NGHIÊN CỨU TẠO PHÁT SINH PHÔI SOMA TỪ PHÔI NON MỘT SỐ DÒNG THÔNG NHỰA Pinus merkusii Jungh. et de Vriese

Khả năng đặc biệt này của các tế bào soma có thể trải qua quá trình biệt hóa tế bào thành phôi soma cho phép thiết lập một hệ thống mô hình có giá trị để phục vụ nghiên cứu cơ bản về sự

-o0o -

BÙI QUANG KIỆT

NGHIÊN CỨU TẠO PHÁT SINH PHÔI SOMA TỪ PHÔI

NON MỘT SỐ DÒNG THÔNG NHỰA Pinus merkusii

Jungh et de Vriese

CHUYÊN NGÀNH: SINH LÝ THỰC VẬT

MÃ SỐ: 60 42 302

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS VƯƠNG ĐÌNH TUẤN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH-2010

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

TS Vương Đình Tuấn - đã tận tình hướng dẫn, động viên và đóng góp nhiều ý kiến quý báu

Cảm ơn các cô chú, anh chị ở Viện nghiên cứu khoa học lâm nghiệp Nam Bộ, đã quan tâm, giúp đỡ và hỗ trợ trong thời gian tiến hành đề tài tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn:

− Ban giám hiệu ĐH Khoa học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh

− Phòng đào tạo sau đại học

− Ban chủ nhiệm khoa Sinh học

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn

TP Hồ Chí Minh 12/2010

Bùi Quang Kiệt

MỞ ĐẦU

Thông nhựa hay còn gọi là thông hai lá có tên khoa học là Pinus merkusii

Jungh et de Vriese, là một trong số ít những loài thông nhiệt đới trên thế giới Thông

nhựa phân bố nhiều ở vùng Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam

Thông nhựa chủ yếu được trồng để lấy nhựa phục vụ một số ngành công nghiệp

như sơn, sản xuất nhựa đường Nhựa thông được tinh chế để thu tinh dầu thông, phần

còn lại là Colophan được xà phòng hóa để làm xà phòng, làm keo trong sản xuất giấy

và một số ứng dụng trong công nghiệp điện, làm chất đốt v.v… Ngoài ra, gỗ thông còn

được dùng trong xây dựng, đóng đồ gia dụng Thông nhựa có thể sống ở những vùng

đồi trọc, đất đai khô cằn, nghèo dinh dưỡng nên được trồng để cải tạo môi trường và

chống xói mòn đất

Ở Việt nam, thông nhựa được trồng nhiều ở một số tỉnh như Quảng Ninh,

Quảng Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh và Lâm Đồng…Tuy nhiên, trong mấy năm gần đây (từ

2005-2007) rừng thông nhựa bị tấn công bởi nhiều loài sâu bệnh, đặc biệt là sâu róm,

gây thiệt hại rất lớn về kinh tế Vì vậy, việc tuyển chọn, lai tạo để tìm ra giống thông

nhựa có khả năng chống chịu cao với sâu bệnh, nhất là sâu róm đang là yêu cầu cấp

thiết của sản xuất

Hiện nay, việc nghiên cứu tạo chọn giống thông nhựa kháng sâu bệnh được tiến

hành chủ yếu là phương pháp truyền thống nên tốn rất nhiều thời gian để đưa một

giống mới vào sản xuất

Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ sinh

học thực vật đã đạt được những thành tựu quan trọng trong việc cải tạo giống cây

trồng Cụ thể, ở Canada người ta đã tạo được giống thông có khả năng chống chịu cao

với sâu ăn lá bằng cách bắn gen Bt vào loài Pinus strobus (Lachance và ctv 2007) Tuy

nhiên, để áp dụng kỹ thuật chuyển gene, một bước không thể thiếu được đó là xây

dựng hệ thống tái sinh in vitro vật liệu dự kiến chuyển gene Các tài liệu đã công bố

trên thế giới cho thấy ở chi thông, phần lớn kết quả chuyển gene thành công đều được

tiến hành trên vật liệu là thể tiền phôi soma

Vì thế, để đạt được mục tiêu là tạo được giống thông nhựa kháng sâu róm bằng kỹ

thuật chuyển gen, việc nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro thông qua con đường tạo

phôi soma là hết sức cần thiết

Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam, chưa có bất cứ một công trình nào được công bố về

hướng nghiên cứu này, vì thế, đề tài : “ Nghiên cứu tạo phát sinh phôi soma từ phôi

non một số dòng thông nhựa Pinus merkusii Jungh et de Vriese ” được đề xuất

nhằm tạo được nguồn vật liệu cho ứng dụng kỹ thuật chuyển gene Bt để tạo cây thông

nhựa kháng sâu róm trong tương lai Mặt khác, kỹ thuật tạo phôi soma còn là một kỹ

thuật nhân giống mới nhằm tạo ra hàng loạt cây con với số lượng lớn và có thể áp dụng

trên quy mô công nghiệp

Mục tiêu đề tài: xây dựng được kỹ thuật tạo phát sinh phôi soma hiệu quả

nhằm cung cấp nguồn vật liệu cho các nghiên cứu chuyển gene và nhân giống vô tính

thông nhựa

MỤC LỤC

Trang ƒ Trang tựa

ƒ Lời cảm ơn

ƒ Mục lục i

ƒ Danh mục chữ viết tắt v

ƒ Danh mục bảng vi

ƒ Danh mục hình vi

ƒ Danh mục ảnh vii

Mở đầu 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về chi Pinus 3

1.1.1 Phân loại Pinus merkusii 3

1.1.2 Phân bố 4

1.1.3 Đặc điểm sinh học 4

1.1.4 Giá trị kinh tế 5

1.1.5 Con đường sinh sản ở thông nhựa 6

1.2 Phôi soma và quá trình hình thành phôi soma 7

1.2.1 Sơ lược về phôi soma 7

1.2.2 Sự phát sinh phôi soma 8

1.2.3 Sơ lược quá trình nghiên cứu phôi soma 10

1.3 Tiềm năng phát sinh phôi soma 10

1.4 Các giai đoạn phát triển của phôi 11

1.4.1.2 Thiết lập chương trình phát sinh phôi 11

1.4.2 Các giai đoạn của sự phát sinh phôi 12

1.4.2.1 Các bước tạo phôi vô tính 13

1.4.2.1.1 Nuôi cấy tạo phôi 13

1.4.2.1.2 Nuôi cấy tăng sinh phôi 15

1.4.2.1.3 Giai đoạn tiền trưởng thành của phôi 15

1.4.2.1.4 Sự phát triển của phôi 15

1.4.2.2 Xây dựng bản đồ phát triển của phôi ở thực vật hạt trần 16

1.5 Một số giả thuyết trong quá trình phát sinh phôi soma 18

1.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh phôi soma 19

1.6.1 Nhân tố tác động đến quá trình cảm ứng 19

1.6.2 Nhân tố tác động đến sự gia tăng số lượng phôi 21

1.6.2.1 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật và nitơ khử 22

1.6.2.2 Kiểu di truyền thực vật 22

1.6.3 Nhân tố ảnh hưởng đến sự biệt hóa mô 22

1.7 Ứng dụng của quá trình tạo phôi soma 23

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Nội dung nghiên cứu 25

2.3 Vật liệu nghiên cứu 27

2.4 Phương pháp nghiên cứu 27

2.4.1 Thu quả non và xử lý vô trùng 27

2.4.2 Phương pháp cảm ứng tạo khối tiền phôi 27

2.4.3 Nghiên cứu sự tăng sinh của khối tiền 28

2.4.4 Nghiên cứu sự trưởng thành của phôi 28

2.4.6 Phương pháp sinh trắc nghiệm đo lượng hocmon nội sinh 28

2.4.7 Phương pháp đo cường độ hô hấp 30

2.5 Môi trường nuôi cấy 30

2.5.1 Môi trường cảm ứng 30

2.5.2 Môi trường duy trì và tăng sinh khối 31

2.5.3 Môi trường trưởng thành 31

2.6 Bố trí thí nghiệm 31

2.7 Các chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu 31

Chương 3: Kết quả và thảo luận 34

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến quá trình cảm ứng tạo khối tiền phôi 38

3.2 Cấu trúc hình thái trong quá trình cảm ứng tạo thể phát sinh phôi 38

3.3 Ảnh hưởng của nước dừa đến các biến đổi hình thái và giai đoạn nhân nhanh 39 3.4 Thí nghiệm ảnh hưởng của Glutamin đến các biến đổi hình thái và giai đoạn nhân nhanh khối sinh phôi 3

3.5 Thí nghiệm Ảnh hưởng của đường maltose và sucrose lên sự tăng sinh khối của PEM 47

3.6 Quan sát cấu trúc hình thái của khối phát sinh phôi trong quá trình phát triển 49

3.7 Ảnh hưởng của nồng độ ABA đến cấu trúc hình thái và tỷ lệ tạo phôi thành thục hóa 50

3.8 Các giai đoạn của quá trình phát sinh phôi soma 51

3.9 Kết quả đo cường độ hô hấp 54

3.10 Sự thay đổi hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong quá trình nuôi cấy 55

Chương 4:

KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO………59 PHỤ LỤC

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về chi Pinus:

Theo phân loại của Stefanovic và ctv.,1998, bộ Coniferales gồm 7 họ: Pinaceae,

Cupressaceae sensu lato, Araucariaceae,

Podocarpaceae, Cephalotaxaceae,

Taxaceae và Sciadopityaceae Pinaceae là

họ lớn nhất trong 7 họ, bao gồm 11 chi, tất

cả đều lưỡng tính, chứa 215 loài, hơn một

nửa các loài này thuộc chi Pinus

Chi Pinus chia làm 2 chi nhỏ: Strobus

(haploxylon) và Pinus (diploxylon)

Pinaceae được xem là họ phân bố ở bắc

bán cầu mặc dù có những ngoại lệ như: Pinus

caribaea và Pinus merkusii phân bố vùng nhiệt

1.1.2 Phân bố:

Pinus merkusii là một trong rất ít loài thông nhiệt đới trên thế giới có thể chịu được

khí hậu nóng ẩm, đất đai khô cằn và khí hậu gần biển Trên thế giới, cây phân bố

nhiều ở khu vực Đông Nam Á như Thái Lan, Lào, Myamar, Việt Nam, Philipine,

Campuchia…Ở Việt Nam thông nhựa phân bố nhiều ở các tỉnh miền trung và một số ở

các tỉnh đông bắc bộ: Thanh Hóa, Quảng Ninh, Hà Tĩnh, Nghệ An, Quảng Bình,

Quảng Trị, Lâm Đồng (Đà Lạt)… [2], [31]

1.1.3 Đặc điểm sinh học:

Pinus merkusii là cây gỗ lớn, cao trung bình 20 - 25 m, đường kính 60 - 70 cm có

khi tới 1m, thân cây thẳng và tròn, gốc không có

bạnh vè, vỏ dày màu nâu đỏ nhạt, nứt dọc sâu, tán

lá rộng hình tháp góc phân cành từ 25 - 80o, cành

cứng và giòn, hai lá kim mọc ra từ một bẹ, bẹ dài

1-1,5 cm, màu nâu nhạt (Lâm Công Định, 1977)

[1]

Pinus merkusii là loài cây lưỡng tính, nón đực mọc

ra ở các nách bẹ lá, có chiều dài từ 2 - 3 cm, màu

vàng nhạt, khi chín có màu vàng đậm

Là cây thụ phấn nhờ gió nên nón đực chủ yếu tập

trung ở những cành nằm phía dưới tầng tán lá, còn

nón cái ngược lại chủ yếu ở phần trên tán lá Nón

cái được mọc ra ở các đầu cành, thường có

2-4 nón, nón gồm nhiều vảy xếp hình xoắn

ốc, bên trong vảy có chứa noãn Noãn cái

chưa được thụ phấn có màu xanh nhạt, vảy giữa mở, nhưng sau khi được thụ phấn thì

vảy quả đóng lại và quả chuyển sang màu xanh đậm Khi quả chín có màu vàng xậm,

chiều dài quả 10-12 cm, đường kính quả 3-4 cm [2], [31]

Hình 1.3: Đặc điểm hình thái P.merkusii

(http://en.wikipedia.org)

Hạt thông nhựa hình trái xoan dài 3-4 cm và có cánh, cánh hạt dài 1-1,5 cm Khi hạt

chín vảy quả mở ra để hạt bay ra theo gió Thời gian để khi hạt chín đến bay ra khỏi

quả thường không quá một tháng Chu kỳ sai quả của thông nhựa là 2-3 năm (Lâm

Công Định, 1977) Thông nhựa là cây ưa sáng hoàn toàn, có khả năng tái sinh hạt rất

mạnh nhưng không có khả năng tái sinh chồi, cây dưới 5 tuổi có thể chịu bóng râm

nhẹ Tùy từng điều kiện sống và loại thông, có giai đoạn cây sinh trưởng rất chậm, cây

5-6 tuổi chiều cao thường không quá 2m, nhưng từ 10-25 tuổi cây sinh trưởng nhanh

nhất, sau đó lại giảm dần Rễ cọc ăn sâu và rộng, có khả năng liền rễ trong cùng một

cây và khác cây (Lâm Công Định, 1977; Lê Đình Khả và Hồ Viết Sắc, 1980)

1.1.4 Giá trị kinh tế:

Pinus merkusii là cây có giá trị công nghiệp toàn diện, cung cấp nhựa và gỗ Gỗ

có vân đẹp, mùi thơm, sợi dài, có nhiều đặc tính cơ lý tốt, gỗ bền, chống chịu được mối

mọt, không chỉ được dùng làm đồ mộc, xây dựng, nguyên liệu giấy mà nó còn được

làm cả tà vẹt và đóng đồ thủ công mỹ nghệ (Lâm Công Định,1977) Nhựa thông được

ứng dụng rộng rãi cho nhiều ngành công nghiệp Thành phần nhựa thông chứa

19-24,1% dầu terpentin; 73,2-77,5% colophan, còn lại là nước và chất tạp (Lâm Công

Định, 1977) Colophan là sản phẩm được dùng trong nhiều ngành công nghiệp xây

dựng và sản xuất sơn, cho công nghiệp kỹ thuật điện và công nghiệp luyện kim Còn

dầu terpentin được dùng trong các ngành công nghiệp sản xuất sơn và công nghiệp xây

dựng, chế biến các sản phẩm tẩy rửa và hoá chất (Lê Đình Khả và ctv, 1995; Hà Huy

Thịnh, 1999) Thông nhựa còn là cây được trồng để chống xói mòn, phủ xanh đất trống

đồi trọc vì có khả năng chịu hạn và sống trong điều kiện thổ nhưỡng khô cằn, khắc

nghiệt Vì thế thông nhựa được phát triển còn nhằm mục đích cải tạo môi trường ở

những vùng đất khô cằn, nghèo dinh dưỡng [1][31][32]

1.1.5 Con đường sinh sản ở thông nhựa

Chu kì sống của thông nhựa là chu kì

sống của thực vật lưỡng đơn bội có 5 đặc

tính chung:

(1) Tính dị bào tử hay (hay bào tử chuyên

biệt cho tính đực và tính cái)

(2) Thể giao tử đực và cái đa bào

(3) Sự duy trì thể giao tử cái bên trong bào

tử trưởng thành

(4) Thụ tinh qua ống phấn

(5) Phát tán của phôi trưởng thành [13]

Sự thụ phấn và thụ tinh ở thông nhựa

Thể bào tử cho ra 2 loại bào tử Túi bào tử cái giảm phân tạo ra các đại bào tử Túi bào

tử đực giảm phân tạo các tiểu bào tử đơn bội, sau đó nảy mầm để tạo ra thể giao tử đực

gọi chung là hạt phấn Sự thụ phấn là việc chuyển hạt phấn (thể giao tử đực), đến vùng

lân cận của thể giao tử cái Ban đầu, các giao tử đực không chín mà rơi ở giữa các vảy

bắc của nón và đáp trực tiếp lên noãn (nơi chứa các giao tử cái cũng chưa chín) Thể

giao tử đực nội bào tử tạo một ống phấn để đưa tinh tử đến gặp trứng và thực hiện quá

trình thụ tinh

Sau khi thụ tinh, phôi được hình thành qua các giai đoạn:

• Tế bào hợp tử phân đôi cho tế bào gốc và tế bào ngọn Tế bào ngọn chủ yếu hình

thành phôi, phân cắt dọc (thẳng góc với vách ngăn đầu tiên) thành bốn tế bào Các

tế bào này đến lượt chúng phân cắt ngang, hình thành một khối cầu 8 tế bào, đó là

giai đoạn tiền phôi

• Tiếp theo, mô phân sinh rễ mầm, mầm của điểm sinh dưỡng thân mầm và trụ dưới

lá mầm hình thành, phôi được phân hoá lớn lên nhanh hơn dây treo Tất cả các cơ

Hình 1.4: Chu kì sống thực vật lưỡng đơn bội [3]

quan mầm trước đây trải qua sự tăng trưởng để phát triển thành cây ở giai đoạn lá

mầm

• Dây treo có vai trò tạm thời, đẩy phôi vào sâu trong phôi tâm và phôi nhũ, lấy chất

dinh dưỡng để vận chuyển vào phôi

1.2 Phôi soma và quá trình phát sinh phôi soma

1.2.1 Sơ lược về phôi soma

Phôi soma, phôi dinh dưỡng, phôi vô tính hay phôi thể hệ đều là cùng một khái

niệm để mô tả một cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà dưới

những điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng hoàn

chỉnh Phôi soma chứa chất dinh dưỡng tương tự phôi hữu tính, có mầm chóp rễ và

chồi đỉnh nên có thể nảy mầm trực tiếp thành cây không qua giai đoạn phát sinh chồi,

rễ [6]

Hình 1.5: Các giai đoạn phát triển của phôi thực vật hạt kín và hạt trần

1.2.2 Sự phát sinh phôi soma

Phát sinh phôi soma là một quá trình trong đó các tế bào soma dưới các điều

kiện cảm ứng sẽ phát sinh các tế bào phôi thông qua một loạt các thay đổi về hình thái

và sinh hóa Sự phát sinh phôi soma khác với sự phát sinh phôi hợp tử là có thể kiểm

soát các điều kiện nuôi cấy khác nhau

Phát sinh phôi soma có các thuận lợi chính so với quá trình phát sinh phôi hữu tính là

kiểm soát được quá trình phát sinh phôi, điều khiển được môi trường nuôi phôi, dễ

dàng thu được một số lượng lớn phôi

Không giống với những cơ thể sinh vật khác, ở thực vật, tính toàn thế của tế bào không

chỉ có ở các tế bào của phôi hợp tử mà các tế bào soma cũng có mang tính toàn thế Sự

linh hoạt của chương trình biệt hóa giúp cho các tế bào đã biệt hóa vẫn hoàn toàn có

thể trở về giai đoạn sinh phôi dưới những điều kiện nhất định Sự lặp lại toàn bộ

chương trình phát sinh cơ thể thông qua việc khởi đầu sự tạo phôi đòi hỏi sự tái chương

trình hóa sự biểu hiện của những gen cần thiết Sau khi đã hoàn toàn thoát khỏi chức

năng trước đó của các tế bào đã biệt hóa, các tế bào soma mang tính toàn thế dưới tác

động cảm ứng phân chia của tế bào sẽ có trạng thái biến dưỡng tương tự như tế bào

trứng đã thụ tinh (Dénes và cộng sự, 1995)

Các tế bào soma của mô thực vật có khả năng trải qua quá trình phản biệt hóa để tạo

một khối các tế bào vô tổ chức, hay còn gọi là mô sẹo, cũng như là có khả năng tạo ra

các tế bào biệt hóa, có nghĩa là tạo các cơ quan bình thường về mặt hình thái và sinh lý

từ các tế bào soma

Từ tế bào trứng đã

được thụ tinh

Từ các tế bào túi phôi chưa thụ tinh

Từ các tế bào soma Từ các tiểu bào tử Từ các giao tử độc lập

hay được dung hợp

Phát sinh phôi in planta Phát sinh phôi in vitro

Hợp tử Vô tính Soma Giao tử

Sự sinh phôi hạt phấn Thụ tinh in vitro

Việc cảm ứng phát sinh phôi in vitro từ mô tế bào soma là một tiến trình phát triển thay

thế xảy ra khi phản ứng với việc thêm nồng độ cao của auxin hoặc các chất có chức

năng tương tự auxin như 2,4-D vào môi trường nuôi cấy Khả năng đặc biệt này của

các tế bào soma (có thể trải qua quá trình biệt hóa tế bào thành phôi soma) cho phép

thiết lập một hệ thống mô hình có giá trị để phục vụ nghiên cứu cơ bản về sự phát sinh

phôi vì tiến trình phát triển của quá trình phát sinh phôi soma có nhiều điểm tương

đồng với tiến trình phát triển của quá trình phát sinh phôi hợp tử (Zimmernman, 1993)

Tiềm năng phát sinh phôi của tế bào đòi hỏi phải có sự hiện diện của auxin trong môi

trường nuôi cấy khi tế bào hình thành các khối tiền phôi (PEM – ProEmbryogenic

Mass) Nếu loại auxin ra khỏi môi trường nuôi cấy, các khối tiền phôi này sẽ trải qua

quá trình biệt hóa và sau đó hình thành cây con Người ta cho rằng khi có sự hiện diện

của auxin, các khối tiền phôi sẽ tổng hợp tất cả các gene cần thiết để biệt hóa Như vậy,

có thể nói các điểm nhấn phát triển của các giai đoạn dường như được điều hòa ở mức

phiên mã, và quá trình phát sinh phôi thể hệ phải thông qua con đường truyền tín hiệu

trung gian mà auxin đóng vai trò là một điểm nhấn chuyển đổi [7]

