Xây dựng quy trình real time rtpcr phát hiện và phân type tác nhân gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản trên heo (prrsv)

Việc phân lập thành công virus PRRSV phụ thuộc rất nhiều vào tuổi heo bị nhiễm, điều kiện lấy mẫu, giai đoạn lấy mẫu,… Nhược điểm của phương pháp này là tiến hành khó khăn, tốn thời gian

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

… oOo……

LÊ THÙY DUYÊN

HEO (PRRSV)

CHUYÊN NGÀNH: DI TRUY ỀN

Mã s ố chuyên ngành: 60 42 70

NG ƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS.H Ồ HUỲNH THÙY DƯƠNG

L ỜI CẢM ƠN

Lu ận văn này đạt được những kết quả như ngày hôm nay là nhờ sự quan tâm, t ận tình hư ớng dẫn của rất nhiều thầy cô và bạn bè thuộc Khoa Sinh học- Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và chân thành cảm ơn PGS.TS Hồ

Hu ỳnh Thùy Dương Cô đã tạo điều kiện về mọi mặt giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này

Tôi xin chân thành c ảm ơn anh Nguyễn Tuấn Anh, cùng các anh chị thuộc công ty TNHH Công Ngh ệ Sinh Học Khoa Thương đã luôn luôn tận tình giúp đỡ,

g ợi ý hướng tiếp cận đề tài cho tôi

Xin c ảm ơn các anh chị công tác ở Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh

h ọc-Sở Khoa học công nghệ Đồng Nai và Công ty Thuốc Thú y Trung Ương - Navetco đã nhiệt tình giúp đ ỡ trong việc cung cấp mẫu cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin c ảm ơn các bạn của tôi đã cùng tôi chia sẻ những khó khăn, quan tâm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Và cu ối cùng con xin cảm ơn ba, mẹ, những người thân yêu và anh Mọi người luôn là chỗ dựa tinh thần, là nguồn động viên to lớn cho tôi vượt qua mọi khó khăn

Tp HCM, tháng 11 năm 2011

Lê Thùy Duyên

L ỜI MỞ ĐẦU

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở heo (Porcine reproductive and respiratory syndrome- PRRS) xuất hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1987 Đến nay PRRS đã lây lan trên khắp thế giới, trở thành dịch địa phương ở nhiều nước

có ngành chăn nuôi phát triển, trong đó có Việt Nam [21] Đây là hội chứng các

bệnh liên quan đến heo, do PRRSV (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) gây ra, có khả năng lây nhiễm cao Heo bị nhiễm PRRSV dễ bị

sảy thai, giảm tỉ lệ sinh sản, sinh non hoặc thai chết lưu Ngoài ra heo bị bệnh PRRS dễ mắc các bệnh kế phát như viêm phổi, tiêu chảy, thương hàn…dẫn đến

tử vong [20]

Dịch heo tai xanh lần đầu tiên xuất hiện ở Việt Nam vào tháng 3 năm

2007 Và cho đến năm 2011, năm nào cũng có dịch bệnh xảy ra, gây tâm lý hoang mang cho người dân Theo cục Thú y, trong năm 2010, qua hai đợt dịch

bệnh trên cả nước có 1.114.166 con heo mắc bệnh, trong đó số con heo tiêu hủy

là 438.699 con [7] Bên cạnh đó, thịt heo vốn là sản phẩm chăn nuôi quan trọng ở nước ta, chiếm 58% tổng GDP nông nghiệp [21] Do đó, kiểm soát dịch bệnh heo tai xanh trở thành một trong những nhiệm vụ quan trọng của ngành chăn nuôi nước ta

Một trong những nhiệm vụ quan trọng của việc kiểm soát dịch PRRS là xây

dựng các công cụ phát hiện và phân type PRRSV chính xác và nhanh chóng Do

đó, mục tiêu của luận văn đề ra là xây dựng quy trình Real time RT- PCR có khả năng đồng thời phát hiện và phân type virus PRRSV với các nội dung chính sau:

1) Thiết kế mồi và mẫu dò bắt cặp đặt hiệu, có khả năng đồng thời phát

hiện và phân type PRRSV

2) Tối ưu hóa phản ứng Real time RT-PCR

4) So sánh hiệu quả của quy trình phát hiện PRRSV với bộ kit thương

mại trên mẫu heo nuôi

Sự thành công của đề tài sẽ là tiền đề cho sự phát triển một bộ kit chẩn đoán Real time RT-PCR có khả năng đồng thời phát hiện và phân type heo mang

mầm bệnh PRRSV, cho kết quả nhanh, chính xác, góp phần phát hiện kịp thời đàn heo bị nhiễm bệnh, giảm thiệt hại đàn heo, giảm chi phí xét nghiệm Ngoài ra ứng dụng phân type PRRSV sẽ là tiền đề phục vụ cho các nghiên cứu về đặc tính gây đáp ứng miễn dịch khác nhau của các type PRRSV, góp phần theo dõi sự lưu hành của các type PRRSV, lựa chọn vaccine phòng ngừa thích hợp cho dịch bệnh PRRS ở nước ta

M ỤC LỤC

M ỤC LỤC i

DANH M ỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH M ỤC BẢNG vii

DANH M ỤC HÌNH viii

L ỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 M ột số thông tin về hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản trên heo (PRRS) 4

1.2 Tri ệu chứng bệnh 6

1.3 Tác nhân gây b ệnh 8

1.4 C ấu trúc bộ gene PRRSV 8

1.5 Cơ chế gây bệnh của PRRSV 10

1.6 M ột số đặc tính của PRRSV 11

1.7 Vaccine phòng ng ừa 12

1.8 Các phương pháp phát hiện PRRSV 13

1.8.1 D ựa trên biểu hiện lâm sàng : 13

1.8.2 Phân l ập virus (VI): 14

1.8.3 Huyết thanh học: 14

1.8.4 RT-PCR ( Reverse transcription- polymerase chain reaction ): 15

1.8.5 Real-time RT-PCR: 15

1.9 Phương pháp Real-time RT-PCR 16

1.10 Tình hình nghiên c ứu và các phương pháp phát hiện PRRSV ở Việt Nam 20 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 22

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 23

2.2 V ật liệu 23

2.2.1 Mẫu sử dụng trong nghiên cứu 23

2.2.2 Các cặp mồi và mẫu dò sử dụng trong đề tài 23

2.2.3 Hóa chất 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 29

2.3.1 Phương pháp tách chiết RNA bằng Phenol-Chloroform 29

2.3.2 Phương pháp tách chiết RNA theo Boom [10], [18],[26] 30

2.3.3 Phương pháp reverse transcriptase (RT) 31

2.3.4 Phương pháp thiết kế cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu cho PRRSV 32

2.3.4.1 Đánh giá hiệu quả hoạt động của mồi và mẫu dò phát hiện và phân type PRRSV 34

