Xác định hàm lượng đạm tổng và melamine trong sữa bằng phương pháp cực phổ

HOÀNG THỊ THÁI THANH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐẠM TỔNG VÀ MELAMINE TRONG SỮA BẰNG PHƯƠNG PHÁP CỰC PHỔ Chuyên ngành: HOÁ PHÂN TÍCH LUẬN VĂN THẠC SĨ: HOÁ PHÂN TÍCH NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS

HOÀNG THỊ THÁI THANH

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐẠM TỔNG VÀ MELAMINE TRONG SỮA

BẰNG PHƯƠNG PHÁP CỰC PHỔ

Chuyên ngành: HOÁ PHÂN TÍCH

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HOÁ PHÂN TÍCH

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS CÙ THÀNH SƠN

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2011

điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn TS Cù Thành Long, TS Nguyễn Trọng Giao đã hướng dẫn chi tiết về lý thuyết cơ bản của thiết bị trước khi em bắt đầu thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh đã dạy dỗ, truyền đạt cho em nhiều kiến thức quí báu trong suốt thời gian ngồi trên giảng đường đại học và sau đại học

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị em ở Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng đã hỗ trợ và giúp đỡ em hoàn thành tốt đề tài này

Con xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ và mọi người trong gia đình luôn động viên và ủng hộ con

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Mục lục i

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vẽ, đồ thị ix

MỞ ĐẦU xiii

Chương 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Giới thiệu chung về phương pháp cực phổ 1

1.1.1 Sơ đồ nguyên l ý 1

1.1.2 Nội dung phương pháp 2

1.1.3 Các tín hiệu kích thích dùng trong cực phổ 3

1.1.4 Dung dịch nền 4

1.1.5 Điện cực giọt thuỷ ngân 5

1.1.6 Dòng khuếch tán (phương trình Ilkovic) 7

1.1.7 Phương trình sóng catod 8

1.1.8 Phương trình sóng oxi hoá 8

1.1.9 Kỹ thuật cực phổ sóng vuông 8

1.1.10 Phương pháp tích góp hoà tan 11

1.2 Giới thiệu chung về máy ANALYZER SQF-505 13

1.2.1 Nguyên lý hoạt động của máy 13

1.2.1.1 Sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm 13

1.2.1.2 Tích góp hoà tan (Stripping) – sóng vuông quét nhanh trên cực

giọt chậm 16

1.2.1.3 Tích góp hoà tan (Stripping) – sóng vuông quét nhanh trên cực giọt tĩnh hay cực rắn 17

1.2.2 Giới thiệu phần cứng của máy 18

1.2.2.1 Hệ thống điện cực 18

1.2.2.2 Máy chủ 18

1.2.2.3 Máy tính, máy in 18

1.2.2.4 Khả năng phân tích các chất vô cơ 19

1.2.2.5 Khả năng phân tích các chất hữu cơ 20

1.3 Giới thiệu chung về đạm tổng và phương pháp phân tích đạm tổng 21

1.3.1 Khái quát chung về protein 21

1.3.2 Giới thiệu chung về đạm tổng 21

1.3.3 Phương pháp Kjeldahl xác định hàm lượng nitơ tổng 23

1.3.4 Định lượng protein theo phương pháp Lowry 24

1.3.5 Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ 24

1.4 Giới thiệu chung về melamine và các phương pháp phân tích 25

1.4.1 Giới thiệu chung về Melamine 25

1.4.2 Các phương pháp phân tích Melamine 28

Chương 2: XÁC ĐỊNH ĐẠM TỔNG BẰNG KỸ THUẬT CỰC PHỔ SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM 29

2.1 Thiết bị và hoá chất 29

2.1.1 Hoá chất 29

2.1.2 Thiết bị 30

2.2 Tối ưu hoá điều kiện phân tích 31

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch natri acetate 31

2.2.2 Khảo sát pH dung dịch nền 33

2.2.3 Khảo sát tỉ lệ natri acetate và formaldehyde 35

2.2.4 Kết luận 37

2.3 Khảo sát các thông số máy 38

2.3.1 Thế bắt đầu và thế kết thúc quá trình quét 38

2.3.2 Bước thế 39

2.3.3 Biên độ xung 41

2.3.4 Thời gian giọt thuỷ ngân rơi Tdrop :42

2.3.5 Kết luận 44

2.4 Xây dựng đường chuẩn 45

2.5 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) theo phương pháp hồi qui tuyến tính 49

2.6 Qui trình phân tích đạm tổng trong mẫu sữa 50

2.6.1 Qui trình xử lý mẫu và công thức tính hàm lượng đạm :50

2.6.2 Đo dung dịch mẫu với máy ANALYSER SQF-505 52

2.6.3 So sánh kết quả thu được với kết quả của TRUNG TÂM 3 52

2.6.4 Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD (relative standard deviation) theo công thức 53

Chương 3: XÁC ĐỊNH MELAMINE BẰNG PHƯƠNG PHÁP CỰC PHỔ TÍCH GÓP HOÀ TAN – SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM 54

3.1 Hoá chất và thiết bị 54

3.1.1 Hoá chất 54

3.1.2 Thiết bị 54

3.2 Tối ưu hoá điều kiện phân tích 55

3.2.1 Khảo sát pH dung dịch 55

3.2.2 Khảo sát nồng độ dung dịch nền Natri acetat 57

3.2.3 Kết luận 59

3.3 Khảo sát thông số máy điện hoá ANALYZER SQF-505 59

3.3.1 Thế bắt đầu và thế kết thúc quá trình quét 59

3.3.2 Bước thế 63

3.3.3 Biên độ xung 64

3.3.4 Thời gian giọt thuỷ ngân rơi T drop 66

3.3.5 Thế tích góp V electrolyze 67

3.3.6 Thời gian tích góp T electrolyze 69

3.3.7 Thời gian ổn định T stabilize 71

3.3.8 Kết luận 71

3.4 Dựng đường chuẩn để khảo sát độ tuyến tính 71

3.4.1 Đường chuẩn ở mức nồng độ vài trăm ppb 71

3.4.2 Đường chuẩn ở mức nồng độ ppm 74

3.4.3 Kết luận 77

3.4.4 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của máy bằng phương pháp tín hiệu đối với tiếng ồn (S/N = signal to noise) 78

3.5 Qui trình phân tích melamine trong mẫu sữa 81

3.5.1 Mô tả qui trình và công thức tính 81

3.5.2 Kết quả đo mẫu sữa bột dinh dưỡng VINAMILK 83

3.5.3 Khảo sát giới hạn phát hiện của phương pháp (method detection limit = MDL) và giới hạn định lượng của phương pháp (MQL - method quantitation limit) 84

3.6 Khảo sát hiệu suất thu hồi R% và độ chính xác RSD của phương pháp tại mức giới hạn định lượng 87

Chương 4: KẾT LUẬN 90

4.1 Xác định tổng đạm trong mẫu sữa bột 90

4.2 Xác định melamine trong mẫu sữa bột 90 4.3 Kiến nghị 91

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Điều kiện phân tích một số cation 19

Bảng 1.2: Những nhóm chức có thể cho tín hiệu khử trực tiếp trên máy ANALYZER SQF-505 20

Bảng 1.3: Hệ số Jones để chuyển đổi hàm lượng nitơ thành hàm lượng protein trong một số mẫu đặc trưng 23

Bảng 2.1: Bảng kết quả khảo sát nồng độ dung dịch nền Natri axetat 31

Bảng 2.2: Bảng kết quả khảo sát pH dung dịch nền Natri axetat 33

Bảng 2.3: Bảng kết quả khảo sát tỉ lệ Natri axetat : HCHO trong dung dịch nền 35

Bảng 2.4: Bảng kết quả khảo sát chiều quét thế ion ammonia 38

Bảng 2.5: Bảng kết quả khảo sát bước thế để xác định ion ammonia 40

Bảng 2.6: Bảng kết quả khảo sát biên độ xung để xác định ion ammonia 41

Bảng 2.7: Bảng kết quả khảo sát thời gian giọt thuỷ ngân rơi để xác định ion ammonia 43

Bảng 2.8: Bảng kết quả đo ion ammonia tại các nồng độ khác nhau bằng máy ANALYZER SQF-505 45

Bảng 2.9: Bảng kết quả giá trị phân tích hồi qui khi xây dựng đường chuẩn ion ammonia bằng máy cực phổ ANALYZER SQF 505 48

Bảng 2.10: Bảng kết quả phân tích đạm tổng các mẫu sữa bột dinh dưỡng VINAMILK 52

Bảng 3.1: Cường độ dòng (nA) của peak Melamine 0.5 ppm được đo tại các pH khác nhau của dung dịch Natri acetate 0.5 M 55

Bảng 3.2: Cường độ dòng (nA) của peak Melamine 1.0 ppm được đo tại pH 11.5 trong dung dịch nền Natri axetat có nồng độ khác nhau 58

Bảng 3.3: Bảng kết quả của quá trình quét thế dung dịch MELAMINE (Nồng độ Melamine là 0.5 ppm) với Vstart khác nhau và Vstop = -1000 mV 60 Bảng 3.4: Bảng kết quả của quá trình quét thế dung dịch MELAMINE với chiều quét thế khác nhau 61 Bảng 3.5: Bảng kết quả của quá trình quét thế dung dịch MELAMINE với Vstep khác nhau 63 Bảng 3.6: Bảng kết quả của quá trình quét thế dung dịch MELAMINE với các V pulse khác nhau 65 Bảng 3.7: Bảng kết quả của quá trình quét thế dung dịch MELAMINE với các thời gian giọt thuỷ ngân rơi khác nhau 66 Bảng 3.8: Bảng kết quả của quá trình quét thế dung dịch MELAMINE với các V electrolize khác nhau 68 Bảng 3.9: Bảng kết quả của quá trình quét thế dung dịch MELAMINE với các T electrolize khác nhau 70 Bảng 3.10: Bảng kết quả của quá trình quét thế dung dịch MELAMINE tại các giá trị nồng độ ppb khác nhau 72 Bảng 3.11: Bảng kết quả giá trị phân tích hồi qui khi xây dựng đường chuẩn 73 Bảng 3.12: Bảng kết quả của quá trình quét thế dung dịch MELAMINE tại các giá trị nồng độ ppm khác nhau 75 Bảng 3.13: Bảng kết quả giá trị phân tích hồi qui khi xây dựng đường chuẩn

MELAMINE ở mức nồng độ ppm bằng máy cực phổ ANALYZER SQF 505 76 Bảng 3.14: Bảng kết quả giá trị đo các dung dịch nền trắng bằng máy cực phổ

ANALYZER SQF 505 78 Bảng 3.15: Bảng kết quả xác định melamine trong mẫu sữa bột dinh dưỡng Vinamilk 83 Bảng 3.16: Bảng kết quả giá trị đo các dung dịch mẫu trắng bằng máy cực phổ

ANALYZER SQF 505 85

Bảng 3.17: Bảng kết quả giá trị đo các dung dịch mẫu có thêm melamine bằng máy cực phổ ANALYZER SQF 505 88

DANH SÁCH CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Sơ đồ nguyên lý đo cực phổ 1

Hình 1.2: Sóng cực phổ của dung dịch nền và chất oxi hoá .2

Hình 1.3: Các tín hiệu kích thích dùng trong phương pháp cực phổ 4

Hình 1.4: Mô tả sự hình thành và thời gian sống của một giọt thuỷ ngân rơi tự do 6