Các đặc tính cơ bản của các tế bào có khả năng sinh phôi: Tế bào có kích thước

nhỏ, đẳng kính, có hoạt động biến dưỡng rất mạnh mẽ, cường độ tổng hợp acid

ribonucleic cao, thể tích không bào giảm, thể tích tế bào chất tăng, nhân và hạch nhân

rất to và đậm màu Đặc biệt là các tế bào này có một số lượng lớn các ribosome, ty thể,

hạt tinh bột và có mạng lưới nội chất nhỏ (Ammirato, 1987; Emons, 1994; Thorpe,

1988)

Mặc dù quá trình phát sinh phôi soma in vitro đã và đang được áp dụng rộng rãi trên

nhiều đối tượng thực vật ở các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhưng cơ chế sinh học

của quá trình này thì hầu như vẫn chưa được hiểu rõ Những điều kiện đặc biệt để kích

thích sự phát sinh phôi thì chỉ được thiết lập một cách máy móc theo kinh nghiệm vì

người ta vẫn chưa biết tại sao những kiểu gen hoặc mẫu cấy như vậy lại có tiềm năng

phát sinh phôi, tại sao và làm thế nào để đạt được khả năng đó, cũng như đâu là điểm

nhấn kích hoạt quá trình phát triển của phôi [7][28]

1.2.3 Sơ lược quá trình nghiên cứu tạo phôi soma:

Mặc dù sự tạo phôi vô tính bất định (apomictic adventive embryogeny) xuất

hiện ở một số loài thực vật hạt kín trong tự nhiên, các thí nghiệm cảm ứng hiện tượng

này cũng được tiến hành trong nuôi cấy tế bào thực vật in vitro và được mô tả bằng

thuật ngữ “somatic embryogenesis” Phát sinh phôi soma là một quá trình hình thành

phôi vô tính in vitro (Krishnaraj và Vasil, 1995) Những mô tả đầu tiên về sự hình

thành phôi vô tính trong nuôi cấy tế bào được Steward và cộng sự (1958) và Reinert

(1959) đưa ra khi nuôi cấy tế bào Cà rốt Cho đến nay quá trình hình thành phôi vô tính

đã được tiến hành thành công trên những cây một lá mầm thuộc các họ sau: Alliaceae,

Araceae, Asparagaceae, Dioscoreaceae, Gramineae, Henerocallidaeae, Iridaceae,

Liliaceae, Musaceae, Orchidaeae, Zingiberaceae [6]

1.3 Tiềm năng phát sinh phôi soma

Khả năng phát sinh phôi soma được biểu hiện trước hết là ở mức kiểu gen

(Kielly và Bowley, 1992; Moltrasio và cộng sự, 2004) Điều này có thể được chứng

minh dễ dàng bằng cách chuyển khả năng phát sinh phôi từ kiểu gen có khả năng phát

sinh phôi sang kiểu gen ngăn cản sự phát sinh phôi thông qua quá trình lai giống hữu

tính (Bowley và cộng sự, 1993; Kielly và Bowley, 1992; Moltrasio và cộng sự, 2004)

Mặc dù các điều kiện kích thích sự phát sinh phôi đã được thiết lập cho nhiều loài,

nhưng vẫn còn một số lượng lớn các loài chưa thể tạo phôi soma Thậm chí ngay trong

cùng một loài, có kiểu gen dễ tạo phôi nhưng cũng có kiểu gen ngăn cản sự tạo phôi

Tuy nhiên, cần phải nhấn mạnh rằng trong nhiều trường hợp, sự ngăn cản tạo phôi có

thể được giải quyết bằng cách tối ưu hóa các điều kiện sinh trưởng của cây hoặc bằng

cách chọn lựa mẫu cấy thích hợp (Krishna Raj và Vasil, 1995) Vì vậy, việc xác định

các đặc tính di truyền có thể chỉ được sử dụng để xác định thời điểm và vị trí biểu hiện

khả năng sinh phôi Do đó, khả năng phát sinh phôi chủ yếu được xác định thông qua

chương trình phát triển của thực vật cũng như những dấu hiệu của môi trường.[6]

1.4 Các giai đoạn phát triển của phôi [4], [26]

1.4.1 Các giai đoạn của sự phát sinh phôi hữu tính:

Sự phát triển của phôi có thể chia thành 2 bước chính sau đây ( Dodeman và ctv,

1997):

(i) Sự phát sinh phôi sensu stricto: ở thực vật hạt trần có thể chia thành 3 giai đọan

(Singh, 1978):

− Tiền phôi: tất cả giai đọan trước khi có sự kéo dài của dây treo

− Phôi sớm: tất cả giai đọan sau khi có sự kéo dài của dây treo và cho tới trước khi

hình thành đỉnh sinh trưởng rễ

− Phôi muộn: sự phát triển mô học mạnh mẽ, bao gồm sự thiết lập đỉnh sinh trưởng rễ

và chồi

(ii) Sự trưởng thành của phôi tiếp sau đó là sự nảy mầm.[5] [28]

1.4.1.1 Điều hòa sự phát triển của phôi:

Suốt quá trình phát triển của phôi, một số lượng gene khổng lồ cần được biểu

hiện để đảm bảo xuất phát từ một hợp tử, một tế bào phát triển tạo nên một cấu trúc đa

bào Có hơn 3.104 gen khác nhau biểu hiện ở phôi và cây con (Thomas,1993) Người ta

thấy rằng có khoảng 3500 gen khác nhau cần thiết để hoàn tất quá trình phát triển

phôi Trong số đó có khoảng 40 gen quyết định trực tiếp đến sự hình thành toàn bộ các

yếu tố cấu thành phôi Arabidopsis thaliana (Mayer và ctv, 1991) [6]

1.4.1.2 Thiết lập chương trình phát sinh phôi:

Có 2 cơ chế dẫn đến sự đa dạng trong các chương trình phát sinh phôi: sự phân

chia không cân xứng của các tế bào phân cực và sự quyết định chương trình sinh phôi

phụ thuộc vào vị trí mặt phẳng phân chia tế bào (Laux, Jurgens, 1997)

Mặt phẳng phân chia đóng vai trò quan trọng trong suốt quá trình hình thành phôi bởi

khi phân chia tế bào bao gồm phân chia tế bào chất và các phân tử điều hòa Kết quả

của việc phân chia bất đối xứng là các tế bào con sinh ra được thừa hưởng những thành

phần quyết định khác nhau từ tế bào chất, do đó mang những chương trình phát triển

khác nhau Một số yếu tố cần cho quá trình phiên mã được mã hóa bởi gen

SHORT-ROOT (SHR) cần cho sự phân chia bất đối xứng chịu trách nhiệm trong việc hình

thành mô nền Do vậy, yếu tố này được cho là có tham gia vào con đường truyền tín

hiệu bằng khuếch tán vòng (Helariutta và ctv.,2000) Giai đoạn phát triển tiếp theo của

tế bào được quyết định bởi các sự kiện được thiết lập từ trước, sau đó được truyền sang

các thế hệ tế bào tiếp theo Tuy nhiên, trừ giai đoạn đầu hình thành biểu bì, sự phát

triển mô phôi được quyết định bởi vị trí của tế bào hơn là việc truyền đạt thông tin

cứng nhắc như trên (Dawe, Freeling, 1991) Nói một cách chung nhất, sự thiết lập

chương trình tế bào trong sự phát triển phôi liên quan đến họat động của các protein

điều hòa, kết quả của sự biểu hiện các gen tại vị trí đó (Lindsey, Topping, 1993)

Mặc dù có sự liên lạc giữa các tế bào nhưng cơ chế phân tử của nó vẫn chưa được hiểu

rõ, tuy nhiên, theo Mayer và Jurgens (1998) thì sự trao đổi thông tin đó nhờ hai cơ chế:

tín hiệu được truyền qua bề mặt tế bào thông qua receptor của serine threonine kinase

có các vùng lặp lại giàu leucin và cơ chế trao đổi phân tử tín hiệu thông qua cầu liên

bào (Mayer, Jurgens, 1998)

Phân tích về dòng vô tính chỉ ra rằng các tế bào mầm được chuyên biệt bởi tín hiệu về

vị trí và ảnh hưởng của các tế bào ở vị trí cao nhất của đỉnh sinh trưởng chồi Nghĩa là

chỉ có thế hệ sau của các tế bào mầm ở vị trí này mới có tính toàn thể, còn những tế

bào rời bỏ vị trí này sẽ trở nên biệt hóa (Mayer và ctv.,1998; Bowman, Eshed,

2000).[6]

1.4.2 Các giai đoạn của sự phát sinh phôi vô tính:

Sự phát sinh phôi vô tính được định nghĩa là một quá trình trong đó cấu trúc lưỡng cực

giống phôi hữu tính phát triển từ một tế bào dinh dưỡng và không có liên kết mao

mạch với tế bào gốc ban đầu Sự phát sinh phôi vô tính xảy ra tương tự như một số giai

đoạn tương tự như phôi hữu tính Phôi vô tính có thể biệt hóa trực tiếp từ mẫu cấy

không cần đi qua trung gian giai đoạn tạo mô sẹo hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn

tạo mô sẹo (callus) (Williams, Maheswaran, 1986)

Phát sinh phôi vô tính là một quá trình gồm nhiều bước, khởi đầu bằng việc hình thành

khối tiền phôi (PEM), theo sau đó là sự hình thành phôi vô tính, phôi trưởng thành,

phôi ở giai đoạn miên trạng và cuối cùng là giai đoạn tái sinh cây

Sự tái sinh thực vật thông qua con đường phát sinh phôi vô tính gồm năm giai đoạn:

− Nuôi cấy tạo phôi bằng cách chọn lựa mẫu cấy sơ cấp cho vào môi trường bổ sung

chất điều hòa sinh trưởng (chủ yếu là auxin)

− Tăng sinh của quá trình nuôi cấy phôi trên môi trường rắn hoặc lỏng có bổ sung các

chất điều hòa sinh trưởng tương tự như trên

− Giai đoạn trước khi trưởng thành của phôi trong môi trường không có chất điều hòa

sinh trưởng, để ngăn sự tăng sinh và kích thích sự tạo phôi và phát triển sớm

− Giai đoạn phôi trưởng thành bằng cách nuôi cấy phôi trong môi trường bổ sung

ABA và/hoặc giảm áp lực thẩm thấu

− Sự phát triển của cây trên môi trường không có chất điều hòa tăng trưởng.[5][6]

1.4.2.1 Các bước tạo phôi vô tính:

1.4.2.1.1 Nuôi cấy tạo phôi:

Các tế bào dinh dưỡng thực vật có chứa đầy đủ các thông tin di truyền cần thiết

để tạo nên một cơ thể thực vật có chức năng hoàn chỉnh Việc cảm ứng quá trình phát

sinh phôi trước hết phải tác động để kết thúc sự biểu hiện gen hiện tại và thay nó bằng

chương trình biểu hiện gen phát sinh phôi Một cơ chế có thể ngừng biểu hiện gen là

methyl hóa DNA, có thể tiến hành bằng auxin (LoSchiavo và ctv, 1989)

Người ta cho rằng các chất điều hòa sinh trưởng và stress đóng vai trò trung tâm trong

điều hòa truyền tín hiệu, dẫn đến tái thiết lập chương trình biểu hiện gen Điều này dẫn

đến kết quả là cảm ứng một loạt các phản ứng phân chia tế bào, dẫn đến tăng trưởng

khối mô sẹo (callus) không tổ chức hoặc tăng trưởng có cực, từ đó đưa đến phát sinh

phôi (Dudits và ctv,1995) Việc khởi động con đường phát sinh phôi chỉ giới hạn ở một

vài loại tế bào nhất định của mô sơ cấp hoặc các tế bào có khả năng họat hóa các gen

liên quan đến phát sinh phôi

Hai cơ chế quan trọng trong phát sinh các tế bào phôi in vitro là : sự phân chia tế bào

bất đối xứng và sự kéo dài tế bào (de Jong và ctv, 1993b; Emons, 1994) Phân chia tế

bào bất đối xứng được thúc đẩy bởi các chất điều hòa sinh trưởng thay đổi cực tế bào

bằng các can thiệp vào sự chênh lệch pH (gradient pH) hoặc điện trường xung quanh tế

bào (Smith, Krikorian, 1990) Khả năng kiểm soát sự phát triển tế bào chịu ảnh hưởng

bởi polysaccharides vách tế bào và các enzyme thủy giải (de Jong và ctv, 1993a;

Emons, 1994; Fry,1995) [4]

Khả năng hình thành phôi vô tính được quyết định bởi gen Có những khác biệt đáng

kể về kiểu gen cho những tính trạng này Có những loài thực vật biểu hiện tiềm năng

phát sinh phôi không chịu ảnh hưởng loại mẫu cấy như ở loài Daucus carota và

Medicago sativa, trong khi những loài khác phải sử dụng mô phôi hoặc các mô còn rất

Hình 1.6: Sự phân chia tế bào trong quá trình phát sinh phôi thực vật hạt kín (a) và hạt trần (b)

trẻ hoặc mô còn non Kiểu đáp ứng phát sinh phôi của các mô nuôi cấy chịu tác động

của ngoại cảnh và bị ảnh hưởng bởi giai đoạn phát triển của thực vật , bản chất của

mẫu cấy… (Litz, Gray, 1995)

Nhu cầu auxin hoặc các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác cần cho việc khởi

động sự phát sinh phôi phần lớn chịu ảnh hưởng của mô cấy tại thời điểm đó Thông

thường khởi sự phát sinh phôi (embryogenic cell) được tạo thành ở môi trường có chứa

auxin [4]

1.4.2.1.2 Nuôi cấy tăng sinh phôi:

Một khi tạo được các tế bào tiền phôi, chúng tiếp tục tăng sinh, tạo thành cụm

tiền phôi (PEM) Auxin rất cần cho việc tăng sinh khối tiền phôi (PEM) nhưng lại ức

chế khối tiền phôi (PEM) phát triển thành phôi vô tính (de Vries và ctv.,1988; Nomura,

Komamine 1985; Filonova và ctv.,2000a) Mức độ hấp thụ auxin tùy thuộc theo loài

Môi trường để duy trì và tăng sinh khối tiền phôi (PEM) tương tự như trong môi

trường cảm ứng nó Có thể nuôi cấy trên môi trường bán rắn, tuy nhiên, nuôi cấy huyền

phù cho tốc độ tăng sinh cao và các tế bào phát triển đồng đều hơn Ở một số loài, phôi

có thể cấy chuyền sau thời gian dài trên môi trường có chất điều hòa sinh trưởng mà

vẫn mang đầy đủ tiềm năng phát triển thành phôi Tuy nhiên, sai biệt về gen tăng lên

với việc kéo dài thời gian cấy chuyền, làm suy giảm khả năng phát triển của phôi [6]

1.4.2.1.3 Giai đoạn tiền trưởng thành của phôi:

Sự chuyển tiếp từ khối tiền phôi (PEM) sang phôi có vai trò rất quan trọng, là

một sự kết nối giữa sự tăng sinh của khối tiền phôi (PEM) và sự phát triển có tổ chức

của phôi Không nên xử lý cho phôi vô tính trưởng thành trước khi nó đạt đến một giai

đoạn phát triển thích hợp

1.4.2.1.4 Sự phát triển của phôi:

Suốt giai đọan trưởng thành, phôi vô tính trải qua các biến đổi về hình thái và

sinh hóa Các bộ phận dự trữ như lá mầm, tăng trưởng mạnh mẽ cùng với việc tích lũy

các vật chất dự trữ Các phôi vô tính tích lũy sản phẩm dự trữ có đặc điểm tương tự

như phôi hữu tính Sản phẩm dự trữ cũng hướng đến một số bào quan dưới mức tế bào

(Merkele và ctv., 1995) Tuy nhiên, lượng các chất dự trữ cũng như thời điểm tích lũy

các chất dự trữ có sự khác biệt giữa phôi vô tính và hữu tính (Merkele và ctv.,1995;

Yeung, 1995) Sự tổng hợp và tích lũy các chất dự trữ và protein có nhiều trong giai

đoạn phôi muộn (late embrogenesis abundant) Ở một số loài, môi trường nuôi phôi

cần được bổ sung ABA để kích thích sự trưởng thành Abscisis (ABA) còn có tác dụng

làm giảm quá trình phát sinh phôi thứ cấp hoặc ức chế sự nảy mầm sớm Tuy nhiên,

tiếp xúc với ABA nhiều có thể ảnh hưởng xấu tới thực vật sau này (Bozhkov và ctv,

1998) Nhiều nhân tố như ethylene, stress nước, pH và quang kỳ cũng được cho là ảnh

hưởng đến sự trưởng thành của phôi Sự trưởng thành của phôi hữu tính thường trải

qua giai đoạn làm khô phôi để làm giảm quá trình trao đổi chất và đi vào trạng thái

miên trạng Sau giai đoạn này, việc hydrate hóa hạt sẽ làm chúng đáp ứng và nảy mầm

ngay tức thời Đối với phôi vô tính có thể không tuân thủ các giai đoạn như phôi hữu

tính mà chúng có khả năng nảy mầm ngay, tuy nhiên, các cây này tỉ lệ sống thấp Có

thể làm phôi đi vào trạng thái miên trạng bằng cách khử nước Một số yếu tố tác động

đến chất lượng của phôi như là áp suất thẩm thấu (muối vô cơ, acid amin, đường,

polyethylen glycol…), stress nước v.v.… Polyethylen glycol (PEG) hay được sử dụng

vì đây là hợp chất cao phân tử Các phân tử PEG không thể đi xuyên qua vách tế bào

trong khi nước thì lại đi ra khỏi tế bào, dẫn đến giảm lực trương tế bào Mặc dù, việc

thêm PEG vào môi trường có tác dụng kích thích trưởng thành, tuy nhiên, nhiều nghiên

cứu cho thấy PEG tác động xấu lên sự nảy mầm của phôi và tăng trưởng của rễ Đối

với loài Picea abies, PEG ảnh hưởng đến hình thái phôi và sự phát triển mô phân sinh

1.4.2.2 Xây dựng bản đồ phát triển của phôi ở thực vật hạt trần

Filonova và ctv.,2000 đã dùng kỹ thuật time-lapse để nghiên cứu con đường

phát triển của phôi ở Pinus Abies Theo đó, từ vài cụm tế bào khối tiền phôi (PEM) I

ban đầu, là những tế bào nhỏ, cứng có tế bào chất đậm đặc bên cạnh các tế bào có

không bào lớn Khi nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng thích hợp có bổ sung auxin

và cytokinin, cụm tế bào khối tiền phôi (PEM) I sẽ phát triển thành nhiều tế bào có

không bào lớn và tiến tới giai đoạn kế tiếp khối tiền phôi (PEM) II

Sơ đồ 1.2: Mô tả con đường phát triển của sự phát sinh phôi vô tính P.abies[16]

Bằng thử nghiệm đánh dấu đọan đứt (dUTP mediated deoxynucleotidyl

transferase), người ta có thể phát hiện ở một trong các tế bào giàu không bào của cụm

khối tiền phôi (PEM) II vài tín hiệu đầu tiên của sự thoái hóa nhân trong suốt con

đường phát sinh phôi vô tính (Filonova và ctv, 2000b) Kích thước của khối tiền phôi

(PEM) II tăng dần lên do chúng phân chia tế bào Cả tế bào giàu tế bào chất và tế bào

nhiều không bào trong khi vẫn giữ được tính phân cực của chúng Sau đó, tính phân

cực mất dần di do sự gia tăng hoạt động tăng sinh Quá trình này tiếp tục cho đến khi

cấu trúc khối tiền phôi (PEM) III được hình thành, theo sau là sự biệt hóa các phôi của

khối tiền phôi (PEM) III Một điều ngẫu nhiên xảy ra cùng với sự tạo phôi, khối tiền

phôi (PEM) III thoái hóa dần (chương trình tự chết của tế bào)

Loại bỏ các chất điều hòa sinh trưởng ra khỏi môi trường nuôi cấy làm gia tăng đáng

kể sự phát sinh phôi và giảm sự chết tế bào theo chương trình của khối tiền phôi (PEM)

(Filonova và ctv., 2000b) Trong phân tích kiểm soát thời gian ở các tế bào, người ta

thấy rằng phôi bắt đầu phát triển trong môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh

trưởng

Để phôi phát triển và trưởng thành, việc nuôi cấy được bổ sung ABA Đáp ứng với

ABA, cụm phôi có màu đục, đi kèm là sự loại bỏ dây treo thông qua chương trình chết

tế bào (Filonova và ctv.,2000b) Sau đó, phôi bắt đầu kéo dài Sự kiểm soát khi phôi

trưởng thành toàn diện giống như phôi hữu tính.[15]

1.5 Một số giả thuyết trong quá trình phát sinh phôi soma

Ở các loài thực vật bậc cao, việc không thể phát sinh phôi hợp tử ở một số loài

được cho là có liên quan đến sự sinh sản tiếp hợp vô tính - sinh sản vô phối (apomixis)

(gồm hơn 400 loài cây thuộc ít nhất 40 họ khác nhau; Bicknell và Koltunow, 2004)

Trong quá trình sinh sản vô phối, sự hình thành hạt vô tính bắt đầu từ những mô mẹ

của noãn, không trải qua quá trình giảm phân và thụ tinh, dẫn đến sự phát triển của

phôi (Bicknell và Koltunow, 2004)

Hiện tượng sinh sản vô phối đã bộc lộ hai khía cạnh quan trọng của quá trình phát sinh

phôi ở thực vật:

(1) những nhân tố kích hoạt sự thụ tinh có thể được thay thế bằng các cơ chế nội sinh

(2) ở một số loài thực vật bậc cao, ngoài tế bào trứng được thụ tinh thì các loại tế bào

khác cũng có thể duy trì và giữ lại khả năng phát triển phôi

Mặc dù quá trình sinh sản vô phối chỉ hạn chế đối với các tế bào phát sinh đỉnh hoặc

noãn, nhưng cũng có một số lượng lớn tế bào soma thực vật có thể trải qua quá trình

phát triển phôi dưới những điều kiện thích hợp Tất cả các tế bào soma ở thực vật đều

có chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết cho việc hình thành nên một cơ thể thực

vật hoàn thiện với đầy đủ các chức năng cần thiết Trong suốt quá trình phát triển, sự

biểu hiện gen ở thực vật được kiểm soát chặt chẽ theo không gian và thời gian để cho

phép sự biệt hóa của rất nhiều cơ quan trong cơ thể

Sự cảm ứng hình thành phôi vô tính phải làm kết thúc sự biểu hiện của một gen trong

mô thực vật tại thời điểm đó, và thay thế nó bằng chương trình biểu hiện của gen sinh

phôi Giả thuyết này được đưa ra lần đầu tiên do Evans và cộng sự (1981), Sharp và

cộng sự (1982) Đây cũng là những người đầu tiên đưa ra một số các thuật ngữ như:

- IEDC (Induced embryogenic determined cell): nhằm mô tả những tế bào có khả năng

sinh phôi xuất phát ban đầu là những tế bào không sinh phôi

- PEDC (Pre-embryogenic determined cell): chỉ những tế bào của phôi hợp tử đã có sẵn

chương trình biểu hiện của các gen sinh phôi

Cả IEDC và PEDC đều có chức năng tương tự nhau là nhằm mục đích tái sinh

EDC – embryogenic determined cell, hay EC – embryogenic cell: dùng để gọi chung

hai dạng trên

Thuật ngữ EC được sử dụng nhiều hơn bởi vì sự hình thành phôi vô tính không phải là

một hiện tượng chắc chắn sẽ xảy ra của các EC, do đó thuật ngữ EC cho thấy là các tế

bào sinh phôi này có tính mềm dẻo trong một số trường hợp (Carman, 1990)

Các thí nghiệm nhằm hình thành phôi vô tính đều phụ thuộc vào việc mô cấy chứa các

PEDC hoặc là EC Nếu mô cấy có các PEDC thì chỉ cần một sự kích thích phân chia tế

bào là đủ để hình thành phôi, và quá trình này được gọi là sự hình thành phôi vô tính

trực tiếp bởi vì phôi xuất hiện trực tiếp từ mô cấy Ngược lại, nếu các mô cấy là những

tế bào đã biệt hóa không còn khả năng sinh phôi thì chúng cần phải trải qua nhiều lần

phân chia tế bào liên tiếp dưới sự cảm ứng của auxin trong suốt quá trình để được tái

lập trình đi vào con đường sinh phôi (Bùi Trang Việt, 2002) Các tế bào được sinh ra

do nhiều lần phân chia nguyên nhiễm được gọi là mô sẹo, và quá trình này được gọi là

sự hình thành phôi vô tính gián tiếp vì phải thông qua giai đoạn tạo mô sẹo (Merkle và

cộng sự, 1995) Sự chuyển vị từ các tế bào mô sẹo sang trạng thái sinh phôi đi kèm với

những thay đổi trong sự sắp xếp của các vi ống từ định hướng ngẫu nhiên để sắp xếp

thành những hàng song song với nhau (Wochok, 1973) [6][15]

1.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh phôi soma

1.6.1 Nhân tố tác động đến quá trình cảm ứng:

− Auxin: là yếu tố cần thiết cho sự phát triển của phôi, nó ảnh hưởng khác nhau

tới từng giai đoạn trong quá trình phát sinh phôi Sự hiện diện của auxin riêng lẽ hay

auxin liên kết với một cytokinin là cần thiết cho sự thành lập các tế bào hay nhóm tế

bào có khả năng sinh phôi, tuy nhiên auxin lại cản sự sinh phôi ở các giai đoạn tiếp

theo Nhu cầu về loại auxin cũng như nồng độ auxin cho sự cảm ứng thay đổi tùy thuộc

vào kiểu gene thực vật cũng như loại mô sử dụng Người ta cho rằng auxin ảnh hưởng

đến kiểu gene, từ đó làm xuất hiện nhiều thay đổi khiến tế bào tái lập sang trạng thái có

thể phát sinh phôi Cơ chế đó có thể là sự methyl hóa DNA LoSchiavo (1989) đã phát

hiện rằng sự methyl hóa DNA đã thực sự xảy ra khi có sự tồn tại một lượng auxin

ngoại bào Ngoài ra, auxin còn có vai trò trong sự thành lập các tế bào có khả năng sinh

phôi là do chúng ảnh hưởng đến tính hữu cực của tế bào và kích thích các phân chia

không cân xứng sau đó Smith và Krikorian (1989) nhận thâý rằng khi cảm ứng bằng

auxin, tính nguyên vẹn của mô bị phá vỡ, làm cho các tế bào hoặc nhóm tế bào tách rời

nhau ra và phá vỡ cầu liên bào Sự tách rời các tế bào có thể là kết quả của sự hoại tử

của các mô xung quanh, các tế bào hình thành calloz hay lớp cutin (Merkle và ctv,

1995) trở nên xốp và dễ tách rời Những tế bào hay lớp tế bào bị tách rời sẽ không chịu

ảnh hưởng của các mô xung quanh nữa Tất cả điều này thúc đẩy sự sinh phôi vô tính

− Cytokinin: sử dụng cytokinin riêng lẻ để tạo phôi vô tính từ phôi hợp tử non đã

đạt được thành công ở nhiều loài, bao gồm hạt kín và hạt trần Vì phôi hợp tử non có

chứa các mô quyết định sự hình thành phôi đo đó không cần phải thiết lập một kiểu

biểu hiện gene nào cả Thay vào đó, tế bào cần được phép phân chia mà không bị kiềm

hãm bởi các tế bào xung quanh, trong trường hợp này cytokinin đóng vai trò đáng kể

Đối với sự phát sinh phôi gián tiếp (sinh phôi từ những mô đã trưởng thành), sự kết

hợp cytokinin ở một hàm lượng thấp với auxin cũng đạt được hiêụ quả sinh phôi

Đối với Abies, cytokinin đóng vai trò quan trong trong cảm ứng sinh quá trình sinh

phôi soma ở phôi non (Schuller, 1989) cũng như phôi trưởng thành (Hristoforoglu,

1995)

− Các nhân tố khác:

o Kiểu gen và đặc điểm mẫu cấy: theo Merkle và ctv, 1995 thì kiểu gen đóng vai trò

rất quan trọng vì sự cảm ứng hình thành phôi vô tính có liên quan đến con đường di

truyền tương tự phôi hợp tử Các khác biệt về di truyền có thể là nguyên nhân ảnh

hưởng đến những khác biệt về khả năng hoạt hóa các nhân tố then chốt, từ đó dẫn

đến con đường tạo phôi

o Tuối và giai đoạn phát triển của mô cấy: có vai trò rất quan trọng Những mô

không có khả năng đáp ứng sinh phôi thì không có thụ quan nhận biết auxin, họăc

là các phân tự nhận biết tín hiệu chưa đồng nhất với nhau (Merkle và ctv, 1995)

o Môi trường nuôi cấy và thành phần môi trường

Sucrose: là nguồn cung cáp carbohydrate Người ta thấy rằng sucrose và auxin có

mối tương tác, nồng độ tối ưu của sucrose hoặc auxin đều phụ thuộc lẫn nhau Bên

cạnh đó, một số loại đường đôi, đường đơn khác như galactose, lactose, mantose cũng

có hiệu quả trong cảm ứng tạo phôi

Polyamin: có hiệu quả kích thích sự hình thành phôi ( Minocha, 1995) Những chất

hữu cơ khác như nước dừa , casein thủy phân, tinh chất mạch nha… cũng như vai trò

của Nitơ, acid amin có nhiều ảnh hưởng đến cảm ứng tạo phôi

Trạng thái môi trưởng: có thể nuôi cấy trên môi trường lỏng tĩnh, lỏng lắc hoặc môi

trường bán rắn Việc lựa chọn trạng thái môi trường là rất quan trọng trong việc cảm

ứng, duy trì và làm tăg cường sự phát triển của phôi vô tính

Điều kiện môi trường về ánh sáng: phôi vô tính có thể được hình thành trong những

điều kiện ánh sáng khác nhau, có những loài có nhu cầu ánh sáng cao ( cây Cà-

Gleddie và ctv, 1983) nhung có những loài sự hình thành phôi trong điều kiện tối hoàn

toàn ( cây Dương- Michlerr và ctv, 1991) [6]

1.6.2 Nhân tố tác động đến sự gia tăng số lượng phôi:

Sự gia tăng các tế bào sinh phôi có nhiều kiểu khác nhau và chịu ảnh hưởng bởi

nhiều nhân tố, một vài nhân tố có thể điều khiển được trong quá trình nuôi cấy nhưng

một số cái thì không Những nhân tố được nghiên cứu trong sự gia tăng số lượng các tế

bào sinh phôi thì tương tự như những nhân tố tác động trong cảm ứng tạo phôi [6]

1.6.2.1 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật và nitơ khử:

Khi một nhóm tế bào sinh phôi hình thành thì sự có mặt của auxin sẽ ức chế sự

phát triển bình thường và sự trưởng thành của phôi vô tính Tuy nhiên khi auxin có mặt

ở nồng độ đủ cao sẽ khởi đầu sự sinh sản một lọat các phôi vô tính mới (Merkle và ctv,

1995) Nồng độ auxin để duy trì sự hình thành phôi vô tính lặp lại là rất khác nhau giữa

các loài thực vật Ngoài ra, có những báo cáo về sự việc không cần sử dụng auxin cũng

có thể khởi động chương trình sinh phôi lặp lại, áp dụng thành công trong nuôi cấy

carot [6]

1.6.2.2 Kiểu di truyền thực vật

Có những ảnh hưởng nhất định của kiểu di truyền lên tốc độ tăng sinh trong quá

trình nuôi cấy tạo phôi vô tính (Merkle và ctv, 1995) Người ta phát hiện có sự khác

biệt đáng kể trong sự tăng sinh phôi vô tính giữa 15 giống Vân Sam Na Uy Tuy nhiên,

vẫn chưa xác định được chính xác khác biệt nào là do ảnh hưởng của sự sai khác về

mặt di truyền (Becwar và ctv, 1993) [6]

1.6.3 Nhân tố ảnh hưởng đến sự biệt hóa mô

– Auxin: Sự có mặt của auxin trở nên bất lợi cho sự biệt hóa mô của phôi Sự duy trì

phôi carot trong môi trường có 2,4-D đã ức chế sự biệt hóa mô của chúng hoặc dẫn

đến sự phát triển bất thường trong mô phân sinh đỉnh Điều này có thể gây ra bởi

khả năng của auxin có thể ức chế sự phát triển của mô phân sinh bên trong tự nhiên

– Cytokinin: Sự hiện hiện cytokinin ngọai bào làm giảm sự phát triển của cả phôi hợp

tử cây Đậu nành và phôi vô tính cây Cần Tây (Merkle và ctv, 1995) Mặt khác, việc

thêm cytokinin trong suốt giai đọan biệt hóa có thể bù đắp những bất lợi mà auxin

gây ra lên sự phát triển của mô phân sinh tạo ra trực tiếp trên bề mặt mẫu cấy (Bell

và cộng sự, 1993; Charrière và Hahne 1998).[6]

1.7 Ứng dụng của quá trình tạo phôi soma

Quá trình hình thành phôi vô tính đã mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn và có

tính thương mại to lớn, đặc biệt trong vi nhân giống in vitro Về lý thuyết, từ một mẫu

mô được nuôi cấy có thể sản xuất ra vô số tế bào phôi Tốc độ nhân giống từ phôi cao

hơn nhiều so với việc nhân giống từ mô phân sinh Đây chính là một ưu thế của nhân

giống từ phôi so với các phương pháp nhân giống in vitro khác (Nguyễn Đức Lượng,

2002)

Ngoài ra, số lượng lớn của phôi chính là một nguồn nguyên liệu đáng kể phục vụ cho

những ứng dụng thực tiễn quan trọng khác như:

− Sản xuất hạt nhân tạo (Redenbaugh, 1993)

− Cải thiện chất lượng cây trồng (là nguyên liệu cho chọn lọc tế bào, biến nạp gen, lai

soma, tạo những dòng đồng hợp tử và đa bội)

− Bảo quản chất mầm

− Loại trừ virus Phôi vô tính có một hệ mao mạch rất phát triển, tuy nhiên hệ thống

này không nối liền với hệ mạch dẫn của mô cấy (Newton và Goussard, 1990) Điều

này có nghĩa là việc tạo phôi vô tính cũng có thể giúp để tạo được các dòng cây

sạch bệnh virus, có thể kết hợp với biện pháp sốc nhiệt hoặc không (Goussard và

Wiid, 1992; Strandberg, 1993) Sản xuất các chất biến dưỡng in vitro

− Sự thành lập khuẩn căn in vitro (Carlos và Martínez, 1998) Việc ủ các nấm khuẩn

căn từ bên ngoài vào môi trường đã thúc đẩy sự phát triển của cây con có nguồn

gốc từ phôi vô tính (Piola và cộng sự, 1995) [5],[8]

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Đối tượng nghiên cứu là phôi non của 3 dòng thông nhựa Pinus merkusii (dòng: 31;

44; 54) do trung tâm nghiên cứu giống cây rừng, viện Khoa học lâm nghiệp Việt nam

cung cấp

Hình 2.1: Cây và trái thông nhựa Pinus merkusii

2.2 Nội dung nghiên cứu:

* Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tạo phát sinh phôi soma và tăng sinh khối

* Nghiên cứu sự thay đổi cường độ hô hấp và chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) trong

quá trình nuôi cấy

Các thí nghiệm bao gồm: