MỞ ĐẦU

Nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển là xu hướng đang phát triển mạnh mẽ Hiện nay, có khoảng gần 20000 hợp chất được phân lập từ sinh vật biển Tuy nhiên, việc thu thập mẫu sinh vật biển rất khó khăn và số lượng không nhiều Các hợp chất tách chủ yếu

để phục vụ xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính in vitro, là khuôn mẫu

cho các nghiên cứu tổng hợp bằng con đường sinh học hoặc hóa học Nghiên cứu tổng hợp toàn phần và bán tổng hợp các hợp chất có nguồn gốc sinh vật biển được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, cung cấp đủ

mẫu cho các nghiên cứu sâu về hoạt tính in vivo và thử nghiệm lâm sàng,

đồng thời có thể thay đổi tạo thành các dẫn xuất mới có cấu trúc và hoạt tính lý thú [2,49-61]

Hemiasterlin là một tripeptit có hoạt tính chống ung thư ở ngưỡng

nM (0,3 nM) với nhiều dòng tế bào ung thư thực nghiệm, được phân lập từ

loài hải miên Hemiasterella minor vào năm 1994 [1] Hoạt tính gây độc tế

bào của hemiasterlin do làm ngưng trệ sự phân bào ở giai đoạn metaphase của động học tế bào nhờ ức chế quá trình polyme hóa tubulin và depolyme hóa microtubule do gắn lên vị trí vinca peptit trên tubulin Tác động này tương tự như một số thuốc gắn lên tubulin đã được ứng dụng trong điều trị ung thư như paclitaxel (3,9 nM) hoặc vinblastin (0,79 nM) [4]

Do hàm lượng trong thiên nhiên rất thấp và việc thu thập mẫu khó khăn [1,2] Hợp chất này có cấu trúc lý thú và hoạt tính sinh học cao nên được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu tổng hợp Đã có rất nhiều

nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới của hemiasterlin bằng cách thay đổi các nhóm thế trên ba axit amin (ba block) của phân tử hemiasterlin tạo thành các dẫn xuất hemiasterlin có cấu trúc độc đáo và hoạt tính rất lý thú

[1-9,34] Trong số đó, các dẫn xuất có cấu trúc lược giản của hemiasterlin 2

và 3 có hoạt tính mạnh hơn cả hemiasterlin [7,8]

Các nghiên cứu cũng đã phát hiện một số hemiasterlin (63a, 63b) có

cấu hình phi thiên nhiên (R) của nguyên tử cacbon gắn với nhóm NH-metyl

trên block 1 vẫn thể hiện hoạt tính mạnh [9]

Ngoài ra, một số hợp chất thiên nhiên 4, 5 có độc tính mạnh với tế

bào ung thư có nhóm α,α-dimetylbenzylic được thay bằng hệ

định hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất hemiasterlin” rất có ý nghĩa

khoa học và thực tiễn Đề tài được thực hiện nhờ biến đổi cấu trúc ban đầu

của hemiasterlin bằng việc thay thế nhân N-metylindol bằng các bioisostere

naphthalen và benzofuran; tổng hợp các hợp chất có cấu hình thiên nhiên

(S) và phi thiên nhiên (R) của nguyên tử cacbon gắn với nhóm NH-metyl

trên block 1 và tổng hợp các dẫn xuất hemiasterlin có cấu trúc lược giản

chứa hệ α,β-cacbonyl-N-axetyl liên hợp (chứa hệ Michael) nhằm tìm kiếm

các hợp chất mới của hemiasterlin

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 HEMIASTERLIN

Hemiasterlin là nhóm các tripeptit thiên nhiên mạch thẳng được phân

lập từ loài hải miên Hemiasterella minor Phân tử hemiasterlin được cấu

tạo từ ba đơn vị amino axit bất thường Do có độc tính mạnh với nhiều dòng tế bào ung thư nên được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Hiện nay, một số hemiasterlin đang được thử nghiệm điều trị ung thư ở giai đoạn hai

1.1.1 Phân lập hemiasterlin

Năm 1994, lần đầu tiên nhóm nghiên cứu của Kashman đã phát hiện

và phân lập được hemiasterlin (1) từ loài hải miên Hemiasterella minor ở

vịnh Dodwana với hàm lượng rất thấp 0,01% so với khối lượng mẫu khô

[1] Cấu trúc phức tạp của hemiasterlin đã được Kashman chứng minh bằng

nhiều phương pháp phổ như phổ khối lượng phân giải cao bắn phá nhanh ghép nối khối phổ (HRFABMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D và phổ IR đã khẳng định cấu trúc mạch thẳng của hemiasterlin gồm ba amino axit bất thường sắp xếp lần lượt theo thứ tự A,B,C, nhưng không giải thích được cấu hình không gian của các nhóm thế trên ba amino axit

Tiếp theo, nhóm nghiên cứu của Raymond J Andersen đã phân lập

được hai dẫn xuất khác của hemiasterlin là hemiasterlin A (5), hemiasterlin

B (6) từ loài hải tiêu Auletta và Cymbastella [2] Do cấu trúc phức tạp của

hemiasterlin và hàm lượng hemiasterlin trong các mẫu hải tiêu rất thấp nên đến năm 1996 cấu trúc không gian của hemiasterlin mới được khẳng định nhờ phổ nhiễu xạ tia X [3], sau này được các nhà khoa học chứng minh bằng nhiều phương pháp hiện đại [20]

Năm 1999, nhóm nghiên cứu của Chandra K Westergaard, Michael

R Boyd và các cộng sự đã phân lập được bốn dẫn xuất hemiasterlin (1),

hemiasterlin A, B và C (5-7) từ hai loài hải miên Auletta sp và Siphonochalina spp., đây là lần đầu tiên hemiasterlin C (7) được phân lập

chứng minh cấu trúc [5]

Như vậy, việc phân lập được hemiasterlin từ các loài hải miên với cấu trúc độc đáo đã cuốn hút được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu phân lập nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có trúc lý thú từ sinh vật biển

1.1.2 Hoạt tính sinh học của hemiasterlin

Kết quả sàng lọc hoạt tính ban đầu của Kashman đã khẳng định khả

năng gây độc tế bào ung thư P388 leukaemia của hemiasterlin (1) ở nồng

độ IC50 = 19 nM [1] Năm 1995, Andersen đã thử nghiệm lại độc tính tế bào của hemiasterlin trên dòng P388 leukaemia với nồng độ ức chế IC50 = 8,7 nM [2] So sánh hai kết quả nghiên cứu, nhóm Andersen đã giải thích

do mẫu hemiasterlin của họ có độ sạch cao hơn, điều này phù hợp với sự khẳng định của nhóm Kashman năm 1994 là mẫu hemiasterlin cho nghiên cứu hoạt tính có độ sạch chưa cao [1,2] Cũng trong công trình này, Andersen đã khẳng định độc tính của hemiasterlin với nhiều dòng tế bào khác như: ung thư vú MCF7 (ED50 = 0,089 µg/ml), ung thư glioblastoma/astrocytoma U373 (ED50 = 0,012 µg/ml), ung thư ovarian carcinoma HEY (ED50 = 0,0014 µg/ml), các dẫn chất hemiasterlin A, B có

hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn hemiasterlin (1) [2]

Năm 1997, nhóm nghiên cứu của Andersen đã phát hiện cơ chế chống ung thư của hemiasterlin Hoạt tính độc tế bào của hemiasterlin là do làm ngưng trệ sự phân bào ở giai đoạn metaphase của động học tế bào nhờ

ức chế quá trình polyme hóa tubulin bởi sự gắn kết của hemiasterlin lên vị trí Vinca peptit của tubulin Tác động này tương tự như một số tác nhân chống ung thư khác gắn kết lên tubulin đã được ứng dụng trong hóa trị liệu ung thư paclitaxel hoặc vinblastin, ở khoảng liều ED50 từ 0,5 nM đến 28

1.2 TỔNG HỢP TOÀN PHẦN HEMIASTERLIN THEO ANDERSEN

Hemiasterlin có hoạt tính gây độc tế bào ung thư rất cao nên được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhằm tìm kiếm các thuốc mới cho điều trị ung thư có nguồn gốc thiên Tuy nhiên, hàm lượng của hemiasterlin trong tự nhiên rất thấp (0,01%) và quá trình thu thập mẫu hải miên gặp nhiều khó khăn nên quá trình phân lập hemiasterlin thường không đủ cho nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính và cấu trúc [1] Đặc biệt hemiasterlin có cấu trúc rất độc đáo gồm ba đơn vị axit amin bất thường nên được nhiều nhà tổng hợp hữu cơ nghiên cứu tổng hợp toàn phần Từ các ý tưởng trên Andersen và cộng sự đã đưa ra phương pháp tổng hợp toàn phần hemiasterlin lần đầu tiên năm 1997 [6,7] Để tổng hợp toàn phần hemiasterlin, người ta phân tích tổng hợp ngược từ các block1, block 2 và block 3 sau đó tổng hợp từng block và ghép nối các block tạo thành hemiasterlin

Hình 1.1 Cấu trúc các block của hemiasterlin

Bước khó nhất của qui trình tổng hợp hemiasterlin là block 1 là phải

điều khiển cấu hình bất đối của nhóm NH-metyl Tổng hợp block 1 được

tóm tắt như sơ đồ 1.1 và sơ đồ 1.2 [6,7]

N Me

CH2OH

N Me

CHO

N Me CH=CHOMe

N Me

CH 2 CO 2 H

N Me

CH2CHO

DIBAL-H, THF, -78 tíi 0 o C

mặt của bazơ mạnh KHMDS với tác nhân metyl hóa MeI trong dung môi

THF, tạo thành sản phẩm dimetyl hóa 11 Sau đó, khử hóa chọn lọc chất 11

bằng tác nhân DIBAL-H trong THF ở nhiệt độ thấp tạo thành ancol bậc

một 12 Tiếp theo ancol 12 được oxy hóa chọn lọc bằng MNO trong sự có mặt của TPAP trong dung môi diclometan tạo thành andehit 13 Tăng mạch cacbon của chất 13 nhờ phản ứng Wittig với Ph3PCH2OMeCl, xúc tác t-

BuOK trong dung môi THF tạo thành chất 14, thủy phân chất 14 bằng TsOH trong dioxan tạo thành andehyt 15, sau đó chất 15 được oxy hóa bằng tác nhân natri clorit trong môi trường kiềm yếu tạo thành axit 16 (sơ

môi etyl axetat tạo thành chất 20 Hợp chất 20 được loại bỏ tác nhân Evan

nhờ phản ứng oxy hóa bằng H2O2 trong môi trường kiềm LiOH tạo thành

axit 21, sau đó metyl hóa chất 21 bằng MeI có mặt của tác nhân kiềm NaH trong dung môi DMF tạo thành chất 22 Thủy phân hợp chất 22 bằng LiOH

trong dung môi MeOH/H2O tạo thành axit 23 (block 1) (sơ đồ 1.2)

OH

O

N O O O

KHMDS, trisylN 3 , THF, -78 o C

N O O O

18

N 3

OH O

HN Me

21

N Me

N Me

N Me

N Me

N O OLi

1 Pivaloyl clorid, THF

2 , THF, -78 o C

H 2 /Pd(C) N

O O O

NH2N Me

19

Boc 2 O, EtOAc N

O O O

HN

Boc N

Me

LiOH, H2O2, MeOH

OCH 3 O

HN Me N Me

dipeptit block 2-3 ghép nối với block 1 Cho nên sau khi tổng hợp block 1 Andersen tổng hợp block 3 nhờ sử dụng nguyên liệu đầu cho tổng hợp

block 3 là L-Boc-valin Cấu hình E-olefin trên block 3 được tổng hợp chọn

lọc nhờ phản ứng Wittig, sơ đồ tổng hợp block 3 được Andersen đưa ra như sau:

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp block 3 của hemiasterlin

Nguyên liệu (S)-N-Boc-metylvalin 25 phản ứng với [H2N(OMe)Me]Cl trong sự có mặt của DCC và i-Pr2NEt, trong dung môi

axetonitrin tạo thành Weinreb amit 26 Tiếp theo, khử hóa chất 26 với tác

nhân khử LiAlH4 trong THF ở -78oC tạo thành andehit 27 với hiệu suất 55% Phản ứng của chất 27 với tác nhân Wittig Ph3P=C(Me)CO2Et trong dung môi CH2Cl2 tạo thành sản phẩm chọn lọc lập thể E-olefin 28 Sau đó

loại bỏ nhóm bảo vệ Boc của chất 28 bằng axit trifloaxetic tạo thành chất

29 (block 3) với hiệu suất 95%

Andersen tổng hợp dipeptit block 2,3 (32) nhờ phản ứng ghép nối của block 3 (29) với block 2 là L-Boc-leuxin (30) trong sự có mặt của các

tác nhân hoạt hóa PyBroP và DMAP, trong dung môi diclometan tạo thành

chất 31 Sau đó loại nhóm bảo vệ Boc nhờ phản ứng TFA tạo thành muối

32, tiếp theo muối 32 phản ứng với chất 23 (block 1) tạo thành dẫn xuất etyl este 33 có nhóm bảo vệ Boc ở block 1 Nhóm Boc của este 33 được loại bỏ nhờ phản ứng với TFA tạo thành chất 34, cuối cùng thủy phân chất

34 để loại bỏ nhóm etyl của đầu este bằng tác nhân tủy phân chọn lọc là

LiOH trong hỗn hợp dung môi metanol: nước ở nhiệt độ phòng trong thời

gian 15h tạo thành hemiasterlin (1) với hiệu suất 83% [2] (sơ đồ 1.4) Hiệu

suất tổng mà Andersen tổng hợp hemiasterlin từ nguyên liệu đầu là 0,6%

Sơ đồ 1.4 Tổng hợp mạch nhánh của hemiasterlin

Như vậy, lần đầu tiên Andersen đã tổng hợp toàn phần hemiasterlin với hiệu suất cao nhờ tổng hợp riêng biệt các block 1,2 và 3 sau đó ghép nối block 2 với block 3 tạo thành dipeptit block 2-3, cuối cùng ghép nối với block 1 tạo thành hemiasterlin Đây là kết quả rất lý thú được nhiều nhà khoa học quan tâm và cũng là phương pháp để chúng tôi áp dụng cho tổng hợp các hemiasterlin mới nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có cấu trúc lý thú và hoạt tính sinh học cao

1.3 TỔNG HỢP DẪN XUẤT HEMIASTERLIN HTI-286

Từ thành công của phản ứng tổng hợp toàn phần hemiasterlin

Andersen đã nghiên cứu tổng hợp nhiều dẫn chất khác của hemiasterlin nhờ

thay từng block 1, block 2 và block 3 trên phân tử nguyên gốc bằng những nhóm thế mới và khảo sát hoạt tính chống ung thư của chúng [7,22,49] Kết

quả đã nhận được một số dẫn xuất mới của hemiasterlin với cấu trúc độc

đáo và hoạt tính rất lý thú Trong đó HTI-286 (35) là dẫn xuất có cấu trúc

lược giản của hemiasterlin với sự thay thế N-metyltryptophan bằng nhóm

phenyl, hoạt tính gây độc tế bào của HTI-286 (0,08 nM) mạnh hơn hemiasterlin (0,3 nM) Ngoài ra, dẫn xuất bán tổng hợp khác của HTI-286

là chất 36, trong đó nhân phenyl có mang nhóm thế para-metoxyl còn có

hoạt tính mạnh hơn [8,22]

Sơ đồ tổng hợp HTI-286 được tóm tắt như sau [22,49]:

N

OEt O N

KHMDS, trisylN3, THF, -78 o C

N O

O O

41

N3

OH O

HN Me

N O OLi

1 Pivaloyl clorua, THF

2. , THF, -78oC

H2/Pd(C) N

O

O O

NH2

42

Boc2O, EtOAc N

O

O O

NH

Boc

43

OH O

HN

Boc

LiOH, H2O2, MeOH

OCH3O

HN Me

Từ sơ đồ 1.5 ở trên nhận thấy phương pháp tổng hợp của HTI-286 của Andersen không có nhiều đột phá so với phương pháp tổng hợp toàn phần hemiasterlin Theo phương pháp này, block 1 được tổng hợp qua tám

giai đoạn từ nguyên liệu đầu là hợp chất 37 phản ứng benzen nhận được chất chìa khóa 38 Tiếp theo hợp chất 38 được biến đổi qua 6 giai đoạn

khác tương tự như tổng hợp block 1 của hemiasterlin nguyên bản đã được trình bày chi tiết trong sơ đồ 1.1 và sơ đồ 1.2 Có thể thấy việc phát hiện HTI-286 có cấu trúc lược giản so với hemiasterlin nguyên bản nhưng hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn là kết quả lý thú mở ra hướng tổng hợp các hemiasterlin mới có cấu trúc lược giản hơn nhưng lại có hoạt tính cao

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP HEMIASTERLIN NHỜ THAY ĐỔI CẤU TRÚC CỦA BLOCK 1

Kết quả tổng hợp toàn phần hemiasterlin của Andersen đã khẳng định sự khó khăn trong tổng hợp block 1, do phải thực hiện liên tiếp mười lăm bước phản ứng cho hiệu suất không cao đồng thời phải điều khiển lập

thể của nhóm N-metyl Do đó người ta đã có nhiều nghiên cứu nhằm cải

tiến phương pháp tổng hợp block 1 để tìm kiếm phương pháp mới đơn giản hơn để tổng hợp và tìm kiếm các hemiasterlin mới có hoạt tính chống ung thư cao hơn

1.4.1 Phương pháp tổng hợp của Andersen

Sau khi đã tổng hợp thành công các dẫn xuất mới của hemiasterlin,

trong đó HTI-286 (36) là cấu trúc lược giản của hemiasterlin nhưng lại có

hoạt tính mạnh hơn hemiasterlin [7, 22], nhóm nghiên cứu của Andersen lại tiếp tục công bố các kết quả mới nhờ thay thế cấu trúc mới của từng block

1, 2 và 3 để tổng hợp các hemasterlin mới có cấu trúc độc đáo hơn và hoạt tính lý thú [8] Trong đó phải kể đến sự thay đổi cấu trúc của block 1, nhóm

nghiên cứu có ba sự thay đổi trên block 1 của hemiaterlin là nhóm dimetyl, nhóm NH-metyl và N-metylindol

α,α-Sự thay đổi đầu tiên là sự vằng mặt của nhóm α,α-dimetyl trên block

1 của hemiasterlin Nhờ ý tưởng này Andersen và các cộng sự đã tổng hợp

thành công hai dẫn xuất mới của hemiasterlin là chất 48, 49 vẫn thể hiện

hoạt tính gây độc tế bào cao

Tiếp theo, sự thay đổi hoàn toàn nhân N-metylindol của hemiasterlin

nguyên bản bằng các nhóm thế đơn giản hơn Andersen và các cộng sự đã phát hiện nhiều hợp chất hemiasterlin lược giản nhưng vẫn thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cao

Sự thay đổi cuối cùng trên block 1 của Andersen là nhóm NH-metyl được thay thế bằng các nhóm N-axylmetyl và NH2 tạo thành các hemiasterlin mới vẫn thể hiện hoạt tính

Như vậy, Andersen và các công sự đã có đóng góp rất quan trọng cho tổng hợp các hemiasterlin mới có cấu trúc lược giản ở block 1 Đây là kết quả rất lý thú để các nhà khoa học quan tâm và cũng là một mục tiêu quan trọng trong luận án nhằm tổng hợp các hemiasterlin mới có cấu trúc lược giản nhưng vẫn thể hiện hoạt tính cao

1.4.2 Phương pháp tổng hợp của Ayako Yamashita [9]

Các phương pháp tổng hợp toàn phần hemiasterlin và các dẫn xuất

đã được trình bày ở trên cho thấy tất cả các block 1 đều được tổng hợp qua

nhiều giai đoạn với hiệu suất thấp, trung tâm lập thể của block 1 là N-metyl

phải được điểu khiển bằng tác nhân bổ trợ Evan Khắc phục các nhược điểm tổng hợp block1 của hemiasterlin trước đây, Ayako Yamashita và cộng sự đã nghiên cứu và đưa ra hai phương pháp tổng hợp hemiasterlin nhờ thay đổi hai phương pháp tổng hợp block 1 Phương pháp đầu tiên qua con đường tổng hợp azlacton, phương pháp thứ hai qua tổng hợp epoxit từ nguyên liệu đầu aryl andehit

1.4.2.1 Tổng hợp block 1 qua con đường tổng hợp azlacton

Ayako Yamashita và cộng sự lần đầu tiên công bố kết quả tổng hợp các block 1 của hemiasterlin vào năm 2004 (sơ đồ 1.6)

Ar-CHO

N H O OH O

H3C

NaOAc, Ac2O

Ar N O O

NH OH O

MeI, NaOH 5N, THF

Ar O OH O

54

57a-i 58a Ar = 3-tolyl

58b Ar = 4-tolyl 58c Ar = 3,4-dimetylphenyl 58d Ar =3-thienyl

58e Ar = 3-clophenyl 58f Ar = 4-clophenyl 58g Ar = 3-bromphenyl 58h Ar = 3-flophenyl 58I Ar = 3,5-di-triflometylphenyl 58j Ar = 3-triflometylphenyl 58k Ar =3,5-ditriflometylphenyl 58l Ar = 2-thienyl

58n Ar = 3,5-dimetylphenyl

Sơ đồ 1.6 Tổng hợp block 1 bằng con đường azlacton

Nguyên liệu đầu được Ayako Yamashita và cộng sự sử dụng cho

tổng hợp block 1 là các aryl andehit 53a-k và N-axetyl glyxin 54 Đầu tiên

chất chìa khóa azlacton 55a-k được tổng hợp nhờ phản ứng của các andehit thơm 53a-k với axetyl glyxin trong sự có mặt của xúc tác natri axetat, dung

môi anhidrit axetic khan, tại nhiệt độ hồi lưu Đây là phương pháp tổng hợp azlacton rất cổ điển [10,11] được Ayako Yamashita ứng dụng cho tổng hợp

block 1 là phương pháp đột phá Tiếp theo, thủy phân azlacton 55 trong

dung dịch NaOH 1N ở nhiệt độ 80oC, ngay sau đó được thủy phân trong

HCl 12N tạo thành axit 56a-k Axit 56a-k được metyl hóa bằng tác nhân

MeI trong sự có mặt của kiềm NaOH, trong dung môi THF tạo thành dẫn

xuất dimetyl 57a-k Tiếp theo, dimetyl 57a-k phản ứng với MeNH2 trong dung môi THF tại nhiệt độ 55oC và tác nhân khử BF3/pyridin ở nhiệt độ

60oC trong thời gian 4h tạo thành hợp chất 58a-k (block 1) Như vậy, theo

phương pháp này các block 1 (58a-k) đều là các racemic đã cho phép

Ayako Yamashita và cộng sự tổng hợp các hemiasterlin mới có cấu trúc

thiên nhiên (63a-k) và phi thiên nhiên của nhóm NH-metyl (62a-k)

Sơ đồ 1.7

Như vậy, phương pháp tổng hợp hemiasterlin của Ayako Yamashita

và cộng sự không chỉ có ưu điểm là phương pháp tổng hợp block 1 thực hiện qua 4 bước phản ứng, rút ngắn được rất nhiều bước so với các phương pháp tổng hợp toàn phần hemiasterlin đã công bố trước đây mà còn có thể tổng hợp được các hemiasterlin phi thiên nhiên Nhiều hemiasterlin mới được tổng hợp có hoạt tính chống ung thư cao và khả ăng ức chế tubulin mạnh được tóm tắt ở bảng dưới đây

Bảng 1.1 Hoạt tính gây độc tế bào của các hemiasterlin 61, 62 và 63

Chất IC50 (nM) Ức chế polyme hóa

tubulin (%) KB-3-1 KB85 KBV1

62c 0,4 1,13 39 88 62d 2,1 6,6 724 96 62e 1,14 3,2 91 88 62f 0,56 1,7 53 96 62g 1,8 4,1 148 84 62h 1,0 1,8 77 93

62j 0,65 1,7 42,7 96

62l 2,0 3,9 162 88 62m 0,55 1,23 44 88

thiên nhiên của nhóm NH-metyl (63a) vẫn thể hiện hoạt tính gây độc tế bào

cao ở giá trị 7,9 nM Như vậy, phương pháp tổng hợp hemiasterlin của Ayako Yamashita và cộng sự theo con đường tổng hợp block 1 qua tổng hợp azlacton có nhiều tiềm năng và thưc tiễn cao

1.4.2.2 Tổng hợp block 1 qua con đường epoxit

Nhằm tìm kiếm phương pháp mới tổng hợp các hemiasterlin mới khắc phục được các nhược điểm khi tổng hợp block 1 Nhóm nghiên cứu của Ayako Yamashita đã đưa ra phương pháp thứ hai tổng hợp block 1 là qua con đường epoxit hóa, sơ đồ tổng hợp được tóm tắt như sau:

Sơ đồ 1.8

Andehit 64 phản ứng với isopropyldiphenylsulfonium tetrafloborat

65 trong sự có mặt của tác nhân DME và xúc tác kiềm mạnh LDA, trong

dung môi CH2Cl2 ở -78oC sau đó nâng dần lên -40oC trong 15h tạo thành

epoxit 66 [12] Tiếp theo, mở vòng 66 với sự có mặt của axit Lewis trong

benzen ở 60oC tạo thành andehit 67 với hiệu suất 89% [13] Phản ứng của

67 với MeNH2,KCN, MeOM trong H2O cho amino-nitrin 68, hiệu suất 89% Thủy phân nhóm nitrin của chất 68 bằng LiOH trong H2O2 trong thời

gian chậm (2-5 ngày) nhận được 69 với hiệu suất thấp 25% Sau đó, thực

hiện phản ứng in situ của chất 69 với lượng dư Boc2O trong dung môi

MeCN thu được chất trung gian 70, sau đó bổ sung tác nhân DMAP và

i-Pr2EtN tạo thành chất trung gian 71, tiếp theo thủy phân chất trung gian 71 trong NaOH tạo thành chất 72 (block 1), hiệu suất 88%

Từ phương pháp tổng hợp block 1 này Ayako Yamashita và các cộng sự đã phát hiện được nhiều hemiasterlin có hoạt tính gây độc đáng

chú ý Trong đó hemiasterlin 73, 74, 75 và 76 có hoạt tính mạnh tương

đương như hemiasterlin Tuy nhiên phương pháp tổng hợp qua con đường epoxit tương đối phức tạp, tổng hợp block 1 phải thực hiện 7 bước phản ứng với hiệu suất từ 25-89% và các hóa chất sử dụng tương đối phức tạp

N

OH

O N

H O

O NH

H O

O NH

75 (IC50=0,86 nM)

N

OH

O N

H O

O NH

76 (IC50=0,79 nM)

1.4.3 Phương pháp tổng hợp của Vedej [14]

Do sự khó khăn của việc tổng hợp nhóm α,α-dimetyl trên block 1

nên Vedej đã đưa ra phương pháp tổng hợp block1 từ nguyên liệu có chứa sẵn hai nhóm dimetyl, sơ đồ phản ứng được trình bày như sau:

CN (R)-2-phenylglycinolSc(OTf)3, CH2Cl2, Bu3SnCN

HN OH Ph

77

78

HN OH Ph

79

H2O2, K2CO3

DMSO, MeOH

Het HN OH Ph

80

Het HN OH Ph

81

NH2O

O

NH2

H2, Pd(OH)2/C MeOH

Het =

Sơ đồ 1.9

Nguyên liệu dimetyl 77 phản ứng với (R)-2-phenylglyxinol với sự có

mặt của Sc(OTf)3và Bu3SnCN, trong dun g môi CH2Cl2ở 0oC tạo thành hỗn

hợp racemic 78 và 79 Tiếp theo hợp chất 78 và 79 được oxy hóa với H2O2

trong môi trường kiềm K2CO3, trong dung môi DMSO và MeOH ở 45oC

thu được cặp đồng phân tương ứng 80, 81 Hợp chất 81 được khử hóa bằng

H2 nhờ xúc tác Pd(OH)2/C trong MeOH thu được chất 82 Sau đó chất 82

phản ứng với BtsCl trong môi trường kiềm Na2CO3 và dung môi CH2Cl2

-H2O cho hợp chất 83 Metyl hóa hợp chất 83 bằng MeI trong dung môi

DMF ở 35oC tạo thành chất 84 Cuối cùng, bảo vệ nhóm amit bậc một của chất 84 bằng Boc2O có mặt của xúc tác DMAP trong dung môi CH3CN thu

được chất 85 Như vậy, block 1 được Vedej tổng hợp qua 6 bước tương đối

phức tạp với hiệu suất tổng tương đối cao 50%

1.4.4 Phương pháp tổng hợp của Durst [15]

Mục tiêu tìm phương pháp mới tổng hợp block 1 khắc phục được các khó khăn khi tổng hợp Nhóm nghiên cứu của Durst đã ra phương pháp tổng hợp block 1, được tóm tắt như sau:

Sơ đồ 1.10

Nguyên liệu đầu 86 phản ứng với cyanodimetylepoxit 87 trong sự có

mặt của SnCl4, trong dung môi CH2Cl2 ở -78oC tạo thành chất 88 Thủy phân hợp chất 88 bằng NaOH trong dung môi EtOH tạo thành hợp chất cacbonyl 89, hiệu suất ở giai đoạn này rất cao đạt 95% Tiếp theo, chất 89

phản ứng với (R)-phenylglyxinol và khử hóa bằng TMSCN trong dung môi

CH2Cl2 tạo thành chất 90 Loại bỏ nhóm (R)-phenylglyxinol nhờ phản ứng

thủy phân tạo thành chất 90 Bảo vệ một nguyên tử hydro của nhóm NH2

của 90 nhờ phản ứng với Boc2O trong sự có mặt của xúc tác Na2CO3 trong dung môi THF/H2O, sau đó metyl hóa bằng MeI trong dung môi DMF, xúc

tác NaH tạo thành hợp chất 91 với hiệu suất 65% Hợp chất 91 dễ dàng được thủy phân trong NaOH tạo thành block 1 (92) Như vậy, phương

pháp của Durst và cộng sự đã đưa 6 bước phản ứng liên tiếp để tổng hợp block 1 của hemiasterlin, đây đều là các phương pháp tổng hợp hữu cơ khó nhưng tạo thành sản phẩm có độ chọn lọc sản phẩm cao

Tóm lại, có rất nhiều phương pháp tổng hợp các hemiasterlin mới nhờ sự biến đổi cấu trúc của block 1 nhằm tìm kiếm các hợp chất có cấu trúc lý thú và hoạt tính sinh học cao Các phương pháp tổng hợp block 1 được trình bày ở trên chủ yếu nhằm mục đích khắc phục các khó khăn khi

tổng hợp block 1 như điều khiển trung tâm bất đối, tạo nhóm

α,α-dimetylaryl nhờ các trung tâm lập thể sẵn có hoặc nhóm gemdimetyl sẵn có của nguyên liệu Các nghiên cứu này có đóng góp lớn vào việc nghiên cứu tổng hợp toàn phần các hemiasterlin cũng như tìm kiếm các hemiasterlin mới có cấu trúc lược giản hơn nhưng có hoạt tính cao hơn [21] Đặc biệt là

đã phát hiện nhiều hemiasterlin mới có hoạt tính còn mạnh hơn cả hemiasterlin nguyên bản như HTI-286 (IC50=0,08 nM) hiện nay đang được ứng dụng trong lâm sàng giai đoạn 2 Trong đó phương pháp tổng hợp block 1 của hemiasterlin theo con đường tổng hợp azlacton của Ayako Yamashita có nhiều ưu việt , đặc biệt là phương pháp này phù hợp với điều

kiện nghiên cứu ở Việt Nam, cho nên chúng tôi đã áp dụng phương pháp này để tổng hợp các block 1 của hemiasterlin

1.5 TỔNG HỢP CÁC HEMIASTERLIN NHỜ THAY ĐỔI BLOCK 2

Block 2 của hemiasterlin nguyên bản là phân tử axit amin L-leuxin,

nhóm thế chính block 2 là tert-butyl Hầu hết các nghiên cứu tổng hợp

hemiasterlin ít quan tâm đến việc biến đổi cấu trúc của block 2 Nhằm tổng hợp các hemiasterlin mới có cấu trúc độc đáo và tìm kiếm các chất có hoạt tính lý thú, Chuan Niu và các cộng sự đã tổng hợp các hemiasterlin mới

nhờ thay thế các nhóm thế của các nhóm tert-butyl trong cấu trúc của block

2, các cấu trúc của block 1 dựa trên cấu trúc của HTI-286, block 3 không

có sự thay đổi Sơ đồ tổng hợp được trình bày tóm tắt như sau [16]:

HN

O O HCl

H2N OH

O

R1 R2

OH O

R1 R2

BocHN

N O

R 1 R 2

BocHN

O O

N O

R1 R2

H2N

O O HCl

O

N

R3

N O

R1 R2

O O Boc

N H

O

N

R3

N O

R 1 R 2

O OH Boc

N H

O

NH

R3

N O

R1 R2

O OH N

R3 97

Sơ đồ 1.11

Nguyên liệu 93 được bảo vệ bằng Boc2O có mặt của NaHCO3 trong dung môi H2O tạo thành hợp chất 94 [16, 17] Sau đó, chất 94 phản ứng với chất 59 trong sự có mặt của các tác nhân hoạt hóa cho phản ứng coupling là

PyBOP và DIEA, trong dung môi CH2Cl2 tạo thành dipeptit 95 Tiếp theo, loại bỏ nhóm Boc của dipeptit 95 bằng dung dịch HCl 4N trong dioxan tạo thành chất muối 96 Tiếp tục, ghép nối chất 96 với chất 97 (block 1) với sự

có mặt của tác nhân hoạt hóa PyBOP và DIEA trong dung môi diclometan

tạo thành tripeptit 98 [16,18] Thủy phân chức este của hemiasterlin 98

bằng tác nhân chọn lọc là dung dịch LiOH 1N trong dung môi CH3OH,

H2O tạo thành axit hemiasterlin 99 Loại bỏ nhóm bảo vệ Boc hemiasterlin

99 bằng TFA trong dung môi CH2Cl2 tạo thành các hemiasterlin 100a-k Các hemiasterlin 100a-k đều có chứa sự thay đổi của block 2 các nhóm

metyl của tert-butyl đã được thay thế bằng các nhóm chứa dị tố

Ngoài ra, Chuan Niu và các cộng sự cũng thay đổi block 2 bằng cách

thay thế một nhóm metyl trong nhóm tert-butyl bằng nguyên tử flo nhằm

tìm kiếm các hemiasterlin có hoạt tính mạnh [16] Với quy trình tổng hợp tương tự, Chuan Niu và các cộng sự đã tổng hợp được các hemiasterlin mới

có chứa flo trên block 2 đồng thời có sự thay đổi cấu hình của nhóm

tert-butyl

Các hemiasterlin 100a-k và hemiasterlin 101, 102, 103 và 104 được

Chuan Niu và các cộng sự thử hoạt tính gây độc tế trên các dòng tế bào

KB-3-1, KB-8-5 và KB-V1 Kết quả thử hoạt tính được tóm tắt như bảng 1.2 [16]

Bảng 1.2 Hoạt tính gây độc tế bào của các hemiasterlin thay đổi block 2

trùng hợp tubulin

IC50 KB-8-5 = 2,2 nM), 100k (IC50KB-3-1= 0,642 nM, IC50 KB-8-5 = 1,8

nM) và 103 (IC50KB-3-1=1,6 nM, IC50 KB-8-5 = 3,5 nM)

Tiếp theo nghiên cứu của M.J Milton năm 2006 [19] cũng có sự biến đổi nhóm thế trên block 2 của hemiasterlin Kết quả đã tổng hợp được

hemiasterlin 105 có sự tương tác tốt với tubulin

Như vậy, việc biến đổi cấu trúc của block 2 đã tạo ra được nhiều hemiasterlin mới có cấu trúc lý thú, nhiều dẫn chất tổng hợp được có hoạt

tính gây độc tế bào tương tự như hemiasterlin Đây là những kết quả nghiên cứu rất lý thú đóng góp vào sự đa dạng trong cấu trúc của hemiasterlin Tuy nhiên việc tổng hợp các hemiasterlin này khó thực hiện vì nguyên liệu block 2 có những nhóm thế như được trình bày ở trên hiếm gặp

1.6 TỔNG HỢP HEMIASTERLIN NHỜ THAY ĐỔI BLOCK 3

Thay đổi cấu trúc của block 3 cũng là chiến lược quan trọng để các nhà khoa học tổng hợp các hemiasterlin mới có cấu trú lý thú nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao Block 3 của hemisterlin nhiều khả năng thay thế để tổng hợp các dẫn xuất hemiasterlin mới như sự có mặt

hay không có mặt của nhóm N-metyl trên block 3 [8] hoặc thay đổi các

nhóm thế khác nhau ở đầu axit của block 3, hoặc kéo dài cấu trúc của block

3 [2,19,24]

Do HTI-286 là chất tổng hợp có cấu trúc lược giản của hemiasterlin nhưng có hoạt tính cao hơn cả hemiasterlin nguyên bản [8,22,49] Để tìm kiếm các hợp chất có cấu trúc tương tự HTI-286, Arie Zask và các cộng sự

đã đưa ra phương pháp tổng hợp các hemiasterlin mới nhờ thay đổi block 3 bằng việc thay đổi các nhóm thế ở đầu cacbon trong HTI-286 bằng nhiều kiểu nhóm thế X khác nhau [19]

Để thực hiện được mục tiêu này, nhóm nghiên cứu của Arie Zask và các cộng sự đã hoạt hóa đầu axit của HTI-286 nhờ phản ứng với EDC trong dung môi CH3CN, ngay sau đó khử hóa bằng NaBH4 tạo thành ancol 106 Tiếp theo, oxi hóa chọn lọc nhóm ancol của chất 106 bằng tác nhân oxi hóa

Swern (DMSO, (COCl)2) trong dung môi CH2Cl2 có mặt của xúc tác Et3N

tạo thành andehit 107 [25] Mặt khác, andehit 107 cũng được tổng hợp

bằng phản ứng tạo Weinreb amit 108 nhờ phản ứng của HTI-286 với NHMeOMe, sau đó khử hóa amit 108 bằng LiAlH4 trong Et2O ở nhiệt độ

thấp nhận được chất 108 (sơ đồ 1.12) [19]

Sơ đồ 1.12

Hemiasterlin 107 và 108 có chứa nhóm Weinreb amit và andehit là

hai nhóm hoạt động nên dễ dàng được chuyển hóa thành các dẫn chất khác nhằm tìm kiếm các hemiasterlin mới

N

O N

H O

N N

1, RMgBr

OH N

H O

O

NH

109a R = Me (R/S) 109b R = 2-thiazolyl (R/S) 109c R = Ph (S)

H O

O

NH

111

OH O

2, H2O

Sơ đồ 1.13.

Hemiasterlin 107 được phản ứng với các tác nhân Grinha sau đó thủy phân tạo thành các dẫn xuất mới của hemiasterlin 109a-d Mặt khác,

phản ứng Wittig của hemiasterlin 107 với PPh3C(Me)CO2Et tạo thành

hemiasterlin 110, sau đó thủy phân chất 110 bằng LiOH trong dung môi

MeOH/H2O tạo thành dẫn xuất axit hemiasterlin 111 [19] (sơ đồ 1.13)

Thành công của phản ứng tổng hemasterlin 111 theo sơ đồ 1.13, Arie Zask

và các cộng sự đã tổng hợp thành công nhiều dẫn xuất hemasterlin khác

nhau, trong đó hemiasterlin 112 và hemiasterlin 113 có hoạt tính gây độc tế

bào rất được lưu ý [19]

Ngoài ra, có thể sử dụng hemiasterlin ở dạng Weinreb amit 108 để

tổng hợp xeton hemiasterlin nhờ phản ứng với các cơ kim khác nhau và cũng đã phát hiện được nhiều hợp chất hemiasterlin mới có hoạt tính đáng lưu ý (sơ đồ 1.14) [19]

Sơ đồ 1.14

Nhóm cacbonyl của đầu axit trên block 3 của hemiasterlin cũng có

thể được chuyển hóa thành các isotere tương đương như nhóm metilen nhờ

phản ứng với tác nhân Tebbe trong dung môi THF ở -40 oC tới 25oC tạo

thành hemiasterlin 116 Tiếp theo, thủy phân hemiaster 116 bằng dung dịch

NaOH tạo thành hợp chất trung gian 117, tiếp theo axit hóa bằng dung dịch HCl 1N trong dung môi THF tạo thành hemiasterlin 118 [19], tuy nhiên

hoạt tính của các hợp chất này không thấy được công bố

Sơ đồ 1.15

Do E-olefin trên block 3 hemiasterlin HTI-286 dễ dàng được chuyển

hóa nhờ các tác nhân oxy hóa hóa Từ ý tưởng này, người ta đã ozonit hóa hợp chất HTI-286 bằng O3 trong metanol ở -78oC, sau đó khử hóa ozonit

bằng dimetylsunfua tạo thành andehit 120 Nhóm andehit của hợp chất 120

dễ dàng được chuyển hóa thành các hợp chất có cấu trúc lý thú nhờ phản ứng với các tác nhân Wittig [19]

Sơ đồ 1.16

Nhóm cacboxilic của axit hemiasterlin dễ dàng được chuyển hóa thành dẫn xuất amit nhờ phản ứng với các amin tương ứng Arie Zask và các cộng sự đã chuyển hóa các nhóm cacboxilic của HTI-286 tạo thành các dẫn xuất hemiasterlin amit mới, nhiều chất được tổng hợp có hoạt tính

mạnh tương đương như hemiasterlin như các hợp chất 121, 122, 123 và hemiasterlin 124 [19]

Như vậy, nhiều hemiasterlin mới được tổng hợp nhờ thay đổi cấu trúc của block 3, nhiều dẫn xuất có hoạt tính gây độc tế bào tương đương như hemiasterlin nguyên bản Đây là hướng nghiên cứu rất có ý nghĩa nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính lý thú Tất cả các biến đổi ở block 3 chủ yếu tập trung vào làm tăng mạch cacbon, tuy nhiên việc tăng mạch cacbon trong thiết kế các phân tử thuốc tiềm năng không phải là chiến lược duy nhất làm tăng sự tương tác tốt hơn với mục tiêu tác dụng [21, 26-30,47,48] Hơn nữa các dẫn xuất hemiasterlin nguyên bản, dẫn xuất tổng hợp HTI-286 và các dẫn xuất hemiasterlin khác có hoạt tính mạnh [8] đều có độ dài mạch cacbon như nhau trên block 3 Do đó trong luận án chúng tôi giữ nguyên độ dài mạch cacbon của block 3, chỉ có sự thay đổi là

sự có mặt hay không của nhóm NH và N-metyl trên cấu trúc của block 3

1.7 QUAN HỆ CẤU TRÚC HOẠT TÍNH CỦA CÁC HEMIASTERLIN

Vai trò của các nhóm thế và cấu trúc của chúng trên phân tử hemiasterlin đã được các nhà khoa học khẳng định nhờ nghiên cứu khảo sát mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính của hemiasterlin và các dẫn xuất từ kết quả thử hoạt tính của các chất tổng hợp được [2-9,49] Các kết quả công bố sau

bổ sung những khuyết điểm của công bố trước Gần đây nhất năm 2014, nhóm nghiên cứu của Lesma G và cộng sự [34] đã khẳng định vai trò quan

trọng của nhóm tert-butyl trên block 2, nhóm isopropyl trên block 3 đóng

vai trò cho khẳ năng kết hợp (binding) với tubulin nhờ liên kết van der

Waals Cấu hình của nhóm tert-butyl trên block 2 và nhóm isopropyl trên block 3 phải có cùng cấu hình tuyệt đối S Liên kết đôi của block 3 phải có cấu hình E-olefin và tạo thành hệ phản ứng với các trung tâm Michael

receptor nhờ liên hợp với nhóm cacboxylic

Hình 1.2 Mối quan hệ cấu trúc và hoạt tính của hemiasterlin[34]

Kết quả nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc hoạt tính của hemiasterlin

có ý nghĩa lớn cho việc thiết kế tổng hợp các dẫn chất mới của hemiasterlin

có cấu trúc độc đáo nhưng vẫn bảo tồn được các trung tâm hoạt động quan

trọng nhằm tìm kiếm các dẫn chất có hoạt tính sinh học cao

1.8 MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN

Qua nghiên cứu tổng quan nhận thấy người ta đã có nhiều phương pháp thay đổi các block1, block 2 và block 3 tạo thành các dẫn xuất mới của hemiasterlin có cấu trúc độc đáo và hoạt tính sinh học lý thú Các biến đổi của block 1 chủ yếu xoay quanh cấu trúc của hemiasterlin nguyên bản hoặc cấu trúc của HTI-286 Các hemiasterlin có cấu hình phi thiên nhiên và các hemiasterlin chứa các trung tâm phản ứng sinh học mới ít được quan tâm nghiên cứu

Từ những phân tích ở trên, luận án này tập trung nghiên cứu tổng hợp các hemiasterlin mới dựa trên các mục tiêu như sau: Tổng hợp các

hemiasterlin mới nhờ thay thế nhân N-metylindol bằng nhân naphthalen và

benzofuran có cấu hình thiên nhiên (S) và phi thiên nhiên (R) của nguyên tử

cacbon gắn với nhóm NH-metyl Tiếp theo tổng hợp các hemiasterlin có

cấu trúc lược giản chứa hệ α,α-cacbonyl-N-axetyl liên hợp Những nghiên

cứu này sẽ mở ra hướng mới trong tổng hợp các dẫn xuất của hemiasterlin

có hoạt tính chống ung thư

Chương 2 THỰC NGHIỆM

2.1 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Phương pháp nghiên cứu

Các phương pháp tổng hợp hữu cơ hiện đại như phương pháp bảo vệ nhóm chức, phương pháp loại bỏ nhóm bảo vệ, phản ứng Wittig, phản ứng tổng hợp Weinreb amit, phản ứng khử chọn lọc, các phương pháp tổng hợp peptit được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hoá dược - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Nhằm mục đích tổng hợp các dẫn xuất mới của hemiasterlin có hoạt tính sinh học lý thú

Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất hemisterlin thực hiện tại phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam theo phương pháp của Mossman trên bốn dòng tế bào ưng thư người KB, Hep-G2, LU và MCF7

2.1.2 Hóa chất và dung môi

Các hóa chất phục vụ cho việc tổng hợp hữu cơ và dung môi được mua của hãng Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ) Silica gel cho sắc ký cột là loại 100 - 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silica gel là bản nhôm tráng sẵn Art 5554 DC - Alufolien Kiesel 60 F254 (Merck)

2.1.3 Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm Thông thường chất đầu và sản phẩm có giá trị Rf khác nhau, màu sắc

và sự phát quang khác nhau Dùng sắc kí lớp mỏng để kiểm tra phản ứng Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất của các chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm

được dung môi hay hỗn hợp dung môi để tách các chất ra xa nhau (Rf khác

xa nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết để tinh chế các chất

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với dung môi thích hợp và TMS là chất chuẩn, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

Phổ 1H-NMR (300MHz) và 13C-NMR (75MHz) được đo trên máy tại Đại học Renne – Cộng hòa Pháp

- Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối của các chất nghiên cứu được ghi trên máy Hewlett Packard Mass Spectrometer 5989 MS hoặc LC- MSD- Trap- SL tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học- Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

2.2 TỔNG HỢP N-AXETYLGLYXIN

Dung dịch của 10,00 g (0,133 mol) glyxin (54a) trong 40 ml nước

được cho thêm 27,20 g (0,266 mol) anhydrit axetic tạo thành hỗn hợp phản ứng và được khuấy ở nhiệt độ phòng trong khoảng 20h Kết thúc phản ứng, sản phẩm xuất hiện dưới dạng tinh thể màu trắng Tinh thể được lọc bằng phễu lọc hút chân không và được rửa lại ba lần bằng nước lạnh sau đó hút khô sản phẩm trong tử sấy chân không, thu được sản phẩm axetyl glyxin

(54b) (15,24 g, 98%), điểm chảy 208 oC [37]

2.3 TỔNG HỢP BENZOFURAN-3-CACBANDEHIT

2.3.1 Tổng hợp etyl 2-(2-axetylphenoxy)axetat

Dung dịch của 1-(2’-hydroxyphenyl)etanon (125) (1,00 g, 7,35

mmol) và etyl 2-cloroaxetat (1,13 g, 9,19 mmol) trong 10 ml anhydrit axetic được cho thêm K2CO3 (1,02 g, 7,35 mmol) Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu trong 48h Kết thúc phản ứng hỗn hợp được cho thêm 40 ml nước, sau đó chiết bằng EtOAc Dịch chiết được làm khô bằng Na2SO4

khan và dung môi được loại bỏ ở áp suất thấp thu được sản phẩm thô Sản

phẩm thô được tinh chế bằng sắc ký cột với hệ dung môi n-hexan/etyl

axetat (97/3) thu được 1,47 g sản phẩm sạch 126 với hiệu suất đạt 90%

1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ ppm: 7,75 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz,

H-6’); 7,44 (1H, dd, J = 2,1, 8,0 Hz, H-3’); 7,07 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-4’); 6,81 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’); 4,72 (2H, s, H-4); 4,27 (2H, q, H-2); 2,72

(3H, s, CH3); 1,30 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-1)

2.3.2 Tổng hợp axit 2-(2’-axetylphenoxy)axetic

Cho 1,30 g (5,86 mmol) hợp chất 126 vào bình cầu 100 ml đã có sẵn

20 ml nước, sau đó được cho thêm 1,05 g (7,62 mmol) K2CO3 Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu trong 3h Hỗn hợp sau phản ứng được chiết bằng EtOAc ba lần và bỏ dịch chiết hữu cơ thu lấy dịch nước Tiếp theo, dịch nước được axit hóa bằng HCl 10% cho tới môi trường đạt pH=6 và được chiết bằng EtOAc ba lần Dịch EtOAc được làm khô bằng Na2SO4 và

dung môi được loại ở áp suất thấp thu được axit 127 (909 mg, 80%)

1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ ppm: 6,50 (1H, dd, J = 2,5, 8,5 Hz,

H-6’); 6,22 (1H, dd, J = 2,5, 8,5 Hz, H-3’); 7,07 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-4’); 5,79 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’); 3,49 (2H, s, H-2); 1,47 (3H, s, CH3)

2.3.3 Tổng hợp 3-metylbenzofuran

O

128

1 2 3 4 5

6 7

Hỗn hợp của axit 2-(2’-axetylphenoxy)axetic (127) (23,64 g, 0,122

mol) và natri axetat (42,46 g, 0,518 mol) trong anhydrit axetic (87 g, 0,85 mol) được đun ở nhiệt độ 160oC trong 3h Kết thúc phản ứng hỗn hợp được làm lạnh về nhiệt độ phòng sau đó được cho thêm nước và chiết 3 lần bằng dietyl ete Lớp hữu cơ được làm khan bằng Na2SO4 sau đó loại dung môi ở

áp suất thấp thu được sản phẩm thô Sản phẩm thô được làm sạch bằng sắc

ký cột với hệ dung môi rửa giải là (n-hexan/etyl axetat = 95/5) thu được

29,66 g (60%) sản phẩm 128

129h

8 9

Hỗn hợp của 3-metylbenzofuran (128) (1,0 g, 7,57 mmol) và selen

dioxit (0,97 g, 8,7 mmol) trong 10 ml 1,4-dioxan khan được đun hồi lưu trong 48 h Kết thúc phản ứng, hỗn hợp được lọc qua Celite với dung môi rửa là THF sau đó dịch lọc được làm bay hơi ở áp suất thấp thu được sản phẩm thô Sản phẩm thô được làm sạch trên cột sắc ký silica gel với dung môi rửa giải là CHCl3 thu được 1,06 g (96%) sản phẩm 129h

2.4 TỔNG HỢP CÁC AZLACTON

2.4.1 Tổng hợp (Z)-2-metyl-4-(naphthalen-2’-ylmetylen)oxazol-5(4H)-on

Hòa tan 2,04 g (12,8 mmol) 2-naphthandehit (129a) trong 25 ml

anhydrit axetic, sau đó cho 2,00 g (17,2 mmol) axetyl glyxin và 1,40 g

(17,2 mmol) natri axetat vào hỗn hợp phản ứng trên Hỗn hợp được đun ở

90 oC trong khoảng 12h Kết thúc phản ứng, hỗn hợp được chiết bằng EtOAc, dịch chiết được làm khô bằng Na2SO4 sau đó được loại dung môi ở

áp suất thấp thu được sản phẩm thô Sản phẩm thô được làm sạch bằng sắc

ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải n-hexan/EtOAc (99:1) thu được

sản phẩm 130a (2,14 g, 73 %)

Hợp chất 130a là chất rắn có điểm chảy 133-134 oC

IR (KBr): 3415; 3282; 3055; 3014; 2933; 1794; 1762; 1701; 1658; 1627; 1600; 1523; 1509; 1430; 1381; 1340; 1294; 1261; 1231; 1189; 1168; 1155; 1129; 1054; 995; 953; 890; 824; 744 cm-1

3 N O

Hợp chất 130b được tổng hợp tương tự như hợp chất 130a Nguyên liệu đầu là 624 mg (6,5 mmol) furan-2-cacbandehit (129b) phản ứng với

1,01 g (8,6 mmol) N-axetyl glyxin tạo thành 840 mg sản phẩm 130b với

hiệu suất 73%

Hợp chất 130b là chất rắn màu vàng nhạt có điểm chảy 173-175 °C

IR (KBr): 3280; 3138; 1791; 1765; 1679; 1662; 1609; 1558; 1509; 1425; 1383; 1354; 1298; 1254; 1164; 1084; 1051; 1004; 991; 885; 869; 814; 765; 747; 692; 670; 625 cm-1

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ ppm: 2,36 (3H, s, CH3); 7,08 (1H, s,

H-6); 7,11 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-4’); 7,48 (1H, t, J = 1,5 Hz, H-5’); 8,01

(1H, s, H-2’)

2.4.3 Tổng hợp (Z)-2-metyl-4-(thiophen-3-ylmetylen)oxazol-5(4H)-on

Hợp chất 130c được tổng hợp tương tự chất 130a từ nguyên liệu là

500 mg (4,27mmol) N-axetyl glyxin phản ứng với 358 mg (3,20 mmol)

thiophen-3-cacbandehit (129c) tạo thành 432 mg sản phẩm 130c với hiệu

suất 70%

Sản phẩm là chất rắn màu trắng có điểm chảy 150-152 oC

IR (KBr): 3254; 3100; 3091; 1771; 1688; 1655; 1600; 1509; 1426; 1383; 1339; 1292; 1263; 1196; 1151; 903; 799; 684; 619 cm-1

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ ppm: 2,38 (3H, s, CH3); 7,18 (1H, s,

CH=C); 7,37 (1H, dd, J = 3,0; 5,0 Hz, 5’); 7,81 (1H, d, J = 5,0 Hz, 4’); 8,07 (1H, d, J =2,5 Hz, H-2’)

H-2.4.4 Tổng hợp (Z)-4-(3-metoxybenzyliden)-2-metyloxazol-5(4H)-on

Hợp chất 130d được tổng hợp theo phương pháp tương tự chất 130a

ở trên từ nguyên liệu 573 mg (4,90 mmol) N-axetyl glyxin phản ứng với

500 mg (3,68 mmol) 3-metoxibenzandehit (129d) tạo thành 600 mg sản phẩm 130d với hiệu suất 75%

Sản phẩm là chất rắn màu trắng có điểm chảy 194-196 oC

IR (KBr): 3469; 3255; 3015; 2958; 2942; 1770; 1698; 1661; 1641; 1599; 1578; 1523; 1490; 1434; 1367; 1305; 1267; 1200; 1172; 1161; 1141; 1051; 786; 776 cm-1

1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz): 2,33 (3H, s, CH3), 3,74 (3H, s, OCH3), 6,67 (1H, s, H-2’), 6,81 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5’), 6,86 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-6’), 7,10 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-4’), 7,63 (1H, s, CH=C)

2.4.5 Tổng hợp (Z)-4-(4’-metoxybenzyliden)-2-metyloxazol-5(4H)-on

Hòa tan 500 mg (3,68 mmol) 4’-metoxibenzandehit (129e) trong 15

ml anhydrit axetic, sau đó cho 573 mg (4,90 mmol) axetyl glyxin và 401

mg (4,90 mmol) natri axetat vào hỗn hợp phản ứng trên Hỗn hợp được đun

ở 90 oC trong khoảng 12h Kết thúc phản ứng, hỗn hợp được chiết bằng EtOAc, dịch chiết được làm khô bằng Na2SO4 sau đó được loại dung môi ở

áp suất thấp thu được sản phẩm thô Sản phẩm thô được làm sạch bằng sắc

ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải n-hexan/EtOAc (98:2) thu được

sản phẩm 130e (590 mg, 74 %)

Sản phẩm là chất rắn màu trắng, điểm chảy 158-159 oC

IR (KBr): 3257; 3120; 3063; 1677; 156; 1625; 1563; 1518; 1472; 1426; 1374; 1263; 1191; 1036; 874; 824; 766 cm-1

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ ppm: 2,38 (3H, s, CH3); 3,86 (3H, s, OCH3); 6,95 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3’, H-5’); 7,10 (1H, s, CH=C); 8,05 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’, H-6’).

2.4.6 Tổng hợp (Z)-4-(3’-bromobenzyliden)-2-metyloxazol-5(4H)-on

1 4 1'

2' 3' 4' 5' 6'

O N O

CH3Br

130f

2

Tương tự như tổng hợp 130a từ 500 mg (2,70 mmol)

3-bromobenzandehit (129f) phản ứng với 372 mg (3,18 mmol) N-axetyl

glyxin trong sự có mặt của 260 mg (3,18 mmol) natri axetat trong (15 ml)

axetic anhydrit tạo thành azlacton 130f (574 mg, 80%)

Sản phẩm tạo thành là chất rắn màu trắng có điểm chảy 190-191 oC

IR (KBr): 3416; 3124; 3077; 3021; 2923; 1733; 1674; 1606; 1549; 1447; 1405; 1383; 1371; 1342; 1321; 1255; 1210; 1171; 1130; 1088; 1040; 1012; 938; 841; 772; 752; 644 cm-1

1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ ppm: 2,41 (3H, s, CH3); 7,02 (1H, s,

CH=C); 7,30 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-2’); 7,53 (1H, dd, J = 1,5, 7,0 Hz, H-5’); 7,92 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-4’); 8,30 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-6’)

2.4.7 Tổng hợp (Z)-4-(4’-bromobenzyliden)-2-metyloxazol-5(4H)-on

2 3

5 14 1' 4'

O N O

CH3Br

130g

2' 3' 5' 6'

Cho (500 mg, 2,70 mmol) của 4-bromobenzadehit (129g) phản ứng

với N-axetylglyxin (372 mg, 3,18 mmol) và natri axetat (260 mg, 3,18

mmol) trong axetic anhydrit (15 mL) tạo thành 130g (580 mg 83%)

Sản phẩm là chất rắn màu trắng có điểm chảy 192-194 oC

IR (KBr): 3273; 3010; 2901; 2799; 1799; 1686; 1648; 1585; 1521; 1485; 1427; 1399 1377; 1301; 1237; 1201; 1181; 1167; 1073; 914; 890; 882; 868; 815cm-1

1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ ppm: 2,41 (3H, s, CH3); 7,06 (1H, s,

CH=C); 7,52 (2H, d, J = 7,0 Hz, H-3’, H-5’); 7,95 (2H, d, J = 7,0 Hz, H-2’,

H-6’)

2.4.9 Tổng hợp (Z)-4-(benzofuran-3’-ylmetylen)-2-metyloxazol-5(4H)-on

Phản ứng của (8,0 g, 25 mmol) benzofuran-3-cacbandehit (129h)

phản ứng với N-axetyl glyxin (7,5g, 64,0 mmol) và natri axetat (5,2 g, 64,0

mmol) trong axetic anhydrit (50 mL) tạo thành 130h (860 mg, 14%)

1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ ppm: 2,42 (3H, s, CH3); 7,32 (1H, s,

CH=); 7,34-7,39 (2H, m, H-5’, H-6’); 7,55 (1H, dd, J = 1,5; 7,0 Hz, H-7’); 7,96 (1H, dd, J = 1,5; 7,0 Hz, H-4’); 8,26 (1H, s, H-2’).

13C-NMR (CDCl3, 75 MHz) δ ppm: 167,0 (C=O); 165,4 (C-2’); 155,0 (C-8’); 150,9 (C-2’, C-4); 132,4 (C-3’); 125,6 (C-5’); 123,9 (C-6’); 120,7 (C-4’); 120,4 (C-7’); 116,1 (C-9’); 111,9 (CH=)

2.5 TỔNG HỢP CÁC AXIT (Z)-3-ARYL-2-HYDROXYACRYLIC 2.5.1 Tổng hợp axit (Z)-2-hydroxy-3-(naphthalen-2’-yl)acrylic

Hòa tan 1,00 g (4,22 mmol)

(Z)-2-metyl-4-(naphthalen-2-ylmetylen)oxazol-5(4H)-on (130a) vào trong 8,4 ml NaOH 1N (8,40

mmol), sau đó duy trì hỗn hợp ở nhiệt độ 85oC cho đến khi kết tủa xuất hiện Hỗn hợp này được cho thêm 1,8 ml HCl 5N và đun hồi lưu 1h, sau đó cho thêm 4 ml HCl 12N và đun hồi lưu trong khoảng 4 h Kết thúc phản ứng hỗn hợp được đưa về nhiệt độ phòng lọc thu thấy kết tủa, rửa kết tủa

bằng nước, sau đó làm khô ở áp suất thấp thu được 800 mg sản phẩm 131a

sạch với hiệu suất 89%