Hình 1.5: Sự hình thành tín hiệu kích thích trong kỹ thuật cực phổ sóng vuông 10

Hình 1.6: Sự hình thành tín hiệu dòng của phản ứng thuận nghịch 11

Hình 1.7: Tín hiệu kích thích cho quá trình xác định ion kim loại bằng phương pháp cực phổ tích góp hoà tan 12

Hình 1.8: Máy điện hoá ANALYZER SQF-505 13

Hình 1.9: Nguyên lý hoạt động của phương thức đo sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm “SQW-F” 15

Hình 1.10: Sơ đồ nguyên lý đo của kỹ thuật stripping - sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm 16

Hình 1.11: Sơ đồ nguyên lý đo của kỹ thuật stripping trên cực tĩnh 17

Hình 1.12: Công thức cấu tạo MELAMINE 26

Hình 1.13: Melamine (màu xanh) dễ dàng kết hợp với axít cyanuric (màu đỏ) qua liên kết hydro tạo kiểu liên kết phân tử hình mái ngói, lắng đọng và gây sỏi thận 27

Hình 2.1: Đồ thị biểu diễn cường độ peak theo nồng độ nền Natri acetat 32

Hình 2.2: Sóng ion ammonia [NH4] = 2 ppm với những nồng độ dung dịch Natri axetat khác nhau 32

Hình 2.3: Đồ thị biểu diễn cường độ peak theo pH dung dịch Natri acetat 34

Hình 2.4: Sóng ion ammonia [ ]  4 NH = 3 ppm với những pH dung dịch Natri axetat khác nhau 34

Hình 2.5: Đồ thị biểu diễn cường độ peak theo tỉ lệ Natri axetat : HCHO trong dung

dịch nền 36

Hình 2.6: Sóng ion ammonia [NH4] = 2 ppm với những dung dịch nền tỉ lệ Natri axetat : HCHO khác nhau 37

Hình 2.7: Sóng ion ammonia [ ]  4 NH = 2 ppm với hai cách quét thế khác nhau 39

Hình 2.8: Sóng ion ammonia [ ]  4 NH = 2 ppm với các bước thế khác nhau 40

Hình 2.9: Đồ thị biểu diễn cường độ peak theo nồng độ nền Natri acetat 41

Hình 2.10: Sóng cực phổ ion ammonia khi thay đổi biên độ xung 42

Hình 2.11: Đồ thị biểu diễn cường độ peak theo nồng độ nền Natri acetat 43

Hình 2.12: Đồ thị biểu diễn cường độ peak theo nồng độ nền Natri acetat 44

Hình 2.13: Các thông số chạy máy ANALYZER SQF-505 để xác định ion ammonia

45

Hình 2.14: Sóng cực phổ của ion ammonia tại các nồng độ khác nhau (sóng từ thấp đến cao ứng với nồng độ từ thấp đến cao trong bảng 2.8) 46

Hình 2.15: Đường chuẩn ion ammonia 49

Hình 2.16: Mẫu sữa bột và các mẫu được thêm chuẩn 53

Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi cường độ peak Melamine theo giá trị pH dung dịch (Nồng độ Melamine là 0.5 ppm) 56

Hình 3.2: Các sóng cực phổ Melamine (Nồng độ Melamine là 0.5 ppm) tại các giá trị pH dung dịch nền khác nhau 57

Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ dung dịch nền và cường độ dòng của sóng cực phổ melamine 58

Hình 3.4: Các sóng cực phổ Melamine (Nồng độ Melamine là 1 ppm) trong dung dịch nền NaAc có nồng độ khác nhau 59

Hình 3.5: Các sóng cực phổ Melamine (Nồng độ Melamine là 0.5 ppm) với Vstart khác nhau và Vstop = -1000 mV 60

Hình 3.6: Các sóng cực phổ Melamine ở hai mức nồng độ khác nhau với chiều quét

thế khác nhau 62

Hình 3.7: Các sóng cực phổ Melamine với Vstep khác nhau 64

Hình 3.8: Các sóng cực phổ Melamine với Vpulse khác nhau 65

Hình 3.9: Các sóng cực phổ Melamine với T drop khác nhau 67

Hình 3.10: Các sóng cực phổ Melamine với Velectrolize khác nhau 69

Hình 3.11: Các sóng cực phổ Melamine với Telectrolize khác nhau 70

Hình 3.12: Các thông số tối ưu để đo dung dịch Melamine bằng máy ANALYZER SQF-505 71

Hình 3.13: Các sóng cực phổ Melamine với nồng độ khác nhau 72

Hình 3.14: Đường chuẩn Melamine ở mức nồng độ ppb, đo bằng máy ANALYZER SQF-505 74

Hình 3.14: Các sóng Melamine ở các mức nồng độ ppm, đo bằng máy ANALYZER SQF-505 75

Hình 3.15: Đường chuẩn Melamine ở mức nồng độ ppm, đo bằng máy ANALYZER SQF-505 77

Hình 3.16: Tín hiệu nền của dung dịch trắng MELAMINE 79

Hình 3.17: Sóng Melamine ở mức nồng độ LOD = 72ppb, đo bằng máy ANALYZER SQF-505 80

Hình 3.18: Sóng Melamine ở mức nồng độ LOQ = 92.72 ppb, đo bằng máy ANALYZER SQF-505 81

Hình 3.19: Sóng cực phổ của các mẫu sữa bột dinh dưỡng vinamilk (không phát hiện MELAMINE) 84

Hình 3.20: Sóng cực phổ của các mẫu sữa bột dinh dưỡng vinamilk trắng melamine

86

Hình 3.21: Sóng cực phổ của các mẫu sữa bột dinh dưỡng vinamilk trắng melamine

87

Hình 3.22: Sóng cực phổ của melamine trong dung dịch mẫu và các sóng cực phổ của mẫu được thêm chuẩn 88 Hình 3.23: Đường chuẩn của dung dịch mẫu được thêm melamine theo phương pháp 89

Các loại thực phẩm như sữa bột hay thức ăn gia súc, … cần được xác định hàm lượng đạm để biết được giá trị dinh dưỡng dung nạp vào con người hay gia súc sử dụng loại thực phẩm đó Tuy nhiên, gần đây với sự xuất hiện của melamine trong thực phẩm làm sai lệch kết quả phân tích hàm lượng đạm thực sự trong mẫu Vì vậy, nếu chúng ta xác định được hàm lượng đạm tổng và hàm lượng melamine trong mẫu thì có thể tìm ra được lượng đạm thực sự cũng như có thể loại trừ được các sản phẩm nhiễm melamine gây hại cho sức khoẻ con người

Có rất nhiều phương pháp phân tích đạm tổng và melamine khác nhau như đã nêu trong phần giới thiệu chung ở trên Nhưng chủ yếu các phòng kiểm nghiệm dùng phương pháp Kjendahl để xác định đạm tổng và kỹ thuật LC-MS/MS để xác định hàm lượng melamine

Máy sắc ký khối phổ thì rất đắt, giá thành phân tích cao, thời gian chuẩn bị mẫu khá lâu, cán bộ vận hành máy phải có trình độ Do đó, chúng ta nên thử nghiệm với một kỹ thuật phân tích melamine khác nhằm giảm giá thành và thời gian phân tích để phục vụ cho công tác kiểm nghiệm nhanh melamine nhưng vẫn đảm bảo được độ đúng

và độ chính xác

Hơn nữa, ta có thể phân tích cả hai chỉ tiêu đạm tổng và melamine trong sữa bột chỉ trên một máy ANALYZER 505, cùng hoá chất không đắt tiền, quá trình phân tích tương đối nhanh, chúng ta có thể đánh giá được chất lượng thật sự của sản phẩm với chi phí thấp

Chương 1:

TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về phương pháp cực phổ [3], [7]:

1.1.1 Sơ đồ nguyên l ý:

 Nguồn điện một chiều (Voltage supply)

 Biến trở nhằm thay đổi thế áp vào hai điện cực (Variable Resistor)

 Volt kế chỉ giá trị thế áp vào hai điện cực

 Ampe kế chỉ cường độ dòng trong mạch

 Tế bào điện phân gồm:

 Điện cực làm việc (working electrode): là nơi phản ứng oxi hoá khử xảy ra trên bề mặt điện cực vài mm2 để tạo ra dòng giới hạn

 Điện cực so sánh (reference electrode): có giá trị thế là hằng số (SCE)

 Điện cực hỗ trợ (Counter electrode): được làm bằng kim loại trơ (Pt), không tham gia vào phản ứng oxi hoá khử, chỉ làm cầu nối để tạo thành mạch điện

 Dung dịch điện ly (supporting electrolyte): là dung dịch muối kiềm, không tạo phản ứng với chất điện ly, nhưng tạo ra độ dẫn

Hình 1.1: Sơ đồ nguyên lý đo cực phổ

1.1.2 Nội dung phương pháp:

 Phương pháp cực phổ ghi lại sự biến thiên cường độ dòng khi thay đổi thế áp vào hai điện cực (điện cực chỉ thị và điện cực giọt thuỷ ngân) trong quá trình điện phân

 Sóng cực phổ (Voltammograms) là đường biểu diễn của dòng (i) và thế áp vào (Eappl)

Hình 1.2: Sóng cực phổ của dung dịch nền và chất oxi hoá

 Khi thế áp vào hai điện cực được nhúng trong dung dịch có chứa ion có khả năng tham gia phản ứng điện cực còn nhỏ thì chưa có quá trình điện hoá xảy ra, dòng không đáng kể

 Nếu thế áp vào tiếp tục tăng, các chất trong dung dịch tham gia phản ứng điện hoá A + ne-  P, cường độ dòng tăng lên và cứ như thế thế tăng đến một giá trị tới hạn,

P

khi mà toàn bộ số phân tử tham gia phản ứng điện cực tại bề mặt điện cực bằng không (có bao nhiêu chạy đến bề mặt điện cực đều phản ứng hết) lúc đó chúng ta có dòng giới hạn (limiting current)

 Nếu trong dung dịch chứa một số phân tử tham gia phản ứng điện hoá ở những vùng khác nhau về thế, trên đường dòng thế sẽ thu được nhiều cường độ giới hạn

 Hai giá trị đặc trưng của phương pháp cực phổ là:

 Thế bán sóng E1/2 là giá trị của E khi

2

gh i

i  , thế bán sóng là một đại lượng đặc trưng cho một chất điện hoạt trong môi trường (pH, ligand) nhất định Giá trị E1/2 cho biết bản chất của chất điện hoạt, và gần bằng Eo

 Dòng giới hạn igh tỉ lệ với nồng độ của chất điện hoạt trong dung dịch

kC

i gh 

1.1.3 Các tín hiệu kích thích dùng trong cực phổ:

 Hình 1.3 mô tả 4 dạng sóng của các tín hiệu kích thích thường dùng:

 Tín hiệu kích thích cực phổ cổ điển là quá trình quét thế tuyến tính, thế áp vào tế bào điện hoá tăng tuyến tính theo thời gian Xem hình 1.3 (a)

 Hai tín hiệu kích thích dạng xung trong hình 1.3 (b) và (c): dòng được đo tại những thời gian khác nhau trong suốt thời gian áp xung

 Dạng sóng hình tam giác được mô tả trong hình 1.3 (d): thế được lặp lại theo chu kỳ giữa hai giá trị, đầu tiên thế tăng tuyến tính đến đỉnh, rồi từ đó giảm tuyến tính cùng hệ số góc về giá trị ban đầu

 Ứng với các tín hiệu kích thích đó là các kỹ thuật cực phổ được ứng dụng, xem cột “type voltammetry” trong hình 1.3

 Cực phổ quét thế tuyến tính

 Cực phổ xung vi phân

 Cực phổ sóng vuông

Cực phổ vòng

Hình 1.3: Các tín hiệu kích thích dùng trong phương pháp cực phổ

1.1.4 Dung dịch nền :

Một chất được làm nền phải thoả mãn các điều kiện sau:

 Phải khử hoặc oxi hoá ở thế âm hoặc dương xa đối với chất cần phân tích, nên những dung dịch muối kim loại kiềm và kiềm thổ, các dung dịch acid được sử dụng làm nền

 Nồng độ dung dịch nền phải  0.1M

 Không phản ứng hoá học với chất cần xác định

 Nếu tạo phức được với chất cần xác định càng tốt Khi trong dung dịch có những chất cũng tham gia phản ứng điện cực gần giá trị với thế chất xác định, nếu phức tạo nên có hằng số không bền nhỏ sẽ dịch chuyển thế phản ứng điện cực của chất xác định ra xa các chất ảnh hưởng

1.1.5 Điện cực giọt thuỷ ngân:

 Điện cực giọt thuỷ ngân (dropping mercury electrode (DME)) được sử dụng là điện cực làm việc trong phương pháp cực phổ

 Mô tả cấu tạo: Một mao quản nhỏ được nối với bình chứa thuỷ ngân Hệ thống được thiết kế sao cho giọt thuỷ ngân chảy từ bình chứa thuỷ ngân qua mao quản và rơi

tự do xuống trong dung dịch diện ly với một tốc độ kiểm soát được Xem hình 1.4

 Đặc trưng cho mỗi giọt thuỷ ngân là: diện tích bề mặt giọt thuỷ ngân (mm2), và thời gian sống của giọt thuỷ ngân (t - giây) Đối với một mao quản nhất định, thời gian sống của giọt thuỷ ngân rơi tự do là một hằng số

 Giá trị dòng thay đổi khi giọt thuỷ ngân lớn dần và rơi xuống Xem hình 1.4

Hình 1.4: Mô tả sự hình thành và thời gian sống của một giọt thuỷ ngân rơi tự do

 Ưu điểm của điện cực giọt Hg:

 Bề mặt điện cực luôn luôn sạch

 Đạt được giá trị dòng là hằng số nhanh

 Rất nhiều quá trình điện hoá xảy ra cho sản phẩm tan trong thuỷ ngân tạo nên hỗn hống nên bề mặt điện cực vẫn mạnh

 Quá thế của Hg cao, đối với kim loại có Eo âm rất nhiều cũng có thể đo được mà không hình thành H2

 Khuyết điểm của điện cực giọt Hg:

 Hg dễ bị oxi hoá, giới hạn sử dụng để làm anode là E < +0.4 V

2Hg + 2Cl-  Hg2Cl2 + 2e

- Hg độc

1.1.6 Dòng khuếch tán (phương trình Ilkovic):

KC C t m nD

Trong đó:

n: số electron D: hệ số khuếch tán (cm2s-1) m: tốc độ dòng của mao quản thuỷ ngân (mg/s) t: thời gian giọt thuỷ ngân (s)

C: nồng độ chất phân tích (mM)

 Dựa vào phương trình (1.1) người ta tiến hành định lượng bằng phương pháp cực phổ Đồ thị chuẩn đi qua gốc toạ độ

 Ảnh hưởng của độ cao cột Hg đến giá trị id: khi thay đổi chiều cao cột Hg thì tốc

độ chảy Hg (m) và chu kỳ tạo giọt (t) sẽ thay đổi theo, m tỉ lệ thuận và t tỉ lệ nghịch với chiều cao cột Hg (h)

 Ảnh hưởng nhiệt độ: khi nhiệt độ của môi trường thay đổi làm thay đổi các thông số vật lý của ion trong dung dịch Khi nhiệt độ tăng lên, độ linh động của ion cũng tăng Khi nhiệt độ thay đổi, độ nhớt của dung dịch điện ly cũng thay đổi theo Ngoài ra, tốc độ chảy Hg (m) và chu kỳ tạo giọt (t) cũng sẽ thay đổi theo Vì vậy, nhiệt

độ thay đổi làm thay đổi giá trị id Theo thí nghiệm thực tế và tính toán, người ta nhận thấy cứ tăng lên 1oC thì giá trị cường độ dòng tăng 1.7% Để đảm bảo sai số không quá 1%, thực nghiệm chỉ cho phép chênh lệch nhiệt độ giữa hai lần thí nghiệm không quá 0.5 oC

] [ lg ]

[

] [ lg

P

A n

E red

ox n

K

K n E

1.1.8 Phương trình sóng oxi hoá:

red

ox O

K

K n

 Chiều dài của mỗi bước trên từng bậc và chu kỳ của xung () được sử dụng khoảng 5 ms

 Bước thế của mỗi bậc E s điển hình là 10 mV

 Cường độ xung 2E thường là 50 mV

 Hoạt động dưới các điều kiện này, tần số xung tương ứng là 200 Hz, quét 1-V yêu cầu 0.5 s

 Đối với phản ứng khử thuận nghịch, kích thước của xung phải đủ lớn để có thể đảo xung oxi hoá sản phẩm đã hình thành trước đó

 Vì vậy, ta xem hình 1.6, xung trước làm phát sinh dòng cathode i1, trong khi đó xung đảo làm phát sinh dòng anode i2

 Sự chênh lệch giữa hai dòng anode và cathode i được vẽ thành sóng cực phổ

Sự chênh lệch này tỉ lệ trực tiếp với nồng độ, thế của đỉnh cũng tương ứng với thế bán sóng cực phổ

 Vì tốc độ đo lường, nó có khả năng và thực hành tăng độ chính xác của chất phân tích do tín hiệu được quét nhiều lần và lấy trị trung bình Giới hạn phát hiện đối với kỹ thuật cực phổ sóng vuông là 10-7 đến 10-8 M

 Ứng dụng: dùng định lượng nhiều hợp chất, đơn chất hữu cơ và vô cơ, bao gồm

cả lĩnh vực hoá sinh và sinh học

Hình 1.5: Sự hình thành tín hiệu kích thích trong kỹ thuật cực phổ sóng vuông







s E



2

1 i i

Hình 1.6: Sự hình thành tín hiệu dòng của phản ứng thuận nghịch

A: dòng thuận i1; B: dòng đảo i2; C: dòng chênh lệch i1-i2

1.1.10 Phương pháp tích góp hoà tan:

 Đây là phương pháp khác với các quá trình điện hoá khác ở bước khởi đầu

 Đầu tiên, chất phân tích được tích tụ tại điện cực Sau một chu kỳ đo chính xác, ngắt quá trình điện phân và quá trình khuấy trộn, chất phân tích đã tích tụ được xác định bằng một trong các kỹ thuật điện hoá hiện có Trong bước thứ hai của quá trình, chất phân tích được hoà tan lại từ điện cực

 Trong phương pháp tích góp hoà tan anode, điện cực làm việc đóng vai trò là cathode trong bước tích tụ, và đóng vai trò là anode trong bước hoà tan, đối với chất phân tích sẽ bị oxi hoá về lại dạng ban đầu

 Trong phương pháp tích góp hoà tan cathode, điện cực làm việc đóng vai trò là anode trong bước tích tụ, và đóng vai trò là cathode trong bước hoà tan

 Bước tích tụ làm giàu chất điện hoạt, nghĩa là nồng độ của chất phân tích trên bề mặt điện cực lớn hơn nhiều trong dung dịch ban đầu Nhờ vào kết quả của bước làm

2

1 i i

E

n(  1/ 2 ),

A current,

A B

C

giàu, phương pháp tích góp có giới hạn phát hiện thấp nhất so với các quá trình điện hoá khác

 Hình 1.7 minh hoạ quá trình áp thế kích thích theo thời gian để tiến hành phương pháp tích góp hoà tan anode xác định các ion kim loại trong dung dịch điện ly Dùng phương pháp điện hoá quét thế tuyến tính để phân tích sau khi tích tụ chất phân tích trên bề mặt điện cực làm việc

Hình 1.7: Tín hiệu kích thích cho quá trình xác định ion kim loại bằng phương pháp

cực phổ tích góp hoà tan

 Phương pháp cực phổ tích góp hoà tan có ý nghĩa quan trọng trong việc phân tích hợp chất hàm lượng vết với độ chính xác cao Các chất phân tích ở mức nồng độ khoảng 10-6 đến 10-9 M trở nên khả thi khi sử dụng phương pháp này

1.2 Giới thiệu chung về máy ANALYZER SQF-505 [1]:

Hình 1.8: Máy điện hoá ANALYZER SQF-505

1.2.1 Nguyên lý hoạt động của máy:

Máy ANALYZER SQF-505 có thể hoạt động trên ba phương thức đo:

 Sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm (giọt rơi tự do)

 Tích góp hoà tan (Stripping) – sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm

 Tích góp hoà tan (Stripping) – sóng vuông quét nhanh trên cực giọt tĩnh hay cực rắn

1.2.1.1 Sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm:

Nguyên l ý hoạt động của phương pháp này như sau:

 Nhúng vào dung dịch nền (dung dịch có các chất điện ly thích hợp) có chứa chất cần phân tích 3 điện cực:

 Cực làm việc là một cực giọt Hg có tốc độ chảy ổn định khoảng 10 s/giọt

 Cực so sánh là cực Ag/AgCl/KCl bão hoà có thế không đổi

 Cực hỗ trợ là cực Pt

 Ta đặt lên cực làm việc hai thành phần thế: thế một chiều tăng dần theo thời gian dạng hình bậc thang với các bước thế 2; 4; 6; 8; 10 mV Thế xoay chiều là các xung vuông góc có giá trị biên độ xung 10; 20; 30; 40 mV với tần số vài trăm Hz Để triệt tiêu dòng tụ điện gây nhiễu cho tín hiệu cần đo, ta tiến hành ghi cường độ dòng Faraday xoay chiều ở đầu xung và cuối xung của một giọt Hg đang rơi tự nhiên với tốc

độ chậm Phần mềm cho phép thể hiện sự biến đổi của cường độ dòng Faraday xoay

chiều theo thế một chiều Đường thu được gọi là phổ sóng vuông quét nhanh Phổ thường chứa nhiều đỉnh Mỗi đỉnh ứng với một chất hay một giai đoạn phản ứng điện hoá của một chất Thế của đỉnh chính là E1/2, với một dung dịch nền xác định, đó là một giá trị đặc trưng cho mỗi chất và thường dùng cho mục đích phân tích định tính Chiều cao của đỉnh (cường độ dòng Faraday xoay chiều) hay diện tích (công suất tạo sóng) tỷ lệ thuận với nồng độ chất tham gia phản ứng điện hoá trên cực làm việc nên được dùng cho mục đích định lượng

Hình 1.9: Nguyên lý hoạt động của phương thức đo sóng vuông quét nhanh trên cực

giọt chậm “SQW-F”

1.2.1.2 Tích góp hoà tan (Stripping) – sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm:

 Đây là kỹ thuật phân tích điện hoá cho phép tăng độ nhạy lên vài lần so với kỹ thuật sóng vuông quét nhanh SQW-F Có thể dùng kỹ thuật này để phân tích khá nhiều chất vô cơ và hữu cơ

 Nguyên lý hoạt động của phương thức đo này như sau: một điện cực giọt thuỷ ngân chảy rất chậm, khoảng 10 giây một giọt, là điện cực làm việc (working electrode) Phần mềm cho phép đặt một giá trị thế một chiều tuỳ ý để tích góp chất cần phân tích trên bề mặt của một giọt thuỷ ngân đang lớn dần lên Sau quá trình này máy sẽ tự động tiến hành quét phổ theo chế độ sóng vuông quét nhanh SQW-F

Hình 1.10: Sơ đồ nguyên lý đo của kỹ thuật stripping - sóng vuông quét nhanh trên cực

giọt chậm

1.2.1.3 Tích góp hoà tan (Stripping) – sóng vuông quét nhanh trên cực giọt tĩnh hay cực rắn:

 Đây là kỹ thuật phân tích có độ nhạy rất cao dùng để phân tích siêu vết Trong những năm trước đây, kỹ thuật này chủ yếu dùng cho phân tích vô cơ Gần đây kỹ thuật này đã được dùng để phân tích siêu vết một số chất hữu cơ và đã mở ra hướng giải quyết mới cho vệ sinh an toàn thực phẩm liên quan tới yêu cầu phân tích siêu vết các thuốc kháng sinh, thuốc trừ sâu, chất kích thích tăng trưởng…

 Trong kỹ thuật này, cực thuỷ ngân tĩnh hay cực rắn là điện cực làm việc (working electrode) Đầu tiên, chất phân tích được tích góp với một thế một chiều không đổi trong quãng thời gian từ 30 giây đến 5 phút tuỳ theo nồng độ chất phân tích trong mẫu cao hay thấp Điện cực quay hay máy khuấy được sử dụng để tăng hiệu quả quá trình tích góp Sau quá trình tích góp, một thời gian ổn định khoảng vài giây, phép

đo được tiến hành

 Máy SQF-505 hoạt động bằng cách dùng máy khuấy thay cho kiểu dùng cực quay

Hình 1.11: Sơ đồ nguyên lý đo của kỹ thuật stripping trên cực tĩnh

1.2.2 Giới thiệu phần cứng của máy:

 Cực so sánh: Ag/AgCl/KCl của hãng RADIOMETER

 Cực hỗ trợ: cực Platin của hãng RADIOMETER, hay dây Platin tinh khiết

1.2.2.2 Máy chủ:

Được chế tạo từ các vi mạch của các hãng có uy tính của Mỹ, Nhật

1.2.2.3 Máy tính, máy in:

Hệ thống tương thích với máy tính và máy in thông dụng

1.2.2.4 Khả năng phân tích các chất vô cơ:

Bảng 1.1: Điều kiện phân tích một số cation

1.2.2.5 Khả năng phân tích các chất hữu cơ:

Bảng 1.2: Những nhóm chức có thể cho tín hiệu khử trực tiếp trên máy ANALYZER

SQF-505

1.3 Giới thiệu chung về đạm tổng và phương pháp phân tích đạm tổng:

1.3.1 Khái quát chung về protein:

Protein được phát hiện lần đầu tiên ở thế kỷ XVIII (1745 bởi Beccari); mới đầu được gọi la allbumin (lòng trắng trứng) Mãi đến năm 1838 , Mulder lần đầu tiên đưa

ra thuật ngữ protein (xuất phát từ chữ Hy lạp proteos nghĩa là “đầu tiên”, “quan trọng nhất”

Như đã biết protein là hợp chất hữu cơ có ý nghĩa quan trọng bậc nhất trong cơ thể sống Về mặt số lượng, nó chiếm không dưới 50% trọng lượng khô của tế bào Về thành phần cấu trúc, protein được tạo thành chủ yếu từ các amino acid qua liên kết peptide Cho đến nay người ta đã thu được nhiều loại protein ở dạng sạch cao có thể kết tinh được và đã xác định được thành phần các nguyên tố hoá học, thông thường trong cấu trúc của chúng gồm bốn nguyên tố chính là C H O N với tỷ lệ C  50%, H  7%, O  23% và N  16% Đặc biệt tỷ lệ N trong protein khá ổn định Ngoài ra trong protein còn gặp một số nguyên tố khác như S  0-3% và P, Fe, Zn, Cu

Khối lượng phân tử (được tính bằng Dalton) của các loại protein thay đổi trong những giới hạn rất rộng, thông thường từ hàng trăm cho đến hàng triệu Ví dụ: insulin

có khối lượng phân tử bằng 5.733, glutamat-dehydrogengenase trong gan bò có khối lượng phân tử bằng 1.000.000…

Từ lâu, đã biết rằng protein tham gia mọi hoạt động sống trong cơ thể sinh vật, từ việc tham gia xây dưng tế bào, mô, đến tham gia hoạt động xúc tác và nhiều chức năng khác v.v Cùng với acid nucleic, protein là cơ sở vật chất của sự sống

1.3.2 Giới thiệu chung về đạm tổng:

Trong nhiều năm, hàm lượng protein trong thức ăn được xác định dựa vào hàm lượng nitơ, và phương pháp Kjeldahl hầu như được ứng dụng chủ yếu để xác định hàm lượng nitơ (AOAC, 2000) Hàm lượng nitơ được nhân với một hệ số để tính ra hàm lượng protein Dựa trên những nghiên cứu trước đây, hàm lượng nitơ trung bình trong

protein được ước tính là khoảng 16%, nên hàm lượng protein được tính bằng hàm lượng nitơ nhân với 6.25

Tuy nhiên, việc sử dụng hệ số 6.25 là không phù hợp cho tất cả các mẫu thực phẩm

vì hai lý do Thứ nhất, không phải tất cả nitơ trong thức ăn đều tồn tại dưới dạng protein, mà có thể có nhiều dạng khác nhau như: amino acids tự do, nucleotides, creatine và choline, đây được gọi là nitơ không phải protein (NPN = non-protein nitrogen) Thứ hai, hàm lượng nitơ của các amino acid đặc thù (phần trăm về khối lượng) khác nhau theo khối lượng phân tử amino acid và số lượng nitơ có mặt trong phân tử Dựa trên nghiên cứu thực tế, hàm lượng nitơ trong protein dao động từ 13% đến 19%, nên hệ số chuyển đổi là từ 5.26 đến 7.69

Năm 1941, Jones đã đề nghị các hệ số chuyển đổi hàm lượng nitơ tổng thành hàm lượng protein trong một số mẫu thực phẩm, và hệ số này được gọi là hệ số Jones Xem bảng 1.1 Với những loại thực phẩm không xác định được hệ số chuyển đổi cụ thể thì

ta dùng hệ số chung là 6.25

Bảng 1.3: Hệ số Jones để chuyển đổi hàm lượng nitơ thành hàm lượng protein

trong một số mẫu đặc trưng

Nội nhũ

5.83 6.31 5.70 Đậu

Đậu nành Đậu phộng

5.30 5.71 5.46

1.3.3 Phương pháp Kjeldahl xác định hàm lượng nitơ tổng [11]:

Phương pháp này được ứng dụng để xác định hàm lượng nitơ tổng trên nhiều mẫu khác nhau, ví dụ như thịt, ngũ cốc, thức ăn, nước thải, đất, v.v…

Phương pháp Kjeldahl gồm 3 bước chính:

 Vô cơ hoá mẫu bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác

Hợp chất có N + H2SO4 → (NH4)2SO4 + H2O + CO2 + một số ion khác

 Dùng một kiềm mạnh (NaOH hoặc KOH) đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4

(NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O

 Sau đó hứng NH3 vào dung dịch acid có nồng độ xác định Dùng kiềm có nồng

độ xác định để chuẩn độ acid dư Từ đó tính được lượng nitrogen có trong mẫu

2NH3 + 2H2SO4 → (NH4)2SO4 + H2SO4 (NH4)2SO4 + H2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + (NH4)2SO4 + 2H2O

1.3.4 Định lượng protein theo phương pháp Lowry:

Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng máy đo màu để xác định màu sản phẩm khử của phosphomolipden - phosphowolframate (thuốc thử Folin - Ciocalteau) với phức hợp đồng - protein Phức màu xanh tạo thành có thể đo ở bước sóng 675nm Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein Dựa vào đồ thị chuẩn protein (thông thường dùng tinh thể albumin huyết thanh bò) ta có thể tính được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu

Phương pháp Lowry được dùng rộng rãi để xác định nhiều loại protein khác nhau Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện được protein trong dung dịch ở nồng độ 1 g/ml Tuy nhiên cường độ màu còn tuỳ thuộc nhiều vào loại protein

Ví dụ, ở cùng một nồng độ, dung dịch trypsin cho cường độ màu cao gấp 3 lần gelatin, hemoglobin cho cường độ màu thấp hơn trypsin nhưng cao hơn gelatin

Ngoài ra, nhiều chất khác có thể làm tăng hay giảm cường độ màu phản ứng, vì vậy phương pháp này cho kết quả chính xác khi xác định protein đã được tinh sạch

1.3.5 Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ:

Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch là độ hấp thụ tia cực tím của nó Nếu protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối của nó được tính theo giá trị đo được Nếu protein không tinh sạch (ví dụ, dịch chiết từ một sắc ký) thì nồng độ của protein tổng được tính tương đối từ độ hấp thụ Nguyên tắc của phương pháp này

là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280nm do các acid amin thơm như tryptophan, tyrosine và phenylalanine Độ hấp thụ ở 280nm thay đổi tuỳ loại protein nhưng hệ số tắt đo được (nghĩa là độ hấp thụ của dung dịch protein 1% với đường sóng truyền qua 1cm) cho mỗi protein cho phép tính nồng độ của protein tinh sạch

Với một hỗn hợp các protein hoặc với bất cứ một loai protein nào mà không biết hệ

số tắt thì nồng độ protein được tính như sau:

Nồng độ protein (mg/ml)=1,55xA280-0,77xA260

Trong đó: A280: độ hấp thụ ở bước sóng 280nm

A260: độ hấp thụ ở bước sóng 260nm

Phương pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp hơn 0,1mg/ml hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng cực tím (ví dụ, đệm, acid nucleic và một số chất béo), hoặc khi protein ở trong dịch huyền phù chứ không phải trong dung dịch (Ví dụ, trong màng hoặc các phức hợp có trọng lượng phân tử lớn) Cũng cần chú ý là nếu tỷ lệ A280/A260 thấp hơn 0,6 nghĩa là dung dịch protein chưa sạch, bị lẫn các chất khác, đặc biệt với acid nucleic thì nên sử dụng phương pháp Lowry để đo nồng độ protein

Vì vậy, phương pháp đo độ hấp thụ tia cực tím thường được dùng để định lượng protein đã tinh sạch hoặc để xác định protein trong các phân đoạn nhận được khi sắc

ký tách các protein qua cột

1.4 Giới thiệu chung về melamine và các phương pháp phân tích:

1.4.1 Giới thiệu chung về Melamine:

Tên gọi: 2,4,6-Triamino-s-triazine; Cyanurotriamide; Cyanurotriamine; Cyanuramide

Công thức phân tử: C3H6N6