2.3.4.2 Đánh giá hiệu quả hoạt động của mồi và mẫu dò chứng nội 35

2.3.5 Phản ứng multiplex Real time RT-PCR: 35

2.3.6 Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR 35

2.3.7 Xác định ngưỡng phát hiện và sự đặc hiệu của phản ứng 36

2.3.8 So sánh hiệu quả phát hiện và phân type với kit thương mại 37

2.3.9 Các bước chuẩn bị cho việc tạo kit chẩn đoán hoàn chỉnh 37

2.3.9.1 So sánh hiệu quả tách chiết RNA bằng phương pháp

Phenol-Chlorofom 37

2.3.9.2 Phương pháp tạo dòng gene làm chứng dương 38

2.1.2 Phương pháp phân tích kết quả giải trình tự bằng Blast (Basic local alignment search tool): 42

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 44

3.1 Thi ết kế mồi và mẫu dò đặc hiệu cho phát hiện và phân type PRRSV 45

3.1.1 Thiết kế mồi và mẫu dò Taqman 45

3.1.2 Đánh giá khả năng hoạt động của bộ mồi PR4 và bộ mồi PR6 46

3.1.3 Đánh giá hiệu quả hoạt động của ba bộ mồi/mẫu dò chứng nội 51

3.2 Ph ản ứng Multiplex Real time RT-PCR 53

3.3 T ối ưu hóa phản ứng Multiplex Real time RT-PCR 54

3.3.1 Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: nhiệt độ lai 55

3.3.2 Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: nồng độ MgCl 2 56

3.3.3 Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: nồng độ mồi PR6 57

3.3.4 Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: mẫu dò PR6-P1 58

3.3.5 Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: Taq DNA polymerase 59

3.4 Xác định ngưỡng phát hiện và sự đặc hiệu của quy trình 60

3.4.1 Ngưỡng phát hiện của quy trình 60

3.4.2 Sự đặc hiệu của phản ứng trên các vi sinh vật khác 61

3.4.3 Đánh giá khả năng phát hiện và phân type của phản ứng multiplex Real Time RT-PCR trên m ẫu có sự hiện diện đồng thời PRRSV type NA và PRRSV type EU 63

3.5 So sánh hi ệu quả phát hiện và phân type PRRSV với kit thương mại 65

3.6 Các bước chuẩn bị khởi đầu cho việc tạo kit chẩn đoán hoàn chỉnh 66

3.6.1 So sánh hiệu quả tách chiết RNA của phương pháp tủa Phenol-Chloroform và phương pháp Boom 66

3.6.2 Tạo dòng gene làm chứng dương 68

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 73

4.1 K ẾT LUẬN 74

4.2 ĐỀ NGHỊ 76

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 77

PH Ụ LỤC 84

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 M ột số thông tin về hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản trên heo (PRRS)

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (Porcine reproductive and respiratory syndrome-PRRS) được mô tả lần đầu tiên ở Mỹ tại vùng bắc của bang California, bang Iowa và Minnesota vào năm 1987 Rất nhanh sau đó, năm 1988

bệnh lây sang Canada Ở Châu Âu nhiều vùng cũng ghi nhận dịch bệnh này như Đức (năm 1990), Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991), Pháp (1992) Năm

1998, bệnh được phát hiện ở các nước châu Á như: Hàn Quốc, Nhật Bản [39] Từ

năm 2006 đến năm 2010, khu vực các nước Châu Á như Trung Quốc, Việt Nam, Philippines và Thái Lan, Lào, Campuchia liên tiếp bị các đợt dịch PRRS hoành hành với chủng PRRSV độc lực cao [22] Cho đến nay PRRS đã tr ở thành dịch

bệnh lưu hành ở nhiều châu lục trên thế giới, là một trong những bệnh gây tổn

thất nặng nề về kinh tế cho ngành chăn nuôi ở nhiều quốc gia Hình 1.1 cho thấy tình hình dịch bệnh PRRS ở khu vực Châu Á được báo cáo ở Tồ chức Thú y Thế

giới (OIE) vào năm 2007

Thời gian đầu, do chưa xác định được nguyên nhân gây bệnh nên bệnh PRRS có nhiều tên gọi như bệnh bí ẩn ở heo (Mistery Disease of Swine-MDS),

hội chứng hô hấp và sẩy thai ở heo (Porcine endemic abortion and respiratory syndrome – PEARS), và ở Việt Nam PRRS thường được gọi là bệnh heo tai xanh (Blue Ear Disease-BED) [16] Năm 1992, Hội nghị quốc tế về hội chứng này được tổ chức ở Minnesota (Mỹ), tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã thống nhất tên

gọi là Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở heo

Hình 1 1: Các đỉnh dịch PRRS bùng phát ở Châu Á được báo cáo ở OIE năm

dịch bệnh liên tục hoành hành và cho đến nay chưa có một loại vaccine nào sử

dụng ở Việt Nam có thể ngăn ngừa hiệu quả bệnh tai xanh Năm 2010 là năm

dịch tai xanh diễn biến phức tạp nhất Không kể đợt dịch thứ nhất với 16 tỉnh thành phía Bắc, thì đợt dịch thứ 2 năm 2010 diễn ra trên 36 tỉnh, thành phố miền Trung và Nam gồm: Nghệ An, Sóc Trăng, Quảng Trị, Tiền Giang, Lào Cai, Long

An, Bình Dưng, Bạc Liêu, Quảng Nam, Đồng Nai, Bình Phư ớc, Đà Nẵng, Vĩnh Long, Khánh Hòa, Đăklăk và H ậu Giang Theo báo cáo tổng kết từ cục Thú ý,

có 717.830 con heo mắc bệnh, trong đó số chết, tiêu hủy là 413.540 con [54]

Dịch heo tai xanh không chỉ gây ảnh hưởng đến ngành chăn nuôi heo trong nước mà còn kéo theo nhiều hệ lụy khác như ô nhiễm môi trường, khan hiếm nguồn heo giống, mất thời gian phục hồi ngành chăn nuôi, giá thịt tăng trong khi nguồn cung không cung ứng đủ nhu cầu thị trường dẫn đến nhập siêu các sản

phẩm thịt Theo thống kê của cơ quan Thú y vùng 6, trong 6 tháng đầu năm

2011, lượng thịt heo nhập về Việt Nam là 39.180 tấn, trong đó, chỉ riêng tháng 7 năm 2011 lượng heo nhập khẩu đạt 1.300 tấn, gần 50% tổng lượng nhập khẩu trong 6 tháng đầu năm Dự đoán trong sáu tháng cuối năm lượng thịt heo nhập

khẩu vẫn tiếp tục gia tăng [56]

1.2 Tri ệu chứng bệnh

Triệu chứng bệnh của heo bị nhiễm PRRSV thường khác nhau tùy theo

chủng virus, đặc điểm giống heo, lứa tuổi, trạng thái miễn dịch của heo và các nhân tố kiểm soát khác Thời kì ủ bệnh có thể từ 3-37 ngày [21] Các triệu chứng

của bệnh PRRS gồm:

- Các triệu chứng về da: da thường có sự đổi màu từ ửng đỏ tới xanh, đặc biệt là vùng da tai và vùng âm hộ (hình 1.1) Có dấu hiệu phù nề

ở dưới da, mí mắt, chi sau, mõm…

- Các triệu chứng về sinh sản ở heo nái: hôn mê, lờ đờ, giảm ham muốn tình dục, sẩy thai, sinh non hoặc thai chết lưu Heo con mới sinh

thường yếu Các bệnh về hô hấp cũng thường xảy ra đối với heo nái

bị nhiễm bệnh

- Các triệu chứng về hô hấp ở heo con và heo trưởng thành như khó

thở, suy hô hấp Các triệu chứng về hô hấp thường trở nên nghiêm

trọng hơn khi nhiễm các bệnh kế phát do các vi sinh vật khác gây ra

như Pasteurella multocida, Porcine Circovirus Type 2 (PCV2), Mycoplasma hyopneumonia, Streptococcus suis, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, swine influenza virus… Tỉ lệ heo

chết thường cao ở heo con (30-50 %) và thấp hơn ở heo trưởng thành (4-20%) [40]

- Đối với heo cai sữa và heo trưởng thành, các triệu chứng của bệnh bao gồm: biếng ăn, hôn mê, lờ đờ, sung huyết, lông thô ráp, sụt cân,

sốt cao…

Hình 1 2: D ấu hiệu lâm sàng nhận biết bệnh PRRS A: Heo có biểu hiện tai màu

tím xanh; B: Heo b ệnh có biểu hiện sốt đỏ toàn thân

Tuy nhiên các dấu hiệu lâm sàng nêu trên không hoàn toàn là đặc trưng cho bệnh PRRS, mà còn xuất hiện ở các bệnh lây nhiễm do các tác nhân khác gây nên Điều này dễ gây nhầm lẫn trong chẩn đoán bệnh nếu chỉ dựa vào biểu

hiện lâm sàng Các bệnh có dấu hiệu lâm sàng tương tự với PRRS được liệt kê trongbảng 1.2 [39]

B ảng 1 1: Bảng liệt kê các bệnh có dấu hiệu lâm sàng tương tự với PRRSV

B ệnh liên quan đến sinh sản B ệnh liên quan đến hô hấp

Sốt heo Châu Phi Viêm phổi

Bệnh trùng xoắn móc câu Nhiễm Haemophilus parasuis

Porcine parvovirus Haemagglutinating encephalomyelitis virus Porcine enterovirus Porcine respiratory coronavirus

Haemagglutinating

encephalomyelitis virus

Syncitial pneumonia and myocarditis

Bệnh Aujeszky Porcine circovirus-associated disease

1.3 Tác nhân gây b ệnh

Virus gây bệnh PRRS (gọi tắt là PRRSV) được xác định và phân lập vào năm 1991 ở viện Thú y Lelystad (Hà Lan) và được phân lớp vào họ

Arteriviridae, gi ống Arterivirus, bộ Nidovirales PRRSV là một loại virus RNA

mạch đơn, không màng bao Kích thước bộ gene khoảng 15 kb, bao gồm 8 khung đọc mã (ORF) Hai chủng chính được xác định gồm: (1) geneotype 1 với prototype Lelystad (thường được gọi là chủng Châu Âu-EU) và geneotype 2 với prototype VR2332 (chủng Bắc Mỹ-NA) Gần đây, một biến thể của geneotype 2

có độc lực cao hơn đã gây nhi ều tổn thất ở châu Á [31], [46] Mặc dù đôi khi triệu chứng gây bệnh trên hai type PRRSV có nhiều nét chung, nhưng theo các nghiên cứu cho thấy hai type có sự khác biệt lớn về bộ gene (55-80% mức độ tương đồng), đặc tính gây đáp ứng miễn dịch cũng như độc lực virus [41] Điều này có nghĩa là vaccine đư ợc làm từ một chủng PRRSV sẽ không thể bảo vệ hoàn toàn cho đàn heo

1.4 C ấu trúc bộ gene PRRSV

PRRSV là một loại virus RNA mạch đơn, gồm có 8 khung đọc mở (ORF)

Trong đó ORF1a và ORF1b mã hóa cho các protein có hoạt tính polymerase và replicase Các ORF2 đến ORF7 mã hóa cho các protein cấu trúc của virus [43]

Sơ đồ cấu trúc bộ gene PRRSV được thể hiện trong hình 1.3

Hình 1 3: C ấu trúc bộ gene PRRSV

Chức năng cụ thể của từng ORF của PRRSV được thể hiện trong bảng 1.3

B ảng 1 2: Chức năng của các ORF của PRRSV [15]

Thông qua phân tích các trình tự PRRSV từ các vùng phân lập khác nhau, người ta thấy rằng chỉ có khoảng 55-80% sự tương đồng về trình tự gene giữa hai PRRSV type NA và type EU Cụ thể là sự tương đồng trình tự giữa các ORF như sau: 57-59 % (ORF7), 70-81 % (ORF6), 51-59% (ORF5), 68% (ORF4), 58% (ORF3), 63% (ORF3) Thậm chí, ngay trong cùng một type, sự biến dị di truyền cao đã được báo cáo ở nhiều công trình trên thế giới, đặc biệt là chủng NA [29] Chính sự biến động di truyền khá lớn là một trong những nguyên nhân dẫn đến

sự khác biệt và đa dạng về tính gây đáp ứng miễn dịch của PRRSV Điều này càng gây khó khăn cho việc sản xuất vaccine phòng bệnh

1.5 Cơ chế gây bệnh của PRRSV

Đến nay cơ chế gây bệnh của PRRSV vẫn chưa được hiểu rõ ràng Các nghiên cứu chỉ thấy rằng virus PRRSV có ái lực đặc biệt với đại thực bào, đặc

biệt là đại thực bào phổi, gây tổn thương đáp ứng miễn dịch tế bào, phá hủy các

bề mặt màng nhày [13],[40]… Những virus này sẽ sao chép bên trong đại thực bào phổi và các mô lympho để tạo ra nhiều virus mới, đồng thời phá vỡ các tế bào đóng vai trò gây đáp ứng miễn dịch này Các virus mới này tồn tại lâu dài ở đại thực bào phổi và đại thực bào amiđan Kháng nguyên PRRSV có thể được phát hiện ở các đại thực bào của các mô khác nhau, cũng như các tế bào khác bao

gồm mô cơ Hình 1.4 cho thấy sự thay đổi hình thái của đại thực bào trước và sau khi nhiễm PRRSV

Một khi hơn 40% đại thực bào của cơ thể bị phá hủy, PRRSV hầu như đã

loại bỏ hệ thống bảo vệ của cơ thể Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho những

vi khuẩn và virus gây hại khác gây bệnh Điển hình của trường hợp này là sự gia tăng nghiêm trọng viêm phổi khi bị nhiễm virus PRRSV Ngoài ra heo mắc bệnh PRRS thường bị bội nhiễm với các bệnh như dịch tả heo, tụ huyết trùng, phó

thương hàn, bệnh do xoắn khuẩn Leptospira spp, bệnh do Steptococcus spp,

Mycoplasma spp, E.coli Các bệnh kế phát này mới là nguyên nhân chính gây

chết nhiều ở heo mắc bệnh PRRS [46]

Hình 1 4 : Hình thái c ủa đại thực bào khi bị nhiễm PRRSV A: đại thực bào bình

thường; B: đại thực bào bị phá hủy

cũng dễ dàng bị bất hoạt Do đó, virus này không tồn tại trong môi trường hay các điều kiện khô ráo [20]

Vì vậy yếu tố then chốt để kiểm soát và ngăn chặn dịch tai xanh đó là phát hiện sớm đàn heo bệnh, các trại heo nhiễm bệnh để có biện pháp ngăn chặn, cách ly và tiêu hủy kịp thời, tránh bùng phát thành dịch bệnh

1.7 Vaccine phòng ng ừa

Mặc dù các hiểu biết về đáp ứng miễn dịch đối với PRRSV vẫn còn chưa

rõ ràng, nhưng một vài vaccine nhược độc và vaccine chết được làm từ chủng

EU và NA đã được thương mại hóa ở nhiều nước Ở nước ta, hiện nay có 5 loại vaccine được cấp phép lưu hành [57]:

- Vaccine nhược độc BSL-PS100 (Bestar, Singapore) và Amervac® PRRS (Hipra, Tây Ban Nha) được đăng kí vào năm 2000 sau khi đàn heo trong nước phát hiện dương tính với virus gây tai xanh vào cuối năm 1997

- Vaccine vô hoạt chủng NVDC-JXA1 (Trung Quốc) và vaccine nhược độc Ingelvac PRRS MLV (Boehringer Ingelheim VET, Đức) được đăng kí vào năm

2007 và 2008 khi dịch tai xanh bùng lên dữ dội

- Vaccine nhược độc JXA1-R (Trung Quốc) đượ c cấp phép lưu hành vào tháng 9 năm 2010 khi đỉnh dịch heo tai xanh bùng phát trên cả nước

Hiệu quả của các loại vaccine nêu trên chưa thật sự tốt Sau khi tiêm heo

vẫn có thể mắc bệnh tai xanh, nên Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn không chính thức khuyến cáo nông dân sử dụng

Do có sự khác biệt lớn trong cấu trúc kháng nguyên của hai type PRRSV, các nghiên cứu sâu hơn cho thấy dường như vaccine type NA chỉ cho hiệu quả

tốt trên vùng thực địa nhiễm type NA và ít hiệu quả hơn trên vùng thực địa nhiễm type EU [43] Hơn nữa, việc sử dụng các vaccine nhược độc tiềm ẩn nguy

cơ lan truyền virus PRRSV từ heo được tiêm vaccine (do sự tái hoạt hóa của virus) sang heo chưa được tiêm phòng thông qua tinh dịch và nước dãi Lúc này

sẽ không thể phân biệt kháng thể có nguồn gốc vaccine với kháng thể có nguồn

gốc từ virus thực địa [39]

1.8 Các phương pháp phát hiện PRRSV

1.8.1 D ựa trên biểu hiện lâm sàng :

Chủ yếu phát hiện heo bị bệnh dựa vào các biểu hiện lâm sàng như: các

vấn đề về sinh sản ở heo nái (tỉ lệ thụ thai thấp, sảy thai ở giai đoạn cuối, tỉ lệ heo sinh non cao, thai chết lưu, heo con yếu hoặc chết (hình 1.5)….), các bệnh về hô

hấp (khó thở, ho…), các dấu hiệu lâm sàng như sốt cao, bỏ ăn, da mẩn đỏ, xảy ra

ở bất kì lứa tuổi heo [32] Theo hướng dẫn của Cục Thú Y nước ta, để phát hiện heo bệnh tai xanh, phải thường xuyên kiểm tra sức khỏe đàn heo nuôi và sử dụng định nghĩa ca bệnh lâm sàng như sau: Heo sốt cao trên 400

Hình 1 5: S ảy thai, thai chết lưu ở các giai đoạn thai kì khác nhau của bệnh

PRRS

Tuy nhiên, phương pháp này nhận diện bệnh không rõ ràng vì các biểu

ện bệnh biến động tùy thuộc chủng virus, tình trạng đàn heo, các yếu tố môi

trường, cũng như việc dễ nhầm lẫn với các bệnh do các tác nhân virus và vi

khuẩn khác gây ra Bên cạnh đó, thời gian để phát hiện heo nhiễm bệnh lâu, chỉ phát hiện khi heo đã phát bệnh nên gây khó khăn cho các biện pháp cách ly và phòng ngừa Tuy nhiên hiện nay, đây lại là phương pháp phát hiện phổ biến nhất

ở các trại chăn nuôi cũng như các trung tâm thú y ở nước ta

1.8.2 Phân l ập virus (VI):

Phân lập virus được xem như là tiêu chuẩn vàng cho việc phát hiện PRRSV PRRSV có thể được phân lập từ mẫu huyết thanh, mô cơ quan như phổi, lách, tim, hạch bạch huyết Đại thực bào phổi hay dòng tế bào MARC-145 rất thích hợp làm hệ thống nuôi cấy virus Việc phân lập thành công virus PRRSV

phụ thuộc rất nhiều vào tuổi heo bị nhiễm, điều kiện lấy mẫu, giai đoạn lấy

mẫu,… Nhược điểm của phương pháp này là tiến hành khó khăn, tốn thời gian [39], rất khó để phân lập được PRRSV type EU vì type này thư ờng không sao chép trong tế bào dòng mà chỉ sao chép trên đại thực bào phổi heo (PAM-porcine alveolar macrophages)

1.8.3 Huy ết thanh học:

Huyết thanh học là phương pháp được ưa chuộng vì dễ thực hiện, có độ

nhạy và độ đặc hiệu tốt Kháng thể IgM có thể phát hiện trong 7 ngày sau khi lây nhiễm và kháng thể IgG có thể được phát hiện 14 ngày sau khi heo bị nhiễm Nhiều phương pháp huyết thanh dựa trên phương pháp IPMA (ImmunoPeroxidase Monolayer Assay), IFA ( Indirect Fluorescent Antibody) hay ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)….đã đư ợc công bố và thương mại hóa như kit HerdCheck-PRRS (IDEXX Laboratories Inc, USA),

Lsivet suis PRRS A/S (Laboratoire Service International, Pháp) Bất lợi của phương pháp huyết thanh là có thể cho kết quả dương tính giả Các nghiên cứu trước đó cho thấy kháng thể đặc hiệu cho PRRSV từ heo mẹ có thể được phát

hiện ở heo con trong 4 ngày sau khi sinh và biến mất trước 3 tuần tuổi (Albina et

al,1994) Mức độ kháng thể có thể giảm rất nhanh khi thiếu sự tuần hoàn virus Ngoài ra đáp ứng vaccine có thể ảnh hưởng đến kết quả cũng như khả năng phân

biệt heo bị nhiễm PRRSV với heo được tiêm ngừa vaccine

1.8.4 RT-PCR ( Reverse transcription- polymerase chain reaction ):

RT-PCR là phương pháp cải tiến của phương pháp PCR truyền thống cho phép phát hiện các RNA từ người, động vật và virus Các RNA này sẽ được phiên mã ngư ợc thành các cDNA và được nhân bản bằng các cặp mồi đặc hiệu

Sản phẩm nhân bản sẽ được phát hiện bằng điện di trên agarose

Theo khuyến cáo của Tổ chức Sức Khỏe Động vật (World Organisation for Animal Health) năm 2011, phương pháp RT-PCR cần được sử dụng trong

việc kiểm soát tính sạch bệnh ở tinh dịch sử dụng trong thụ tinh nhân tạo và theo dõi các đàn heo nhi ễm khi cần tái lập tình trạng sạch bệnh [40] Phương pháp RT-PCR đơn giản, ít tốn kém Kỹ thuật RT-PCR nhạy hơn phân lập virus, có thể phát hiện 10 phần tử virus/ml tinh dịch và hoàn toàn đặc hiệu Tuy nhiên phương pháp này cũng có các m ặt hạn chế như có thể cho kết quả dương tính giả, tốn

thời gian do các bước sau PCR, dễ gây nhiễm chéo Ngoài ra do đặc tính khác

biệt lớn về trình tự gene giữa hai type PRRSV cũng gây khó khăn cho việc thiết

kế cặp mồi đặc hiệu phát hiện PRRSV

1.8.5 Real-time RT-PCR:

Real-time RT-PCR được xem là phương pháp khắc phục nhược điểm của phương pháp RT-PCR do ưu điểm nhanh, nhạy, đặc hiệu, giảm các bước sau PCR, từ đó giảm nguy cơ nhiễm Hiện nay kĩ thuật Real-time RT-PCR ngày càng được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh trên người, động vật

và thực vật Nhiều công trình đã xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện PRRSV sử dụng mẫu dò Taqman hoặc SYBR đã đư ợc công bố [9],[16],[45] Ngoài ra, nhiều nước cũng đã thương mại hóa các bộ kit chẩn đoán PRRSV bằng

kĩ thuật Real-time RT-PCR như PRRSV Real Time RT-PCR kit (Shanghai ZJ

Bio-Tech Co., Ltd), Real-Time PCR PRRSV Specific Reagents (Tetracore, Inc), ADIAVET® PRRS EU/NA (Adiagene, France) [53]…

1.9 Phương pháp Real-time RT-PCR

Real time RT-PCR là phương pháp cải tiến của phương pháp RT-PCR truyền thống cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm nhân bản ngay khi phản ứng đang xảy ra mà không cần qua bước điện di gel agarose Khả năng này được

thực hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang báo hiệu

sự gia tăng lượng DNA tỷ lệ với sự gia tăng lượng dấu hiệu huỳnh quang [8], [33] Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA (Evagreen, SYBR I, SYBR II) và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc

hiệu với mồi gọi là mẫu dò (mẫu dò Taqman, molecular beacon, mẫu dò Eclipse, Amplifluor, Scorpions, LUX….) Những máy luân nhiệt đặc biệt trang bị bộ

phận phát hiện huỳnh quang được sử dụng để kiểm soát dấu hiệu huỳnh quang khi quá trình nhân bản xảy ra Dấu hiệu huỳnh quang được đo lường phản ánh lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ

Hiện nay, mẫu dò Taqman và thuốc nhuộm liên kết Evagreen, SYBR được

sử dụng phổ biến nhất Mỗi loại đều có những ưu điểm và mặt hạn chế của nó

a Thu ốc nhuộm liên kết DNA:

Thuốc nhuộm liên kết DNA được sử dụng chủ yếu là SYBR và Evagreen cho phép liên kết không đặc hiệu với DNA mạch đôi (hình 1.6) Các chất này chỉ phóng thích một lượng nhỏ dấu hiệu huỳnh quang khi nó ở dạng tự do trong dung

dịch, nhưng dấu hiệu huỳnh quang sẽ tăng đến 1000 lần khi nó liên kết DNA

mạch đôi Như vậy, dấu hiệu huỳnh quang tổng từ phản ứng sẽ tỷ lệ với lượng DNA mạch đôi hiện diện, và gia tăng khi trình tự mục tiêu được khuếch đại

Hình 1 6: Thu ốc nhuộm liên kết DNA trong phản ứng Real-Time PCR

Ưu điểm của việc sử dụng thuốc nhuộm liên kết DNA là thiết kế phản ứng đơn giản (chỉ cần 2 mồi, không cần thiết kế mẫu dò), kiểm tra được nhiều gene nhanh chóng mà không cần phải thiết kế các mẫu dò khác nhau (ví dụ, xem xét

hiệu quả biểu hiện gene từ nhiều gene trong một thí nghiệm microarray), chi phí ban đầu thấp (mẫu dò tốn kém hơn), và có khả năng thực hiện một phân tích melt-curve (đường cong nóng chảy) để kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng khuếch đại Tuy nhiên trở ngại lớn nhất của thuốc nhuộm liên kết DNA là chúng không đặc hiệu, nghĩa là chúng liên kết với bất kỳ DNA mạch đôi nào Kết quả

là, sự hiện diện của các sản phẩm không đặc hiệu trong phản ứng Real-Time PCR có thể làm tăng lượng dấu hiệu huỳnh quang tổng và ảnh hưởng đến tính chính xác của kết quả định lượng Một bất lợi khác là không thể sử dụng thuốc nhuộm liên kết DNA cho phản ứng multiplex bởi vì ta không thể phân biệt được

dấu hiệu huỳnh quang từ các sản phẩm khuếch đại khác nhau

b Hoá ch ất phát huỳnh quang dựa trên mồi và mẫu dò:

Hoá chất phát huỳnh quang dựa trên mồi và mẫu dò được sử dụng phổ

biến hiện nay là mẫu dò Taqman Đó là một trình tự oligonucleotide đặc hiệu có

gắn chất huỳnh quang Cũng được biết đến như là phản ứng 5’exonuclease, phản ứng Taqman sử dụng khả năng 5’-exonulease của các DNA polymerase chịu nhiệt hiện nay Mẫu dò Taqman đư ợc gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’

và một chất hấp thụ huỳnh quang ở đầu 3’ Khi còn nguyên vẹn, dấu hiệu của

chất phát huỳnh quang bị hấp thụ do chúng nằm gần chất hấp thụ Trong giai đoạn kết hợp bắt cặp và kéo dài DNA trong phản ứng nhân bản, mẫu dò liên kết

với trình tự đích và hoạt động 5’-3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi

của DNA polymerase sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang Kết quả là, chất phát

huỳnh quang bị tách rời khỏi chất hấp thụ, và dấu hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ

với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu (hình 1.7)

Hình 1.7: Nguyên lý ho ạt động của mẫu dò Taqman

Ưu điểm chính của mẫu dò Taqman là độ đặc hiệu cao, tỷ lệ huỳnh quang phát cao, và khả năng thực hiện các phản ứng multiplex Tuy nhiên giá thành của

nó có thể đắt và việc thiết kế phản ứng khó khăn

Một phản ứng Real-Time PCR thành công đòi h ỏi sản phẩm phải được khuếch đại đặc hiệu và hiệu quả Do đó, cần phải cẩn thận khi lựa chọn trình tự đích và thiết kế mồi và mẫu dò phù hợp với nó

Một khía cạnh quan trọng trong việc thiết kế mẫu dò là việc lựa chọn chất phát và hấp thụ huỳnh quang Mẫu dò gắn chất phát huỳnh quang màu FAM thường được sử dụng vì không đắt tiền và có sẵn, hiệu quả tốt và dấu hiệu có thể được phát hiện bởi bất kỳ thiết bị nào hiện có trên thị trường Ngoài ra, cần lưu ý

là một số chất hấp thụ chỉ thích hợp cho mẫu dò molecular beacon như DABCYL Bên cạnh đó, TAMRA không nên sử dụng như là một chất hấp thụ, nhưng nó có thể được sử dụng cho các thí nghiệm một màu FAM TAMRA không phải là một chất hấp thụ tốt trong mẫu dò molecular beacon Bảng 1.3 liệt

kê một số cặp chất phát và hấp thụ huỳnh quang thường được sử dụng

B ảng 1 3: Các cặp chất phát và hấp thụ huỳnh quang thường được sử dụng

Ch ất phát huỳnh quang Ch ất hấp thụ huỳnh quang thích hợp

1.10 Tình hình nghiên c ứu và các phương pháp phát hiện PRRSV ở Việt Nam

Ở Việt Nam, các nghiên cứu bước đầu về PRRSV bắt đầu muộn và có phần

hạn chế hơn so với thế giới Chỉ sau khi đợt dịch heo tai xanh bùng phát vào năm

2007 mới có một số nghiên cứu bước đầu về sự hiện diện và tỉ lệ nhiễm của PRRSV trên heo bằng phương pháp bằng RT-PCR (Nguyễn Ngọc Hải & cộng

sự, 2007) Công trình của Kim Văn Phúc và cộng sự (2007) sử dụng các phương pháp ELISA, phân lập virus, RT-PCR, IPMA điều tra sự lưu hành của virus trên

8 tỉnh thành (Tp HCM, Đồng Nai, Bình Dương, Tiền Giang, Long An, Tây Ninh,

Bà Rịa Vũng tàu và Khánh Hòa) Công trình của Youjun Feng và cộng sự (2008)

tiến hành trên một số chủng PRRSV phân lập ở Việt Nam và Trung Quốc năm

2007 cho thấy có 99 % đồng nhất ở trình tự bộ gene giữa các chủng này [23]

Một công trình khác của Lê Thanh Hòa và cộng sự (2009) tìm hiểu đặc tính di truyền của chủng PRRSV phân lập từ heo bệnh ở Việt Nam dựa trên việc phân tích gene M mã hoá protein màng của virus Năm 2011, đánh giá chung tình

trạng nhiễm PRRSV trên đàn heo sinh sản của thành phố Hồ Chí Minh, công trình của Nguyễn Ngọc Hải và Phan Xuân Thảo kết luận có bốn kiểu nhiễm PRRSV trong các trại chăn nuôi trong địa bàn thành phố Hồ Chí Minh là: (1) nhiễm dòng PRRSV type NA cổ điển; (2) nhiễm dòng PRRSV type NA đ ộc lực cao của Trung Quốc; (3) nhiễm hai dòng PRRSV type NA cổ điển và type NA độc lực cao Trung Quốc; (4) nhiễm hai dòng PRRSV type NA cổ điển và PRRSV type EU

Tuy nhiên hiện nay, phương pháp chẩn đoán bệnh PRRS ở nhiều địa phương trên cả nước chủ yếu vẫn dựa vào nhận biết các dấu hiệu lâm sàng Điều này làm chậm trễ cho các biện pháp cách ly, tiêu hủy và phòng ngừa, dễ dẫn đến tình trạng lây lan và bùng phát dịch bệnh Việc áp dụng các phương pháp phát

hiện PRRSV bằng kĩ thuật sinh học phân tử chỉ có ở một số trung tâm thú y lớn,

Ngoài ra, việc phân type PRRSV để tìm hiểu dịch tễ của virus, cũng như dự đoán cho việc sử dụng loại vaccine thích hợp vẫn chưa được quan tâm trong khi theo

cục thú y cho biết hiện nay ở Việt Nam có lưu hành cả 2 loại type PRRSV là EU

và NA

Xây dựng quy trình cho phép đ ồng thời phát hiện và phân type PRRSV

bằng phương pháp Real-time RT-PCR sẽ là một công cụ hỗ trợ hiệu quả trong

việc chẩn đoán heo nhiễm PRRSV Sự thành công của quy trình sẽ là tiền đề cho

việc xây dựng bộ kit hoàn chỉnh giúp phát hiện nhanh, nhạy, chính xác đàn heo nhiễm bệnh, giúp giảm chi phí phát hiện cũng như làm giảm các tổn thất về kinh

tế do bệnh PRRS gây ra Ngoài ra, khả năng phân type PRRSV của quy trình mà chúng tôi xây dựng sẽ góp phần rất lớn trong việc theo dõi dịch tễ học virus cũng như việc lựa chọn vaccine phòng ngừa thích hợp

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

− Đề tài được thực hiện tại Công ty TNHH CNSH Khoa Thương

− Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2011 đến tháng 11/2011

2.2 V ật liệu

2.2.1 M ẫu sử dụng trong nghiên cứu

- 20 mẫu huyết thanh heo nghi ngờ nhiễm bệnh (có triệu chứng sốt cao,

biến ăn, sảy thai, đẻ non…) được lấy từ các trại heo ở Đồng Nai trong đợt dịch bệnh tai xanh năm 2010

- Chủng vi sinh vật dùng để dòng hóa: Escherichia coli DH5α (Promega)

2.2.2 Các c ặp mồi và mẫu dò sử dụng trong đề tài

Các cặp mồi và mẫu dò được tổng hợp nhân tạo bởi công ty IDT

(Intergrated DNA Technologies, Mỹ) và được bảo quản trong dung dịch đệm TE 1X ở nhiệt độ -200

C Trình tự và thông tin của các mồi và mẫu dò được thể hiện

B ảng 2 1 Thông tin trình tự các mồi và mẫu dò

Tên Trình tự nucleotide T m Kích

thước sản

ph ẩm (bp)

Vùng b ắt cặp

Nguồn gốc

Egli C

et al.,

(2001) PR4-R 5’-AAATGIGGCTTCTCIGGITTTT-3’ 59

ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3’

bp NA: 127

bp

ORF 7 trên

c ả hai type PRRSV

Tự thi ết kế

Erkens

T et al.,

Erkens

T et al.,

bp

ORF7 c ủa PRRSV

Olekse -wicz

2.2.3.1 Kit thương mại phát hiện PRRSV

Kit Real time RT-PCR phát hiện PRRSV (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Real time RT-PCR Kit): Được sản xuất

bởi công ty Shanghai ZJ Bio-tech (Trung Quốc), là bộ kit cho phép phát hiện và phân type PRRSV từ mẫu huyết thanh và mẫu mô bằng phương pháp Real time RT-PCR một bước Đầu tiên là bước phiên mã ngư ợc bằng enzyme reverse transcriptase Kế đến enzyme thermostable DNA polymerase được sử dụng để

nhân bản vùng gene đặc hiệu bằng hệ thống Real time Bộ kit sử dụng hai master

mix với hai cặp mồi bắt cặp đặc hiệu cho từng type PRRSV với độ nhạy là 5.104

- f1 (IG): vùng intergeneic của phage f1

- Rep (pMB1): relicon pMB1 đóng vai trò kh ởi đầu sao chép trong phagemid

- Bla (ApR): gene mã hóa beta lactamase, có vai trò kháng Ampiciline

- lacZ: đầu 5’ terminal của gene lacZ mã hóa cho tiểu phần beta

galactosidase Tiểu phần này cho phép sàng lọc khuẩn lạc xanh trắng trong phagemid tái tổ hợp

- Multi cloning sites (MCS): chứa các vị trí của enzyme cắt giới hạn, trong đó có enzyme Sma I (hình 2.2) được sử dụng để mở vòng plasmid ạo

mạch thẳng với hai đầu bằng

ản đồ phagemid pBluescript II SK

Hình 2 2: Trình t ự và vị trí các enzyme cắt giới hạn của vùng multiples cloning

sites c ủa plasmid pBlue

Tris-HCl 1M, pH 8,0 1 ml

Thêm nước cho đủ 100 ml

- Hóa chất tinh sạch DNA

Cloroform (Merk) Phenol bão hòa pH 8(Merk) Ethanol 100% và Ethanol 70% (Merk) Dung dịch TE 1X

- Môi trường Luria-Bertani (LB)

40 – 45oC, bổ sung thêm:

− Dung dịch Ampicillin 100 mg/ml để đạt nồng độ cuối là 100 µg/ml

− Dung dịch IPTG 100 mM để đạt nồng độ cuối là 0,5mM

− Dung dịch Xgal 50 mg/ml để đạt nồng độ cuối là 80µg/ml

Đổ môi trường vào các đĩa petri vô trùng Bảo quản môi trường ở 4o

C

2.2.3.4 D ụng cụ, thiết bị, phần mềm

Máy li tâm Z233-M2 (Hermle)

Máy vortex SA8 (Stuart)

Máy luân nhiệt CFX96 (Biorad)

Bàn đèn UV M-15 (UVP)

Phần mềm chuyên dụng: Clustal X 1.81, AnnHyb 4.944, AlleleID 7.0

2.3 P hương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tách chiết RNA bằng Phenol-Chloroform

Nguyên t ắc: là phương pháp tách chiết RNA khỏi các thành phần khác

dựa trên sự phân tách các pha bằng li tâm Một dung dịch ly giải gồm phenol pH4 và guanidine thyocyanat sẽ làm phá vỡ tế bào, giải phóng nucleic acid, protein và các thành phần khác bao gồm DNase và RNase Dưới tác dụng của lực

li tâm lớn sẽ làm phân tách thành ba pha: pha trong suốt ở trên (RNA), pha giữa (protein biến tính) và pha Phenol – Chloroform ở dưới (DNA, mảnh vỡ tế bào…) Trong quy trình này, chúng tôi sử dụng kit tách chiết RNA của công ty TNHH Công Nghệ Sinh học Khoa Thương

Quy trình:

− Chuẩn bị số lượng ống eppendorf bằng số bệnh phẩm cộng thêm chứng dương và chứng âm; đánh dấu các ống eppendorf với ký hiệu của các bệnh phẩm

− Thêm 100 µl huyết thanh vào mỗi ống

− Thêm 900 µl dung dịch 1 Vortex mạnh ít nhất 5 giây Để yên 10 phút

− Thêm 200 µl dung dịch 2, trộn thật đều

− Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

− Chuyển 600 µl dịch nổi vào ống eppendorf mới

− Thêm 600 µl dung dịch 3 (dung dịch này cần được trộn đều trước khi sử

dụng)

C (trong bồn ủ nhiệt khô) trong 10 phút

− Hòa cặn lại trong 50 µl dung dịch 5

− Nếu không sử dụng ngay, dịch RNA tách chiết được bảo quản ở -200

C cho đến 6 tháng

2.3.2 Phương pháp tách chiết RNA theo Boom [10], [18],[26]

Nguyên t ắc: là phương pháp tách chiết nucleic acid dựa trên sự hấp thụ

của nucleic acid với các hạt silica Trong môi trường nồng độ cao của các tác nhân như guanidine thyocyanate, các nucleic acid sẽ gắn vào các phần tử silica hay thủy tinh Phương pháp này được phát triển đầu tiên bởi Boom vào năm

1989 Ưu điểm của nó là ít độc hại cho người thao tác, quy trình đơn giản, nhanh,

hiệu suất tách chiết khá cao, nguy cơ nhiễm ít [10], [18], [26]

Cách pha các dung dịch được sử dụng trong tách chiết RNA theo Boom như sau:

 Dung d ịch Silica

+ 6g Silicon dioxide vào 50 ml H2O đã khử trùng trong falcon

Lắc đều, sau đó để yên 24h ở nhiệt độ phòng

+ Loại bỏ 43 ml và tái huyền phù trong 50 ml H2O Để yên trong 5h Sau đó loại bỏ 44 ml H2O Thêm 60 µl HCl pH2

+ Phần Silica còn lại được chia vào các eppdorf 1,5 ml Hấp khử trùng và trữ trong tối

 Dung d ịch rửa

+ Dung dịch L6: Cân 24g GuSCN (guanidine thyocyanat) vào falcon 50 ml, cho vào 20 ml Tris-Cl 0,1 M pH 6,4 Đợi cho tan

hoàn toàn Sau đó thêm 4,4 ml EDTA 0,2 M pH 8 và 0,5 ml Triton X-100 (Calbiochem) Trữ trong tối

+ Dung dịch L2: cân 24g GuSCN (guanidine thyocyanat) vào falcon 50 ml Cho vào 20 ml Tris-Cl 0,1 M pH 6,4 Trữ trong

tối

+ Ethanol 70%: 35 ml Ethanol + 15 ml H2O

Quy trình tách chi ết RNA (Boom):

- Cho 900 µl dung dịch L6 và 40 µl silica vào eppendorf 1,5 ml Vortex cho đều

- Thêm 100 µl huyết thanh vào Vortex ngay khoảng 5 giây Để yên 10 phút

ở nhiệt độ phòng Vortex 5 giây Li tâm ở 13.000 vòng/phút trong 15 giây Loại

- Cách rửa tủa: cho 1 ml dung dịch rửa tủa Vortex cho tủa tan hoàn toàn

Li tâm 15 giây ở 13.000 vòng/phút Loại bỏ dịch nổi

- Silica rất khó vortex cho tan hoàn toàn Vì vậy cần sử dụng máy vortex

với tốc độ mạnh

2.3.3 Phương pháp reverse transcriptase (RT)

Nguyên t ắc: RNA sau khi tách chiết sẽ được phiên mã ngư ợc thành cDNA nhờ hoạt động của enzyme reverse transcriptase Trong đề tài này, chúng

tôi sử dụng enzyme MLV của Biorad Phản ứng và quy trình RT đư ợc thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Biorad)

Thành phần phản ứng gồm 1 µl enzyme reverse transcriptase, 4 µl dung

dịch đệm và 15 µl RNA sau khi tách chiết Chương trình RT g ồm các bước 5 phút ở 25°C, 30 phút ở 42°C, 5 phút ở 85°C cDNA thu được được bảo quản ở -

20 °C

2.3.4 Phương pháp thiết kế cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu cho PRRSV

Để thiết kế thành công mồi và mẫu dò đ ặc hiệu cho phản ứng Real-time PCR cần tuân thủ những nguyên tắc sau:

- Kích thước sản phẩm nhân bản từ 75-200 bp

- Cần tránh cấu trúc thứ cấp nếu có thể

- Chiều dài mồi khoảng 17-20 bp với hàm lượng GC từ 50-60%

- Kiểm soát nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi ở giữa 50 và 650

C

- Thiết kế base G và C ở đầu cuối của mồi

- Kiểm tra trình tự của mồi xuôi và ngược để đảm bảo không có sự bắt cặp

bổ sung ở đầu 3’ (tránh tạo ra primer-dimer)

- Chiều dài mẫu dò khoảng 25-30 bp

- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mẫu dò cao hơn của mồi từ 5-10o

C

Dựa vào các bài báo khoa học đã công bố chúng tôi nhận thấy vùng trình

tự ORF 7 của PRRSV là vùng thích hợp cho việc thiết kế mồi và mẫu dò phát

hiện và phân type PRRSV Sơ đồ thiết kế cặp mồi và mẫu dò như trong hình 2.4

Hình 2 4 Sơ đồ thiết kế các mồi và mẫu dò phát hiện và phân type PRRSV

Thiết kế mồi và mẫu dò đồng thời phát hiện và phân type PRRSV được

tiến hành theo các bước sau:

- Tải các trình tự ORF 7 của PRRSV type EU và PRRSV type NA đã được

công bố từ cơ sở dữ liệu NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)

- Dùng phần mềm ClustalX 1.81 để sắp gióng cột các trình tự ORF7 của hai

type PRRSV nhằm tìm ra những vùng trình tự bảo tồn cao cũng như

những vùng có trình tự đặc trưng cho cả hai type

- Chọn ra vùng có sự tương đồng chung giữa hai type để sử dụng làm cặp

mồi chung, và hai vùng riêng đặc trưng cho từng type để làm mẫu dò

- Kiểm tra các yêu cầu cần thiết của mồi và mẫu dò: % GC, nhiệt độ nóng

chảy … (http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/Oligo Analyzer/)

- Kiểm tra lại sự đặc hiệu của mồi và mẫu dò bằng công cụ Basic Local

Alignment Search Tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)

Bên cạnh đó, nhằm kiểm soát qui trình phát hiện Real time RT-PCR,

chúng tôi tiến hành thiết kế các mồi và mẫu dò đặc hiệu với chứng nội nội sinh

Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng trình tự các cặp mồi của ErkensT et al.,

PR6-P1

(2006) và Nygard A.B et al., (2007) cho sự phát hiện các gene mã hóa cho ribosomal protein L4 (RPL4), TATA box binding protein (TBP) và beta actin (ACTB) ở heo [17],[38],[44] Song song đó, chúng tôi thiết kế thêm các mẫu dò đặc hiệu với các RPL4, TBP và ACTB

Đầu tiên chúng tôi tải trình tự RPL4 (DQ845176), TBP (DQ178129) và ACTB (DQ178122) của heo được công bố trên NCBI Sau đó dùng phần mềm AlleleID 7.0 đề tìm các mẫu dò tốt nhất

2.3.4.1 Đánh giá hiệu quả hoạt động của mồi và mẫu dò phát hiện

và phân type PRRSV

Thực hiện phản ứng monoplex Real time RT-PCR với hai bộ mồi PR4 và PR6 trên hai mẫu chứng là mẫu vaccine EU và mẫu VR2332 (ATCC) Hiệu quả

hoạt động được đánh giá thông qua khả năng phát hiện và phân type đúng với

từng mẫu chứng sử dụng và cho giá trị Ct thấp hơn ở từng mẫu chứng Phản ứng monoplex Real time RT-PCR gồm các thành phần như sau: