Xử lý rơm rạ bằng sợi tơ nấm rơm volvariella volvacea và đánh giá khả năng tạo bioethanol

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Điều kiện sinh trưởng của nấm rơm Bảng 1.2: Thành phần một số nguồn nguyên liệu trồng nấm Bảng 2.1: Các bước tiến hành dựng đường chuẩn glucose và xylose Bảng 2.2

NGUYỄN THỊ HIỀN

XỬ LÝ RƠM RẠ BẰNG SỢI TƠ NẤM RƠM

VOLVARIELLA VOLVACEA VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ

NĂNG TẠO BIOETHANOL

Lời cảm ơn

Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Hoàng Quốc Khánh, phòng

Vi sinh ứng dụng, Viện sinh học nhiệt đới đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, chỉnh sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất cũng như trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn chị Đào Thị Thu Hiền cùng tập thể phòng vi sinh, Viện sinh học nhiệt đới đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình làm luận văn

Tôi cũng không bao giờ quên sự tận tình dạy bảo, động viên của các thầy cô Khoa Sinh học, phòng Sau đại học, trường Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ động viên tôi trong suốt thời gian học tập

MỞ ĐẦU

™ Đặt vấn đề

Vào những năm cuối thế kỷ 20 và đầu thế kỷ 21, đi đôi với sự phát triển kinh

tế xã hội, nhu cầu sử dụng năng lượng càng tăng nhanh Theo dự báo của tổ chức Năng lượng thế giới IEO (International Energy Organzation), từ năm 1999 đến

2020 nhu cầu tiêu thụ năng lượng của thế giới sẽ tăng 60% Nguồn năng lượng có thể chia làm ba dạng: Năng lượng hóa thạch (dầu mỏ, than đá và khí tự nhiên), năng lượng tái tạo và năng lượng hạt nhân Hiện nay trên thế giới nguồn cung cấp năng lượng chủ yếu vẫn là từ nhiên liệu hóa thạch Hơn nữa, nguồn dầu thô và than đá được sử dụng quá nhiều, tạo ra sự giải phóng Carbon ngược lại vào bầu khí quyển,

là nguyên nhân chủ yếu của sự thay đổi khí hậu toàn cầu Do đó, nhiều quốc gia và tập đoàn năng lượng trên thế giới có chiến lược sử dụng tiết kiệm dầu mỏ đồng thời nghiên cứu sản xuất các nhiên liệu sạch thân thiện với môi trường trong đó có nhiên liệu sinh học

Nhiên liệu sinh học (NLSH) là loại chất đốt tái tạo sản xuất từ nguyên liệu động thực vật gọi là sinh khối (biomass) Nguồn năng lượng được tạo ra từ biomass chiếm 63% tổng số năng lượng tái tạo Có nhiều cách phân loại nhiên liệu sinh học (NLSH) Thông thường dựa vào nguồn gốc của các nguyên liệu dùng để sản xuất NLSH có thể chia NLSH thành ba thế hệ:

- NLSH thế hệ thứ nhất từ các loại cây trồng ăn được như lương thực, thực phẩm, ví dụ: Mía, của cải, ngũ cốc, dầu mỡ động thực vật Nhược điểm cơ bản là đã sử dụng những nguồn tài nguyên sinh khối liên quan đến lương thực dẫn đến mất an ninh lương thực trên thế giới

- NLSH thế hệ thứ hai chủ yếu từ các phụ phẩm hoặc phế thải trong sản xuất, sinh hoạt có nguồn gốc hữu cơ, ví dụ: Phế thải nông lâm nghiệp (rơm rạ, trấu, bã mía, thân ngô, mùn cưa, gỗ vụn…), chăn nuôi (phân súc vật, bùn cống rãnh…) và sinh hoạt (dầu, mỡ thải) Ưu điểm nổi bật là sử dụng nguồn sinh khối không ảnh hưởng

gì đến lương thực, thực phẩm nuôi sống con người và gia súc đảm bảo an ninh lương thực toàn cầu, đồng thời còn góp phần giảm thiểu ô nhiễm

- NLSH thế hệ thứ ba từ tảo (nước ngọt và nước biển), cây jatropha curcas (cây cộc rào hay cây dầu mè), cỏ swichgrass, cây halophyte, có ưu điểm vượt trội là dựa vào nguồn sinh khối phong phú của các loại cây không thuộc cây lương thực, có thể sinh trưởng hoang dại ở cả những nơi đất cằn cỗi với hàm lượng dầu cao Tuy nhiên

đó mới chỉ là nghiên cứu thăm dò ban dầu còn nhiều vấn đề khoa học và công nghệ liên quan đến canh tác, khai thác, chế biến các tài nguyên sinh khối này cần phải giải quyết trước khi NLSH thế hệ ba xuất hiện trên thị trường

Hiện nay NLSH thế hệ thứ hai được ưu tiên nghiên cứu và sử dụng vì hầu như sẽ không ảnh hưởng đến giá lương thực và đảm bảo an ninh lương thực toàn cầu Biomass như rơm rạ, thân cây ngũ cốc và các phế thải nông nghiệp khác được tạo ra hàng năm trên thế giới khoảng hơn nửa tỷ tấn, trong đó châu Á chiếm tới 92% Rơm rạ là một trong những phế thải nông nghiệp ít giá trị sử dụng, số lượng lớn đặc biệt ở các nước xuất khẩu lúa gạo, như ở Việt Nam Rơm rạ chiếm hơn 50% tổng trọng lượng cây lúa

Thành phần chủ yếu của chúng bao gồm cellulose, hemicellulose và lignin gắn kết chặt chẽ với nhau bởi những liên kết hidro và liên kết đồng hóa trị Để có thể sản xuất ethanol, các polymer này cần được phân hủy thành đường đơn và sau

đó hỗn hợp đường được lên men thành ethanol Việc thủy phân lignocellulose theo con đường hóa học và enzyme đều không đơn giản và hao phí về mặt kinh tế Các nghiên cứu cho thấy một số loài vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose

trong đó có loài Volvariella volvacea, tên thường gọi là nấm rơm Nấm rơm được

trồng trên nhiều dạng chất thải có lignocellulose như rơm của các cây ngũ cốc, lá chuối, bã mía đường, vỏ quả cọ dầu (Cai et al., 1999) Giống với nhiều vi nấm, trong quá trình sinh dưỡng, các loại nấm này có khả năng sản sinh trong môi trường nuôi dưỡng chúng hệ enzym để phân giải cellulose, hemicellulose thành các đường

đơn sau đó mới hấp thụ làm nguồn dinh dưỡng V volvacea sản xuất ra một hệ

thống nhiều enzym gồm β-glucosidase, endo-1,4-β-glucanase, cellobiohydrolase

chuyển hoá cellulose thành glucose (Cai et al., 1998) Ngoài ra, V volvacea còn tạo

ra laccase là một enzym phân giải lignin và oxy hoá các hợp chất phenol[1]

Việc sử dụng V volvacea để thủy phân lignocellulose góp phần giảm ô nhiễm

môi trường và mang lại hiệu quả kinh tế Do đó, chúng tôi chọn đề tài “Tiền xử lý,

thủy phân và thử khả năng tạo bioethanol từ rơm rạ” với mục tiêu và nội dung cụ

thể như sau:

™ Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu: Sử dụng các chủng nấm rơm để tiền xử lý, thủy phân và

thử khả năng tạo bioethanol từ rơm rạ từ đó chọn chủng nấm rơm có khả năng thủy

phân nguyên liệu lignocellulose tốt nhất

™ Nội dung nghiên cứu:

Nuôi cấy nấm rơm trên cơ chất rơm rạ với độ ẩm, hàm lượng dinh dưỡng thích

hợp

Theo dõi hoạt tính các enzyme thủy phân cơ chất rơm rạ và sự thay đổi thành phần rơm rạ theo thời gian

Điện di protein để kiểm tra sự hiện diện của protein enzyme

Lên men bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae

Thử khả năng tạo cồn bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ GC/MS-headspace

Nội dung Trang

Lời cảm ơn i

Mục lục ii

Danh mục hình iv

Danh mục bảng vi

Ký hiệu và viết tắt vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: Tổng quan 4

1.1 Nguồn rơm rạ ở Việt Nam 4

1.2 Cấu trúc rơm rạ 4

1.2.1 Cellulose 5

1.2.2 Hemicellulose 6

1.2.2 Lignin 7

1.3 Nấm rơm 9

1.3.1 Tổng quát về nấm rơm 9

1.3.2 Cấu tạo hình thái quả thể nấm rơm 10

1.3.3 Vòng đời của nấm rơm 11

1.3.4 Nguyên liệu trong môi trường trồng nấm 12

1.4 Qúa trình sản xuất bioethanol từ rơm rạ 13

1.4.1 Bioethanol 13

1.4.2 Qúa trình sản xuất bioethanal từ rơm rạ 15

1.4.2.1 Tiền xử lý 15

1.4.2.2 Thủy phân 16

1.4.2.3 Lên men 26

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 32

2.1 Vật liệu 32

2.1.1 Nguyên liệu 32

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 33

2.1.3 Hóa chất 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 34

2.2.1 Phương pháp phân tích 34

2.2.1.2 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase và xylanase 37

2.2.1.3 Phương pháp xác định hoạt tính laccase 41

2.2.1.4 Xác định hàm lượng protein 42

2.2.1.5 Phương pháp định lượng đường khử 43

2.2.1.6 Phương pháp xác định thành phần rơm rạ 44

2.2.1.7 Phương pháp xác định hàm lượng glucosamine 45

2.2.1.8 Phương pháp nuôi cấy nấm men 47

2.2.1.9 Điện di phân tích protein 47

2.2.1.10 Đo nồng độ cồn bằng máy sắc ký khí khối phổ 53

2.2.2 Trình tự nghiên cứu 54

2.2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm 54

2.2.2.2 Tiền xử lý 54

2.2.2.3 Thủy phân 55

2.2.2.4 Lên men 55

2.2.2.5 Đo nồng độ cồn của các mẫu lên men 55

Chương 3: Kết quả và thảo luận 56

3.1 Hoạt tính enzyme FPase, cellulase, xylanase, laccase của mẫu theo thời gian 56

3.2 Sự thay đổi pH theo thời gian 59

3.3 Sự tăng trưởng tế bào nấm rơm theo thời gian 61

3.4 Thành phần rơm rạ thay đổi theo thời gian 62

3.5 Hàm lượng glucose sau thủy phân 63

3.6 Hàm lượng protein trong dịch nuôi cấy 65

3.7 Xác định protein enzyme bằng điện di SDS-PAGE 66

3.8 Nồng độ cồn sau lên men 68

Chương 4: Kết luận và kiến nghị: 69

4.1 Kết luận 69

4.2 Kiến nghị 69

Tài liệu tham khảo 71

Phụ lục 75

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Điều kiện sinh trưởng của nấm rơm

Bảng 1.2: Thành phần một số nguồn nguyên liệu trồng nấm

Bảng 2.1: Các bước tiến hành dựng đường chuẩn glucose và xylose

Bảng 2.2: Các bước của quá trình xác định hoạt tính cellulase và xylanase

Bảng 2.3: Các bước tiến hành dựng đường chuẩn protein

Bảng 2.4: Các bước tiến hành dựng đường chuẩn glucose

Bảng 2.5: Các bước tiến hành dựng đường chẩn glucosamine

Bảng 2.6: Các thành phần của HVP

Bảng 3.1: Hoạt tính enzyme FPase, cellulase và xylanase của mẫu

Bảng 3.2: Hoạt tính laccase của mẫu

Bảng 3.3: pH theo thời gian của cơ chất

Bảng 3.4: Hàm lượng đường glucosamine của các mẫu

Bảng 3.5: Thành phần rơm rạ thay đổi theo thời gian

Bảng 3.6: Hàm lượng glucose sau thủy phân

Bảng 3.7: Hàm lượng protein trong dịch nuôi cấy

Bảng 3.8: Nồng độ cồn sau lên men

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Rơm rạ ở Việt Nam

Hình 1.2: Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose

Hình 1.3 : Vùng vô định hình và vùng kết tinh trong vách tế bào thực vật

Hình 1.9: Các giai đoạn phát triển khác nhau của tai nấm rơm

Hình 1.10: Chu trình sống của nấm rơm

Hình 1.11 : Cellulase

Hình 1.12: Tóm tắt quá trình thủy phân của cellulase

Hình 1.13: Cơ chế hoạt động của xylanase

Hình 1.14 Cơ chế xúc tác của laccase

Hình 1.15: Nấm men Saccharomyces cerevisiae

Hình 1.16: Cơ chế quá trình lên men

Hình 2.1: Rơm rạ được xử lý với chủng nấm rơm

Hình2.2 : Nấm rơm được phân lập trong ống thạch nghiêng

Hình 2.3: Sơ đồ thực hiện điện di protein trên gel

Hình 2.4 : Quy trình tiến hành thí nghiệm

Hình 3.1: Hoạt tính enzyme Fpase theo thời gian nuôi cấy

Hình 3.2: Hoạt tính cellulase theo thời gian nuôi cấy

Hình 3.3: Hoạt tính xylanase theo thời gian nuôi cấy

Hình 3.4: Hoạt tính laccase theo thời gian nuôi cấy

Hình 3.5: Sự thay đổi pH theo thời gian

Hình 3.6: Hàm lượng glucosamine theo thời gian

Hình 3.7: Thành phần rơm rạ thay đổi theo thời gian

Hình 3.8: Hàm lượng glucose sau thủy phân

Hình 3.9: Hàm lượng protein trong dịch nuôi cấy

Hình 3.10: Hoạt tính cellulase trên môi trường CMC agar

Hình 3.11: Kết quả điện di protein

Hình 3.12: Nồng độ cồn sau lên men

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Nguồn rơm rạ ở Việt Nam

Rơm rạ gắn liền với đời sống người dân Việt Nam từ bao đời nay Rơm rạ cũng tạo nên nét đẹp rất riêng của làng quê Việt Nam với cây rơm, mái rạ Nó là nguồn nhiên liệu, nguyên liệu cho rất nhiều lĩnh vực sản xuất và là vật phẩm phục

vụ muôn mặt đời sống sinh hoạt của chúng ta

Tuy nhiên vài năm trở lại đây tình trạng đốt rơm rạ diễn ra ngày càng phổ biến sau mùa gặt gây ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người Như vậy rơm rạ nên giải quyết thế nào? Hầu hết các nước đã và đang tìm kiếm các phương pháp tận dụng rơm rạ xử lý theo cách an toàn thân thiện với môi trường

Rơm rạ là một trong các nguồn nguyên liệu lignocellulose Hằng năm nền nông nghiệp Việt Nam tạo ra một lượng lớn rơm rạ nhưng phần lớn dùng để bón, làm chất đốt hay làm thức ăn cho gia súc mà chưa được sử dụng một cách hiệu quả trong vấn đề năng lượng

Rơm rạ chiếm 62,6% các nguồn biomass chính ở Việt Nam cho thấy việc tận dụng nguồn nguyên liệu này trong việc sản xuất bioethanol là cách sử dụng chúng hiệu quả trong vấn đề năng lượng[3]

Hình 1.1: Rơm rạ ở Việt Nam 1.2 Cấu trúc rơm rạ

Thành phần chính của rơm rạ là cellulose, hemicellulose, lignin, các chất trích

Cellulose chiếm 29,68%, hemicellulose chiếm 17.11% và lignin chiếm 12.17% thành phần rơm rạ [17]

1.2.1 Cellulose

Cellulose là một polymer mạch thẳng của các D- glucose, các D- glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4- glycoside (Hình 1.2)

Hình 1.2 : Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose [19]

Liên kết β-1,4- glycoside là một liên kết nội phân tử nên các đơn vị glucose xen kẽ trên và dưới tạo nên cellulose có dạng chuỗi xoắn Mỗi một chuỗi celllose chứa hàng chục nghìn đơn vị β-1,4- glycoside, các chuỗi này lại sắp xếp song song nhau tạo thành các sợi có đường kính 3.5 nm Các sợi này lại kết hợp với nhau thành bó sợi có đường kính lớn hơn Giữa các chuỗi cellulose thường hình thành rất nhiều các liên kết hydro, nhờ đó mà sợi cellulose rất bền Các bó sợi có cấu trúc không giống nhau:

+ Phần cấu trúc chặt gọi là cellulose kết tinh

+ Phần cấu trúc không chặt gọi là cellulose vô định hình

Hình 1.3: Vùng vô định hình và vùng kết tinh trong vách tế bào thực vật

Cellulose là nguồn nguyên liệu sinh học dồi dào nhất trên trái đất và được sản xuất với tốc độ 4x1010 tấn/ năm Các sản phẩm thủy phân của cellulose là nguồn nguyên liệu chế biến cho rất nhiều quá trình hóa học, là nguồn cung cấp glucose lớn nhất và được dùng sản xuất nhiên liệu ethanol

1.2.2 Hemicellulose

Hemicellulose cùng với lignin và cellulose tạo thành tế bào thực vật Hemicellulose là polymer của xylose, galactose, mannose, aribinose, các đường khác và các acid uronic của chúng

+ Nhóm thế phổ biến là nhóm acetyl O- liên kết với vị trí 2 hoặc 3

+ Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc trisaccharide Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại

ở dạng vô định hình và vì thế dễ bị thủy phân

1.2.3 Lignin

Lignin là một phức hợp polymer thơm vô định hình, là polymer phong phú thứ hai sau cellulose, thông thường được tìm thấy ở gỗ và là một phần không thể thiếu của vách tế bào thực vật

Lignin lấp đầy khoảng trống trong vách tế bào giữa cellulose, hemicellulose và các thành phần pectin, đặc biệt trong tracheids, sclereids và xylem Nó có liên kết đồng hóa trị với hemicellulose tạo độ bền cơ học cho vách tế bào

Lignin thông thường chứa 3 alcohol thơm bao gồm coniferyl alcohol, sinapyl

và p-coumaryl [33]

p-coumaryl alcohol Coniferyl alcohol Sinapyl alcohol

Hình 1.5: Các alcohol thơm của lignin [31]

Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lignin hoàn toàn không đồng nhất trong cấu trúc Lignin dường như bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình thuôn hoặc hình cầu Lignin trong tế bào thực vật bậc cao hơn không có vùng

vô định hình Các vòng phenyl trong lignin của gỗ mềm được sắp xếp trật tự trên mặt phẳng thành tế bào Ngoài ra, cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của lignin đều bị ảnh hưởng bởi mạng polysaccharide Việc mô hình hóa động học phân

tử cho thấy rằng nhóm hydroxyl và nhóm methoxyl trong các oligomer tiền lignin

sẽ tương tác với vi sợi cellulose cho dù bản chất của lignin là kỵ nước

Nhóm chức ảnh hưởng đến hoạt tính của lignin là nhóm phenolic hydroxyl tự

do, methoxyl, benzylic hydroxyl, ether của benzylic với các rượu thẳng và nhóm carbonyl

Lignin có liên kết hóa học với thành phần hemicellulose và cả với cellulose, độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên kết và cấu trúc hóa học của lignin và những đơn vị đường tham gia liên kết

Cấu trúc hóa học của lignin dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp

Lignin khó được tiêu hóa bởi enzyme do bởi các liên kết chéo với các thành phần khác của tế bào, nó cũng làm giảm sự tiếp cận của cellulose và hemicellulose tới một vài enzyme của vi khuẩn Do đó, lignin thông thường giúp bảo vệ thực vật khỏi mầm bệnh và vật gây hại Tuy nhiên, vài loài nấm và vi khuẩn có khả năng

phân hủy các polymer này: Nấm mục trắng Coriolus versicolor, P chrysosporium

and T versicolor [34]

Hình 1.6 : Cấu trúc lignin [31]

Tóm lại, các thành phần của rơm rạ có thể được minh họa trong hình dưới đây

khoa học là Volvariella volvacea, thuộc họ nấm rơm Plutaceae Nấm cũng có thể

mọc trên một vài loại nguyên liệu khác như: lục bình, bẹ chuối khô, bông gòn, mạt cưa, bã mía,…

Về phân loại, nấm rơm dự kiến có hơn 100 loài nhưng sự phân biệt giữa chúng

thường không rõ ràng Ví dụ một vài loài nấm như: V.diplasia, mũ nấm có màu nâu đất, hay nấm rơm lụa bạc V.bombycina,…

Điều kiện sinh trưởng của nấm rơm được tóm tắt trong bảng 1.1

Bảng 1.1: Điều kiện sinh trưởng của nấm rơm [17]

Khoảng biến thiên

Tối thích Khoảng biến

1.3.2 Cấu tạo hình thái quả thể nấm: Qủa thể nấm rơm gồm:

- Bao gốc: Bao gốc dài và cao, lúc nhỏ bao lấy mũ nấm, khi mũ nấm trưởng thành

gây nứt bao, bao gốc chỉ còn lại phần trùm lấy gốc chân cuống nấm Bao nấm chứa

sắc tố melanin tạo ra màu đen ở bao gốc Độ đậm nhạt tùy thuộc vào ánh sáng, ánh

sáng càng nhiều thì bao gốc càng đen

- Cuống nấm: Khi còn non thì mềm và giòn Khi già xơ cứng lại và khó bẽ gảy

- Mũ nấm: Mũ nấm hình nón cũng có chứa melanin nhưng nhạt dần từ trung tâm ra

rìa mép Bên dưới mũ có nhiều phiến nấm

Hình 1.8: Quả thể nấm rơm [17]

Tai nấm rơm đặc biệt lúc còn non được bao trong một lớp vỏ có màu trắng

xám đến đen, khi trưởng thành xé rách vỏ bọc và vươn mũ nấm lên cao, cuống có

bao gốc và không vồng cổ Đảm bào tử hình thành ở hai mặt phiến nấm bên dưới

mũ nấm Đảm bào tử nấm rơm có màu hồng thịt nên khi tai nấm trưởng thành phiến

có màu đỏ, vươn mũ nấm lên cao

Từ lúc hình thành nụ nấm đến khi phát triển thành tai trưởng thành, quả thể nấm rơm trải qua nhiều giai đoạn Người ta gọi tên quả thể dựa theo hình dạng của chúng ở mỗi giai đoạn: Hình đinh ghim, hình nút, hình trứng, hình kéo dài và hình

dù hay trưởng thành

Dạng nút Dạng trứng Dạng kéo dài Dạng trưởng thành

Hình 1.9: Các giai đoạn phát triển khác nhau của tai nấm rơm [17]

1.3.3 Vòng đời của nấm rơm :

Bắt đầu từ các đảm bào tử và được xem là kết thúc khi hình thành tai nấm hoàn chỉnh Đảm bào tử là bào tử hữu tính, khi rụng sẽ bay đi khắp nơi, gặp điều kiện thuận lợi nẩy mầm và cho lại hệ sợi nấm Hệ sợi nấm này thường chỉ có một nhân nên gọi là sợi nấm sơ cấp Đối với nấm rơm, chỉ cần hệ sợi sơ cấp từ một bào tử nẩy mầm cũng có thể tự phối hợp cho ra tơ thứ cấp Từ hệ sợi tơ thứ cấp chứa hai nhân, nấm phát triển thành mạng sợi, lan ra khắp nơi trên cơ chất để rút lấy dinh dưỡng Trong trường hợp bị đứt khúc, các sợi nấm tự làm lành vết thương và tái lập lại hệ sợi, tương tự như cây trồng trong giâm chiết cành Hệ sợi nấm phát triển thành mạng sợi Gặp những điều kiện nhất định, hệ sợi nấm sẽ bện lại và tạo thành hạch nấm Hạch nấm tiếp tục phát triển cho quả thể trưởng thành

Hình 1.10: Chu trình sống của nấm rơm [17]

Nấm rơm còn một dạng bào tử thứ hai gọi là hậu bào tử Đây là bào tử vô tính

có dạng hình cầu và là một dạng sống đặc biệt của chúng nhằm tránh qua các giai đoạn môi trường khắc nghiệt Hậu bào tử hình cầu, có hai nhân và có màu hồng thịt như đảm bào tử Khi nẩy mầm, hậu bào tử sẽ cho lại hệ sợi nấm

Chất xơ của thực vật là cellulose, hemicellulose và lignin trong khi chất xơ của nấm là chitin.[28] Chitin là vật liệu cấu trúc cơ bản trong nấm và được chứng minh

có giá trị như chất xơ Nó cũng được thủy phân thành glucosamine

1.3.4 Nguyên liệu trong môi trường trồng nấm

Trong thiên nhiên, hầu như tất cả các xác bã thực vật đều có thể trồng nấm Tuy nhiên, không phải nguyên liệu nào nấm cũng sử dụng ngay mà cần trải qua quá trình chế biến thích hợp Quá trình này gồm nhiều công đoạn với sự tham gia của các yếu tố khác nhau, vừa sinh học vừa không sinh học [17]

Tùy loài nấm, có loài sản xuất được các loại enzym phân giải mạnh nên nguyên liệu sử dụng tương đối thô hơn Ngược lại, cũng có những loài cần có nguyên liệu gần như mùn hóa Dưới đây là một số nguồn nguyên liệu trồng nấm (bảng 1.2)

Bảng 1.2: Thành phần một số nguồn nguyên liệu trồng nấm [7]

Rơm rạ lúa khô

Bã mía đã phơi khô

Cỏ khô

1.4 Qúa trình sản xuất bioethanol từ rơm rạ

1.4.1 Bioethanol:

Việc cung cấp và sử dụng năng lượng đóng một vai trò trong tâm trong tổ chức xã hội, từ phúc lợi cá nhân cho đến sự phát triển xã hội và công nghiêp Khả năng tiếp cận năng lượng và chi phí cho năng lượng được đánh giá là yếu tố quyết định cho mối quan hệ kinh tế và chính trị giữa các quốc gia Xem xét các nguồn năng lượng, xã hội loài người đã sử dụng nhiên liệu hóa thạch tăng lên đáng kể trong 50 năm qua Việc sử dụng xăng cho vấn đề giao thông vận tải đã chiếm 1/3 lượng khí thải gây hiệu ứng nhà kính (Wyman, 1996) ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường đã dẫn đến một vấn đề thiết yếu là giảm nhu cầu tiêu thụ Thật vậy, các nền kinh tế mạnh nhất thế giới đã ký cam kết sâu sắc đối với việc phát triển các kỹ thuật công nghệ nhằm vào việc sử dụng các nguồn năng lượng tái tạo Trong chương trình nghị sự này, viêc thay thế xăng nhiên liệu lỏng bằng ethanol tái tạo là

có tầm quan trọng hàng đầu

Nhiên liệu bioethanol chủ yếu được sản xuất từ quá trình lên men đường Nguồn đường chính để sản xuất ethanol là các cây trồng cho mục đích năng lượng bao gồm ngũ cốc, ngô, lúa mì, mùn cưa, rơm,… Cũng có những nghiên cứu việc sử dụng rác thải đô thị để sản xuất nhiên liệu ethanol

Ethanol là một chất lỏng không màu, có thể bị phân hủy do vi khuẩn, tính độc thấp và ít gây ô nhiễm môi trường nếu bị tràn Khi cháy sẽ tạo ra CO2 và H2O Bioethanol có một số thuận lợi hơn các nguồn nhiên liệu khác: Có thể tái tạo, giảm lượng khí nhà kính, có thể bị phân hủy và ít độc hơn các nhiên liệu hóa thạch khác, giảm lượng carbon monoxide do đó cải thiện chất lượng không khí

Ethanol có thể được sản xuất từ biomass thông qua quá trình thủy phân và lên men đường Biomass chứa một phức hợp carbohydrate như cellulose, hemicellulose

và lignin Để sản xuất đường từ biomass, biomass phải được tiền xử lý bằng acid hay enzyme để làm giảm kích thước vật liệu thô và mở cấu trúc thực vật Các phần của cellulose và hemicellulose bị phá vỡ bởi enzyme hay acid thành đường và sau

đó sẽ lên men thành ethanol

Brazin là nước tiên phong trong việc sử dụng nhiên liệu tái tạo Việc thay thế xăng bằng ethanol bắt đầu từ năm 1975, khi chính phủ Brasil phát động chương trình “Proálcool Program" Tại thời điểm cuộc khủng hoảng dầu lửa đầu tiên vào những năm 1970, cả nước phải nhập khẩu 85% dầu thì tiềm năng sản xuất ethanol

từ mía như một nhiên liệu vận chuyển phù hợp với chính sách của chính phủ về cung cấp năng lượng Chương trình “Proálcool Program" ưu đãi cho các nhà máy rượu và các công ty ô tô sản xuất xe hơi chỉ chạy bằng ethanol

Gần đây, ngành công nghiệp ethanol ở Brazin không được sự khuyến khích của chính phủ và nhiên liệu sinh học được phân phối bởi công ty dầu Petrobras Các hạm đội Brazin của 20 triệu xe hơi (gồm xe hơi, ánh sáng quảng cáo, xe tải và xe buýt khoảng 24 triệu) chạy được xăng pha trộn có chứa 22-24% ethanol hay 100% ethanol Khí đốt tự nhiên cũng được sử dụng số lượng ít Sự tiêu thụ ethanol được

dự báo sẽ tăng lên khi số lượng xe chạy bằng cả xăng pha trộn hay bằng ethanol, được dự báo sẽ tăng từ 4 đến 15 triệu vào 2013.

Mĩ cũng đầu tư mạnh vào sản xuất nhiên liệu sinh học Liên minh châu Âu cũng đã tiến tới việc khuyến khích năng lượng tái sinh cho tương lai với những đạo luật về điều khoản sử dụng phương tiện giao thông tối thiểu cho các nước thành viên

Ở Việt Nam, công nghệ sản xuất ethanol đã được hình thành từ rất lâu, chủ yếu sản xuất từ rỉ đường mía làm ethanol cho ngành thực phẩm và công nghiệp

Cần có những nghiên cứ để làm sao tăng hiệu quả của quá trình sản xuất ethanol và tăng quá trình chuyển hóa biomass thành nhiên liệu bền vững thay thế nhiên liệu hóa thạch

1.4.2 Quá trình sản xuất bioethanol từ rơm rạ

1.4.2.1 Tiền xử lý

Tiền xử lý lignocellulose là cần thiết bởi vì quá trình thủy phân các nguyên liệu không được tiền xử lý xảy ra chậm và kết quả là sản lượng sản phẩm thấp Vài phương pháp tiền xử lý làm giảm sự kết tinh của cellulose Tiền xử lý cũng làm cho cellulose đến gần hơn với các enzyme phân hủy cellulose, điều này làm giảm chi phí quá trình xử lý

Nhiều phương pháp tiền xử lý khác nhau được sử dụng, có thể chia thành ba nhóm chính:

+ Hóa học ( acid hay kiềm)

+ Vật lý/ hóa lý

+ Phương pháp sinh học bằng vi sinh vật

Trong phương pháp tiền xử lý bằng phương pháp hóa học, ví dụ dùng acid, hemicellulose sẽ bị tấn côngvà phần lớn lignin bị loại bỏ

Không có một nguyên lý tiền xử lý chung nào và các nguyên liệu khác nhau sẽ

có phương pháp tiền xử lý khác nhau Vì nhiều enzyme phân hủy cellulose của nấm hoạt động ở pH thấp ( 4-5), tiền xử lý bằng acid dường như được ưu tiên trong khi enzyme nấm được chọn cho thủy phân

Tiền xử lý sinh học dùng vi sinh vật và các enzyme của chúng có những thuận lợi như: Nhu cầu năng lượng thấp, tạo chất thải thấp và ít tác động đến môi trường

Vài loài nấm đảm, ví dụ P chrysosporium, Streptomyces viridosporus, Phelebia

tremellosus, Pleurotus florida và Peurotus cornucopiaeđược chứng minh có khả năng tấn công lignin và carbohydrate, nó cũng được chứng minh có khả năng biến đổi nguyên liệu lignicellulose thành ethanol

1.4.2.2 Thủy phân

Sau khi tiền xử lý, cellulose và hemicellulose được thủy phân thành đường đơn ( hexose và pentose) bằng cách dùng cellulase và hemicellulase Enzyme chịu đựng nhiệt độ cao và pH thấp được dùng cho thủy phân vì hầu hết các kỹ thuật tiền xử lý hiện nay dựa vào acid và độ nóng Hơn nữa, enzyme chịu nhiệt có vài thuận lợi như hoạt tính chuyên biệt và tính ổn định cao, cải thiện toàn bộ quá trình thủy phân, từ

đó làm giảm chi phí Do bởi những hứa hẹn về enzyme nấm chịu nhiệt và acid nên chúng có tiềm năng tốt dùng để thủy phân lignocellulose ở quy mô công nghiệp

+ Exocellulase hay exobiohydrolase : Enzyme này thủy phân cellobiose từ đầu không khử của chuỗi glucan và cellodextrin, pH thích hợp 4-5, nhiệt độ thích hợp 37-600C

+ β-glucosidase hay cellobiase : Enzyme này thủy phân cellobiose và cellodextrin tạo thành glucose, nhiệt độ thích hợp 45-750C

- Cơ chế tác động của cellulase

Quá trình tác dụng của cellulase có thể chia thành những giai đoạn sau :

+ Quá trình hấp phụ enzyme lên xơ sợi

Có hai yếu tố quyết định năng lượng hấp phụ của protein lên bề mặt phân pha rắn/ lỏng là bản chất của bề mặt và lực liên kết giữa các phân tử Những tương tác này thường không mang bản chất cộng hóa trị, nói cách khác, các tương tác này thường tạo thành do liên kết hydro, lực tĩnh điện hoặc là tương tác giữa các nhóm

kỵ nước Các phân tử protein hay các ion khối lượng phân tử thấp đã hấp phụ trước trên bề mặt sẽ có ảnh hưởng đến sự hấp phụ mới Lực tĩnh điện góp phần vào việc hấp phụ của enzyme lên bề mặt phân pha, tuy nhiên không phải là yếu tố quyết định quá trình hấp phụ của protein

Protein là một polymer lưỡng cực, chứa cả điện tích dương và âm, điều này làm cho protein có bản chất của một phân tử hoạt động bề mặt Phần kỵ nước trong phân tử protein là những nhóm chứa nhân thơm như trong tryptophane, phenylalanine và tyrosine Thông thường, khi phân tử protein bị gấp khúc, các amino acid mang nhóm kỵ nước sẽ được giấu vào bên trong Tuy nhiên cũng có một vài phần kỵ nước được sắp xếp tại bề mặt ngoài của phân tử protein Chính các phần này tạo liên kết với các cơ chất mang bản chất kỵ nước nhờ vào tương tác giữa các phần kỵ nước và liên kết hidro Ái lực của protein sẽ tăng khi bản chất kỵ nước trong phân tử protein tăng mặc dù điều này sẽ ảnh hưởng tới tương tác tĩnh điện Một cách tổng quát, sự hấp phụ của phân tử protein lên bề mặt kỵ nước là bất thuận nghịch hơn sự hấp phụ lên bề mặt ưa nước Điều này bởi vì phân tử protein sẽ có một vài thay đổi một khi đã hấp phụ lên bề mặt kỵ nước

Bề mặt cellulose mang bản chất kỵ nước do giữa các mạch tạo liên kết hydro Cellulose tinh khiết không chứa nhóm mang điện Trong thực tế, điện tích bề mặt của các chất sẽ được tạo thành khi có sự phân bố các ion từ bề mặt đó

Tùy thuộc vào tính chất của protein và bề mặt hấp thụ mà tương tác điện tích- điện tích hay tương tác của các nhóm kỵ nước sẽ đóng vai trò quyết định cho quá trình

Điện tích của cellulase và sự hiện diện của nhóm không phân cực có thể dẫn tới sự hấp phụ không chọn lọc lên cả cellulose và lignin Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng cellulase hấp phụ lên cả lignin trong vật liệu lignocellulose Ngoài ra, đối với β- glucosidase không giống các enzyme cellulase khác không có trung tâm tạo liên kết CBD, enzyme này hấp phụ khá mạnh lên lignin đã được tách riêng

Rất cần thiết hạn chế tối đa việc hấp phụ không chọn lọc của cellulase lên lignin nếu muốn ứng dụng quá trình thủy phân enzyme một cách kinh tế Về mặt lý thuyết, công nghệ protein có thể làm thay đổi cấu trúc của cellulase để làm cho enzyme này hấp phụ chọn lọc hơn Tuy nhiên, khả năng hấp phụ của cellulase lên vùng cellulose kết tinh là yếu tố quan trọng trong quá trình thủy phân, vì vậy các tác động lên cấu trúc cần được tránh Hiện tại, vẫn chưa có nghiên cứu nào thành công trong việc thay đổi chuỗi acid amin của cellulase để làm cho enzyme này thủy phân vật liệu lignocellulose hiệu quả

Cellulase tương tác với bề mặt cellulose thông qua trung tâm liên kết cellulose -CBD và trung tâm hoạt động chính -CD Cellulase tạo được liên kết với cellulose

là nhờ vào trung tâm tạo liên kết CBD Đối với các chủng T reesi, CBD là trung

tâm gồm các phân tử nhỏ, gồm 36 amino acid Thông thường trung tâm liên kết có

3 amino acid tyrosine, chịu trách nhiệm cho việc liên kết với cellulose Trong CBD

I, một tyrosine được thay thế bằng tryptophane

Khác biệt trong cấu trúc của các loại enzyme (CBD I, CBDII, EG,…) sẽ dẫn đến ái lực khác nhau trong quá trình hấp phụ của các enzyme này lên cơ chất Đã có nhiều nghiên cứu về cấu trúc của các enzyme và sự liên hệ đến khả năng tạo liên kết với cellulose

+ Cơ chế tác động hiệp đồng của các enzyme

Từ những năm 1954, Gilligan và Reese đã chỉ ra rằng việc pha trộn cellulose

từ các nguồn nấm mốc khác nhau có thể làm tăng lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy phân Từ lúc đó, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm mô tả quá trình tác động hiệp đồng của các enzyme endo, exo cellulase

Nghiên cứu về tác động hiệp đồng của endo-exo công bố đầu tiên vào 1980 Sự tác động hiệp đồng của endo-exo có thể nói là nhằm mục đích tạo bề mặt tấn công mới cho exoglucanse Enzyme exo thường tấn công vào những cellulose đã bị cắt mạch (cellodextrin) có đầu là nhóm khử C (C chứa OH hemiacetal) hoặc không khử Trong khi đó, enzyme endo lại tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cellulose, tạo thành các cellodextrin, là các cơ chất thích hợp cho enzyme exo Exoglucanase

có những loại enzyme tấn công đặc trưng tùy theo tính chất khử được hay không khử được của nhóm đầu mạch Thật vậy, theo những nghiên cứu của Teeri và cộng

sự, nhóm khử đầu mạch của cellodextrin sẽ được định hướng vào trung tâm xúc tác của CBHI Trong khi đó, CBH II lại ưu tiên tấn công vào đầu không có nhóm khử của cellodextrin

Ngoài ra cũng có nhiều nghiên cứu về sự tác động hiệp đồng của các enzyme endo, exo có nguồn gốc nấm mốc và vi khuẩn Dựa trên các nghiên cứu này, enzyme cellulase có thể được pha trộn với các thành phần từ các nguồn gốc khác nhau nhằm tạo được một hệ enzyme có tác động mong muốn

Tóm tắt quá trình thủy phân (Hình 1.12)

• Enzyme endo-cellulase tấn công ngẫu nhiên vào mạch cellulose nhờ tạo liên kết bằng tương tác giữa CBD với cellulose, tạo thành các oligosaccharide

• Enzyme exo-cellulase tấn công vào cellulose và cả oligomer từ đầu đường khử và không khử thông qua tương tác của CBD với cellulose, tạo thành cellobiose và cả glucose

• β-glucosidase tấn công cellobiose và oligosaccharide tan, tạo glucose

Hình 1.12: Tóm tắt quá trình thủy phân của cellulase [38]

- Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

+ Ảnh hưởng của cấu trúc nguyên liệu

Cấu trúc tự nhiên của lignocellulose tạo ra nhiều cản trở đến quá trình tấn công của các tác nhân thủy phân Ngay cả quá trình thủy phân cellulose tinh khiết, tốc độ thủy phân cũng giảm theo thời gian Tốc độ phản ứng giảm dần theo thời gian vì một số lý do sau : Sự ức chế enzyme do sản phẩm, sự giảm của các phần cơ chất dễ thủy phân, enzyme bị bất hoạt hoặc bị giữ lại trong các lỗ xốp của cellulose

Hiệu suất quá trình thủy phân bị ảnh hưởng mạnh bởi tính chất của nguồn nguyên liệu Một cách tổng quát, gỗ mềm thường khó thủy phân hơn gỗ cứng Cấu trúc của nguyên liệu cùng với cơ chế tác động của các enzyme và cơ chất là hai yếu

tố chính làm hạn chế hiệu suất quá trình thủy phân

Khả năng tiếp cận vật liệu lignocellulosic của cellulase đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân Cellulose có bề mặt trong và ngoài, bề mặt ngoài bao gồm bề mặt bao quanh các xơ sợi, bề mặt trong là bề mặt do các mao quản bên trong xơ sợi tạo thành Nếu cellulose không được tiền xử lý, hiệu quả thủy phân thấp Xử lý loại bỏ hemicellulose (bằng tiền xử lý acid) sẽ làm tăng khả năng thủy

phân cellulose ( theo nghiên cứu của Grohmann) Grethlein đã giải thích rằng loại

bỏ hemicellulose sẽ làm tăng cấu trúc xốp đồng thời tăng bề mặt cellulose, làm cho enzyme dễ tấn công hơn Kích thước của các lỗ xốp lại liên quan đến độ trương nở của vật liệu Thật vậy, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, khi làm khô vật liệu lignocellulose, các mao quản sẽ bị mất đi, điều này làm giảm kích thước lỗ xốp và

vì vậy hiệu suất quá trình thủy phân giảm rõ rệt Hàm lượng và sự phân bố của lignin trong cấu trúc vật liệu có ảnh hưởng tới khả năng thủy phân của vật liệu đó Hiệu suất thủy phân thu được khá cao đối với các nguyên liệu đã được loại bỏ gần hết lignin

+ Ảnh hưởng của nhiệt độ

Giống như nhiều phản ứng enzyme khác, phản ứng thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase chịu ảnh hưởng lớn của nhiệt độ Tốc độ phản ứng thủy phân tăng theo nhiệt độ, tuy nhiên đến một nhiệt độ nhất định, tốc độ phản ứng sẽ giảm dần và đến mức triệt tiêu

Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Q10 để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40-

500C Riêng đối với enzyme cellulase, nhiệt độ tối ưu là 500C Những enzyme khác nhau đều có nhiệt độ tối ưu khác nhau

Nếu đưa nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi hoạt tính Ngược lại khi ở nhiệt độ 00C, enzyme sẽ bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ, hoạt tính của enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu

+ Ảnh hưởng của pH

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính Tuy nhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở môi trường acid yếu Một

số enzyme khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid Đối với enzyme cellulase, khoảng pH thích hợp là 4-5 trong đó tốt nhất là 4.8

+ Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng enzyme tăng vì sẽ có nhiều cơ chất

va chạm với enzyme tiến hành phản ứng Khi nồng độ cơ chất đủ lớn, các enzyme

bị bão hòa cơ chất, vì vậy tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng sẽ không thay đổi đáng kể

+ Ảnh hưởng của các chất kìm hãm

Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng

Các chất gây kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm các ion, các phần tử vô

cơ, các chất hữu cơ và cả protein Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào sinh vật Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Tùy thuộc vào bản chất chất kìm hãm người ta chia những chất kìm hãm: Chất kìm hãm cạnh tranh và chất kìm hãm không cạnh tranh Các chất kìm hãm không cạnh tranh thường gồm hai loại: Kìm hãm do sản phẩm phản ứng và kìm hãm do thừa cơ chất

Đối với enzyme cellulase, người ta nhận thấy, sản phẩm của phản ứng thủy phân, bao gồm cả cellobiose và glucose đều có tác động kìm hãm hoạt tính cellulase, đặc biệt là cellobiose

™ Enzyme xylanase

Hai loại enzyme chủ yếu tham gia vào quá trình phân hủy hemicellulose là endo-1,4-D-xylanase và endo-1,4-β-D-mannase trong đó endo-1,4-D-xylanase là tên thường gọi của xylanase Xylanase là một tác nhân sinh học thuộc nhóm enzyme thủy phân, chủ yếu xúc tác các phản ứng nội thủy phân các cầu nối 1,4-β-

D-xylosidic ở xylan và tạo ra xylose, nhờ đó phân hủy một phần hemicellulose giúp quá trình thủy phân hiệu quả hơn Xylanase hoạt động tốt ở pH 5.3, nhiệt độ tối thích là 550C

Xylan là thành phần phong phú nhất của hemicellulose chiếm trên 70% cấu trúc của chúng Xylan là cơ chất của xylanase, là một polymer liên kết 1,4 của xylose Dưới tác dụng của xylanase, xylan sẽ chuyển hóa thành nhiều sản phẩm khác nhau và cuối cùng tạo thành đường xylose

Cơ chế tác động của xylanase : Xylanase có hai tác động chính :

+ Tác dụng trực tiếp lên liên kết lignin- xylan

+ Xúc tác quá trình phân giải và hòa tan các xylan trong vách tế bào, làm cho lignin

dễ khuếch tán ra ngoài xơ sợi, đồng thời giải phóng các xylose (Hình 1.13)

Hình 1.13: Cơ chế hoạt động của xylanase

™ Laccase

Ngoài ra trong nấm rơm còn có enzyme laccase có khả năng phân giải lignin, làm cho sự gắn kết của lignin với các thành phần cellulose và hemicellulose lỏng lẻo, tạo điều kiện cho enzyme cellulase và hemicellulase tác động tốt hơn

Laccase là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, chúng được tìm thấy ở thực vật, nấm, một số vi khuẩn và côn trùng, chúng liên quan đến nhiều quá trình khác nhau trong đó có tổng hợp và phân hủy lignin Laccase lần đầu tiên được phát hiện đầu

tiên ở cây Rhus vernicifera vào 1883 Laccase từ nấm được nghiên cứu và khảo sát rất kỹ đặc biệt là laccase từ ngành nấm đảm Basidomyces Ngoài ra các các loài nấm như Ascomyces, Deuteromyces, basidomyces và các loài nấm có khả năng phân hủy lignocellulose như: Agaricus bisporus, Botrytis cinerea, Chaetomium

themophilum,Coprius cinereus

Laccase là enzyme xúc tác sự oxi hóa của cơ chất và sử dụng electron mà chúng thu được để khử phân tử O2 thành nước Laccase có 4 phân tử đồng và có thể oxi hóa nhiều loại cơ chất đặc biệt là các hợp chất phenolic

- Cấu trúc phân tử laccase : Ba loại nguyên tử đồng có thể phân biệt : Loại 1 (T1), loại 2 (T2) và loại 3 (T3)

+ T1 tạo cho laccase có màu xanh nước biển đặc trưng khi được hấp thụ ở bước sóng xấp xỉ 600nm, thường liên kết 2 nguyên tử N2 từ 2 gốc histidines và sulphur từ gốc cystein, liên kết giữa đồng T1 và gốc histidine chịu trách nhiệm việc tạo màu xanh của laccase

+ T2 thì không tạo màu, liên kết với 2 gốc histidine bảo thủ và có tính chất hấp phụ điện tử tạo phổ điện tử mạnh

+ Trong khi đó T3 chứa một cặp nguyên tử đồng tạo liên kết với 6 gốc histidine bảo thủ và không tạo phổ hấp thụ điện tử, có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh

- Cơ chế xúc tác của laccase

Trung tâm nguyên tử đồng một (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hóa cơ chất

Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều

ở trạng thái khử (Cu+) Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời 4 electron từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptide bảo thủ His-Cys-His Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nước.(Hình 1.14)

Hình 1.14 Cơ chế xúc tác của laccase [2]

khả năng chịu ethanol cao Tuy nhiên, S.cerevisiae không thể sử dụng hiệu quả

xylose như nguồn Carbon hay lên men nó thành ethanol [26]

Hình 1.15: Nấm men Saccharomyces cerevisiae

Pichia stipitis là nấm men phổ biến nhất trong các chủng nấm men có thể lên

men đường 5C P.stipitis có ưu điểm: Hiệu suất tiêu thụ xylose cao, chịu nhiệt độ và

nồng độ cơ chất cao Tuy nhiên bị ức chế bởi ethanol nồng độ cao

Sự tạo thành ethanol từ glucose phải trải qua nhiều giai đoạn, cơ chế quá trình được thể hiện trong hình 1.16

Glyceraldehyd – 3 – Phosphat Dihydro aceton

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

+ Nhiệt độ

Mỗi vi sinh vật đều có một khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng

Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 28-320C Ở nhiệt độ cao, hoạt tính nấm men giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm vi sinh vật như vi khuẩn lactic và nấm men hoang dại Ở nhiệt độ 300C, nấm men hoang dại

phát triển nhanh hơn Saccharomyces 2-3 lần, còn ở nhiệt độ 35-380C chúng phát triển gấp 6-8 lần Mặt khác khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều sản phẩm phụ như ester, aldehyd và tổn thất ethanol theo CO2 sẽ tăng

+ pH

Nồng độ ion H+ trong canh trường sẽ ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu của các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định, trạng thái này phụ thuộc vào pH của canh trường

Trong điều kiện lên men ethanol, pH tối ưu để tạo ethanol là 4.5-5.0 Nếu pH thấp khoảng 3.0-4.0 nấm men còn hoạt động được và vi khuẩn bị ức chế pH hơi cao hơn thì sẽ tạo ra sản phẩm có độ chua thấp, sản phẩm dễ bị nhiễm khuẩn và các sản phẩm phụ trong quá trình lên men sẽ tạo nhiều hơn, lên men có hiệu suất thấp

+ Nồng độ của dịch lên men

Nếu nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men Kết quả là ethanol nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà cả nấm men Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn hao nguồn nguyên liệu và phải kéo dài thời gian lên men Hơn nữa nếu nồng độ đường của dịch lên men thấp thì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men và làm cho nấm men không đủ chất dinh dưỡng để phát triển

Thông thường nồng độ dịch đường được giới hạn ở 22% khối lượng hoặc ít hơn (nếu cao hơn thành tế bào có thể bị vỡ)

+ Thời gian

Thời gian cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng nấm men,…

Thời gian lên men được tính bắt đầu từ khi cấy chủng nấm men vào môi trường lên men, nhưng thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng môi trường lên men

cụ thể và tùy thuộc vào mục đích lên men mà ta dừng quá trình lên men

Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men phải cho dịch đường tiếp xúc với oxy Lúc này nấm men cần oxy để tích lũy một lượng sinh khối cần thiết cho quá trình lên men

Tiếp theo để chuyển hóa đường thành ethanol, nấm men phải được phát triển trong điều kiện yếm khí hoàn toàn Vì trong môi trường này, sự hô hấp của nấm men bị ức chế và bắt đầu phải tìm lại năng lượng bằng con đường lên men Để đáp ứng năng lượng cần thiết thì nấm men cần phân hủy một lượng đường lớn và đường

sẽ chuyển hóa thành ethanol và CO2 Đó là nguyên nhân nếu muốn có ethanol nhiều thì không được thoáng khí môi trường Nếu có oxy thì trong giai đoạn này rượu sẽ tiếp tục chuyển hóa thành acid lactic làm sản phẩm bị chua

+ Nồng độ CO 2 trong môi trường

CO2 được hình thành trong quá trình lên men rượu từ đường Một phần sẽ tồn tại trong môi trường; một phần tách lên trên bề mặt môi trường; phần còn lại tích tụ thành một lớp ngăn cách giữa không khí và môi trường CO2 tích tụ trong môi trường chỉ làm giảm khả năng sinh sản của nấm men, nhưng không thể làm cho khả năng lên men của nấm men yếu đi

Trong môi trường có hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thoát ra ngoài, dẫn đến ức chế sinh sản của nấm men và sự lên men có hiệu suất thấp CO2 nằm trong khoảng không giữa bề mặt môi trường và không khí có tác dụng kiềm chế sự phát

triển của những vi sinh vật hiếu khí gây hại Do vậy, các thùng lên men phải có nút đặc biệt chỉ cho phép CO2 bay ra mà không cho không khí vào

+ Thành phần các chất dinh dưỡng trong môi trường lên men

Môi trường nuôi cấy cần phải có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng chủ yếu là glucid ở dạng monosaccharide và disaccharide, nitơ ở dạng acid amin, các muối vô

cơ, trừ dạng muối nitrit, nitrat, các vitamin và muối khoáng

+ Hàm lượng giống nấm men

Nấm men là nhân tố tạo ra quá trình lên men, chuyển hóa đường thành ethanol

và khí carbonic Mỗi loại nấm men có khả năng lên men khác nhau Cùng loài nấm men, nhưng ở những điều kiện lên men khác nhau thì khả năng lên men khác nhau

và sản phẩm của quá trình lên men cũng khác nhau Việc bổ sung tỷ lệ giống lên men cũng phải được lựa chọn Thông thường lượng men giống cấy vào 15 triệu tế bào/ml dịch lên men

Tóm lại quá trình sản xuất bioethanol từ nguyên liệu lignocellulose được tóm tắt trong hình 1.17

Hình 1.17: Qúa trình sản xuất ethanol từ nguyên liệu lignocellulose [26]