Các phương pháp định lượng các cấu tử hương của dịch nước nho sau lên men

Trong đó, theo nghiên cứu và thực tế sản xuất, loài Vitis vnifera được cho là thích hợp nhất để sản xuất rượu vang vì: nó chứa hàm lượng chất dinh dưỡng cao cho sự phát triển của nấm me

LỜI CÁM ƠN 5

LỜI MỞ ĐẦU 6

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ DỊCH NHO LÊN MEN VÀ CÁC CẤU TỬ HƯƠNG TRONG DỊCH NHO SAU LÊN MEN 7

1.1 TỔNG QUAN VỀ DỊCH NHO SAU LÊN MEN 7

1.1.1 Nho 7

1.1.1.1 Phân loại 8

1.1.1.2 Thành phần hóa học của nho 8

1.1.2 Nấm men sử dụng để lên men dịch nho 10

1.1.2.1 Các nấm men thường gặp 11

1.1.2.2 Các tiêu chuẩn lựa chọn nấm men 11

1.1.3 Các sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men dịch nho 12

1.1.3.1 Sản phẩm tạo thành do quá trình trao đổi chất của nấm men 12

1.1.3.2 Các sản phẩm tạo thành từ quá trình tự phân của nấm men 13

1.1.4 Các cấu tử hương và nguồn gốc phát sinh 15

1.1.5 Hương của các cấu tử 16

Chương 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CẤU TỬ HƯƠNG TRONG DỊCH NHO 19 2.1 SẮC KÍ KHÍ (GAS CHROMATOGRAPHY- GC) 19

2.1.1 Khái niệm và nguyên tắc 19

2.1.2 Cấu tạo của hệ thống sắc kí khí 20

2.1.2.1 Bộ phận cung cấp khí mang 20

2.1.2.2 Bộ phận bơm mẫu 21

2.1.2.3 Lò 22

2.1.2.4 Cột sắc kí 22

2.1.2.5 Chất mang rắn 25

2.1.2.6 Pha tĩnh 25

2.1.2.7 Đầu dò (detector) 25

2.1.2.8 Máy ghi 29

2.1.3 Quy trình sắc kí khí 30

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả sắc kí 31

2.1.4.1 Tốc độ dòng khí mang 31

2.1.4.2 Chiều cao đĩa lý thuyết 31

2.2 CÁC NGUYÊN LÝ CƠ BẢN TÁCH CẤU TỬ HƯƠNG TRƯỚC KHI VÀO SẮC KÍ KHÍ 32

2.2.1 Tách dựa vào khả năng hòa tan 32

2.2.2 Tách dựa vào khả năng hấp phụ( sorptive extraction) 34

2.2.3 Tách dựa vào khả năng bay hơi 35

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT TRƯỚC KHI SẮC KÍ ĐỊNH LƯỢNG

CẤU TỬ HƯƠNG TRONG DỊCH NHO SAU LÊN MEN 36

2.3.1 Phương pháp Vi chiết pha rắn (Solid-phase microextraction - SPME)37 2.3.1.1 Giới thiệu 37

2.3.1.2 Thiết bị SPME 38

2.3.1.3 Cơ chế thực hiện quá trình tách cấu tử của SPME 39

2.3.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng trong SPME 41

2.3.1.4.1 Pha tĩnh 41

2.3.1.4.2 Phương pháp tách chiết 41

2.3.1.4.3 Sự khuấy đảo 42

2.3.1.4.4 Thể tích mẫu (Vw) và thể tích phần HS (Vh) 42

2.3.1.4.5 Thời gian tách cấu tử bằng hấp phụ (te) 42

2.3.1.4.6 Nhiệt độ 42

2.3.1.4.7 Điều kiện giải hấp phụ 43

2.3.1.5 So sánh phương pháp SPME và bơm mẫu trực tiếp 43

2.3.1.6 Ưu và nhược điểm của SPME 44

2.3.1.7 Ứng dụng định lượng cấu tử hương của dịch nho sau lên men .44 2.3.1.7.1 Nguyên liệu 44

2.3.1.7.2 Cột hấp phụ 45

2.3.1.7.3 Giai đoạn tách chiết SPME 45

2.3.1.7.4 Chạy sắc kí 45

2.3.1.7.5 Kết quả 45

2.3.2 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và trích ly đồng thời (Simultaneous steam distillation /extraction – SDE) 47

2.3.2.1 Giới thiệu 47

2.3.2.2 Nguyên tắc tách chiết 47

2.3.2.3 Thiết bị SDE 48

2.3.2.4 Quá trình tách chiết bằng SDE 49

2.3.2.5 Ưu- nhược điểm của phương pháp SDE 50

2.3.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết SDE 51

2.3.2.6.1 Dung môi tách chiết 51

2.3.2.6.2 Thời gian tách chiết 51

2.3.2.6.3 Nhiệt độ 52

2.3.2.6.4 Các yếu tố khác 52

2.3.2.7 So sánh SDE với những phương pháp tách chiết khác 52

2.3.2.7.1 So sánh SDE với SBSE 52

2.3.2.7.2 So sánh SDE với SPME 53

2.3.2.8 Ứng dụng SDE vào phân tích định lượng các cấu tử hương trong dịch

nho sau lên men 53

2.3.2.8.1 Chuẩn bị mẫu 54

2.3.2.8.2 Hóa chất sử dụng 54

2.3.2.8.3 Phương pháp tách chiết 54

2.3.2.8.4 Phân tích sắc ký 54

2.3.2.8.5 Kết quả phân tích 55

2.3.3 Phương pháp chiết lỏng-lỏng (Liquid-liquid extraction -LLE) 57

2.3.3.1 Giới thiệu 57

2.3.3.2 Thiết bị LLE 58

2.3.3.3 Cơ chế tách cấu tử hương bằng LLE 58

2.3.3.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp 60

2.3.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng 60

2.3.3.6 Ứng dụng LLE trong phân tích cấu tử hương trong rượu vang và dịch nước nho sau lên men 61

2.3.3.6.1 Các chất chuẩn 61

2.3.3.6.2 Quá trình thực hiện LLE 61

2.3.3.6.3 Quá trình sắc kí khí 61

2.3.3.6.4 Kết quả phân tích 62

2.3.4 Phương pháp “Chiết pha rắn” (Solid phase extraction -SPE) 63

2.3.4.1 Giới thiệu 63

2.3.4.2 Cấu tạo thiết bị SPE 63

2.3.4.2.1 Cột SPE thông thường 64

2.3.4.2.2 Thiết bị SPE membrane 65

2.3.4.3 Cơ chế tách cấu tử bằng phương pháp SPE 65

2.3.4.3.1 Tách bằng cột SPE 65

2.3.4.3.2 Tách bằng membrane 66

2.3.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng trong SPE 66

2.3.4.4.1 Loại thiết bị 66

2.3.4.4.2 Chất mang nhồi cột 67

2.3.4.4.3 Thể tích mẫu chạy SPE và thể tích dung môi rửa giải 67

2.3.4.4.4 Tốc độ dòng lưu chất qua cột và thời gian tách chiết 67

2.3.4.5 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp 67

2.3.4.5.1 Ưu điểm 67

2.3.4.5.2 Nhược điểm 68

2.3.4.6 Ứng dụng SPE để phân tích các cấu tử hương trong dịch nước nho sau lên men68 2.3.4.6.1 Cột SPE và chất chuẩn 68

2.3.4.6.2 Thiết bị GC-MS và quá trình chạy sắc kí 68

2.3.4.6.3 Quá trình tách mẫu SPE 69

2.3.4.6.4 Kết quả 69

2.3.5 Phương pháp Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) 71

2.3.5.1 Giới thiệu 71

2.3.5.2 Nguyên tắc 71

2.3.5.3 Thiết bị SBSE 73

2.3.5.4 Cơ chế tách cấu tử bằng SBSE 73

2.3.5.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả của phương pháp SBSE 74

2.3.5.5.1 Thời gian tách chiết 74

2.3.5.5.2 Nồng độ cấu tử cần phân tích trong mẫu ban đầu 74

2.3.5.5.3 Kĩ thuật sử dụng thanh khuấy và số thanh khuấy 74

2.3.5.5.4 Thể tích mẫu và tỉ lệ pha 75

2.3.5.5.5 Nhiệt độ và thời gian giải hấp phụ 75

2.3.5.6 Ưu nhược điểm của phương pháp SBSE 75

2.3.5.7 Ứng dụng SBSE vào phân tích các cấu tử dễ bay hơi trong dịch nho sau lên men76 2.3.5.7.1 Thanh hấp phụ 76

2.3.5.7.2 Quá trình tách mẫu SBSE và giải hấp phụ 76

2.3.5.7.3 Quá trình sắc kí 76

2.3.5.7.4 Kết quả 76

Chương 3: KẾT LUẬN 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO 80

LỜI CÁM ƠN

Trong học kì II năm học này, việc làm Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm đã giúp cho chúng em ngày một trưởng thành hơn trong kĩ năng làm việc độc lập và làm việc nhóm Để hoàn thành đồ án này, em đã được sự giúp đỡ và hướng dẫn của nhiều thầy cô trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm và bạn bè

Em xin chân thành cám ơn đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho em trong thời gian làm Đồ án môn học này

Do thời gian và khả năng có hạn nên đồ án này còn nhiều sai sót, mong quý thầy cô và bạn bè chỉ bảo và góp ý thêm để em có thể ngày càng hoàn thiện được những

mảng kiến thức về Công nghệ Thực phẩm.

LỜI MỞ ĐẦU

Rượu vang là một trong những sản phẩm lên men có lịch sử lâu đời nhất Nó được

ưa thích tại nhiều nơi trên thế giới bởi hương vị hết sức đặc trưng, đem lại cảm giác sảng khoái và sức khỏe cho người sử dụng

Hương vị được xem là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định đến đặc điểm và chất lượng rượu vang Theo nghiên cứu của các nhà khoa học thì hương vị của rượu vang là sự tổng hợp của hơn 800 hợp chất dễ bay hơi thuộc các nhóm như: rượu, esterr, acid hữu cơ, phenol, thiol, monoterpen và nor-isoprenoid Chúng được tạo thành từ quá trình trao đổi chất của nấm men và phản ứng giữa các hợp chất hóa học trong quá trình tàng trữ rượu vang Các cấu tử hương trong dịch nước nho sau lên men sẽ góp phần quyết định đến hương vị rượu vang thành phẩm Tùy loại rượu vang sản xuất mà thành phần của các cấu tử hương của dịch nước nho lên men sẽ khác nhau Vì vậy, việc định lượng các cấu tử hương là vô cùng quan trọng để xác định chất lượng và điều chỉnh thành phần cấu tử hương theo mong muốn, và những phương pháp định lượng cũng góp phần không nhỏ vào việc nghiên cứu của các đề tài liên quan đến nước nho sau này

Nhiệm vụ chính của đồ án “Các phương pháp định lượng các cấu tử hương của dịch nước nho sau lên men” là tìm hiểu về các phương pháp tách chiết cũng như định lượng các cấu tử hương có hàm lượng khác nhau trong dịch nho sau lên men

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ DỊCH NHO LÊN MEN VÀ CÁC CẤU TỬ HƯƠNG TRONG DỊCH

NHO SAU LÊN MEN

1.1 TỔNG QUAN VỀ DỊCH NHO SAU LÊN MEN

1.1.1 Nho

Lên men nước nho là một phần trong quy trình sản xuất rượu vang Trong số các loại quả, nho là nguyên liệu lý tưởng nhất để sản xuất rượu vang Nho ưa đất ít chua và khí hậu khô, nhiều nắng Vùng đất Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận là những vùng nho mới và đang phát triển [3]

Với rượu vang, nho là nguyên liệu thích hợp nhất vì [3]:

 Từ nho cho rượu vang chất lượng tốt nhất, hương vị êm dịu, hài hòa

 Thàng phần dịch quả nho rất thích hợp cho lên men và thành phần rượu thành phẩm nhiều chất dinh dưỡng

Bảng 1.1: Thành phần của dịch nho thông thường [71]

Hợp chất % trong dịch nho

(ethanol và hàm lượng vết của terpenes, glycerols và

rượu bậc cao)

0,1

Acid hữu cơ

(tartaric, malic và một ít lactic, succinic, oxalic,…) 0,9

(các flavonoid như là các chất màu cùng với các

nonflavonoid như là cinnamic acid và vanillin)

0,3

Các hợp chất chứa nitơ

(protein, amino acid, humin, amide, ammonia,…)

0,2

Các hợp chất hương

(các esterr như là ethyl caproate, ethyl butyrate,…)

Vết

1.1.1.1 Phân loại

Nho thuộc giới Plantae, ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Vitales, họ

Vitaceae, chi Vitis Trong đó, theo nghiên cứu và thực tế sản xuất, loài Vitis vnifera

được cho là thích hợp nhất để sản xuất rượu vang vì: nó chứa hàm lượng chất dinh dưỡng cao cho sự phát triển của nấm men, chứa hàm lượng acid đủ cao để ức chế các

vi sinh vật dại, hàm lượng đường thích hợp cho lên men, và cuối cùng là có thể tạo hương vị phù hợp [75,76]

Nho có hai loại: nho đỏ để sản xuất rượu vang đỏ và nho xanh để sản xuất rượu vang trắng.[1,3]

 Nho trắng: trái nho khi chín vỏ không có màu hoặc màu vàng lục nhạt

 Nho đỏ: trái nho khi chín vỏ có màu đỏ – tím ở những mức độ khác nhau

Hình 1.1: Nho xanh (a) và nho đỏ (b)

1.1.1.2 Thành phần hóa học của nho

 Đường

Thông thường dịch nho để sản xuất rượu vang chứa 16 – 26% (w/v) đường Trongnho khô và trong nho thu hoạch trễ, hàm lượng đường có thể lên tới trên 30% (w/v).Dịch nho cô đặc với hàm lượng đường 35oBx được sử dụng để sản xuất rượu vang cóhàm lượng cồn cao Hàm lượng đường cao có thể ảnh hưởng đến khả năng lên mencủa nấm men [40]

Dịch nho trước khi lên men thường chứa tỷ lệ cân bằng của glucose và fructose

Trong suốt quá trình lên men, tất cả các chủng Saccharomyces cerevisiae đều ưu tiên

sử dụng glucose hơn là fructose Hàm lượng ethanol cao có tác động ức chế mạnh sự

sử dụng fructose hơn là glucose Trong khi đó, bổ sung nitơ vào dịch nho sẽ kích thíchsự sử dụng fructose hơn là glucose [9,15,61]

 Nitơ

Các hợp chất nitơ rất cần cho sự phát triển và trao đổi chất của nấm men Trongsố các chất dinh dưỡng mà nấm men có thể sử dụng được trong suốt quá trình lên mendịch nho, về số lượng, nitơ là thành phần quan trọng thứ hai sau các hợp chất carbon.Có nhiều hợp chất chứa nitơ có mặt trong dịch nho, với hàm lượng thay đổi từ 60 –2400mg/L [27]

Saccharomyces cerevisiae có khả năng sử dụng các nguồn nitơ khác nhau để phát

triển, nhưng không phải tất cả các nguồn nitơ đều hỗ trợ phát triển tốt như nhau Cácnguồn nitơ tốt là ammonium, glutamine và asparagine, trong khi đó proline và ureađược xem như là những nguồn nitơ kém chất lượng [27]

Tất cả các hợp chất chứa nitơ tích lũy trong dịch nho bị biến đổi thành một tronghai sản phẩm cuối là ammonium hoặc glutamat Glutamat cùng với glutamine đóngmột vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi nitơ của nấm men Từ 2 amino acid nàytất cả các hợp chất chứa nitơ trong tế bào được tạo ra [27]

 Acid hữu cơ

Trong nho và rượu vang, 6 acid chiếm thành phần chính là acid tartaric, acidmalic, acid citric, acid lactic, acid succinic và acid acetic Trong đó, acid acetic là hợpchất dễ bay hơi còn các acid khác là acid không bay hơi

Độ phân ly của các acid này giảm theo thứ tự sau: acid citric, acid tartaric, acidmalic, acid succinic, acid lactic, và acid acetic

Bảng 1.2: Thành phần các một số acid hữu cơ chính trong dịch nho đỏ và rượu vang đỏ [62]

Acid hữu cơ Dịch nho đỏ Rượu vang đỏAcid citric

Acid tartaricAcid malicAcid succinicAcid lacticAcid acetic

0,25 – 0,35g/L4,07 – 7,65g/L1,99 – 2,91g/LRất ít

Rất ítRất ít

0,17 – 0,40g/L2,60` – 5,7g/L0,06 – 3,13g/L0,48 – 1,22g/L0,07 – 4,89g/L0,30 – 1,44g/L

 SO 2

Sulfur dioxide được sử dụng rộng rãi trong rượu vang như là một chất chống oxyhóa, tác nhân kháng khuẩn và đồng thời cũng là tác nhân cho việc chọn lọc các loàihoặc chủng có thể phát triển và đóng góp vào quá trình lên men Trong rượu vang,

SO2 tồn tại ở 2 dạng: tự do và liên kết Nhưng chỉ SO2 tự do mới có tính khử và diệtkhuẩn Mặc dù vậy, một vài dạng SO2 liên kết có thể chuyển hóa thành SO2 tự do vàcó thể bù lại cho lượng SO2 bị giảm trong quá trình lên men Vì thế, SO2 là một thôngsố quan trọng ảnh hưởng đến động học quá trình lên men và chất lượng rượu vang[14,24]

Bên cạnh đó, SO2 còn có ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men rượu vang: dẫn tớikéo dài thời gian lên men hoặc quá trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sótcòn cao, và ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của rượu vang [6,24]

 Tannin

Trong các thập kỷ qua, thành phần polyphenolic được quan tâm do nó ảnh hưởngđến giá trị cảm quan của rượu vang (màu sắc và mùi vị) và các giá trị dinh dưỡngkhác (theo quan điểm về y học, tannin được xem là chất chống oxi hóa, chống khối uvà bệnh mạch vành)

Tannin có ở 2 dạng là tannin ngưng tụ và tannin thủy phân [75]:

 Tannin thủy phân: có nguồn gốc từ các acid phenolic như là acid gallic và acidellagic

 Tannin ngưng tụ: là polymer của flavan-3-ol (epicatechin, catechin vàgallocatechin) và flavan-3,4-diol

Tannin có ở trong nho và rượu vang chủ yếu là các tannin ngưng tụ [75]

Tannin có thể được thêm vào rượu vang dưới dạng acid tannic để phản ứng và kếttủa với protein và để cải thiện độ trong của rượu vang Trong suốt quá trình ủ, sự thayđổi hàm lượng tannin ngưng tụ sẽ ảnh hưởng đến màu sắc và tính chất cảm quan củarượu vang, và khi đó, khối lượng phân tử của tannin có thể tăng lên [75]

1.1.2 Nấm men sử dụng để lên men dịch nho

Nấm men là vi sinh vật quan trọng, kiểm soát quá trình lên men cồn trong sản xuấtrượu vang Nấm men trong quá trình lên men rượu vang có thể có từ 3 nguồn gốc khác nhau: bề mặt trái nho, bề mặt thiết bị và từ canh trường được cấy vào Thành phần và chất lượng của rượu vang có liên quan chặt chẽ đến nấm men Trong quá trình lên men, bên cạnh các sản phẩm chính là ethanol và CO2, nấm men tạo thành nhiều sản phẩm phụ, ví dụ như glycerol, acid acetic, acid succinic và đặc biệt là các hợp chất hương, góp phần đáng kể vào chất lượng của rượu vang.[3,58,59]

1.1.2.1 Các nấm men thường gặp

Giống nấm men thường sử dụng nhất trong sản xuất vang là saccharomyces

Chúng có bào tử trong nang thường là 1-4 bào tử, có khi lên đến 8 Tế bào của chúng có hình dáng khác nhau như tròn, oval, elip Chúng sinh sản bằng cách nảy chồi, sử dụng đường trong quá trình hô hấp và lên men, không sử dụng được muối nitrat

Giống saccharomyces có tới 18 loài , nhưng chỉ có 7 loài thường gặp trong nước quả.

[3]

Một số nấm men thường gặp nhất trong sản xuất rượu vang [3,27]:

 Saccharomyces cerevisiae: Nấm men này phổ biến trong quá trình lên men

nước quả và chiếm tới 80% trong tổng số saccharomyces có trong nước quả khi lên

men Khả năng kết lắng của nó phụ thuộc vào từng nòi: các tế bào dạng bụi hay dạngbông Nguồn dinh dưỡng carbon của chủng này là đường, cồn, và acid hữu cơ, những tác nhân sinh trưởng là acid pantotenic, biotin, thiamin, và piridoxin

Đa số các tế bào của chủng này hình oval, kích thước (3-8)x (5-12)  m,

sinh sản theo cách nảy chồi và tạo thành bào tử S.cerevisiae sinh ra enzym invertase

có khả năng chuyển đường saccharose thành glucose và fructose, vì vậy trong lên men ta có thể bổ sung loại đường này vào dịch quả Hàm lượng rượu được tạo thành bình thường đối với nhiều nòi của nấm men này chỉ đạt 8-10% thể tích

 Ngoài S.cerevisiae, đôi khi người ta còn sử dụng các chủng nấm men khác như S.uvarum, S chevalieri, S oviformis, Henseniaspora apiculate …

1.1.2.2 Các tiêu chuẩn lựa chọn nấm men [3,27]

 Có lực lên men cao đối với nước quả, sử dụng đường cho lên men gần như là hoàn toàn, kết lắng tốt, làm trong dịch rượu nhanh, chịu được độ rượu cao và độ acid của môi trường, cũng như các chất sát trùng, chịu áp suất thẩm thấu tốt, sinh khốitạo thành vừa phải, tạo cho rượu vị thơm ngon thanh khiết

 Tạo thành ít sulphite, thiol, ít acid dễ bay hơi và rượu bậc cao, hoạt tính esterrase thấp

 Có tính ổn định cao về mặt di truyền, khả năng chịu sulphite cao, ít liên kết với sulphite, ít tạo bọt, có khả năng kết bông, kết lắng cặn nhanh, nhu cầu nitơ thấp

1.1.3 Các sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men dịch nho

1.1.3.1 Sản phẩm tạo thành do quá trình trao đổi chất của nấm men

Đây là những chất do nấm men tạo ra trong quá trình sống và được giải phóng vào môi trường Một số chất này là sản phẩm trao đổi chất của nấm men rất đáng được quan tâm đối với rượu vang, đặc biệt chúng tạo ra hương đượm và vị dịu êm của vang [3,6]

Trong lên men có hai sản phẩm chính tạo thành là ethanol và CO2 Ngoài ra còn có các sản phẩm phụ là các chất thứ cấp hay là các sản phẩm bậc 2 Các sản phẩm được tạo thành từ protein hay acid amin với các chất phân giải trung gian của đường tạo thành các loại rượu bậc cao Ngoài ra còn có glycerin, acid succinic, acetaldehyde,acid acetic, aicid propionic, acid lactic, acid citric, acetoin, diacethyl, ester.[3,6]

 Glycerin: tạo thành trong lên men khi acetaldehyde liên kết với Natri bisulphite Nó tạo thành mạnh mẽ khi bắt đầu lên men Nhờ có vị ngọt và sánh như dầu, glycerin đóng vai trò nhất định trong việc tạo vị hài hòa cho rượu vang Bình thường, hàm lượng của nó trong dịch nho sau lên men khoảng 7-14g/L

 Aceton và diacethyl: đều ảnh hưởng đến chất lượng vang, mặc dù số lượng của chúng được tạo ratrong vang không lớn lắm Acetoin 2-84 mg/L, diacethyl 0,1-1,8 mg/L Diacethyl ở nồng độ thấp tạo cho vang có mùi xác định, nhưng lớn hơn

1 mg/L sẽ tạo cho vang mùi vị chua oxy hóa Những loại champagne và vang khô tốt thường diacethyl chỉ ở dạng vết Việc tạo thành acetoin có liên quan đến quá trình sulphite hóa dịch quả: dịch quả không sulphite hóa cho hàm lượng acetoin cao gấp hailần dịch quả đã sulphite hóa Việc tạo thành hai chất này phụ thuộc vào nồng độ đường ban đầu: nồng độ càng cao càng tích tụ nhiều diacethyl

 Aldehyde: hay gặp nhất là acetaldehyde, aldehyde propionic, butyric, valeric, enantic Các aldehyde này có mùi rất gắt Khi pha loãng, trừ acetaldehyde, các alhehyde khác có mùi dễ chịu của tông mùi quả tự nhiên Acetaldehyde thường tích tụ trong vang với lượng khá nhỏ

 Các acid: các acid bay hơi thường gặp là acid acetic, propionic, isobutyric, butyric, isovaleric, caproic, caprilic, valeric Các loại acid dễ bay hơi được tích tụ chủ yếu ở giai đoạn đầu của quá trình lên men Acid acetic được tạo thành nhanh chóng giai đoạn đầu, sau đó giảm rõ rệt trong giai đoạn cuối là do một số nấm men có thể dùng acid acetic làm cơ chất dinh dưỡng Ngoài ra, trong vang còn có các acid khác như: acid lactic, citric, malic, cetoacid

 Các ester: được tạo thành trong quá trình lên men và đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành hương vị của vang Các ester tạo thành rất phức tạp và khác nhau khi sử dụng các giống và loài nấm men khác nhau Trong các ester, ethyl acetat vượt trội nhất về hàm lượng, nó có mùi quả tự nhiên, và đây là một trong những cấu tử tạo hương quan trọng nhất Ngưỡng cảm nhận của nó là 180-200 mg/L, nếu thấp hay cao hơn mức này đều ảnh hưởng trực tiếp tới vị của vang, cao hơn sẽ cho

vị gắt, khó chịu Các ester thuộc cả 2 nhóm có độ sôi cao và thấp Điều kiện lên men chỉ ảnh hưởng tới số lượng ester Lên men ở điều kiện kị khí sẽ tạo thành ester nhiều gấp 6 lần so với hiếu khí và 4 lần so với lên men dừ thừa CO2 Lên men ở điều kiện kịkhí hay hiếu khí sẽ dẫn đến việc thay đổi nồng độ của các ester có độ sôi cao và làm tăng nồng độ các ester có độ sôi thấp

 Lipid: lipid có trong vang có thể từ 2 nguồn là quả và chủng loài nấm men Trên bề mặt nho thường phủ một lớp sáp và chất sáp này sẽ rơi vào dịch quả Các acid béo thường gặp trong vang là acid oleic, linoleic, stearic và palmitic

 Rượu bậc cao: được tạo thành từ quá trình khử amin hoặc chuyển amin của các acid amin, tiếp nữa là khử carbonyl của các cetoacid và khử các aldyhyde trong quá trình lên men rượu Trong vang, ta thấy có các rượu sau: methanol, n-

propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, n-pentanol, 2-methyl butanol, 3-methyl butanol, n-heanol, triptofol, phenyl ethylic Hàm lượng các rượu này phụ thuộc vào điều kiện lên men dịch nho Trong điều kiện dư oxi không khí thì sẽ tạo thành các rượu bậc cao có hàm lượng lớn hơn điều kiện kị khí Một số rượu mạch vòng như triptofol, phenyl ethylic góp phần tạo hương vị êm dịu cho vang

 Sulfuhydryl (-SH): làm thay đổi thế oxi hóa-khử của môi trường Đây là các hợp chất có tính khử cao, nó sẽ giúp bảo vệ các cấu tử hương khỏi bị tác dụng củacác chất oxi hóa

1.1.3.2 Các sản phẩm tạo thành từ quá trình tự phân của nấm men

Tự phân là sự phân hủy các cấu tử tế bào dưới tác dụng của các enzym thủy phân của chính bản thân tế bào Trong quá trình tự phân này, protein, hydrocarbon, nucleotide, lipid và các vật chất tế bào khác sẽ bị phân hủy Sản phẩm sẽ hòa tan vàomôi trường Điều kiện để có sự tự phân là tế bào đã chết và vẫn còn giữ được hoạt tính của các enzym nội bào [3]

Nhiều nhà khoa học đã khẳng định, quá trình tàng trữ dịch nho sau lên men hoặc bổ sung các sản phẩm tự phân của nấm men sẽ làm tăng chất lượng hương vị của dịchnho sau lên men (cũng như vang) Các sản phẩm dạng này thường là các hợp chất chứa Nitơ và đặc biệt là các vitamin nhóm B, đặc biệt là acid pantotenic-vitamin B3và acid nicotinic- vitamin B5 (là những chất có hoạt tính sinh học cao, một lượng nhỏ cũng ảnh hưởng đến các quá trình hóa sinh làm cho dịch nho sau lên men “chín” và hình thành hương vị cho sản phẩm).[3]

1.2 CÁC CẤU TỬ HƯƠNG TRONG DỊCH NHO SAU LÊN MEN

1.2.1 Phân loại

Tìm hiểu về bản chất hóa học của các cấu tử hương của dịch nho sau lên men cũngnhư rượu vang, người ta thường quan tâm đến việc định tính và định lượng chúng Cáccấu tử hương có hàm lượng thay đổi trong một khoảng rất rộng (tùy loại nho và vang) và hàm lượng rất khác nhau Vì vậy, việc phân tích định lượng chúng cũng khá khó khăn và phải có chiến lược phân tích hợp lý.[33,41,42,60,64]

Một trong các chiến lược phân tích được nhiều nhà khoa học ủng hộ là phân loại các cấu tử hương trong dịch nho sau lên men theo hàm lượng gồm 3 nhóm như sau [60]:

 Nhóm 1: Bao gồm các cấu tử dễ phân tích, thường là những cấu tử có hàm lượng khá cao (C>0,1 mg/L) như acetaldehyde, các rượu bậc cao, acid béo và một số ethyl ester Các cấu tử này thường được phân tích khá đơn giản: chúng được tách khỏi hỗn hợp qua một bước tách đơn giản rồi đem chạy sắc kí khí với đầu dò FID

 Nhóm 2: gồm các cấu tử có khả năng phân tích trung bình Để phân tích chúng, người ta sẽ tách riêng chúng khỏi hỗn hợp đồng thời làm giàu (tăng nồng độ) trước khi phân tích GC-MS Các cấu tử này thường nằm trong khoảng nồng độ từ 0,1

g/L đến 0,1 mg/L, gồm các cấu tử như các hợp chất phenol, lactone, dẫn xuất của vanillin, một số ester hàm lượng thấp và một số hợp chất nor-isoprenoid (như 

damascenone và  ionone)

 Nhóm 3: gồm các hợp chất rất khó phân tích Đây là những hợp chất ít nhạy với phân tích sắc kí và không bền hóa học, và thường ở nồng độ cực kì thấp, gồm các hợp chất dễ bay hơi chứa lưu huỳnh, một số aldehyde, alkyl methoxypyrazine,

furaneol và một số thiol thơm Việc phân tích các hợp chất này đòi hỏi những phương pháp tách chiết đặc hiệu hoặc phải tạo dẫn xuất trước khi phân tích sắc kí

Chiến lược phân tích thường thấy của các nhà khoa học là xác định hàm lượng các cấu tử thuộc nhóm 1 và 2 Các cấu tử nhóm 2 thường được phân tích bởi các phương pháp hiện đại như “vi chiết” (microextraction) nhưng các phương pháp này thường tốn nhiều thời gian phân tích và các cấu tử phân cực như vanillin thì khả năng tách chiết không cao [60]

1.1.4 Các cấu tử hương và nguồn gốc phát sinh

Các cấu tử hương có thành phần rất đa dạng và phức tạp về cấu tạo hóa học Do chúng có các nhóm chức đặc biệt (như rượu, aldehyde, acid…) nên tính chất hóa lý rất khác nhau về độ phân cực, độ bay hơi và mức độ tạo mùi vị Trong quá trình lên men rượu, nấm men và vi khuẩn sẽ giải phóng ra hàng loạt các cấu tử dễ bay hơi, chiếm

ưu thế nhất là ethanol và glycerin, ngoài ra còn có các cấu tử hương thuộc nhóm aldehyde, rượu bậc cao và ester

Trong các ester, ethyl acetat là cấu tử chính và quan trọng nhất góp phần hình thành hương của sản phẩm, bên cạnh đó còn có các loại ester của các rượu bậc cao vàcác acid béo mạch trung bình Các ethyl ester của acid béo (ethyl decanoat, ethyl hexanoat, ethyl octanoat) và các rượu bậc cao (rượu isoamylic, valeric…) là những hợpchất tạo hương quan trọng của dịch nho lên men từ nho trắng [6,26,31,42,44,49,64]Thành phần hương trong dịch nho sau lên men (cũng như rượu vang) phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, những yếu tố quan trọng nhất là giống nho, quy trình lên men

dịch nho, việc tàng trữ dịch nho sau lên men (nếu có) Mùi vị của dịch nước nho sau lên men (cũngnhư rượu vang) rất đa dạng, và các cấu tử hương được tạo ra từ 3 nguồn khác nhau: cấu tử có sẵn trong trái nho, tạo ra nhờ quá trình lên men và sinh ra trong quá trình tồn trữ Bên cạnh các cấu tử hương vốn có của nho, các cấu tử hương khác sẽ được tạo thành trong quá trình xử lý thông qua các phản ứng hóa học, hóa sinh và

các phản ứng do nhiệt độ (bảng 1.3) Ngoài ra, các cấu tử hương tạo thành từ quá

trình lên men và tàng trữ cũng góp phần tạo thành hương vị cuối cùng vô cùng đa dạnh cho dịch nho (cũng như rượu vang) [18,31,44,48,49]

 Các cấu tử hương tạo ra từ các hợp chất có sẵn trong dịch nho: các hợp chất có sẵn trong dịch nho là những tiền chất tạo hương Các quá trình xử lý nguyên liệu sẽphát sinh những phản ứng hóa sinh, oxi hóa do enzym và nhiệt độ tạo ra các cấu tử hương cho dịch nho

 Các cấu tử hương tạo thành từ quá trình lên men chính:Sự khác nhau chủ yếuvề hương giữa các loại rượu là do các rượu bậc cao Hơn nữa, hàm lượng ethyl lactat tạo thành là do quá trình lên men malolactic trong vang đỏ Sau lên men malolatic, hàm lượng ethyl lactat khoảng 39- 168mg/L Về các rượu bậc cao, hàm lượng khoảng 190-260 mg/L đối với vang trắng và 370-650 mg/L đối với vang đỏ Hàm lượng các rượu bậc cao dưới 300 mg/L sẽ đóng góp vào hương vị đặc trưng của vang, nhưng nếu quá 400 mg/L sẽ tạo ra hương vị không tốt

 Với các cấu tử hương tạo thành từ lên men phụ: Các rượu bậc cao và các ester như ethyl lactat, ethyl acetat, 2-phenyl ethanol là những cấu tử hương quan trọngnhất Bên cạnh đó có thể kể đến ethyl 4-hydroxy butyrat, diethyl succinat, monoethyl succinic…

1.1.5 Hương của các cấu tử

Gần đây, một số nhà khoa học đã nghiên cứu hương của từng thành phần cấu tử

trong rượu vang Bảng 1.4 thể hiện các đơn mùi của một số cấu tử hương chính có

trong dịch nho sau lên men (cũng như rượu vang)

Bảng 1.3: Thành phần các cấu tử hương trong dịch nho sau lên men [44]

Nguồn gốc phát sinh Nhóm chất Các chất điển hình

Các phản ứng hóa sinh Hợp chất 6C

Terpen

Benzenoid

PhenolNorisoprenoid

Hexanol, cis-3-Hexenol, trans-2-hexenolfuran linalool oxit, linalool,  -terpineol, cis, tran-pyran linalool oxit, nerol, geraneol, geranic acid, p-methen-7,8 diol, các đồng phân dimethyl-dihydroxy-octadien, dimethyl-dihydroxy-octadiol benzaldehyde, methyl salycilat,  -methyl benzenemethanol, benzylic, 2-phenyl ethanol, rượu omovanilic, dihydro coniferylic4-vinyl guaiacol, 4-vinyl phenol

3-hydroxy  damascone, 3-oxo  -ionol, 3,9-dihydroxy

mega-5-en, vomifoliolLên men sinh học Ester và rượu bậc

cao

Ethyl acetat, propanol, isobutanol, ethyl lactat, isoamylic

Ester

Acid

PhenolLactonAldehyde

Hexanol, cis-3 hexenol, butanol, benzylic, 2-phenyl ethanol, 4-methyl pentanol

Isoamyl acetat, hexyl acetat, 2-phenyl ethyl acetat, ethyl hexanoat, ethyl decanoat, ethyl octanoat, isoamyl lactat, diethyl succinat, ethyl piruvat, ethyl-3-hydroxy butyrat, ethyl-4-hydroxy butyrat, diethyl malat, monoethyl-2-hydroxy glutarat, diethyl-2-hydroxy glutarat

Butyric, isobutyric, isovaleric, hexanoic, octanoic, decanoic, dodecanoic, monoethyl succinic

9-4-vinyl guaiacol

 butyrolactonAcetoin

Bảng 1.4 Bản chất mùi của các cấu tử hương trong dịch nho sau lên men [38]

Cây cỏCây cỏCây cỏCây cỏCây cỏHoa quảHoa quảHoa quảHoa quảHoa quảHoa quảHoa quảHoa quả

Vi sinh

Vi sinh

Acid isovalericIsoamylicAcid butyricAcetoin3-hexen-1-olBenzaldehydeAcid aceticAcid decanoicSufur dioxitEthyl acetatAcid octanoicAcetaldehydeGuaiacolp-cresol

Phô maiXà phòngPhô maiCreamCỏ xanhHạnhGiấmXà phòngLưu huỳnhGumOâiSherryGỗStable

Vi sinhThảo mộc

Vi sinh

Vi sinhThảo mộcThảo mộcHăng cayHóa họcHóa họcHóa họcHóa họcHóa họcHóa họcHóa học

Chương 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH

LƯỢNG CẤU TỬ HƯƠNG TRONG DỊCH NHO

SAU LÊN MEN

Như đã trình bày ở Chương 1, các cấu tử hương là những cấu tử dễ bay hơi có nhiệtđộ bay hơi và nhiệt độ phân hủy khá thấp Mặt khác, các cấu tử có hàm lượng là rất khác nhau và dao động trong một khoảng lớn (từ vài chục ng/L đến vài mg/L) và nhiều cấu tử ở dạng vết Do vậy, phương pháp phân tích được cho là hiệu quả nhất và cũng được sử dụng gần như là duy nhất trong định lượng các cấu tử hương trong dịch nước quả là phương pháp sắc kí khí (GC)

Chương này sẽ trình bày về phương pháp phân tích sắc kí khí và quan trọng hơn cả là những phương pháp tách chiết cấu tử hương trước khi phân tích GC

2.1 SẮC KÍ KHÍ (GAS CHROMATOGRAPHY- GC)

2.1.1 Khái niệm và nguyên tắc

Sắc ký là phương pháp phân tích các cấu tử có trong hỗn hợp dựa vào khả nănghấp phụ hay phân bố khác nhau của các cấu tử giữa 2 pha: pha động và pha tĩnh

Pha tĩnhPha động

Mẫu

Tách

Sắc ký khí (Gas Chromatography – GC) là một bộ phận của kỹ thuật phân tích sắcký nên nguyên tắc của nó cũng tương tự như các phương pháp phân tích sắc ký khácnhưng có một số điểm khác biệt sau:

 Mẫu phân tích ở trạng thái khí

 Pha động: chất khí hoặc ở dạng hơi

 Pha tĩnh: có thể gồm 2 loại:

 Pha tĩnh là màng mỏng chất lỏng trên bề mặt chất hấp phụ rắn: sắc ký phânbố hay còn gọi là sắc ký khí – lỏng

 Pha tĩnh là chất hấp phụ rắn: sắc ký hấp phụ

Hiện nay sắc ký khí sử dụng pha tĩnh là chất lỏng được áp dụng nhiều trong phântích thực phẩm

Căn cứ vào phổ sắc ký người ta định lượng được các hợp chất bay hơi có trongdung dịch mẫu phân tích Việc nhận biết những hợp chất bay hơi có trong dung dịchchiết được thực hiện bằng cách nối máy sắc ký với máy quang phổ khối hoặc quangphổ tia hồng ngoại.

2.1.2 Cấu tạo của hệ thống sắc kí khí [17,47,73]

Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc kí khí

2.1.2.1 Bộ phận cung cấp khí mang:

Bộ phận cung cấp khí mang làm nhiệm vụ cung cấp khí mang cho hệ thống

Hình 2.2 : Bộ phận cung cấp khí mang

Khí được lựa chọn làm khí mang phải đáp ứng được các yêu cầu sau đây:

 Trơ với cấu tử khảo sát

 Có tỷ khối nhỏ, nghĩa là độ nhớt thấp, để làm tăng vận tốc khí mang (vì độgiảm áp suất qua cột tách tỷ lệ với độ nhớt của khí mang)

 Tồn tại ở dạng tinh khiết hay dễ làm cho tinh khiết

 Khi xét quan hệ giữa chiều cao đĩa lý thuyết H và vận tốc tuyến tính của dòngkhí mang, loại khí mang nào cho cực tiểu càng trải rộng càng tốt

 Khi lựa chọn khí mang cần chú ý đến detector sử dụng, yêu cầu tách, sử dụngphối hợp các phương thức khác.

 Một số loại khí mang thường sử dụng trong sắc ký khí:

 Khí H2: Trong phân tích vết, khi sử dụng hydro thì pha tĩnh dễ bị hỏng và trongsắc ký điều chế cần thiết phải làm sạch và khô khí

 Khí He: rất thích hợp cho sắc kí khí nhiệt độ cao

 Khí Ar: do độ nhớt của Ar khá cao, yêu cầu về dây dẫn khi sử dụng nó khônggặp khó khăn lắm Khí Ar ngày càng được sử dụng nhiều làm khí mang

 Khí N2: do không nguy hiểm, giá rẻ, dễ dàng làm tinh khiết nên nó được sửdụng nhiều trong sắc kí khí

 Không khí và O2: trước khi sử dụng cần phải sấy khô vì rất dễ lẫn nước trongbơm đựng khí

Lưu lượng khí mang ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tách, do đó cần điều chỉnhvận tốc và áp suất khí mang qua cột hết sức chặt chẽ

2.1.2.2 Bộ phận bơm mẫu:

Bộ phận bơm mẫu dùng để đưa mẫu cần phân tích vào cột sắc kí

Hình 2.3: Bộ phận tiêm mẫu có chia dòng

Mẫu dạng lỏng được bơm vào cột (bằng syringe) qua một màng cao su đặc biệt cókhả năng giữ cho áp suất của hệ thống luôn ổn định gọi là septum) Mẫu tiêm vào,trước khi vào đến cột phải đảm bảo được hóa khí hoàn toàn và phải đi vào cột dướidạng một dải mỏng Vì vậy, nhiệt độ ở bộ phận tiêm mẫu thường phải lớn hơn nhiệt

độ bay hơi của thành phần khó bay hơi nhất trong mẫu ít nhất là 10oC, nhưng phải nhỏhơn nhiệt độ làm phân hủy mẫu.

Đối với mẫu dạng khí, dùng hệ thống đặc biệt để đưa mẫu vào cột Nếu mẫu ởdạng rắn, cách thông thường là hòa tan mẫu bằng dung môi dễ bay hơi và bơm vào cộtnhư mẫu lỏng, nhưng hiện nay đã phát minh được bộ lấy mẫu rắn trực tiếp

Lượng mẫu bơm vào cột có thể dao động trong khoảng 0,1 - 10l đối với mẫu lỏng,0,5 – 10ml đối với mẫu khí Khi sử dụng cột mao quản chỉ cần một lượng mẫu rất nhỏ,đôi khi không thể đo được một cách chính xác Bởi vậy, trong trường hợp này người tathường dùng thêm cột chia dòng (splitter)

Ngoài ra, khi bơm mẫu vào phải chú ý sao cho mẫu không khuếch tán thành vùngrộng mà tập trung ở đầu cột ở diện tích càng nhỏ càng tốt

Bộ nạp mẫu được giữ ở nhiệt độ thích hợp theo chương trình nhiệt độ, thường caohơn nhiệt độ hóa hơi của cấu tử một ít Với các máy hiện nay, hàng loạt mẫu có thểđược nạp vào máy hoàn toàn tự động (autosampler) theo một thứ tự đã được chươngtrình hóa trước

2.1.2.3 Lò

Lò là buồng điều nhiệt, có tác dụng gia nhiệt, chuyển mẫu về trạng thái khí

Thường điều chỉnh nhiệt độ ở bộ phận bơm mẫu cao hơn một chút so với nhiệt độ bay hơi của mẫu Nhiệt độ của hệ thống được tăng dần và giữ cột ổn định nhiệt trong quá trình sắc kí

2.1.2.4 Cột sắc kí

Cột sắc kí là nơi xảy ra qua trình tách các cấu tử trong hỗn hợp

Cột tách sắc ký phải thỏa mãn các yêu cầu sau đây:

 Đảm bảo quá trình trao đổi chất giữa pha động và pha tĩnh

 Độ thấm cao, nghĩa là độ giảm áp suất qua cột nhỏ tương ứng với một tốc độkhí mang nhất định

 Tải trọng cao

 Làm việc ở nhiệt độ cao và khoảng nhiệt độ sử dụng tương đối rộng

Trong kỹ thuật phân tích sắc kí khí người ta sử dụng 2 loại cột:

 Cột nhồi

 Làm bằng kim loại

 Thường có đường kính cột lớn (2-4 mm) nhưng chiều dài ngắn (1-6m)

 Chất nhồi cột có thể là phân cực hoặc không phân cực Pha tĩnh thường đượcgắn trên bề mặt trong của ống nhờ một phản ứng hóa học Tính chất của pha tĩnh sẽquyết định tới thứ tự phân tích của các thành phần

 Cột mao quản

 Là một ống silic nung chảy bọc ngoài bằng một phim polimid chịu nhiệt đến

370 – 400oC, hoặc bằng một lớp nhôm chịu nhiệt đến 480oC

 Không có chất rắn mang

 Thành cột được chế tạo sao cho pha tĩnh có thể tráng một lớp mỏng ngay trênthành cột

 Có dạng hình xoắn

 Đường kính nhỏ nhưng chiều dài lớn

Hiện nay, người ta hay sử dụng cột mao quản thay cho cột nhồi

Việc chế tạo ra cột mao quản được xem là một phát minh quan trọng trong lĩnh vựcsắc ký Nhờ trở lực dòng khí trên loại cột này giảm đáng kể, người ta có thể tăngchiều dài cột lên rất lớn (hàng trăm mét) và do đó cột mao quản cho hiệu quả tách caohơn nhiều so với cột nhồi

Bảng 2.2: Thông số kỹ thuật của cột nhồi và cột mao quản

Hình 2.4: Cột sắc ký

(a) Cột nhồi (b) Cột mao quản

Hình 2.5: Cấu tạo các loại cột sắc ký

Có 2 loại cột mao quản chủ yếu :

 Cột mao quản phim mỏng PLOT, có đường kính khoảng 0,2 - 0,5mm; pha tĩnhđược tẩm trực tiếp lên thành trong cột tạo thành lớp phim mỏng

 Cột mao quản lớp mỏng WCOT, pha tĩnh là một lớp mỏng chất hấp phụ trựctiếp lên thành mao quản

Hình 2.6: Cấu tạo của cột mao quản lớp mỏng

Trong sắc ký khí-lỏng, pha tĩnh lỏng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nêntương tác cần thiết để các cấu tử được tách ra khỏi nhau Qui tắc chung khi lựa chọnpha tĩnh là các chất giống nhau hoà tan tốt vào nhau Ngoài ra, pha tĩnh không đượcphản ứng bất thuận nghịch với khí mang, chất mang rắn, và các cấu tử cần tách Nhiệtđộ sử dụng tối đa của pha tĩnh phải thấp hơn điểm sôi khoảng 70oC, sao cho áp suấthơi không vượt quá 1 mmHg

2.1.2.5 Chất mang rắn

Chất rắn mang trong sắc ký khí – lỏng thường là các chất trơ có bề mặt phát triểnnhưng ít lỗ xốp để không xảy ra hiện tượng hấp phụ trên bề mặt Chất mang thường

dùng là diatomite Để tách các chất có hoạt tính mạnh, có thể dùng teflon làm chấtmang Đôi khi chất mang còn có thể làm từ bột thủy tinh ở dạng hạt hình cầu rất mịn.Trong cột mao quản, thành mao quản đóng vai trò chất mang (pha tĩnh được chotrực tiếp lên thành mao quản).

Chất mang rắn phải có những đặc điểm sau:

 Trơ, không phản ứng với pha tĩnh

 Có độ bền cơ học, không bị nát vụn khi nhồi vào cột

 Có độ bền nhiệt

 Có kích thước đồng đều và có diện tích bề mặt lớn (1-20m2/g)

Hiện nay có rất nhiều loại pha tĩnh được sử dụng trong sắc ký khí - lỏng, tuy nhiêncó thể chia theo nhiều nhóm có tính phân cực của phân tử khác nhau:

 Nhóm rất phân cực: nước, glycol, glycerin,…

 Nhóm phân cực: alcol mạch thẳng, acid béo hữu cơ, phenol,

 Nhóm phân cực vừa phải: ete, ankanal, ester, amin bậc 3,

 Nhóm ít phân cực: hydrocacbon thơm, anken,

 Nhóm không phân cực: ankan, sulfua,

2.1.2.7 Đầu dò (detector)

Có rất nhiều loại detector được sử dụng trong phân tích sắc kí khí Tùy vào đốitượng phân tích mà ta chọn loại detector sử dụng cho phù hợp

Trong sắc ký, một đầu dò lý tưởng cần có các đặc điểm sau:

 Phải có khả năng phát hiện chất cần phân tích ngay khi nó ra khỏi cột

 Đủ nhạy để có thể phát hiện cả khi chất phân tích có hàm lượng rất nhỏ

 Phát hiện phải đáp ứng với sự thay đổi nồng độ để có thể ghi được hết các mũivà các mũi không bị biến dạng, độ đáp ứng không phụ thuộc tốc độ dòng

 Đáp ứng tuyến tính trên một khoảng nồng độ rộng

 Đáp ứng giống nhau cho mọi loại hóa chất

 Ổn định và chính xác, đường nền ít nhiễu, không trôi

 Nhiệt độ sử dụng lên đến 400oC

 Không hủy mẫu

 Dễ sử dụng.

Một số loại đầu dò phổ biến:

 Detector dẫn nhiệt (TCD)

TCD cấu tạo dựa trên các điện trở làm bằng kim loại dẫn nhiệt rất tốt : Au,Vonfram, Pt Khi dòng khí mang đi qua nó sẽ làm giảm nhiệt độ của điện trở Mứcđộ làm giảm nhiệt độ sẽ thay đổi sự có mặt của các cấu tử phân tích

TCD áp dụng cho mọi đối tượng phân tích nhưng độ nhạy không cao Nó chỉ cókhả năng phát hiện mẫu có nồng độ > 5g, thời gian phân tích lâu hơn

Hình 2.6: Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của TCD

 Detector ion hoá ngọn lửa (FID):

Đây là một đầu dó có độ nhạy cao, độ tuyến tính tương đối rộng, khá nhạy nếuchất hữu cơ chứa nhiều CH

Hình 2.7: Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của FID

Nguyên lý hoạt động của đầu dò này là sẽ đốt cháy những chất ra khỏi cột phântích bằng ngọn lửa có khí hydro đang cháy trong môi trường có không khí Khi mộtchất hữu cơ bị đốt cháy dưới tác dụng ngọn lửa tạo ra bởi sự đốt cháy hydro, có sự tạothành các gốc CHn*, OH*, O2* ở biên ngọn lửa Các gốc tự do phản ứng sinh ra CHO*:

C* + OH*  CHO* + eTín hiệu ghi nhận dựa trên ion (CHO*) sinh ra Ion sinh ra tạo dòng điện, đượckhuếch đại và biến đổi thành mũi sắc ký

-Số lượng ion tạo thành phụ thuộc vào các yếu tố sau:

 Tỷ lệ thành phần hydro/ không khí

 Nhiệt độ ngọn lửa

 Cấu trúc của các phần tử mẫu cần xác định

Đặc điểm của FID:

 Aùp dụng cho mọi đối tượng phân tích

 Độ nhạy cao gấp 100 -1000 lần TCD

 Nhược điểm: phải sử dụng thêm hệ thống khí đốt Không được dùng cho cácmẫu có chứa các khí sau: SO2, CO2, hơi H2O, NxOy

 Detector bắt điện tử (ECD):

Hình 2.8: Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của ECD

Nguyên tắc hoạt động của ECD dựa trên đặc tính của các chất có khả năng bắtđiện tử tự do trong pha khí

 Đầu tiên, chùm tia  do 63Ni tạo ra ion hóa các phân tử khí mang tạo thành cácion dương phân tử khí mang và các điện tử tự do sơ cấp So với các điện tử của chùmtia  thì các điện tử tự do này chậm hơn hẳn Chúng được gia tốc nhờ điện trường vàchuyển dịch về anode tạo ra dòng điện nền của detector

 Các nguyên tử hoặc phân tử của các chất sau khi rời khỏi cột tách được đưathẳng vào buồng ion cùng với khí mang Tùy theo ái lực điện tử của các phân tử này,các điện tử tự do sơ cấp nói trên sẽ bị các phân tử đó bắt giữ và tạo ra các ion âm Cácion âm tạo ra sẽ kết hợp với các ion dương của phân tử khí mang để tạo thành cácphân tử trung hòa

 Như vậy, do khả năng bắt điện tử của các chất cần phân tích, điện tử bị lấy mấtkhỏi hệ và dòng điện nền bị giảm đi so với lúc chỉ có khí mang tinh khiết đi quadetector Mức độ suy giảm dòng điện nền trong lúc có chất đi qua được thể hiện bằngpeak sắc kí của chất đó

Đầu dò này rất nhạy đối với các hợp chất có chứa các nhóm chức hoặc các đa liênkết, đặc biệt các phân tử có chứa các nguyên tử halogen.

 Detectơ quang phổ ngọn lửa (FPD):

Nguyên tắc: ngọn lửa hydro được tạo ra bằng dòng không khí trộn lẫn với hỗn hợphydro – khí mang Khí mẫu cuốn theo khí mang, đốt cháy bằng ngọn lửa hydro trongống phát ra ánh sáng ở một bước sóng bất kì Bộ lọc cản chỉ cho ánh sáng có độ dàisóng đặc thù đi qua

Để đáp ứng khả năng phân tích định tính trong sắc kí khí, cần phải đảm bảo sự ổnđịnh đủ lớn các thông số của detector như nhiệt độ detector, tỷ lệ giữa khí đốt và khímang…

FPD tỏ ra rất hữu hiệu trong việc phân tích dược phẩm, dư lượng các hợp chấtcarbamat và phosphat, các hợp chất có chứa N và P

Hình 2.9: Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của FPD

2.1.2.8 Máy ghi

Máy ghi là nơi nhận tín hiệu từ đầu dò, xử lý số liệu chuyển thành dạng đồ thị.Trên đồ thị có peak, mỗi peak được xác định bằng thời gian lưu

5 Ở các máy hiện đại, thay vì chuyển sang bộ ghi, tín hiệu sẽ được chuyển sang tíchphân kế và máy tính Tại đây, các tín hiệu được xử lý và chuyển sang bộ phận in kếtquả 6.

 Trên sắc đồ nhận được ở bộ phận in kết quả 6 ta thu được các tín hiệu ứng vớicác cấu tử gọi là peak với thời gian lưu tR của peak là đại lượng dùng để định tính, còndiện tích của peak được sử dụng để định lượng

Hình 2.11: Quy trình sắc kí khí

Hình 2.12: Hình dạng của sắc kí đồ

t

tR(A) tR(B)

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả sắc kí [2,17]

2.1.4.1 Tốc độ dòng khí mang

Các cấu tử mẫu được khí mang cuốn qua cột sắc kí Do đó, tốc độ di chuyển của các cấu tử sẽ phụ thuộc tốc độ của khí mang và sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến độ đối xứng của mũi sắc kí

Trong sắc kí, có hiện tượng khuếch tán các cấu tử dọc theo cột và khuếch tán vòngvèo theo hình dạng chất mang, đồng thời có sự phân bố của các cấu tử trong pha tĩnh lỏng Do đó có cân bằng phân bố của các cấu tử giữa pha động và pha tĩnh

Sự phân bố của mẫu giữa pha động và pha tĩnh xác định bởi phương trình Henry :

Q u

Vl,Vk: thể tích pha tĩnh và thể tích tự do của cột (ml)

Q : Lưu lượng khí mang (ml/s)Vận tốc dịch chuyển của cấu tử tỉ lệ thuận với vận tốc của khí mang và tỉ lệ nghịchvới K Do đó, hai cấu tử có hệ số phân bố khác nhau sẽ chuyển động với tốc độ khác nhau và tách rời nhau dễ dàng khi ra khỏi cột

Theo phương trình Henry: Cl= KCk

 K là hằng số thì mũi sắc kí có dạng đối xứng

 K giảm khi nồng độ tăng: làm u tăng đột ngột, mũi có dạng dốc hơn

 K tăng theo nồng độ làm u giảm đột ngột, mũi có dạng thoải hơn

2.1.4.2 Chiều cao đĩa lý thuyết:

Do các cân bằng phân bố lần lượt được thiết lập trong cột sắc kí nên có thể xem cột được chia làm nhiều vùng nhỏ, mỗi vùng tương đương với một mâm trong cột chưng cất phân đoạn, được gọi là mâm lý thuyết Khả năng tách càng lớn khi số đĩa lýthuyết càng nhỏ

Chiều cao đĩa lý thuyết tính theo công thức của Van Deemter như sau:

HETP=

l

f k

D K n

u d K u

D

2)'1(

'82



Trong đó:

HETP: chiều cao đĩa lý thuyết

 : hệ số biểu diễn sự không đồng đều của cột

dp : đường kính hạt rắn mang

 : hệ số liên hệ đến sự khuếch tán vòng của khí mang

Dk,Dl : hệ số khuếch tán phân tử của cấu tử khảo sát trong pha động và pha tĩnh

df : bề dày pha tĩnh lỏng bao ngoài chất rắn mang

u : vận tốc dòng khí mangK’ =K*F1/F2 với F1,F2 là thể tích pha tĩnh và động trong cộtHiệu suất tách càng lớn khi số đĩa càng lớn hay H càng nhỏ Để giảm H, ta có thể thực hiện các giải pháp:

 Giảm A bằng cách giảm kích thước hạt, nhưng theo thực nghiệm thì nếu dp< 0,1 mm thì không còn khả năng làm cho cột đồng đều nữa, do đó làm hệ số tăng và làm A tăng

 Giảm B bằng cách giảm Dk Do đó phải dùng khí mang có tỉ khối lớn để giảm sự khuếch tán của cấu tử vào tướng động Tuy nhiên nếu tỉ khối quá lớn thì độ dẫn nhiệt kém làm giảm độ nhạy của máy Thường ít khi giảm B

 Giảm C : hệ số này chứa nhiều thông số do sự chuyển đổi vật chất và những biến đổi của nó trong cột sắc kí Có thể giảm C bằng cách:

 Tăng K’: tăng Fl và giảm Fk

 Giảm df : giảm bề dày pha tĩnh, nhưng chỉ có thể giảm đến một giá trị giới hạn nào đó thôi

2.2 CÁC NGUYÊN LÝ CƠ BẢN TÁCH CẤU TỬ HƯƠNG TRƯỚC KHI VÀO SẮC KÍ KHÍ

Hầu hết các cấu tử hương được tách ra dựa vào khả năng hòa tan chọn lọc hoặc độ bay hơi của nó Các cấu tử hương nếu dễ bay hơi thì hiển nhiên là độ bay hơi sẽ được sử dụng như là nguyên tắc cơ bản để tách chúng từ thực phẩm Mặt khác, các cấu tử hương có xu hướng hòa tan trong các dung môi hữu cơ hơn là trong nước, và chính đặc điểm này được sử dụng để thực hiện các quá trình tách bằng trích ly [23,57]

2.2.1 Tách dựa vào khả năng hòa tan [23]

Như đã đề cập, các cấu tử hương có xu hướng ưa béo, dễ tan trong các dung môi

hữu cơ Bảng 2.1 thể hiện khả năng tan trong các dung môi hữu cơ của các cấu tử

hương, được thể hiện qua giá trị Log P (log P là logarit của nồng độ phân bố của cấu tử trong dầu:nước, được thực hiện cụ thể với hệ octanol: nước)

Bảng 2.1: Sự phân bố của các cấu tử hương qua Log P và kow

Tên chất Log P K ow Tên chất Log P K ow

0,050,722,813,093,805,626,306,767,248,3110,7011,7018,60

1-methyl pyrrolePhenol

HexanalDimethyl trisulfideBenzothiazol1-octen-3one4-ethyl guaiacol1-pentanethiolEugenol2,4-decandienalAnethol

Etel decanoatLimonen

1,431,511,801,872,172,372,382,672,733,333,394,794,83

26,9032,4063,1074,10148,00234,00240,00468,00537,002138,002455,006465,006761,00

Qua Bảng 2.1, ta thấy rất nhiều các cấu tử hương phân bố trong dầu nhiều hơn hẳn

trong nước Vì vậy, phương pháp sử dụng dung môi để trích ly cấu tử hương từ thực phẩm là rất hiệu quả và là giai đoạn chuẩn bị tốt cho các phần phân tích tiếp theo.Nhược điểm của phương pháp:

 Các cấu tử hương khác nhau thì sẽ có hệ số phân bố khác nhau, do đó chúng sẽ được trích ly với các tỉ lệ trích khác nhau Dễ thấy rằng các cấu tử tan trong nước nhiều hơn như diacethyl thì sẽ rất khó trích còn các chất như eugenol thì trích ly rất hiệu quả, ví dụ người ta tính tỉ lệ diacethyl và eugenol còn lại trong pha ưa nước sau khi sử dụng 100mL dung môi hữu cơ trích 1L dung dịch ban đầu thì kết quả thu được tương ứng là 95,5% diacethyl và 4,1% eugenol còn lại trong pha ưa nước

 Phương pháp sử dụng các dung môi hữu cơ để trích ly, vì vậy dung môi cũng trích ly cả lipid trong thực phẩm, gồm tryglyceride, phospholipid, sáp, các chất tạo nhũ, các vitamin tan trong dầu Lipid sẽ làm giảm hiệu quả của mục đích tách cấu tử hương (là tăng nồng độ các cấu tử) cũng như gây khó khăn cho công việc sắc kísau này

Tuy nhiên, với các thực phẩm ít lipid (rau trái, hầu hết các thức uống) thì đây là một phương pháp có hiệu quả cao cho việc chuẩn bị mẫu trước khi đi vào sắc kí

Phương pháp trích ly bằng dung môi đơn giản nhất là sử dụng phễu trích ly Và thường thì người ta thực hiện trích nhiều cấp để tiết kiệm thể tích dung môi sử dụng.Hiệu quả trích ly được thể hiện qua biểu thức:

Phần không được trích = n

w o ow

w

V V k

V

) (

Trong đó:

Vw : thể tích của pha ưa nước

Vo : thể tích của dung môi trích ly sử dụng

Kow: hệ số phân bố

N : số lần trích lyBiểu thức trên cho thấy n càng lớn thì kết quả thu được của phần không được trích sẽ giảm rất nhanh Cùng ví dụ về diaceyl và eugenol ở trên, nếu ta trích 5 lần, mỗi lần20ml dung môi thay vì trích 1 lần 100ml thì kết quả thu được như sau: với diacethyl thì

2 trường hợp cho kết quả gần như nhau, trong khi đó với eugenol thì khi trích 5 lần, kếtquả thu được là 0,017%

Như vậy, với lượng dung môi và mẫu cung cấp vừa đủ thì phương pháp trích ly nhiều cấp cho khả năng thu hồi tốt hơn nhiều so với phương pháp trích ly đơn giản

2.2.2 Tách dựa vào khả năng hấp phụ( sorptive extraction)

Polydimethylsilosane (PDMS) Tỉ lệ thu hồi cấu tử cần phân tích được tính theo công thức sau:





/ 1

/

PDMS PDMS

k

k m

m





Trong đó:

mPDMS: khối lượng của cấu tử cần phân tích trong pha trích

kPDMS: hệ số phân bố của cấu tử trong pha trích và pha ưa nước

m0 : tổng khối lượng của cấu tử trong hệ ban đầu

 : tỉ lệ pha (Vnước / Vpha chiết )Hiệu quả trích có thể dự đoán qua hệ số phân bố của cấu tử trong octanol:nước.Công thức trên cho thấy không chỉ có Log P mà tỉ lệ pha  cũng ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly của cấu tử cần phân tích Giá trị của  càng lớn thì tỉ lệ thu hồi của cấu tử cần phân tích càng lớn Với phương pháp SPME thì vấn đề lớn nhất chính là tỉ lệ pha còn thấp, với cột PDMS 100  m mà thể tích pha chỉ đạt đến 0,5  l Điều này sẽ làm cho tỉ lệ thu hồi là không cao với những cấu tử có kow <10000 Ngoài ra, tỉ lệ

pha thấp sẽ dẫn đến khả năng trích ly của các cấu tử không phân cực thay đổi rất nhiều do các phản ứng cạnh tranh giữa cột hấp phụ, pha ưa nước và chính cánh khuấy mẫu Phương pháp SBSE có bề mặt hấp phụ lớn hơn nên sẽ có hiệu quả hơn phương pháp SPME Hiệu suất trích ly theo lý thuyết sẽ đạt 100% với các cấu tử có kow >500

Theo bảng 2.1 ở trên thì rất nhiều cấu tử có hệ số phân bố thấp (<500) và chúng sẽ

thích hợp với phương pháp SBSE hơn là SPME

2.2.3 Tách dựa vào khả năng bay hơi [23]

Nói đến khả năng bay hơi của các cấu tử hương là nói đến tỉ lệ của cấu tử trong pha khí và trong thực phẩm khi đạt trạng thái cân bằng (phương pháp Static headspaceisolation) hoặc ở điều kiện không cân bằng (phương pháp Dynamic headspace

isolation) Cả hai phương pháp trên đều dựa trên cùng một nguyên lý là các cấu tử hương sẽ tồn tại một tỉ lệ hàm lượng trong pha khí và ta sẽ dựa vào hàm lượng trong pha khí để phân tích

a.Trong điều kiện cân bằng

Khối lượng cấu tử hương trong pha khí được xác định bằng hệ số phân bố (là tỉ lệ của cấu tử trong pha khí và trong thực phẩm) kgf Hệ số này xác định theo công thức:

kgf = cg/cf

cg, cf: lần lượt là nồng độ của cấu tử trong pha khí và trong mẫu thực phẩm ban đầu

Vì thực phẩm chứa rất nhiều các chất hòa tan khác nhau (đường đơn, lipid,

protein, nước, khoáng) nên việc xác định hệ số phân bố là rất phức tạp Ta có thể dự đoán nồng của của cấu tử hương trong pha khí ở điều kiện cân bằng khi coi thực phẩmlà hệ nhũ tương đơn giản dầu và nước Nồng độ của cấu tử trong pha khí có thể tính:

cg= kgc cc [(1-d ) +d kdc]Trong đó:

kgc: hệ số phân bố của cấu tử trong pha khí và pha liên tục ở điều kiện cân bằng

cc: nồng độ của cấu tử trong pha liên tục

d

 : tỉ lệ thể tích của pha phân tán

kdc: hệ số phân bố của cấu tử trong pha phân tán và pha liên tục

Công thức thức trên cho thấy với những cấu tử hương có hệ số phân bố trong pha khí thấp (khả năng hòa tan cao, hoặc áp suất hơi thấp, khối lượng phân tử lớn) thì sẽ không thích hợp với phương pháp sử dụng cân bằng khí lỏng này

Vấn đề sẽ trở nên phức tạp hơn nữa khi có sự tương tác (liên kết) giữa các cấu tử hương với các cấu tử khác trong thực phẩm Trong các trường hợp đó, rất khó dự đoán

cg Đồng thời, các cấu tử hương đều có kgc và kdc rất khác nhau, điều đó có nghĩa là mối liên hệ của các cấu tử trong thực phẩm và trong pha khí là rất phức tạp và gần như không thể dự đoán

b Tách trong điều kiện không cân bằng (nonequilibrium isolation)

Khác với điều kiện cân bằng, trong trường hợp này, tỉ lệ cấu tử hương trong phakhí sẽ thay đổi Với phương pháp này, người ta sử dụng một dòng khí đi qua mẫu thực phẩm và lôi cuốn các cấu tử hương vào trong pha khí Đây là quá trình truyền khối qua bề mặt tiếp xúc pha lỏng khí

Phương trình sau biểu thị quá trình truyền khối của cấu tử hương:

)) ( ) ( ( ))

( ) ( ( )

/ (

2 D t 1 / 2A c t c t h A c t c t dt

dm

e

i e gc D e

i e gc e

De : hệ số khuếch tán của cấu tử tự do trong nhũ tương

Agc : diện tích bề mặt tiếp xúc pha

cei(t) và ce(t) : nồng độ cấu tử trên bề mặt tiếp xúc pha và trong hệ nhũ thực phẩm

Những trở ngại chính của nguyên lý tách này là sự có mặt của nước trong mẫu thực phẩm Trong hầu hết hệ thực phẩm, các cấu tử hương thường tồn tại không quá 300 ppm, còn nước thì ngay cả các thực phẩm khô, hàm ẩm cũng trên 2% Nhiệt độ sôi cao của nước sẽ gây khó khăn cho quá trình làm tăng nồng độ và phân tích vì các cấu tử hương sẽ bị tổn thất (do nồng độ thấp và dễ bay hơi hơn nước) Chính vì vậy, hầu hết các phương pháp tách trong điều kiện không có cân bằng sẽ có sự kết hợp thêm các phương pháp loại bỏ nước khỏi thực phẩm trong quá trình tách

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT TRƯỚC KHI SẮC KÍ ĐỊNH LƯỢNG CẤU TỬ HƯƠNG TRONG DỊCH NHO SAU LÊN MEN

Các cấu tử hương luôn có thành phần và hàm lượng rất khác nhau trong các hỗn hợp khác nhau Chúng cũng rất khác nhau về các tính chất vật lý, hóa lý như độ phân cực, độ bay hơi, khả năng hòa tan Trong dịch nho sau lên men, có một lượng lớn trongđó là nước và cồn, đây là các cấu tử ái nước, phân cực Trong khi đó, pha tĩnh của GC cũng như các dung môi tách chiết đều không phân cực hay phân cực thấp.Vì vậy, trước khi phân tích sắc kí khí (GC), người ta phải tiến hành tách chiết, làm giàu các

cấu tử hương để thu được một hỗn hợp có các cấu tử có độ phân cực phù hợp với cột sắc kí

Để phân tích được hàm lượng của các cấu tử hương khác nhau một cách chính xác, người ta cần sử dụng những phương pháp, dung môi, pha tĩnh khác nhau Sau đây, em xin trình bày 5 phương pháp cơ bản và thông dụng nhất để tách chiết và làm giàu các cấu tử hương trong dịch nho sau lên men nói riêng và trong các hỗn hợp lỏng nói chung Đó là các phương pháp sau:

 Phương pháp Vi chiết pha rắn (SPME)

 Phương pháp Chưng cất và trích ly đồng thời (SDE)

 Phương pháp Chiết lỏng-lỏng (LLE)

 Phương pháp Chiết pha rắn (SPE)

 Phương pháp Chiết nhờ hấp phụ của thanh khuấy từ (SBSE)

2.3.1 Phương pháp Vi chiết pha rắn (Solidphase microextraction SPME)

-2.3.1.1 Giới thiệu [21,35,47,57]

SPME là một kĩ thuật làm tăng nồng độ các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi mà không cần sử dụng bất cứ một dung môi trích ly nào Nguyên lý tách của kĩ thuật này là do sự phân bố của các cấu tử hữu cơ giữa pha lỏng (hay pha khí) và một pha là một lớp polymer mỏng (lớp này được phủ bên ngoài của cột silicagel trong thiết bị SPME)

Kĩ thuật này được phát minh bởi hai nhà khoa học Berlardi và Pawliszyn khi hai ông tiến hành phân tích các hợp chất hóa học trong môi trường Càng về sau này, kĩ thuật trên được đánh giá là rất phù hợp để phân tích các cấu tử hương và các hợp chất dễ bay hơi

Kĩ thuật SPME có thể được sử dụng để phân tích các cấu tử rất đa dạng trong cả thể rắn, lỏng và khí Đây là kĩ thuật dựa trên nguyên lý cân bằng giữa hai pha, và để phân tích định lượng chính xác thì quá trình tách cấu tử từ pha này sang pha kia phải được điều khiển vô cùng nghiêm ngặt Mỗi cấu tử cần phân tích đều có sự khác nhau về độ phân cực, độ bay hơi, hệ số phân bố trong pha nước và pha “dầu”, thể tích trongmẫu và trong không gian headspace, tốc độ dịch chuyển khi khuấy trộn

Quá trình thực hiện kĩ thuật SPME không cần sự hỗ trợ của các dung môi hữu cơ và cũng cần không gia nhiệt mẫu nên sự hình thành các cấu tử thứ cấp không mong muốn cũng giảm đáng kể

2.3.1.2 Thiết bị SPME [10,57]

Hình 2.13 dưới đây mô tả thiết bị SPME được sản xuất bởi công ty Supelco

Ngày nay, người ta đã sản xuất các thiết bị có nguyên lý tương tự nhưng có thể tiến hành bơm mẫu tự động

Hình 2.13: Cấu tạo thiết bị SPME [57]

Thiết bị có dạng một ống tiêm (syringe) có piston gắn lò xo và một bộ phận chứa (barrel) cho phép piston dịch chuyển, thay đổi vị trí trong quá trình tách cấu tử hay khi giải hấp phụ Trong bộ phận chứa còn có một “kim tiêm” (needle) bằng thép không rỉ, và bên trong “kim tiêm” đó là một ống cũng bằng thép không rỉ được gắn

chặt với cột làm bằng silicagel Phần dưới của cột được bọc bên ngoài bằng một lớp pha tĩnh Pha tĩnh này chính là tác nhân hấp phụ để tách các cấu tử hương đi ra khỏi dung dịch ban đầu Chức năng của “kim tiêm” là để đâm xuyên qua vách ngăn giữa bộ phận chứa mẫu và bộ phận tiêm mẫu vào thiết bị GC, đồng thời nó còn dùng để bảo vệ cột silicagel không bị vỡ trong khi lưu giữ và sử dụng.

Cột SPME thường được bao bên ngoài một lớp polymer có bề dày xác định, có thể là loại không phân cực như Polydimethyl Silosane (PDMS) hay phân cực hơn như Carbowax Người ta có thể kết hợp các loại polymer với nhau (Carboxen, PDMS, carbowax, polymer của diphenylbenzen) để tạo ra các pha tĩnh có những đặc tính riêng dùng để tách các loại hợp chất dễ bay hơi đặc trưng

Trong hầu hết các phép phân tích, người ta thường sử dụng PDMS có bề dày 100

m Nếu cần thiết phải đạt trạng thái cân bằng hấp phụ sớm hơn thì người ta có thể dùng pha tĩnh PDMS có bề dày nhỏ hơn (30  m), còn bề dày 7  m thích hợp với những mẫu chứa các cấu tử có nhiệt độ bay hơi cao hoặc khi cần phải giải hấp phụ ở nhiệt độ cao trước khi vào sắc kí khí Pha tĩnh có có bề dày lớn hơn thích hợp với những hệ cần đạt cân bằng hấp phụ trong thời gian dài, nhưng những cột này sẽ nhạy hơn và hấp phụ được cả các cấu tử có khối lượng phân tử lớn

2.3.1.3 Cơ chế thực hiện quá trình tách cấu tử của SPME [35,57,65,70]

Quá trình thực hiện tách các cấu tử hương dễ bay hơi được minh họa trong hình dưới đây:

Hình 2.14: Cơ chế tách cấu tử bằng SPME [70]

Mẫu sẽ được chứa trong bộ phận chứa mẫu phù hợp Trước khi tiến hành phân tích, cột phải được làm sạch bởi vì pha tĩnh có thể hấp phụ các chất trong không khí trước đó và sẽ tạo ra các peak lạ khi sắc kí

 Nếu lấy mẫu trực tiếp, “kim tiêm” sẽ đâm xuyên qua vách ngăn và cột sẽ

bị đẩy nhô ra ngoài “kim tiêm” và đi vào dung dịch mẫu Các cấu tử hương sẽ hấp phụlên bề mặt pha tĩnh PDMS

 Nếu tách chiết mẫu bằng nguyên lý headspace (headspace là phần không gian ngay trên mẫu trong bộ phận chứa mẫu), cột chỉ nhô ra ngoài “kim tiêm” nhưng không đi vào dung dịch mà chỉ nằm trong phần không gian ngay trên mẫu Các cấu tử hương trong không gian headspace sẽ hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh

Cả 2 cách lấy mẫu sẽ hiệu quả hơn nếu bổ sung một lượng muối ăn vào dung dịch trước khi lấy mẫu Lượng muối này sẽ điều chỉnh lực ion trong dung dịch và do đó sẽ cải thiện trạng thái cân bằng hấp phụ Có thể sử dụng thêm cánh khuấy để rút ngắn thời gian đạt trạng thái cân bằng

Sau thời gian lấy mẫu thích hợp (từ 1-20 phút), cột sẽ được rút vào trong “kim tiêm” và “kim tiêm” sẽ được tháo tách rời khỏi vách ngăn và sẽ được gắn vào bộ phận bơm mẫu của thiết bị chạy sắc kí khí Các cấu tử sẽ được giải hấp phụ bằng nhiệt nhờ nhiệt cung cấp từ bộ phận tiêm mẫu và sau đó sẽ được đưa vào cột sắc kí khí

Vì SPME là kĩ thuật làm tăng nồng độ các cấu tử cần phân tích nên cần phải chỉnh tỉ lệ chia dòng ở bộ phận tiêm mẫu thấp hơn (10:1) để quá trình làm tăng nồng độ cấu tử không bị lãng phí Phương pháp không chia dòng thường sẽ đưa nhiều cấu tửcần phân tích hơn vào cột và thường áp dụng cho những phương trường hợp cần độ nhạy cao

Mỗi loại cột đều có mức độ phù hợp khác nhau đối với các cấu tử khác nhau Nhìn chung thì cột với chất mang không phân cực sẽ thu hồi tốt các cấu tử hương hơn Cột Polyacrylat sẽ nhạy khi phân tích cồn, phenol, aldehyde hơn là các ester và

hydrocacbon

Bảng 2.2: So sánh hiệu quả tách cấu tử hương trong mẫu chứa 10ppm bằng

phương pháp Headspace SPME của cột PDMS 100  m và cột Polyacrylat 85  m [57]

Cấu tử Cột PDMS Cột Polyacrylat

3,13,348,119,559

Từ bảng trên, ta thấy cột Polyacrylat tách tốt các cấu tử có nhóm chức rượu (butanol, cis-3-hexenol, linalool), benzaldehyde, các hợp chất phenol như eugenol ; trong khi đó đối với các cấu tử thuộc nhóm ester (ethyl acetat, ethyl caproat),

hydrocacbon và pyridin thì khả năng tách kém hơn

2.3.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng trong SPME [35,36,57,70]

2.3.1.4.1 Pha tĩnh

Chất mang sử dụng làm chất hấp phụ trong cột SPME bao gồm một hoặc hai loại polymer (như PDMS, PA, carboxen-PDMS, PDMS-polydivinylbenzen, carbowax- DVB) Nguyên tắc làm giàu cấu tử như đã trình bày ở trên, đó là nguyên tắc hấp phụ

Bề dày lớp chất mang PDMS thường là 7m, 30m, 100m ; PA là 85 m; carboxen-PDMS là 75m; PDMS-DVB là 65m

Yêu cầu của pha tĩnh:

 Độ phân cực của pha tĩnh phải gần với độ phân cực của cấu tử cần tách

 Pha tĩnh phải chịu được các điều kiện nhiệt độ cao, pH, muối

PDMS là một trong các pha tĩnh không phân cực chịu được các điều kiện khắc nghiệt nhất và cột PDMS có khả năng hấp phụ và giải hấp phụ nhiều lần Khi cần phân tích các cấu tử có độ phân cực thấp thì có thể sử dụng cột PA

Bề dày của pha tĩnh của các loại pha tĩnh được đưa ra như trên là do tính toán dựa vào yêu cầu về độ nhạy và tốc độ hấp phụ:

 Bề dày 100m thường được sử dụng khi cần độ nhạy cao và ít quan tâmđến thời gian,

 Bề dày 7m sử dụng khi cần thời gian ngắn và không cần quá nhạy (trường hợp nồng độ cấu tử cần phân tích đủ cao)

2.3.1.4.2 Phương pháp tách chiết